Troubles nerveux

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.

Procédures

Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.

Réduction

La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.

Choix des espèces

La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'une neurotoxine, le MPTP, destinée à provoquer des symptômes parkinsoniens modérés comme une perte de mobilité et une posture prostrée, puis une illumination proche infrarouge, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur revendique la recherche d'un traitement curatif comme une nécessité tout en renvoyant les résultats de l'essai clinique en cours à quatre ou cinq ans. Il justifie le recours à la souris par le fait que le modèle MPTP est un modèle de référence déjà utilisé dans son laboratoire.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui touche de plus en plus de personnes. Cette maladie se traduit par des tremblements, des difficultés à se mouvoir, des troubles cognitifs et moteurs, des sautes d’humeur ainsi que des troubles de la personnalité. Elle prend naissance à cause d’un dysfonctionnement progressif des ganglions de la base situés dans le cerveau. Les traitements les plus utilisés actuellement pour limiter les symptômes sont une administration de L-Dopa, qui est un substitut de dopamine (neurotransmetteur impliqué dans la maladie), ou encore un implant cérébral (Stimulation Cérébrale Profonde). Ces 2 traitements sont pour le moment symptomatiques et ont une durée d’efficacité limitée dans le temps. Il n’y a aucun traitement curatif permettant à l’heure actuelle de guérir cette maladie. Lors des 10 dernières années, des équipes ont étudié les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est une technique d’illumination de tissus ou d’organes par un rayon proche infra-rouge, sur le cerveau dans un contexte préclinique mettant en place des modèles animaux parkinsoniens. Les résultats sont très encourageants avec des réductions de symptômes observés sur les différentes études menées. Une étude clinique est en cours chez des patients parkinsoniens pour évaluer le potentiel thérapeutique de la PBM pour ralentir l’avancée de la maladie. Ce projet consiste à mieux comprendre les effets de la PBM, sur des souris parkinsoniennes (induits par administration d’une neurotoxine, le MPTP). L’objectif de l’étude est d’évaluer si la PBM permet de préserver la fonctionnalité des neurones impliqués dans le processus de la maladie de Parkinson. En effet, nous ne savons toujours pas si la PBM garde la fonctionnalité de ces neurones intacte. Des neurones peuvent en effet rester en vie mais ne plus fonctionner; les symptômes restent donc présents. A l’inverse, si les neurones préservés conservent ou retrouvent même partiellement une fonctionnalité, traduite par une production de dopamine les symptômes de la maladie diminuent. Pour évaluer les effets de la PBM sur la dégénérescence fonctionnelle des neurones, il est nécessaire d’étudier si les cellules préservées par la PBM sont encore fonctionnelles ou si elles perdent tout de même leur activité. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en œuvre, et donc d’adapter et d’interpréter au mieux les résultats cliniques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative et un problème de santé public. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques possédant une efficacité limitée dans le temps. La recherche d’un traitement curatif efficace de cette pathologie est donc une nécessité. Des études préalables ont déjà permis d’identifier la photobiomodulation (PBM) comme une alternative thérapeutique permettant de préserver la survie des neurones dopaminergiques dont la dégénérescence est responsable des symptômes de la maladie. Un essai clinique est en cours et les résultats ne seront connus que d’ici 4 à 5 ans. Néanmoins, son interprétation sur l’évaluation de la maladie et les symptômes associés nécessitera d’avoir des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM, et notamment de savoir si la lumière permet, en plus de la survie des neurones, de préserver leur fonctionnalité. En effet, des neurones vivants mais non fonctionnels ne produisent plus de dopamine ; si la PBM permet de restaurer (même partiellement) la fonctionnalité des neurones, on peut espérer réduire certains symptômes (recul de la pathologie). Le modèle MPTP choisi induit des symptômes modérés, permettant aux animaux de rester autonomes (mais ralentis) le temps du protocole. Ce modèle est représentatif de patients dans les premières années après le diagnostic quand il reste encore 30 à 50% des neurones dopaminergiques à préserver et/ou rendre à nouveau fonctionnels. Si les résultats démontrent que la PBM restaure une partie de la fonctionnalité des neurones, cela ouvrira la porte au traitement de patients plus avancés dans la maladie, auxquels on peut espérer redonner de la mobilité en réduisant les symptômes, et en rendant à nouveau fonctionnels la petite proportion de neurones encore présents. Enfin, cette étude ouvrira des pistes d’applications pour d’autres pathologies neurodégénératives, ou de défaut de fonctionnalité des neurones.

