Troubles nerveux

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

305 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue et le reste réutilisé ou transféré. Ils reçoivent par voie orale ou injectable des substances hallucinogènes présentes dans l'ayahuasca, la DMT et une β-carboline, subissent des prélèvements de sang et sont observés isolés pendant deux heures pour compter leurs secousses de type wet dog shakes. Le porteur indique que l'ayahuasca peut provoquer une anxiété aiguë et perturber le comportement des rats plusieurs heures durant. Selon les besoins du commanditaire en échantillons terminaux, chaque rat est tué pour prélèvement d'organes ou gardé vivant pour des formations internes.

Objectifs

Dans ce projet, les effets hallucinogènes de principes actifs pharmaceutiques seront étudiés. La N,N- diméthyltryptamine (DMT) et la β-Carboline, un alcaloïde, sont des substances psychotropes puissantes considérées comme des stupéfiants en France. Ils sont retrouvés dans la composition de l’Ayahuasca, boisson amazonienne psychédélique, ingérée traditionnellement dans un cadre chamanique, principalement à des fins thérapeutiques, d’apprentissage ou de divination. Cette boisson est produite à partir de la décoction de Banisteriopsis caapi et Psychotria viridis, des plantes contenant respectivement de la BC et de la DMT. Il existerait des bénéfices thérapeutiques de l’Ayahuasca pour les patients souffrant de dépression, d’idées suicidaires ou de graves problèmes de santé mentale. Cependant, l’Ayahuasca présente de nombreux effets indésirables en fonction de la dose utilisée (nausées, vomissements, diarrhées ou psychoses aigus conduisant même à la mort). L’objectif du présent projet est donc d’évaluer les effets hallucinogènes de plusieurs doses et compositions à partir du breuvage traditionnel de l’Ayahuasca en comparaison avec le 2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) qui est une substance psychédélique et une amphétamine substituée. Le DOI est un agoniste sérotoninergique puissant. Le DMT a une activité pharmacologique similaire mais sa biodisponibilité orale est très faible sans les composants de l'Ayahuasca, comme la β-Carboline, qui empêchent son métabolisme dans l'intestin. En jouant sur les doses et le ratio des composants du breuvage, le sponsor souhaite obtenir un composé qu’il pourrait développer en clinique dans l’indication de troubles psychiques en limitant les risques d’effets secondaires. Les effets du DMT seul, de la β-Carboline seule et de différents ratios de DMT et β-Carbolines seront mesurés. Le sponsor souhaite ensuite étudier les effets secondaires de type nausées et vomissements chez le furet (dans le cadre d’une autorisation de projets différente). L'activité hallucinogène sera étudiée en utilisant le test de "secouement du chien mouillé" (WDS pour wet dog shake). De nombreuses substances hallucinogènes qui agissent comme agonistes des récepteurs sérotoninergiques, tel que le DOI, provoquent un mouvement rotatif paroxystique et rythmique chez les rongeurs. Pour ce projet, le nombre de WDS et de secousses isolées de la tête (HS pour head shake) chez le rat seront comptabilisés pendant un total de 120 minutes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les effets hallucinogènes de l’Ayahuasca à différentes doses sur le modèle rongeur de WDS. L’Ayahuasca pourrait être prometteuse et être proposée comme nouvelle stratégie thérapeutique aux patients souffrant de dépression et troubles de santé mentale.

Procédures

Les rats seront traités par voie orale, par voie sous cutanée (ou par voie intrapéritonéale) avec une substance à tester ou son véhicule. Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles en contention et dureront moins d'une minute. Des prélèvements de sang seront réalisés pour l’étude du profil pharmacocinétique des substances. Un prélèvement sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (induction 4% pendant 4 minutes, entretien 2,5% mix air et oxygène) par ponction directe à la veine jugulaire sera réalisé. Le prélèvement de sang est très rapide (quelques minutes). Si le volume de sang souhaité par le sponsor est important, un prélèvement en intracardiaque avant la mise à mort est alors réalisé. L’effet hallucinogène des substances sera étudié avec le test du WDS qui consiste à observer les animaux sur une période de 2h et comptabiliser le nombre de WDS. Les animaux seront isolés pendant cette période et seront replacés dans leur cage d’hébergement avec leur paire dès le retour à un comportement normal. Dans le cas où le sponsor voudrait réaliser des analyses sur cerveau perfusé, alors une perfusion intracardiaque serait réalisée.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de l’Ayahuasca et de DOI. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Ces molécules sont connues pour induire des effets indésirables et de forts effets hallucinogènes. Après administration de DOI, une activité locomotrice et exploratoire normale est décirt dans la littérature. Avec l'Ayahuasca, une anxiété aigue (diminution de l'exploration et de l'activité locomotrice) pourrait être observée. L’état comportemental des rats pourra donc être perturbé pendant les quelques heures qui suivront l’administration. L’observation des WDS nécessite d’isoler les animaux pendant 2h. Le stress de l’isolement est considéré comme aigu. Les animaux satellites subiront au maximum 3 prélèvements de sang par ponction de la veine jugulaire (technique faiblement invasive) sous anesthésie gazeuse de courte durée.

