Troubles nerveux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Neurochimie chez le rongeur
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2000
20 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules à tester en administration unique ou répétée jusqu'à quinze jours, puis sont tués dans les quatre heures pour prélever des structures cérébrales et en mesurer les neuromédiateurs. Le porteur indique que les composés peuvent provoquer prostration, hyperlocomotion, perte de poids, stéréotypies, agressivité voire convulsions, auquel cas les animaux sont écartés et tués. Il justifie le recours au rongeur par la "nécessité" d'un système nerveux "intègre" pour évaluer les molécules.
Objectifs
La communication entre les différentes cellules du système nerveux central s’effectue via la libération de molécules, des neuromédiateurs, se liant à des récepteurs localisés sur les cellules cibles. Les nouveaux composés à tester, agissent sur ce système de transmission entre cellules nerveuses en activant ou inhibant la libération de neurotransmetteurs, en activant ou bloquant les récepteurs cibles. Afin de connaitre l’action de nos nouveaux composés sur l’activité de ces systèmes neurochimiques nous avons besoin d’évaluer les contenus en neuromédiateurs (dopamine, noradrénaline, acétylcholine, histamine…) et leurs métabolites (molécules résultant de leur dégradation) dans le cerveau ou des zones particulières du cerveau (hippocampe, hypothalamus, striatum, cortex…) de rongeurs. Pour ce faire nous avons besoin d’administrer nos composés à des rongeurs afin d’observer leurs effets sur les contenus en différents neuromédiateurs cérébraux.
Bénéfices attendus
La technique de neurochimie va permettre d'orienter la recherche de nouvelles molécules à visée thérapeutique - en permettant de vérifier leurs actions positives sur des systèmes neurochimiques connus pour être défaillants dans certaines pathologies psychiatriques (trouble du sommeil, dépression, anxiété, schizophrénie...). - au contraire en vérifiant leur absence d'effet délétère sur certains systèmes neurochimiques pouvant être impliqués dans des effets indésirables (addiction, hypolocomotion...). - en aidant la chimie médicinale à déterminer les familles de molécules ayant le plus d'activité sur un système neurochimique ciblé et à optimiser le(s) composé(s).
Procédures
Les animaux vont recevoir une administration aigüe ou chronique (maximum 15 jours, deux fois par jour) de molécules à tester. La mise à mort se fera au maximum 4 h après la dernière administration de composé.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de sélectionner les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être une prostration ou une hyperlocomotion, une perte de poids (si traitement chronique), des stéréotypies, de l'agressivité voir des convulsions. Si ces signes sont détectés, les animaux sont écartés de l'expérimentation et euthanasiés.
Devenir
L'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever les différentes structures centrales d'intérêt.
Remplacement
L’utilisation de souris ou de rats pour les mesures de neurochimie est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système nerveux intègre. En effet, le fonctionnement neurochimique du cerveau est particulièrement complexe avec de nombreuses interactions entre les différents systèmes neurochimiques des différentes régions du cerveau.
Réduction
Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'euthanasie des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien-Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors l’euthanasie de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Dans le cas d'une expérimentation chronique, en plus de la surveillance continue pendant 1h30 post-traitement, une fiche de suivi journalier est mise en place : tout signe de mal être (prostration, poils hérissés, perte de poids supérieure à 15% dans le cas des traitements chroniques, convulsions) entraînera l'exclusion de l'animal du protocole et son euthanasie (par exposition à une concentration croissante de CO2).
Choix des espèces
- La taille adéquat de l’animal : les rats et les souris présentent une taille suffisante pour permettre des microdissections de structures déterminées du cerveau. - Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée et documentée chez le rat et la souris. Les études de neurochimie pourront être menées aussi bien sur de jeunes animaux sevrés que sur des animaux adultes en fonction des objectifs.
Suivi par imagerie de peptides pour le traitement de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent une injection intraveineuse unique d'un peptide marqué par fluorescence, puis cinq séances d'imagerie, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour vérifier le passage de la barrière hémato-encéphalique. Le porteur limite les nuisances déclarées au stress de préhension lors des pesées et des anesthésies. Il indique avoir sélectionné les peptides par modélisation informatique et tests in vitro en amont, mais affirme que la confirmation du passage "impose" le recours à l'animal.
Objectifs
La Maladie de Parkinson (MP) fait partie des maladies neurodégénératives progressives qui affectent le système nerveux central (SNC) entraînant la mort des cellules nerveuses. Elle est la deuxième maladie neurodégénérative et sa prévalence augmente fortement avec l'âge. Elle est associée à la perte de neurones dans le cerveau et dans les neurones survivants, on observe la présence d’agrégats de protéines qui perturbent leurs fonctionnements. La plupart des thérapies actuelles n'atteignent pas leurs cibles car elles sont incapables de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE), elles procurent un soulagement temporaire des symptômes mais elles sont aussi accompagnées d’effets secondaires graves. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au SNC est l'utilisation de peptides pénétrant les neurones mais capables de passer la BHE. Parmi les cibles potentielles, le gène LRRK2 appelé « Dardarine », du mot basque dardara signifiant « tremblement », a été identifié. Ce gène interagit avec une protéine (PP1), cette interaction entraine des mutations du gène LRRK2 identifiées dans la MP. Des peptides interférents (IP) ciblant l'interaction PP1/LRRK2ont été développés dans le cadre de ce projet ANR afin de disposer de nouveaux outils pour aider à comprendre cette interaction et sa signification biologique dans la MP. Ces molécules sont économiques, chimiquement polyvalentes et non immunogènes. Récemment, plusieurs peptides pour la délivrance cérébrale ont été décrits. Parmi les peptides synthétisés, six peptides ont été sélectionnés et associés à trois navettes pour générer des peptides bifonctionnels capables de traverser la BHE et de bloquer l'interaction PP1/LRRK2 dans les neurones du cerveau. Nos objectifs sont de suivre la distribution et la localisation des six peptides marqués avec le fluorochrome Cyanine 7 chez la souris et valider leur capacité à passer la BHE. A l'issue de cette évaluation, le meilleur peptide sera sélectionné et une étude de dose sera réalisée.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé publique. Il existe aujourd'hui des traitements symptomatiques mais ayant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace pour cette pathologie est donc une nécessité. Ce projet s’intègre dans une approche translationnelle pour permettre l’identification de peptides thérapeutiques pour traiter la MP, et prévenir l’apparition d’effets indésirables graves et fréquents. Ce projet permettra non seulement de confirmer que les peptides sont capables de traverser la BHE mais également, d’envisager leurs utilisations chez les patients atteints de la MP pour prévenir les troubles invalidants. Ces nouveaux traitements permettront d'avoir un bénéfice direct pour les patients et leurs entourages ainsi qu'un bénéfice pour la société en évitant des troubles comportementaux ayant d'importantes conséquences médico-sociaux-économiques.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vigiles. Les souris seront soumises à 2 pesées (réalisées sur animal vigile), chaque pesée durera moins de 30 secondes. Afin d'éviter du stress et de l'inconfort aux animaux, l'injection intraveineuse unique de peptide sera réalisée sous analgésie locale couplée à une anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure maximum 5 minutes). Les imageries de fluorescence, un total de 5 imageries de 5 minutes maximum par souris sur toute la durée de la procédure, seront réalisées sous anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, ce prélèvement dure maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress lié à la préhension des souris pourra être généré lors de la pesée des animaux, deux pesées de moins de 30 secondes seront réalisées. Du stress pourra également être généré au moment de la préhension de la souris pour l'analgésie oculaire (moins de 30 secondes) et lors de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes. Une seule injection intraveineuse rétro-orbitaires sur souris anesthésiée sera réalisée (moins de 30 secondes). Du stress pourra être généré lors des anesthésies gazeuses nécessaires pour réaliser les imageries sur les souris (5 imageries maximum/souris).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever les cerveaux qui seront imagés par fluorescence afin de confirmer que le(s) peptide(s) ont passé la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
L'objectif étant de confirmer que des peptides ont la capacité de passer la barrière hémato-encéphalique (BHE), ceci impose d'avoir recours à des animaux pour atteindre l'objectif. Par contre, des études de modélisation informatiques ont permis de désigner des peptides d'intérêt. Une vingtaine de peptides générés vont être évalués in vitro sur un modèle mimant la BHE par une monoculture de cellules endothéliales capillaires cérébrales avec un milieu conditionné par des astrocytes dans un transwell système. Six candidats potentiels seront été retenus et seront évalués dans ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, seuls 6 peptides couplés à un fluorophore seront évalués. Nous avons également fait le choix de n'utiliser qu'une seule posologie (5mg/kg) pour chaque peptide afin de sélectionner le meilleur candidat et ce, dans le respect du principe de réduction. Le choix de la posologie s'est basé sur des données d'imagerie antérieures utilisant des peptides pour le traitement d'autres pathologies. En conséquence, le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre de souris par groupe, 4 souris par peptide afin d’obtenir des résultats exploitables et valides. Nous comparerons les moyennes de fluorescence cérébrale des différents peptides (loi normale par un test de Bartlett puis analyses des moyennes par un test ANOVA).