Procédures

Un groupe d’animaux tests de 12 individus maximum sera mis en place au début de l’étude, afin que l’expérimentateur puisse se former aux gestes nécessaires qu’il aura à effectuer lors de la réalisation de ce projet. Ces animaux seront, dans la mesure du possible, des animaux issus de procédures expérimentales précédentes afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la procédure expérimentale. Pour pouvoir être inclus dans cette nouvelle procédure, ces animaux ne devront pas avoir subi de procédures autres que légères. Une fois la procédure réellement commencée, les animaux ne seront pas manipulés avant d’avoir observé une période d’acclimatation à l’expérimentateur ainsi que d’adaptation à l’environnement (habitat et salles dans lesquelles se dérouleront les procédures). Lors de la procédure, les animaux seront soumis à 2 prises de sang sous anesthésie générale gazeuse (le sang sera prélevé dans les deux cas par la veine de la queue), comprenant des prélèvements de 0,15ml maximum, à T=0 avant les premières injections et à J=6 avant la mise à mort. Les animaux seront également soumis à 2 injections (MPTP ou sérum physiologique, d’un volume permettant de rester en dessous du seuil limite de volume d’injection chez la souris, à savoir, 100µl/10g de poids corporel et permettant d’atteindre 25 mg/kg) par voie intrapéritonéale, à T=0 et T=24h. Les volumes d’injections seront calculés pour chaque animal après la pesée de ce dernier. Pour l’illumination, les animaux seront juste maintenus par contention sous le dispositif d’illumination pendant 90 secondes (dispositif allumé ou éteint), cette intervention arrivera 4 fois, à T=0, 6, 24, et 30 h. Pour la ponction du liquide céphalorachidien, les animaux seront sous anesthésie générale et ne seront pas réveillés.

Impact sur les animaux

Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris va amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux. Lors des prélèvements sanguins, l'anesthésie gazeuse est brève (quelques minutes), les animaux seront sur une plaque chauffante durant l'anesthésie et la phase de réveil, nous ne nous attendons donc pas à des effets indésirables particuliers sur les animaux. Pour éviter tout stress lors du test de comportement une phase d'habituation va être réalisée et le test Open Field n'est pas un test contraignant pour les animaux.

Devenir

Les animaux sont obligatoirement mis à mort dans cette procédure, afin de pouvoir prélever les pièces anatomiques qui permettront par la suite d’effectuer les dosages de neurotransmetteurs, de métabolites d’intérêt, et les tissus nécessaires aux coupes histologiques. La mise à mort permet donc de pouvoir prélever les cerveaux des animaux, qui sont essentiels pour pouvoir évaluer la neuroprotection, ainsi que les fonctionnalités préservées ou non par photobiomodulation des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie de Parkinson.

Remplacement

Les animaux seront traités avec une neurotoxine, le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Cette procédure a pour but d’induire des symptômes parkinsoniens modérés aux animaux afin de pouvoir observer les effets de la photobiomodulation (PBM), qui est ici le traitement, sur la protection des fonctionnalités des neurones dopaminergiques impliqués dans la maladie. La dose injectée de MPTP aux souris vont amener des symptômes parkinsoniens modérés. Les effets indésirables attendus sont donc une perte de mobilité partielle, des troubles de la locomotion et une inactivité relative illustrée par une posture plus facilement prostrée. Le protocole expérimental est rédigé pour durer 6 jours. Ces effets seront observés dans un intervalle allant de quelques heures après la première injection de neurotoxine à T=0 jusqu’à la mise à mort à J=6, soit des effets d’une durée comprise entre 5 et 6 jours. A noter qu’il est recensé dans la littérature que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (baisse de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur certaines souches de souris, mais aucune de ce genre n’est recensée sur la souche de souris utilisée ici, que ce soit dans l’état de l’art ou les travaux sur ce même sujet effectués précédemment. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Si des observations sont portées sur ces changements éventuels de températures, ils seront retranscrits dans les résultats de l’étude afin d’apporter de nouvelles informations sur ce point dans l’état de l’art du modèle murin MPTP, ce qui permettra pour des procédures futures sur cette souche de souris de prendre ces éléments en compte et donc de prendre des dispositions particulières pour améliorer le bien-être des animaux.