Devenir

Selon si le sponsor a besoin d’échantillons prélevés en terminal (volume de sang important et/ou organes) ou non, l’animal sera mis à mort ou gardé en vie. Les animaux maintenus en vie seront utilisés dans le cadre de formations internes ou d’améliorations de nos procédures (raffinement) ou bien seront réhabilités dans des centres de formation (université, formation d’expérimentation animale ou chirurgie).

Remplacement

Ce projet ayant pour but l’étude comportementale chez le rat de l’effet hallucinogène de préparations à tester, il est indispensable d’avoir recours à l’animal. De plus, même si les méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites pour caractériser le profil pharmacocinétique d'un composé (absorption, métabolisme et excrétion). L’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

L’étude est séquencée en plusieurs étapes afin de n’utiliser des animaux qu’après validation de chaque étape. Si l’induction avec le contrôle positif n’était pas concluante alors le projet serait interrompu. Un seul groupe contrôle négatif sera utilisé pour chaque étape afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les observations comportementales seront réalisées en aveugle, ce qui justifie de n'utiliser qu'un seul groupe contrôle négatif même si les voies d'administrations et les véhicules sont différents entre le contrôle positif et les préparations à tester. Le N a été déterminé en tenant compte de l'effet hallucinogène attendu du contrôle positif, décrit dans la littérature. Avec les premiers résultats obtenus au cours des études pilotes, un calcul de puissance sera réalisé.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance toute particulière sera portée au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations. Les administrations seront réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Le matériel utilisé sera adapté à l’espèce (aiguille, canule de gavage, etc.). Si l’administration des substances entrainait l’apparition de diarrhées et/ou des difficultés à se nourrir alors des croquettes ou des gels pour la réhydratation seraient placés dans la cage de l’animal. Pendant, la semaine d’acclimatation, les animaux seront habitués au moins une fois à la pièce d’expérimentation où sera réalisée les tests de WDS. Si les secousses WDS se poursuivaient après les 2h d’observations et seraient assez intenses, alors l’isolement de l’animal serait prolongé jusqu’à un retour à un comportement normal. Les prélèvements de sang se feront sur tapis chauffant avec un rétrocontrôle afin de maintenir la température de l’animal à 37°C. Pour cela, une sonde rectale reliée au tapis chauffant sera placée dans l’animal pendant le prélèvement. Après chaque prélèvement de sang, un volume de sérum physiologique équivalent à 3 fois le volume prélevé sera injecté en sous cutanée afin de compenser la perte de volémie. Dans le cas où une incision est nécessaire, une injection d'un analgésique local au niveau du site de l'incision sera réalisée au moins 15 min avant. Une analgésie générale sera apportée avant la perfusion cardiaque.

Choix des espèces

L’activation des récepteurs sérotoninergiques est responsable des effets psychédéliques chez l’Homme et induit chez le rat une réponse comportementale caractéristique de WDS. Les hallucinogènes sérotoninergiques agissent via des mécanismes d’action similaires chez l’Homme et le rat. Ces résultats démontrent que le test de WDS chez le rat est un modèle préclinique intéressant pour l’étude pharmacologique des effets hallucinogènes. Des rats adultes de 5 à 8 semaines pourront être utilisés.

98 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, des formes altérées d'une protéine liée à la maladie de Parkinson, pour comparer leur pouvoir pathogène. Le porteur indique que cette inoculation conduit irrémédiablement à une paralysie mortelle, les animaux étant tués dès l'apparition d'une démarche saccadée et d'une perte d'équilibre. Il affirme que le projet ne peut être mené qu'in vivo, faute de méthode alternative.