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 4-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure qui a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors la préhension des animaux pour les pesées (durée de moins de 30 secondes par animal). Afin de limiter le stress et l'inconfort de l'animal, une analgésie oculaire sera mise en place par l'utilisation d'un collyre ophtalmique. Les souris seront ensuite endormies par anaesthésie gazeuse et les peptides seront injectés par voie intraveineuse (durée de moins de 30 secondes par animal). Les souris seront ensuite imagées à différents temps sous anesthésie gazeuse (5 imageries par animal d'une durée de 5 minutes chacune). Tout au long de la procédure, les souris seront suivies, le registre de soins complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour l’étude par imagerie. De ce fait, nous utiliserons des souris, de la souche Swiss non consanguines, qui sont couramment utilisées pour les études de pharmacologie et de distribution. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 7 semaines, adultes et matures sexuellement, dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors d'étude d'imagerie et de distribution de produits.
Etude d’un modèle de souris de maladie rare de syndrome de Kohlschütter-Tönz
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie rare humaine dont dix-neuf cas ont été décrits, elles reçoivent un produit pro-convulsivant qui déclenche des crises myocloniques, cloniques et toniques, dont la durée est mesurée. Elles meurent ensuite par exsanguination après perfusion intracardiaque, pour prélever le cerveau. Le porteur affirme qu'il est indispensable de disposer d'un modèle animal à l'échelle de l'"organisme entier", un système in vitro ne pouvant selon lui apporter le même niveau d'information.
Objectifs
Le syndrome de Kohlschütter-Tönz (ou Le syndrome amélo-cérébro-hypohidrotique) est une maladie dégénérative rare caractérisée par des atteintes neurologiques (épilepsie précoce, régression psychomotrice, autisme) et dentaire (une coloration jaune des dents due au défaut de l'émail). Quelques dix-neuf cas ont été rapportés jusqu'alors. Cette pathologie est due à une mutation d'un gène dont on a que très peu d'informations sur son rôle. Pour comprendre comment cette mutation génétique est responsable de la pathologie, nous avons généré une souris mutante de ce gène, dans le but est de comprendre à la fois la physiologie et la pathophysiologie et le rôle de la mutation dans la maladie. L’exploration par scanner, et la microscopie électronique montrent un émail dentaire hypominéralisé sans contenu calcique chez les souris mutantes. L'objectif de notre projet est l’étude de l’atteinte neurologique sur notre modèle de souris mutantes, et plus précisément de voir si les souris développent une épilepsie précoce de manière similaire aux patients. Pour cela, nous réaliserons un test de susceptibilité à l’épilepsie sur des souris adultes jeunes.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude de la susceptibilité à l’épilepsie dans le cadre d'une maladie rare (syndrome de Kohlschütter-Tönz). Nous souhaiterions comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur les crises épileptiques. À l'avenir, ce modèle pourrait être essentiel pour tester la pertinence thérapeutique des cibles moléculaires identifiées pour le traitement des patients.
Procédures
Injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute
Impact sur les animaux
Suite à l’injection du produit, des crises myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés), et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur) surviennent, la durée et la latence sont enregistrées.
Devenir
Les 24 animaux meurent par exsanguination, suite à une perfusion de PBS par voie intracardiaque, afin de pouvoir prélever les cerveaux en vue des analyses post-mortem
Remplacement
Cette étude a pour but l'étude de la susceptibilité à l’épilepsie dans le cadre d'une maladie rare syndrome de Kohlschütter-Tönz. Nous souhaiterions comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur les crises épileptiques. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible, et en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un total de 24 souris est nécessaire pour notre étude. L’analyse statistique de la latence d’apparition des crises tonico-cloniques ainsi que leur durée sera réalisée en utilisant le test t de Student ou le test de Mann-Whitney en fonction de la normalité des données. Le facteur de comparaison sera le génotype (comparaison des mutants Vs contrôles). Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons les 2 sexes en veillant à avoir la même proportion entre les mutants et les contrôles, ce qui éviterait de dédoubler les effectifs
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. La mutation provoquant des malformations dentaires, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition des animaux. Si l’état de santé d’un animal est dégradé, le personnel formé et compétent décidera de ne pas réaliser le test et de soigner ou mettre à mort l’animal. Chaque animal sera ainsi suivi avant l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation et son euthanasie.
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour l'études des modifications des gènes à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique. Notre objectif est d'étudier l’importance de la mutation du gène ROGDI dans l’atteinte neurologique et plus précisément sur le développement des crises d'épilepsie. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ne peut mimer ou refléter toute la complexité des phénomènes neurologiques comme les crises d'épilepsie. Le test sera réalisé sur des animaux jeunes adultes (8 semaines d'âge), afin d'être dans des conditions d'age similaire à la clinique humaine (apparition des symptomes dans l'enfance / adolescence)
Caractérisation et sélection de composés ciblant un nouveau mécanisme d’action biologique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil, c'est-à-dire une mise à mort sous anesthésie sans reprise de conscience. Auparavant vigiles, elles subissent des contentions, des injections et une administration orale de composés, puis sont endormies et tuées pour prélever sang et organes, afin de caractériser la pharmacocinétique et la biodistribution d'inhibiteurs enzymatiques. Le porteur affirme avoir mené de nombreux tests in vitro et sur embryon de poisson zèbre en amont pour limiter le recours aux souris. Il conclut que l'expérimentation animale est "obligatoirement requise" par les agences réglementaires avant tout essai clinique, sans autre alternative.