Réduction

La procédure se déroulera sur un rythme de 12 animaux par semaine (répartis aléatoirement selon les groupes). Pour le traitement des résultats, les données seront confrontées par les tests statistiques appropriés. Au préalable, l’étude de mise au point sera arrêtée dès que les gestes nécessaires à la bonne réalisation des procédures seront acquis ; les dosages seront mis au point sur ces pièces anatomiques. Si des animaux ont été réalisés dans des conditions qui les rendent incluables dans le groupe correspondant (Contrôle + photobiomodulation), cela permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre les 12 animaux par groupes prévus initialement. Le groupe n=12 est donc déterminé en fonction de 2 choses : 1) Avoir assez d’individus au sein de chaque groupe pour pouvoir effectuer les tests mentionnés plus haut dans cet encadré de manière correcte, avec une vraie puissance statistique robuste. Ce nombre est déterminé grâce à l’état de l’art et l’expertise de l’équipe. 2) Au sein des individus, il y a n=2 souris qui sont déclarées dans cette demande d’autorisation de projet pour pallier à d’éventuels soucis d’analyses sur certains animaux au cours de la procédure expérimentale. En effet, il est admis qu’en expérimentation préclinique, la variabilité interindividuelle entre les individus inclus dans l’étude peut parfois amener des situations de non réponse à l’induction de la maladie ou une non réponse au traitement testé. De plus, des conditions d’hébergement et de manipulation identiques peuvent amener de temps en temps un stress ou une réponse de la part des animaux totalement différente ; pouvant entraîner une impossibilité d’inclusion de l’individu en question dans les données traitées. Sans cette marge de n=2 individus, le nombre d’animaux pris en compte dans les résultats peut engendrer un sous-effectif au sein de certains groupes ce qui rendrait caduque les analyses statistiques des résultats, rendant ainsi les données et résultats obtenus inexploitables. Afin de se prémunir de ce scénario, même rare, il est déclaré ici n=12 pour chaque groupe, en accord avec la règle de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Une fois les souris réceptionnées, elles seront transférées dans leurs cages propres, avec un temps d’acclimatation de minimum 7 jours avant le début des protocoles. Les zootechniciens veilleront à leur bien-être au quotidien, à leur adaptation à leur nouvel environnement ainsi qu’à la nourriture et la boisson. Un enrichissement de leur milieu de vie sera mis en place pour assurer le bien-être des souris (tunnels en carton, « nids » en coton etc). Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, ces derniers seront parfaitement habitués aux manipulations et bénéficieront d’une surveillance quotidienne. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination. Par expérience, le protocole envisagé pour rendre les animaux MPTP ne génère pas de douleur et les symptômes moteurs induits permettent à l’animal de rester autonome. Il est recensé que le modèle MPTP peut induire une hyperthermie (augmentation de la température corporelle) fugace suivie d’une hypothermie (diminution de la température corporelle) de quelques heures. Ces observations sont recensées sur seulement certaines souches de souris. Aucune observation de ce genre n’est recensée sur la souche utilisée ici. Néanmoins, un suivi de la température corporelle des animaux sera mis en place dans les 24 heures suivant les 2 injections de MPTP, et la température de la pièce d’hébergement sera adapté aux éventuelles variations de température corporelle des souris. Le seul prélèvement effectué sur les animaux impliquant un réveil est une prise de sang à T=0. Elle sera effectuée par veine de la queue selon la méthode préconisée par les instances du bien être animale. Les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse. Les autres prélèvements se font sous anesthésie sans réveil via injection d’anesthésiques appropriés. Le vétérinaire en charge des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle ; une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la SBEA et le vétérinaire si besoin, le tout en accord avec les observations des points limites établis (perte de poids, toilettage, singes de souffrance…)Une intervention appropriée sera prise en compte par le personnel responsable selon la situation.