Objectifs

L’alpha-synucléine est une protéine présente sous une forme anormale dans les lésions cérébrales des patients atteints de la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy ou l’atrophie multisystématisée. Nous avons développé une méthode permettant d’amplifier in vitro les altérations de l’alpha-synucléine à partir d’un cerveau (substrat) provenant de souris conventionnelles C57Bl/6 après amorçage de la réaction par une petite quantité de matériel cérébral de souris modifiées génétiquement (M83) et présentant des altérations de l’alpha-synucléine humaine. Notre projet vise à évaluer dans quelle mesure la présence d'autres protéines humaines anormales dans le cerveau utilisé comme substrat peut modifier les altérations de l’alpha-synucléine lors de la réaction in vitro. Ces autres protéines humaines examinées sont celles impliquées dans la maladie d’Alzheimer (β-amyloïde et tau) et dans le diabète de type 2 (peptide amyloïde des ilots pancréatiques). Les caractéristiques de l’alpha-synucléine ainsi altérée in vitro sont évaluées dans notre projet par les caractéristiques de la maladie et des lésions cérébrales observées suite à son inoculation dans le cerveau de souris modifiées génétiquement (M83).

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur les relations entre des protéines qui sont altérées dans la maladie d’Alzheimer ou le diabète de type 2 et l’alpha-synucléine, qui est altérée dans la maladie de Parkinson. Il est en effet établi que l’altération des premières protéines entraîne une fréquence accrue et une aggravation des maladies humaines associées à l’alpha-synucléine altérée, mais les mécanismes en cause restent encore très mal compris. Ce projet envisage de répondre à la question de savoir dans quelle mesure ceci peut être lié à des altérations différentes de l’alpha-synucléine elle-même, du fait de la présence dans le cerveau d’autres protéines altérées. On parle de co-morbidités.

Procédures

Les produits d’amplification obtenus in vitro sont caractérisés par leur pathogénicité après inoculation dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 98 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation de différentes formes altérées d’alpha-synucléine présentes dans les différents produits d’amplification étudiés est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les 7 lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque produit d’amplification examiné. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée de survie, de la distribution des lésions cérébrales et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. L’analyse statistique de la distribution de l’alpha-synucléine nécessite en particulier un minimum de 6 souris au stade clinique de la maladie. Un lot de 14 souris nous permet ainsi de bénéficier au stade clinique d’au moins 6 cerveaux, pour les analyses biochimiques de l’alpha-synucléine et d'au moins 6 cerveaux pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire dans ce modèle de souris sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Grâce à ce projet fondé sur l’inoculation de différentes sources d’alpha-synucléine anormale nous souhaitons affiner la caractérisation clinique comme possible critère de différenciation, une possibilité décrite dans la littérature scientifique, par exemple lors d’un test de suspension par la queue.

Choix des espèces

Plusieurs études récentes ont montré que les souris (M83) utilisées dans ce projet permettaient la caractérisation de différentes formes anormales d’alpha-synucléine, après leur inoculation dans le cerveau de ces souris, sur la base du délai d’incubation de la maladie, de l’extension des lésions dans le cerveau et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6 à 8 semaines. Compte-tenu de l’importance de la mesure de la durée d’incubation de la maladie ces souris sont entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à son apparition, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie implante une sonde de microdialyse, parfois couplée à une fibre optique, dans leur cervelet, les animaux étant tués dans les 24 heures pour vérification anatomique, afin d'étudier le rôle des cellules gliales dans la neurotransmission. Le porteur qualifie cette chirurgie intracérébrale de gêne légère et de mineure au motif que le cerveau serait dépourvu de fibres de la douleur. Il réduit les bénéfices attendus à la mise en évidence d'un rôle de ces cellules, sans application décrite.

Objectifs

Notre projet vise à édudier le role des cellules de Bergmann (les cellules gliales du cervelet) dans les neurotransmissions monoaminergiques (Sérotonine, Noradrénaline, Dopamine) dans le cervelet de souris.

Bénéfices attendus

La mise en évidence de l'implication des cellules gliales dans la neurotransmission monoaminergique

Procédures

Chirurgie : implantation stéréotaxique de sonde de microdialyse couplées ou non avec une fibre optique dans le cervelet. Ceci concerne l'ensemble des animaux la durée totale entre l'implantaion et le sacrifice des animaux est de 24 heures.

Impact sur les animaux

Techniquement les expériences menées impliquent la microdialyse mise en oeuvre seule ou avec l'optogénétique. Ces implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. Le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires ontvréalisée chez l'humains sous simple anesthésie locale.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour vérification anatomique des implantations intracérébellaires

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes comme les interactions neurones-glies sur une structure cérébrale en fonctionnement dans des conditions physiologiques, n'est à ce jour pas modélisable.