Objectifs
Le projet consiste à caractériser les propriétés de pharmacocinétique, de pharmacodynamique et de biodistribution de composés inhibiteurs d'une famille d'enzyme par voie systémique et orale. Au final, le but sera d'identifier et d'isoler les meilleurs composés. Les résultats constitueront un ensemble de données qui alimenteront le dossier préclinique réglementaire en vue d'obtenir les autorisations pour réaliser les essais cliniques chez l’Humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont multiples et d’une très grande valeur pour le développement pharmaceutique envisagé. Cibler le mode d’action de l’enzyme d’intérêt n’a jamais été réalisé dans le panorama scientifique et pharmaceutique. A terme ces composés pourront servir à réaliser des essais cliniques humains dans des indications médicales comme certaines neuropathies, pour espérer apporter de nouveaux traitements dans des maladies présentant de forts besoins médicaux insatisfaits. Ainsi, les résultats du projet alimenteront la base de connaissances scientifiques et renseigneront sur les effets pharmacologiques et potentiellement toxiques de la voie de signalisation ciblée. L’ensemble des travaux proposés alimenteront le dossier à soumettre aux agences réglementaires en vue d’obtenir les autorisations d’essais cliniques. Ce projet permettra également de développer les compétences des équipes sur la recherche pharmaceutique qui pourront largement être mises à profit pour de futurs projets et pour la diffusion des connaissances.
Procédures
Les souris vigiles recevront des manipulations de "classe légère", comme des contentions (30 à 45 secondes, 3 à 4 fois maximum, sur une période de 24 heures) et des procédures équivalentes à une piqûre (15-30 secondes, un maximum de 3, sur une période de 24 heures). Pour les administrations en voie orale (une seule fois par animal), la contention et l'administration dureront au maximum 1minute par animal. Pour les manipulations classées sans réveil, les animaux recevront un analgésique, puis seront endormis par anesthésie générale (20 à 25 minutes, une seule et unique fois pour un animal). Nous veillerons à l’application des gestes corrects par le personnel qualifié pour limiter le stress des animaux et assister pendant toute la procédure à l'observation des animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Un de nos composés administré par voie systémique à des souris à des doses 4 fois supérieures à la dose efficace n’a présenté aucune toxicité apparente, ni à l’échelle macroscopique ni sur des paramètres anatomopathologiques. Ce résultat préliminaire important présage de l’absence ou du peu d'effets indésirables. De plus, nous savons que les données de la littérature entrevoient un profil de toxicité favorable pour nos inhibiteurs. Les animaux seront manipulés avec ou sans contention et seront soumis à des prélèvements de petits volumes sanguins, suffisants pour réaliser les analyses, mais n’entraînant pas de perturbations physiologiques. Ces manipulations représentent des douleurs de l’ordre d’une piqûre. Pour l'ensemble du projet, nous avons établi un score de suivi des animaux basé sur l'apparence physique, des signes cliniques et comportementaux pour contrôler nos procédures et limiter toute souffrance animale. Notamment, nous répertorierons toute anomalie liée au comportement (la tonicité et la réactivité), la posture (s’il y a isolement), l’alimentation, la température corporelle, les excrétions ; Et rapporterons le cas échéant, tout effet délétère au responsable du bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des mesures à prendre. En cas d'effet indésirable avéré, aucun animal ne sera laissé sans traitement palliatif, et si non applicable, sera immédiatement sorti du protocole.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’échantillons et d’organes afin de les analyser. Ces échantillons uniques et précieux permettront de réaliser les analyses microscopiques pour déterminer les effets de l’action des composés inhibiteurs et déterminer quels organes reçoivent ou non la molécule, ce qui permettra de réaliser la caractérisation à visée pharmacologique et réglementaire. L’euthanasie sera réalisée conformément aux méthodes recommandées par la réglementation et les comités d'éthique et de bien-être animal. Nous veillerons au contrôle des méthodes utilisées par le personnel formé et qualifié pour éviter toute souffrance animale.
Remplacement
Pour caractériser le devenir de nos composés inhibiteurs dans un organisme, le recours à l’expérimentation animale est obligatoirement requis par les agences réglementaires avant le passage à l’expérimentation clinique humaine. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris vivantes, sans aucune autre alternative. Toutefois, avant de proposer de tester nos composés inhibiteurs chez la souris, nous avons réalisé une multitude de tests in vitro, in cellulo et ex vivo pour traquer de potentiels effets toxiques et/ou indésirables. Jusqu’alors, nous avons analysé et confirmé que nos inhibiteurs n’engendrent aucun effet sur la prolifération et la survie cellulaire, le métabolisme énergétique, le métabolisme du calcium intracellulaire cardiaque. Nous avons également évalué la toxicité sur le développement de l’embryon de poisson zèbre par balnéation sans relever d’effet toxique notable. Avant de rédiger ce projet, nous avons veillé à mettre au point des méthodes robustes de détection et d’analyse sur des modèles non animaux. En somme, toutes ces préparations en amont permettent de drastiquement limiter les mises au point sur des échantillons issus de l’expérimentation animale.
Réduction
Nous avons déjà vérifié qu’un de nos composés ne provoque aucun dommage sur des neurones primaires de rétine jusqu’à dix fois la dose efficace. De plus, nous avons réalisé des expérimentations sur des lots très restreints d'animaux pour évaluer les potentiels effets délétères de nos composés sur le système nerveux ou plus généralement dans la circulation générale et n’avons relevé aucun effet dommageable. Le déroulé de ce projet, construit sur une séquentialité, permettra de bien choisir les doses minimales et maximales à utiliser et de révéler les organes cibles où les molécules s’accumulent : ces données sont prédictives des effets indésirables à anticiper et permettront de réduire de façon significative le nombre d’animaux. Nous avons défini des filtres décisionnels de sélection permettant d'étudier les composés inhibiteurs sur un faible nombre d’animaux de manière incrémentale et ainsi de rapidement réduire le nombre de composés à analyser et le nombre d'animaux. Ensuite, nous avons prévu d’arrêter chacune des procédures dès lors que les objectifs seraient atteints (par exemple, retenir 5 composés formulés ou non). Ceci permettra de facto de réduire le nombre d’animaux. Des tests statistiques sont prévus pour établir des corrélations clés, évaluer systématiquement la robustesse des résultats obtenus et interroger leur significativité. Ces tests permettront de contrôler la variabilité expérimentale, ce qui limitera drastiquement le nombre de répétition. En somme, ces analyses permettront de cerner des tendances ou valider des résultats sans recourir à un grand nombre d’animaux.
Raffinement
A réception, les souris seront stabulées une semaine dans leur habitat d’hébergement avant toute manipulation. Aucun animal ne sera jamais délaissé en isolement. De manière générale, pour pallier au manque de recul de l’effet de nos composés, les animaux traités seront suivis rigoureusement et quotidiennement pour traquer l’émergence d’effets indésirables potentiels. La méthodologie choisie permettra de détecter l’atteinte des « points limites » les plus précoces. Nous prévoyons de rapporter tout effet délétère au responsable de bienêtre de la structure et au vétérinaire référent pour décider des orientations à suivre. Plus spécifiquement, notre stratégie de raffinement prévoit de rechercher l’émergence d’effets toxiques selon le suivi du comportement (agitation ou prostration), de l’apparence physique des animaux (clôture des yeux, aspect du pelage et du poil), et du suivi des signes cliniques (température corporelle, rythme respiratoire, poids corporel, état des fèces). De plus, nos travaux cadreront les fonctions rattachées aux organes à monitorer. Nous porterons alors une attention stricte aux fonctions biologiques liées à ces organes. Nous prévoyons qu’aucun animal présentant un signe de souffrance ne sera laissé sans traitement palliatif. Nous prévoyons une prise en charge des nuisances en apportant un complément à l’alimentation et à l’eau si nécessaire. Un animal recevant une injection sera désinfecté localement avec un antiseptique. Les manipulations plus invasives prévoient d’abord une analgésie, puis une anesthésie générale pour pallier à toute douleur potentielle.
Choix des espèces
La souris est un des modèles de petit animal de laboratoire utilisé pour étudier les caractéristiques pharmaceutiques in vivo pour des inhibiteurs de nature chimique. De plus, ce modèle est reconnu par les agences réglementaires de médicaments pour constituer les preuves pharmaceutiques et scientifiques en vue d'obtenir les autorisations d'essais cliniques. Puisque l’application de nos composés inhibiteurs est prévue pour des adultes, ce projet prévoit donc d’utiliser des souris mâles et femelles adultes, ce qui permet de réaliser l’étude alors que le contexte hormonal adulte est déclenché. Nous n'avons pas trouvé d'alternative de remplacement.
Imagerie de la neuromélanine dans un modèle rat de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Sous anesthésie, chaque rat reçoit dans le cerveau une injection de vecteurs viraux qui lui fait surproduire de la neuromélanine et développer peu à peu un syndrome parkinsonien. 56 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à cinq séances d'IRM de deux heures trente sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, et une observation de cinq minutes dans une cage propre en guise de test comportemental. Le porteur affirme que leur phénotype "n'est pas considéré comme dommageable dans la limite d'âge attendue", puis que le syndrome pourrait "mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats". Tous sont tués pour prélever leur cerveau et analyser les neurones de la substance noire.
Objectifs
La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.
Procédures
Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteurs viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 56 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 56 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min.
Impact sur les animaux
Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux AAV-hTyr. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats AAV-hTyr n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats AAV-hTyr, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de NM, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.
Réduction
Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. Au total un nombre de 56 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane et recevront une analgésie par dérivé d'opioïde (injection sous-cutanée par aiguille 25G) 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. Un gel oculaire sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux,une analgésie par dérivé d'opioïde (injection sous-cutanée par aiguille 25G) sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l'imageur par résonance magnétique 11,7T rongeurs. Un anesthésique local sera appliqué sous forme de gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique. Des points limite seront mis en place entraînant la mise à mort de l'animal (perte de poids supérieure à 10% lors du suivi hebdomadaire, hémorragie, accident d'anesthésie entraînant un arrêt respiratoire).
Choix des espèces
Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés dès leur arrivée à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin d’autisme et évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent un traitement dans l'eau de boisson puis passent une batterie de tests comportementaux mesurant locomotion, apprentissage, mémoire, anxiété, coordination et interactions sociales, avant prélèvement du cerveau, une partie subissant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur affirme que ces tests ne provoquent qu'un léger stress et utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle d'autisme. Il étudie un gène et un traitement par modulateurs endocannabinoïdes, retombées cliniques présentées au conditionnel, et affirme qu'il n'existe pas de modèle informatique des comportements complexes.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont doubles : Le premier objectif est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire et l'activation des circuits cérébraux. Nous analyserons l'activité des régions cérébrales suite à un test de reconnaissance d'objet et explorerons les populations neuronales impliquées chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Le deuxième objectif est d'évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris transgéniques modèles d'autisme. Nous étudierons leur capacité d'améliorer ou corriger les déficits comportementaux et au niveau des synapses observés chez les souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés. Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits cérébraux lors de l'apprentissage et la mémoire, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. Par ailleurs, l'évaluation d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris modèles d'autisme pourrait mener à terme à des essais cliniques chez les personnes atteintes.
Procédures
Certaines souris recevront un traitement chronique, administré par voie orale dans l'eau de boisson, pendant 1 mois. Après 7 jours de prétraitement, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle ; pendant les tests elles continueront à recevoir le traitement. Nous évaluerons l'activité locomotrice (1 jour), l'apprentissage et la mémoire (4 jours), l'anxiété (2 tests, chacun 1 jour), la coordination locomotrice (5 jours) et le comportement social (1 jour). La durée de l'ensemble des tests est de 3 semaines. A la fin des expériences, le cerveau sera prélevé post-mortem afin de réaliser des analyses pour comprendre le mécanisme d'action du traitement. Dans d'autres expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.
Impact sur les animaux
L'administration par voie orale des traitements n'engendre pas d'effets secondaires. Les expériences de comportement réalisées ne provoquent pas de gêne particulière sauf un léger stress dû à la manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau. L'injection intrapéritonéale d'un anesthésique avant la perfusion intracardiaque peut causer de la douleur.
Devenir
Tous les animaux traités avec des modulateurs du système endocannabinoïde seront euthanasiés à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau et le sang pour effectuer des analyses. Dans d'autres expériences, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur à la fin, afin de fixer le cerveau et effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et moteurs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation des gènes d'intérêt dans le cerveau et développer de nouvelles approches thérapeutiques. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1148 souris. Ce nombre des souris s'explique par la nécessité d'étudier des souris génétiquement modifiées et de souris normales de deux sexes traitées avec différents composés administrés à plusieurs doses. Les groupes d’animaux nécessaires afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans les expériences de comportement doivent se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux à utiliser dans les expériences d'administration chronique des traitements, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle. De plus, à la fin des expériences de comportement, nous récupérons le cerveau des souris, afin d'étudier l'effet du traitement et doser le taux des substances administrées. Enfin, lors des études explorant les effets des nouveaux traitements, nous effectuons toujours une étude pilote de taille réduite, afin de déterminer la nécessité de réaliser des études dose-réponse utilisant un grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de gêne possible. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance est exclue du protocole. Les souris sont hébergées à raison de 2 à 5 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant les expériences, les souris sont manipulées quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 24-72 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales. A la fin de certaines expériences nécessitant de prélever le cerveau avec fixation pour des analyses histologiques, les souris sont anesthésiées avant d'être perfusées, leur évitant toute détresse.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Impact d’un traitement chronique avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont la moitié vigiles au moment de la mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une chirurgie pour implanter une pompe délivrant le traitement, des tests comportementaux, puis sont tuées pour analyser le cerveau. Les souris perdant plus de 15 % de leur poids ou montrant prostration ou agressivité sont mises à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs validés" et que l'euthanasie est "incontournable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer sous sa forme sporadique est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et le stress. Cependant, le rôle du stress dans cette maladie est très mal connu. Il nous a donc semblé important de caractériser de façon précise l’implication des hormones du stress (les glucocorticoïdes) dans la maladie d'Alzheimer et d’évaluer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes, grâce à l’utilisation de nouveaux modulateurs sélectifs de leurs récepteurs (sGRm), dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer, la souris transgénique J20. Ce projet comprend 2 objectifs principaux: Déterminer l’impact d’un traitement chronique (4 semaines) avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur l’évolution de la pathologie Alzheimer chez des souris J20 ; et d’évaluer l'efficacité de ce traitement chronique à long terme.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d'Alzheimer restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et l’hypersécrétion précoce des hormones du stress ou glucocorticoïdes. Cependant, le rôle de ces hormones, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer reste très méconnu. L’objectif de cette étude sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules très sélectives modulant l’activité des récepteurs aux glucocorticoïdes. Si l’efficacité de ces modulateurs sélectifs est démontrée, une étude clinique chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourra être envisagée très rapidement, dans la mesure où les tests de toxicité chez l’homme ont été validés sur cette famille de composés et que l’une de ces molécules est déjà en clinique (Phase II) dans le cadre d’une autre pathologie associée aux stress.