Réduction

Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de microdialyse a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 25% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 14 animaux par groupe nombre qui est augmenté à 15 pour pallier aux aléas expérimentaux. Une approche statistique sera envisagée

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux

Choix des espèces

L'utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Les souches modifiées génétiquement ne sont disponibles que pour cette espèce. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines ainsi la chirurgie sera menées sur les animaux agés de 14 à 16 semaines.

960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le septième jour de vie, une chirurgie lèse leur hippocampe pour induire un modèle de schizophrénie, puis ils sont exposés jeunes à l'alcool et à des cannabinoïdes avant une seconde chirurgie d'implantation de canules, pour étudier l'impact de ces drogues sur la consommation d'alcool. Le porteur signale des douleurs postopératoires après chaque chirurgie. Il présente ce modèle par lésion comme le plus utilisé et le plus complet pour cette comorbidité.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission. En effet la dérégulation des systèmes de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.

Bénéfices attendus

Il n'existe à l'heure actuelle aucune étude visant à étudier l'impact de la co-exposition précoce à l'alcool est aux cannabis ni chez l'Homme, ni chez l'animal alors que la consommation de ces drogues est relativement fréquentes chez les adolescents et jeunes adultes. Grâce aux expériences proposées dans ce projet nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques. Nous ajouterons à cette étude neurobiologique un aspect purement comportemental qui nous permettra d'évaluer l'impact de cette exposition précoce aux drogues sur les comportements associés à la consommation d'alcool et à ceux associés à la schizophrénie.

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Chacune de ces opérations ne durera jamais plus de 20 minutes. Par la suite à l'âge adulte 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. Lors de ces chirurgies les animaux subiront une anesthésie gazeuse et recevront une injection d'analgésiques adaptés. En soins post-opératoires, les animaux (au 7ème jour de vie et à l'âge adulte) recevront pendant au moins 2 jours post-opératoires au moins 2 injections quotidiennes d'analgésique adapté.

Impact sur les animaux

- Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. - Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à l'âge adulte suite à l'implantation des canules par chirurgie stéréotaxiques. Durée attendue : 3-4 jours.

Devenir

Procédures 1, 2, 3: Ces procédures ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis soit dans la procédure 4 (640 rats) soit dans la procédure 5 (320 rats). Procédure 4 : A la fin des analyses comportementales les cerveaux de ces animaux devront être récupérés pour des analyses post-mortem en vue d’étudier l’expression de marqueurs biologiques importants dans ces pathologies et iront donc en procédure 6. Procédure 5: Tous les animaux seront euthanasiés pour vérifications histologiques des sites d'implantation des électrodes d'enregistrement et de stimulation. Procédure 6: Tous les animaux seront euthanasiés au cours de cette procédure.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle en prennant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).

Choix des espèces

Le modèle de lésion choisi pour induire des symptômes de schizophrénie est le plus utilisé en recherche sur la comorbidité addictive car ce modèle est sans doute celui qui représente le mieux l'évolution de la maladie. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Ce modèle nécessite une lésion du cerveau au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont affaiblies par quatre jours de Busulfan qui peut entraîner infections et perte de poids, reçoivent une greffe de cellules souches par injection derrière l'œil, puis passent des tests de mémoire nommés (piscine de Morris, labyrinthe en croix surélevé, open field). Le porteur évalue une thérapie cellulaire contre la maladie d'Alzheimer, dont il présente le bénéfice pour l'humain au conditionnel. Il justifie le modèle murin par l'absence de modèle in vitro reproduisant la perte de mémoire.

Objectifs

Notre objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique dans la maladie d'alzheimer (MA) visant à surexprimer deux protéines du métabolisme du cholesterol, en utilisant comme véhicule des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de souris. Ces cellules peuvent en effet être génétiquement modifiées ex vivo par un vecteur lentiviral pour exprimer un gène thérapeutique. Elles peuvent être ensuite réinjectées chez l’animal (modèle de la MA), après un traitement qui détruit les CSH de la moelle. Les cellules ainsi injectées reconstitueront le système hématopoïétique des animaux hôtes et après passage de la barrière hématoencéphalique, pourront se différencier localement pour exprimer nos protéines d'intêrets. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette approche dans le but de diminuer la pathologie liée à l’accumulation de l’amyloïde Beta.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de mieux caractériser les rôles des protéines d'intérêts dans la maladie d’Alzheimer. Si cette étude apporte des résultats encourageants, les bénéfices seraient de développer une approche thérapeutique potentielle permettant de traiter la MA chez l'humain. Cette approche permettrait une administration par voie intraveineuse de macrophages/monocytes purifiés et génétiquement modifiés obtenus à partir des CSH des patients eux-mêmes au lieu d'une greffe de CSH (qui est une technique invasive). Ces cellules élimineraient les protéines toxiques qui causent les symptômes de la maladie.