Procédures
L’ensemble des animaux (160 animaux) seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place de la pompe osmotique (durée 5 minutes sous anesthésie gazeuse), à des tests comportementaux et enfin seront mis à mort pour l’analyse des tissus cérébraux. Mise à mort sur animaux anesthésiés (80 animaux) ou vigiles (80 animaux). Les animaux seront suivis entre 4 (80 animaux) et 8 semaines (80 animaux).
Impact sur les animaux
L’incision nécessaire à l’introduction de la pompe osmotique délivrant le traitement peut entrainer un inconfort temporaire (dans les 24h suivant la chirurgie), et induire un grattage plus important au niveau de la cicatrice. Afin d'éviter au maximum cet effet lié à la cicatrisation, l’incision est réalisée au niveau de la nuque de l’animal, une zone moins accessible au grattage.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront le comportement général de l’animal, ainsi que leur apparence. Toute observation anormale (comportement, poids, pelage, plaie,…) sera transmise à l’expérimentateur afin d’être traitée dans les plus brefs délais et sera noté dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle de la maladie d’Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Nous allons réaliser le traitement chronique sur le modèle souris Alzheimer entre 6 et 9 mois. C’est-à-dire à un âge où ces souris présentent des déficits comportementaux, et une augmentation des différents marqueurs biochimiques associés à la physiopathologie Alzheimer, mais aussi une hyperactivité de l’axe du stress (augmentation des taux sanguins en glucocorticoïdes).
Effets cognitifs d’un traitement par un antagoniste des récepteurs 5-HT6 (SB-271046) dans un modèle murin de schizophrénie combinant un facteur génétique et un facteur environnemental
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès le neuvième jour de vie, les souriceaux sont séparés de leur mère pendant 24 heures, en hypoglycémie et hypothermie, puis soumis à une batterie de tests comportementaux nommés, labyrinthe en Y, labyrinthe en croix surélevé, test de sursaut et préférence au sucrose, avec une restriction alimentaire maintenant leur poids à 85-90 %. Ce modèle dit "2-hit" combine une mutation génétique et ce stress précoce pour imiter la schizophrénie, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur revendique une "nécessité majeure" de nouveaux traitements et affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal vivant.
Objectifs
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique qui touche environ 1% de la population. Les traitements pharmacologiques actuels sont efficaces sur une partie des symptômes (les délires et les hallucinations) mais d’autres symptômes (perte de motivation, anhédonie, déficits mnésiques, troubles de la perception et de l’attention) ne répondent pas aux traitements. D’autre part, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. Il y a donc une nécessité majeure d’en développer de nouveaux, particulièrement pour viser la sphère cognitive, ce qui ne pourra se faire que par l’amélioration de la validité des modèles animaux dans les études précliniques. Ainsi, ce projet se positionne dans le développement d’un nouveau modèle de schizophrénie pour tester par la suite, une molécule potentiellement intéressante pour traiter les symptômes qui ne sont pas encore pris en charge. Le modèle, appelé « 2-hit », combine deux facteurs connus pour être impliqués dans l’étiologie de la schizophrénie : un facteur génétique, la délétion du gène de la sérine racémase, enzyme nécessaire à la production de l’acide aminé D-sérine, et un facteur environnemental qui est un stress précoce induit par une séparation maternelle de 24h au 9ème jour de vie post-natal. La combinaison de ces deux facteurs devrait permettre d’obtenir un modèle animal plus fidèle aux données épidémiologiques actuelles de la maladie humaine. Le projet se découpe donc en trois procédures : • La caractérisation comportementale du modèle 2-hit sur un lot d’animaux (n=125). • L’étude des effets d’un traitement chronique par un antagoniste des récepteurs sérotoninergiques de type 6 (5-HT6), le SB-271046, sur le comportement du modèle 2-hit (n=131). • L’intervention pour la mise à mort induite par perfusion intracardiaque a été rajouté à la fin de chaque procédure Une étude post-mortem sera ensuite effectuée pour comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans ces comportements (électrophysiologie et immunohistochimie).
Bénéfices attendus
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique qui touche environ 1% de la population. Les traitements pharmacologiques actuels sont efficaces sur une partie des symptômes (les délires et les hallucinations) mais d’autres symptômes (perte de motivation, anhédonie, déficits mnésiques, troubles de la perception et de l’attention) ne répondent pas aux traitements. D’autre part, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. Il y a donc une nécessité majeure d’en développer de nouveaux, particulièrement pour viser la sphère cognitive, ce qui ne pourra se faire que par l’amélioration de la validité des modèles animaux dans les études précliniques. Ainsi, les données obtenues chez l’animal permettront d’apporter de nouvelles connaissances scientifiques sur les effets pro-cognitifs d’un traitement pharmacologique (blocage des récepteurs 5HT6 par un antagoniste) et sur les effets secondaires indésirables de ces substances.
Procédures
Les différentes interventions auxquels les animaux seront soumis durant 3 mois sont : - Séparation maternelle : une seule fois à l’âge de 9 jours, durée : 24h - Identification sous anesthésie générale permettant de placer une puce RFID : une seule fois à l’âge de 30 jours, durée : 2 minutes - Tests comportementaux réalisés une seule fois : mémoire de travail en labyrinthe en Y (5 minutes), activité motrice à l'aide d'un actimètre (30 minutes), comportement de type anxieux dans un labyrinthe en croix surélevé (5 minutes), comportement social (5 minutes) - Restriction alimentaire et test d’apprentissage sur écrans tactiles durant 6 semaines (85-90% du poids). Durée de chaque phase de test d’apprentissage : 1h. - Test de l’inhibition du réflexe de sursaut deux fois, durée : 30 minutes. Avec un sans injection intra-péritonéale préalable selon le groupe (injection 30 minutes avant). - Test de préférence au sucrose, durée : 3 jours. - Mise à mort lors d’une perfusion-fixation. Les animaux de la procédure 2 recevront une injection intra-péritonéale quotidienne durant 15 jours avant le début des tests.
Impact sur les animaux
Lors de la séparation maternelle de 24h, les animaux sont en état d’hypoglycémie, d’hypothermie et de stress psychologique. Une augmentation de l’anxiété à l’âge adulte peut être observée, il s’agit d’un état attendu à la suite de cette manipulation. Une légère perte de poids transitoire peut être observée suite à la séparation. Cet état est attendu, c’est le but de la modélisation, mais toutes les mesures seront prises pour réduire au maximum ces formes d’inconfort et de souffrance. Afin qu’ils puissent maintenir au mieux leur température en restant groupés, les souriceaux restent dans le nid et c’est la mère qui est placée dans une cage attenante. La restriction alimentaire nécessaire pour le test de l’écran tactile sera contrôlée quotidiennement et sera stoppée et/ou réadaptée si nécessaire. Le calcul des 15% maximum de perte de poids sera basé sur le poids moyen des animaux témoins nourris ad libitum afin de prendre en compte l’évolution des besoins inhérents à la croissance « normale » des souris. La quantité de nourriture donnée chaque jour aux animaux dépendra également du poids moyen des animaux de la cage ce jour-là. Si une grande différence de poids apparaît entre les animaux d’une même cage alors les animaux ayant perdu le plus de poids seront alimentés séparément puis replacés avec leurs congénères. La restriction alimentaire sera effective seulement durant le test de -l’écran tactile et sera stoppée dès le test fini.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort dont une partie (160) seront réutilisés pour des études immunologiques.
Remplacement
S’agissant d’études comportementales faisant appel à des fonctions cérébrales très intégrées et à une pathologie psychiatrique très complexe, aucun modèle in vitro ne peut remplacer, à l’heure actuelle, l’utilisation des animaux vivants dans notre projet.
Réduction
Les animaux seront utilisés pour l’ensemble des tests comportementaux puis pour les études post-mortem permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. De plus, nous avons déterminé un nombre de 15 animaux minimum par groupe. En effet, un test de puissance proposé sur le site https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets# nous a permis d'aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire.
Raffinement
Les animaux seront quotidiennement surveillés, et régulièrement pesés. Ils seront manipulés par du personnel expérimenté. Une semaine avant le début des expériences, les animaux seront manipulés quotidiennement (handling). De plus, au moins 30 min avant le début de chaque test, les animaux seront placés dans la pièce d’expérimentation pour leur permettre de s’habituer à l’environnement.
Choix des espèces
A l’heure actuelle, il n’existe qu’une seule espèce animale, la souris de souche C57BL/6, dont le génome a été modifié pour porter la délétion du gène sérine racémase (souris SR-KO). Les animaux seront testés une fois devenus adulte entre le 3ème et le 5ème mois puisque que les déficits cognitifs apparaissent dès l’âge adulte. Ils seront cependant préparés en amont : accouplement des animaux (témoins et SRKO) puis séparation maternelle au 9ème jour de vie post-natale mimant ainsi un des facteurs de risque chez l’Homme, le stress post natal. Les études en électrophysiologie et immunohistochimie seront réalisées post-mortem.
Mesure de biomarqueurs d’imagerie cérébrale en IRM haut champ dans des modèles murins de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 10 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 30 un niveau modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie intracrânienne pour détériorer localement la myéline ou une induction d'encéphalomyélite provoquant une paralysie progressive des membres, avant des séances d'IRM sous anesthésie. Elles sont ensuite tuées à différents temps pour des analyses histologiques. Le porteur affirme que l'étude de la pathologie "ne peut actuellement pas être remplacée" par des systèmes in vitro et que l'animal vivant est "nécessaire" pour valider un biomarqueur avant la clinique.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d’évaluer et de mettre au point des mesures par imagerie de résonance magnétique, technique non invasive, à très haut champ magnétique (11,7T) pour le suivi des atteintes de la gaine protectrice des neurones (la myéline) telles celles que l’on observe chez les patients atteints de sclérose en plaques (maladie neurologique). Deux modèles de souris présentant des lésions dans la gaine de myéline seront utilisés: 1) le modèle LPC pour lequel la lésion est localisée 2) le modèle EAE pour lequel les lésions sont plus petites et réparties dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à établir de nouvelles méthodes de mesure par imagerie pour le suivi de la dynamique de la détérioration/reconstitution de la gaine de myéline –protectrice des neurones- chez les sujets atteints de sclérose en plaques au cours de la maladie. Ces phénomènes doivent être davantage explorée, à un moment où des thérapies innovantes pour aider à la reconstitution de la gaine de myéline doivent être évaluées cliniquement. De plus, la mise au point de biomarqueurs d’imagerie non invasive réalisée dans ce projet représente un bénéfice pour les futures études thérapeutiques sur le petit animal puisque l’imagerie permettra le suivi du même animal et donc de réduire le nombre d’animaux.
Procédures
Chirurgie intracranienne pour détériorer localement la gaine de myéline des neurones pour mimer la sclérose en plaque. Une seule chirurgie sur l'animale. Pas de prélèvement sur animal vigile.
Impact sur les animaux
La démyélinisation focale au LPC nécessite une chirurgie (injection stéréotaxique, durée < 1h)et n’engendre pas de signes cliniques persistents. Seule la cicatrisation post-chirugie est à surveiller et seuls les animaux ayant complètement récupéré et cicatrisé seront éligibles au suivi par IRM haut-champ, réalisé sous anesthésie générale (4 sessions de 2 h maximum réalisées sur 3 mois). Pour le modèle EAE, un altération de l’état général de l’animal est attendu avec un score clinique maximal généralement entre 15 et 25 jours après l’induction de l’EAE, suivi d’unerémission partielle. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère (injections i.v.) à moyenne (symptômes cliniques de l’EAE) et il existe une gradation des symptômes allant de la queue molle; au réflexe de redressement avec facultés affaiblies et parésie d'un membre à la paralysie des membres postérieurs et/ou antérieurs. La procédure complète est de classe de gravité moyenne. Il est nécessaire de préciser que la faiblesse ou la paralysie des membres n’entraîne pas de douleur en soi, mais plutôt une gêne pour l’animal dans ses déplacements, à l’instar de la pathologie humaine.
Devenir
Ils seront mis à mort à différents temps en vue de réaliser des mesures histologiques post-mortem.
Remplacement
À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables. Nous utiliserons des modèles de pathologies très bien décrits dans la littérature, ce qui permettra un suivi précis de la sévérité de la maladie. L’animal vivant est nécessaire pour valider un biomarqueur d’imagerie avant som implémentation en clinique, dans une démarche de recherche translationnelle
Réduction
Pour chacune des procédures expérimentales, le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et interprétables, en tenant compte de la variabilité biologiques des modèles animaux. Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet est de 40. Le suivi longitudinal effectué en imagerie permet d’obtenir jusqu’à 4 points de mesure par animal pour suivre les phases de démyénisation et remyélinisation sans mise à mort intermédiaire des groupes supplémentaires d’animaux.
Raffinement
Les points limites qui permettront d'arrêter le protocole sont les suivants: cicatrisation de la plaie crânienne, changement de poids corporel , apparence physique i.e. pelage, posture et comportement (vocalisations non sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile). L'arret des souffrances si elles sont constatées se fera par traitement antalgique ou par euthanasie des animaux concernés.
Choix des espèces
L’IRM haut champ ne peut accueillir que des petits animaux de type rongeur. Nous avons réalisé une première étude sur rat du fait d’un cerveau plus grand que la souris ce qui a facilité la mise en œuvre des techniques IRM avec des volumes à explorer plus gros. L’objectif étant d’étudier les pathologies cérébrales, les procédures de cette demande se feront chez la souris afin d’étudier notamment le modèle de sclérose en plaques EAE modèle pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes de la sclérose en plaques. Animaux adultes ayant un développement cérébral achevé (7-10 semaines).