Procédures

Les animaux seront immunodéprimés par injection de Busulfan pendant 4 jours (l'injection dure 10 secondes par souris) puis recevront une greffe de cellules souches génétiquement modifiées par injection rétro-orbitale le jour d'après la dernière injection de Busulfan (l'injection dure moins de 2 min par souris, réalisée sous anesthésie gazeuse). Deux semaine après la greffe, une partie des animaux seront nourris avec de la nourriture spéciale (appelée PLX5622) permettant de dépleter la microglie du système nerveux central pendant 28 jours. Des prélèvements sanguins seront réalisés (1 fois par mois maximum avec un volume prélevé de 150 uL maximum et seulement si les souris pèsent plus de 20g, le prélèvement dure 2 min maximum par souris) sous anesthésie gazeuse pour vérifier la bonne prise de la greffe. Le premier prélèvement sera réalisé 2 mois après la greffe. Des tests comportementaux seront réalisés sur un des modèles murins de la maladie d'Alzheimer. Les tests commenceront 1 semaine après le prélèvement sanguin et s'étaleront sur 2 semaines. Pour la piscine de Morris, chaque essai dure maximum 1 min et chaque animal a 3 essai par jour pendant 5 jours. Le labyrinthe en croix surélevé et l'openfield durent 10 min chacun par souris et un seul essai est réalisé. L'euthanasie sera réalisée après les tests comportements, entre 6 et 7 mois d'âge.

Impact sur les animaux

Le conditionnement pré-greffe par injection de Busulfan 4 jours de suite affaibli les souris (perte de poids) et peut entrainer des infections. L’injection IV se fait dans le sinus rétro-orbitale se trouvant à l’arrière de l’œil. L’aiguille est donc insérée à côté de l’œil et l’œil n’a aucun dommage après l’injection (une lésion oculaire est possible mais rare). L’injection dure moins d’une minute. Nous avons préféré réaliser des injections rétro orbitale au lieu d’injection dans la veine caudale car cette dernière méthode est plus stressante que l’injection rétro orbitale (placement sous une lampe chauffante pour dilater la veine, contention mécanique). Les croquettes spécifiques n’entrainent aucun effet indésirable. Lors des prélèvements sanguins, les souris peuvent perdre beaucoup de sang. Les tests comportementaux peuvent être stressants et angoissants pour les animaux.

Devenir

A l'issue de nos deux procédures, les animaux sont euthanasiés pour récuperer les tissus post mortem pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

Nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris) car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne permet aujourd’hui d’étudier les symptômes de perte de mémoire typiques de cette maladie ainsi que la complexité des mécanismes neuronaux. De plus, la souris est un modèle d'alzheimer bien caractérisé tant d’un point de vue comportemental que biologique (marqueurs histologiques ou moléculaires) pour évaluer le bénéfice thérapeutique associé à notre approche. Pour ce faire, nous utiliserons au maximum 4 modèles de d'alzheimer déjà décrits.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques fiables. En effet, des travaux précédents ont permis de montrer que l’étude de groupes de 15 animaux par groupe permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en comportement, ainsi que dans les analyses biochimiques et de biologie moléculaire, réalisées sur de petits échantillons (1 hippocampe / souris). De plus, ce nombre d’animaux prend en compte la mortalité spontanée, ayant cours du fait du phénotype, particulièrement chez les APP/PS1 De9 (perte d’environ 10% dans un groupe APP/PS1 De9 non traité), et de l’âge des souris. Ainsi, dans ce projet, nous prévoyons un total de 385 souris. Des tests statistiques seront ensuite réalisés sur les résultats obtenus pour avoir une interprétation fiable de ces résultats.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (annexe III de la directive 2010/63/EU), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (avec mise au point de points limites) et des soins adaptés si besoin. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et en prévention de la douleur un antidouleur sera administrer. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux ayant subi une chirurgie seront observés quotidiennement la semaine suivant la chirurgie avec une attention particulière.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proches de celles de l’Homme. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Nous avons prévu d’utiliser au maximum 4 modèles animaux de la MA ayant tous des avantages à leur utilisation afin de valider notre approche thérapeutique dans ces modèles. Pour les souris APP/PS1 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (plaques Ab). Pour les souris THY-Tau22 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (protéines Tau). Pour les souris APP23 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition des symptômes cognitifs.