Impact du microbiote intestinal dans les maladies neurodégénératives – MICROBIOTALZ
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
1 389 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur des souris modèles d'Alzheimer, le porteur décrit une déplétion du microbiote par antibiotiques ou laxatif pouvant provoquer des diarrhées, des prélèvements de sang et de selles, et un conditionnement par la peur reposant sur trois chocs électriques. Il indique que les souris donneuses de microbiote sont tuées d'emblée et que les receveuses le sont après les tests, pour analyse du cerveau. Le remplacement est écarté au motif que l'étude des déficits de mémoire ne peut se faire in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier le lien entre la dysbiose intestinale présente dans les souris 5xFAD, modèle transgénique de la maladie d'Alzheimer, et l'amplitude des déficits de mémoire de ces animaux. Nous souhaitons démontrer la causalité de la dysbiose intestinale sur les phénomènes mnésiques.
Bénéfices attendus
L'identification de souches causales et/ou protectrices de la pathologie constituera la base d'une prévention de la maladie d'Alzheimer basée sur la restauration d'un microbiote intestinal sain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang (2 min) et de selles (1 min) : les fèces et environ 150μL de sang seront prélevés en sous-mandibulaire au démarrage de l'experimentation et à la fin de l'étude 60 jours plus tard.
Impact sur les animaux
La déplétion du microbiote endogène des animaux par antibiotiques ou laxatif peut induire des diarhhées qui seront toutefois temporaires car la réintroduction d'un microbiote intestinal complet traite immédiatement ces symptomes. Lors de la procedure de conditionnement par la peur, les 3 chocs électriques administrés aux animaux vont générer une douleur transitoire. Lors de la réexposition des animaux à l'environnement où ils auront reçu les chocs, un stress sera mesurable si leurs performances de mémoire ne sont pas altérées.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux donneurs de microbiotes sont mis à mort et ne rentrent pas expérimentation. A l'issue des procédures 1 à 3, les animaux receveurs sont conservés jusqu'à la fin des traitements et des tests de comportement. A l'issue de la procédure 4 (dernier test expérimental), tous les animaux sont mis à mort pour analyse de la pathologie cérébrale.
Remplacement
L’étude des déficits de mémoire nécessite l’utilisation d’animaux, ceci ne pouvant se faire sur des modèles in vitro.
Réduction
Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 12 souris receveuses par groupe était suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. Taille minimale des groupes receveurs : le nombre d’individu varie entre 9 et 22 animaux en fonction du test comportemental. Nos expériences seront réalisées sur des groupes de 12 animaux/traitement et reproduites sur 2 à 3 lots d’animaux différents soit au total 24 à 48 animaux/groupe (logiciel G*power, erreur α de 5%, puissance (1-β err prob) de 80%). Plan d'analyses statistiques (logiciel Graphpad Prism7) -Vérification de normalité des données : test de D'Agostino-Pearson -Distribution Gaussienne => analyse de variance à un facteur (ANOVA) puis test de Dunnett pour correction des comparaisons multiples par rapport à la condition Véhicule -Distribution non Gaussienne => test de Kruskal-Wallis puis test correctif de Dunn's -Niveau de significativité à p=0,05. La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. •Stratégie de réduction La réalisation de plusieurs tests de mémoire durant le protocole permettra une optimisation de l'utilisation des animaux, évitant de multiplier les séries expérimentales. Le suivi longitudinal des performances mnésiques produira un recueil de données multiples pour un même animal. Le projet prévoit une multiplicité d'analyses post mortem sur un même animal.
Raffinement
•Suivi des animaux Inspection - 2 à 3 fois par semaine avec prise de poids 2 fois par semaine, avant chaque injection. Une grille d’évaluation de l’état général de chaque animal sera remplie (présentée en annexe 2) avec identification de points limites où une prise en charge adaptée sera effectuée. •Hébergement et raffinement - Hébergement en cage collective contenant de l'enrichissement environnemental (matériel pour la nidification). Les animaux seront tatoués afin de pouvoir les identifier dans la cage collective. •Procédure de conditionnement à la peur - Le plan expérimental a été optimisé en déterminant qu’un nombre réduit de 3 chocs d'une durée courte de 2 secondes est suffisant pour d’obtenir des résultats reproductibles et analysables statistiquement. L'intensité des chocs sera adaptée à la taille/poids de l'animal au moment de l'expérimentation.
Choix des espèces
Les souris C57Bl/6J, utilisées dans nos études, représentent des lignées classiques pour les études en neurobiologie, principalement pour l'étude de la mémoire. La lignée de souris transgénique 5xFAD (fond C57Bl/6J) est également une lignée très utilisée pour modéliser la maladie d'Alzheimer car elle récapitule l'ensemble de la neuropathologie à l'exception de la pathologie Tau. L'extrême rapidité d'apparition des symptômes fait de cette lignée transgénique le modèle le plus adapté pour étudier une modification de l'apparition des déficits de mémoire induite par des interventions sur la composition du microbiote intestinal. Les souris Swiss présentent une alternative aux souris C54BL/6J, étant également de très bons modèles d'étude des performances mnésiques. Les études seront réalisées sur des animaux adultes car les pathologies étudiées seront des pathologies se développant à l'âge adulte.
Evaluation des conséquences de la surexpression de CYP46A1 dans le métabolisme striatal et sanguin dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
146 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée transgénique qui reproduit la maladie de Huntington, elles présentent perte de poids, déficits moteurs et cognitifs et peuvent mourir spontanément vers trois mois, avant de recevoir une injection dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique puis d'être tuées pour prélèvement. Le porteur indique que la craniotomie peut provoquer douleur, saignement et inflammation. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la complexité du cerveau et présente la lignée comme bien caractérisée.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. Des nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but principal de cette étude est d’investiguer quelles sont les conséquences générales de la surexpression de ce gène et donc de la quantité d’enzyme sur la restauration des paramètres biologiques attendus des souris du modèle murin pour la MH. Pour répondre à cette question différents biomarqueurs présents dans les tissus et dans le sang seront analysés.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’identifier un marqueur métabolique dont le profil pourrait être modifié après l'injection d’un AAV exprimant le gène thérapeutique CYP46A1 chez un model murin de la maladie d’huntington. Ce métabolite pourra être utilisé comme marqueur d’efficacité de ce traitement dans le cadre du futur essai clinique.
Procédures
A partir de 6 semaines d’âge, les animaux transgéniques issus des couples reproducteurs développeront un phénotype dommageable. Les souris utilisées recapitulent les atteintes patholgiques de la maladie d'Huntington, c'est a dire qu'ils présentent une perte de poids, des defauts moteurs et cognitifs et décedent spontanément apres 3 mois de vie. A 4 semaines d’âge, les animaux seront soumis à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (Durée 70 minutes), avec prise en charge analgésique avant et apres la chirurgie. A 10 semaines d’age, les animaux seront mis à jeun pendant 6 heures puis euthanasié avec prise en charge préalable d’analgésique avant l’intervention (euthanasie). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir analyser les prélèvements de sang et de tissus.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées récapitulent les atteintes patholgiques de la maladie d'Huntington, la perte de poids, les défauts moteurs et cognitifs impactant la capacité de l'animal a s'alimenter et ils peuvent décédés spontanement apres 3 mois de vie. Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque d’inflammation relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé (5 à 7% ) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été evaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.
Devenir
Lors de la procédure n°1 qui correspond à l’élevage d’une lignée dommageable les animaux d’intérêt produits seront maintenus en vie et inclut dans la procédure n°2 qui est la procédure expérimentale à proprement parler. Pour la procédure n°2 et donc l’euthanasie des animaux, les animaux seront euthanasiés en fin procédure pour les prélèvements et leur analyse afin de pouvoir répondre à la question scientifique de ce projet.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les souris Huntington sont bien caractérisées. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (146) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests des analyses biochimiques post-mortem seront dans la mesure des possibles réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’information en utilisant un minimum d’animaux. Les distincts paramètres (biochimiques) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des revendications expérimentales. De plus, un plan statistique complet a été rédigé et validé.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6h après l’acte chirurgical, une injection d'analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une deuxième injection d'analgésique est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur et il sera vérifié qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d'analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire clinicien.
Choix des espèces
Le but principal de cette étude est d’investiguer quelles sont les conséquences générales, de la surexpression du CYP46A1 (le gène thérapeutique) et la restauration de la voie de synthèse du cholestérol dans la région cible du cerveau (striatum), sur le métabolisme cellulaire des souris du modèle murin pour la MH. Pour répondre à cette question différents biomarqueurs du métabolisme présents dans les tissus et dans le sang seront analysés. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4-8 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau. Ce protocole a déjà été validé dans notre laboratoire.
Evaluation physique et in vivo d’un nouveau modèle de scanner microTEP/CT chez le primate
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 macaques à longue queue vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent jusqu'à six anesthésies générales de deux à trois heures, avec pose de cathéter et injection de radiotraceurs, pour évaluer les performances d'un nouveau scanner d'imagerie médicale. Le porteur indique que les doses de radiotraceurs restent trop faibles pour un effet pharmacologique. Il affirme que le recours à un organisme vivant est essentiel pour tester la caméra sur un animal de taille moyenne.
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP), dénommée PET ou PET scan pour « positron emission tomography » en anglais, est une méthode d'imagerie médicale utilisée en médecine nucléaire qui permet de mesurer en trois dimensions une activité métabolique ou moléculaire d'un organe grâce aux émissions produites par les positons (positrons en anglais) issus d'un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Initialement dévelopée chez l’homme, cette technique est de plus en plus utilisée chez l’animal de laboratoire et permet d’étudier des mécanismes complexes in-vivo tout en étant très peu invasif pour le sujet. Cependant, le passage de l’homme à l’animal implique d’améliorer la sensibilité et la résolution de ces appareils dans le but d’obtenir une image la plus informative possible. A ce jour, de nombreux systèmes permettant l’imagerie de rongeurs à haute résolution existent. Cependant, les systèmes permettant l’imagerie de sujets intermédiaires (animaux de taille moyenne) sont très rares. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les performances physiques et la qualité d’image in-vivo,d’un nouveau modèle de caméra microTEP/CT sur deux primates et deux lapins. La campagne d’expérimentation donnant lieu à la demande APAFIS aura deux objectifs : - Des mesures physiques sur fantômes pour effectuer une évaluation des performances du scanner (résolution spatiale, sensibilité du système, etc...) selon les normes NEMA internationales des fabricants de scanners (étude hors du périmètre de l’expérimentation animale) - Des mesures in vivo avec l’acquisition d’images sur différents modèles animaux : le PNH et le lapin. Des traceurs radiopharmaceutiques produits au laboratoire seront utilisés pour avoir des images isotopiques fonctionnelles sur corps entier et/ou sur cerveau dans le but d’évaluer la qualité d’image de ce nouveau système.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu pour ce projet est d'obtenir des données contribuant à l'améliorer les performances (sensibilité et résolution) d'une méthode d'imagerie utilisant une nouvelle caméra microTEP/CT, utilisée dans le cadre d'évaluation par imagerie de sujets de tailles moyennes (a contrario, les systèmes d'imageries hautes résolutions sur petits sujets (rongeurs) et sur sujet humain existent et sont déjà bien développés. Cette validation permettra : - la réalisation de projets scientifiques futurs sur l’exploration du cerveau de primate à travers l’utilisation de nouveaux traceurs (biodistribution, pharmacocinétique, capacité à passer la barrière hémato-encéphalique) - d’imager des modèles de pathologies neurologiques (ischémie, Sclérose En Plaques...etc).
Procédures
Les animaux auront au maximum 6 anesthésies et 6 poses de cathéter veineux permettant de faire des examens d'imagerie. Chaque examen sera espacé d'un minimum de 15 jours. Les données TEP/CT seront acquises pendant 90 min, après injection du radiotraeur. La durée totale d’anesthésie est donc estimée à 2h30-3h.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les animaux subiront des anesthésie générale durant les acquisitions et l'injection du radiotraceur en intra veineux. Les animaux seront monitorés tout au long de l'anesthésie (SpO2 et rythme cardiaque) et leur température sera maintenue à l'aide d'un tapis chauffant. Pour les acquisitions, il est nécessaire d'administrer des radiotraceurs (à dose dites "traceuses", impliquant que les quantiés administrées sont suffisement faibles pour ne pas entrainer d'effet pharmacologique chez les sujets) et sont tous autorisés pour des administrations chez l'homme.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie après examen et accord vétérinaires. La décision de réutiliser les animaux dépendra du vétérinaire de l’installation et en consultation avec la SBEA.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer une caméra microTEP/CT dédiée à l’animal moyen (< 6kg) et en particulier au primate. Le recours à un organisme vivant est donc essentiel. Nous avons donc choisi le macaque fascicularis comme espèce pour l’imagerie.
Réduction
Dans ce contexte de validation instrumentale, il est préconisé d’avoir un nombre large de radiopharmaceutiques, au détriment du nombre d’acquisition par molécules radioactives. Nous prévoyons donc un maximum de 6 radiotraceurs différents administré sur un même animal. Chaque animal subira un maximum d'une acquisition par quinzaine. Cette stratégie nous permet d'atteindre notre objectif en incluant un total de deux macaques fascicularis dans ce projet, ce qui est un minimum pour tester un panel de radiotraceurs sur la période de disponibilité de la caméra.
Raffinement
Les primates seront hébergés par groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager et dans des volières conformes aux recommandations et bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal, avec rotation du matériel pour renouveler l’intérêt des animaux. Des friandises seront distribuées quotidiennement aux animaux. Le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. L’imagerie TEP/CT sera effectuée de manière consécutive, au cours d’une même anesthésie. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant la durée de la procédure afin de détecter tout signe clinique anormal (douleur, détresse ou stress). Les manipulations et le suivi des animaux seront réalisés exclusivement par du personnel formé et compétent.
Choix des espèces
La caméra a été développée pour imager le cerveau et/ou le corps entier de singe. La géométrie de la détection (couronnes de détecteurs TEP) est adaptée aux dimensions du corps et au cerveau du singe ayant un poids maximum de 6 kg. C’est un modèle de microTEP/CT intermédiaire entre un microTEP/CT « rongeurs » et un scanner TEP/CT clinique. Le singe cynomolgus est choisi pour sa la taille et pour la structure de son encéphale qui se rapproche de l’homme. De jeunes primates adultes seront utilisés (36 à 48 mois environ), stade de développement choisi car le poids des animaux est compatible avec la taille de la machine. De plus, certaines acquisitions concernent le cerveau et il est préférable de les réaliser sur un cerveau adulte pour pouvoir évaluer le système le mieux possible. L’aspect translationnel est un point important pour l’utilisation de traceurs TEP.