Choix des espèces

Afin de standardiser nos études nous utiliserons des souris traitées au MPTP, comme dans les publications passées en revue sur ce même sujet d’étude. En effet, ce modèle fait partie des modèles de référence afin de mener des études précliniques sur la maladie de Parkinson. En plus d’être bien référencé dans la littérature, ce modèle détude est déjà utilisé lors des précédentes études sur les effets de la photobiomodulation sur la neurodégénérescence des cellules dopaminergiques de la substance noire compacta. Enfin, le modèle murin est bien connu et maitrisé au sein des laboratoires. Le mécanisme d’action de la photobiomodulation (PBM) semblant générique, les résultats obtenus via l’étude sur les souris devrait, qui plus est, bénéficier à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu par la PBM dans d’autres maladies neurodégénératives. La bibliographie et les études antérieures sur cette thématique, s’appuyant eux même sur la littérature et l’état de l’art existant sur les modèles murins MPTP démontrent une vraie cohérence entre la souche de souris proposée ici et le modèle d’expérimentation. En effet, avec des injections de 25 mg/kg de MPTP par animaux, sur un modèle Parkinson aigu destiné à ne durer que 6 jours, nous nous trouvons dans une fenêtre de 40 à 60 % de neurones dopaminergiques supprimés, ce qui correspond environ au stade moyen de diagnostic et de prise en charge de la maladie de Parkinson chez l’Homme. Les 2 injections espacées de 24 h à la dose de 25 mg/kg permettent une dégénérescence progressive jusqu’à 7 ou 8 jours en moyenne, avant un recouvrement d’une partie des neurones dopaminergiques. Les animaux étant mis à mort au bout de 6 jours pour le prélèvement des pièces anatomiques, le recouvrement des neurones dans ces délais chez les animaux n’est pas un problème et reste cohérent avec le modèle envisagé ainsi que l’état de l’art sur le sujet. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie. Dans le but d’éviter tout biais dû aux cycles hormonaux, et dans un souci d’homogénéité des résultats, des rongeurs mâles seront utilisés.

6 300 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique. Selon les cas, ils reçoivent des injections deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, sont des lignées génétiquement modifiées ou ont été opérés, avant d'être mis à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélèvement de tissus nerveux. L'objet est de mesurer ex vivo l'effet de molécules candidates sur le système nerveux. Le porteur affirme que des réseaux neuronaux "plus physiologiques" sont nécessaires et qu'aucune reproduction in silico n'est possible.

Objectifs

Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleur appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le developpement de modèle rongeur génétiquement modifé (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’evaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ ou de cellulles nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le PATCH = un enregistrement à l'echelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques (composés « LEADS ») en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule, le cas échéant - afin de pouvoir déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire. Notre direction scientifique valide une stratégie d’étude, comportant plusieurs conditions, en se basant sur des données bibliographiques.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphallique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développment de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Procédure 1, par étude, 60 animaux vigiles seront injectés deux fois par jour. Ces injections seront réalisées par du personnel entrainé, qualifié et du matériel adapté. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne un mois. L’animal sera habitué à la contention, limitant le stress lors des gestes à venir. La plus grande vigilance de suivi sera portée pour éviter les problèmes dus aux injections répétées. 2700 animaux maximum entreront dans les 5 ans du projet. La Procédure 2 permettra de phénotyper 60 animaux génétiquement modifiés par étude, 2700 animaux sur 5 ans. Nous travaillerons sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Procédure 3 : 900 animaux subirront une chirurgie par notre partenaire, 15 jours avant leur envoi. Avant réception dans nos locaux, les animaux auront pleinement récuperer leur état de santé. En fonction de l’opération subie, les animaux devront être isolés depuis leur intervention jusqu’à leur MAM et donc être isolés 3 semaines. Tous ces animaux seront mis à mort par deux techniques: *- en fonction de leur âge, l’animal sortira de la zone d’hébergement par décapitation rapide sous anesthésie gazeuse; *- certains animaux sevrés seront mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthéise gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables: La procédure 1 peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. Nous habituerons les animaux concernés à ces manipulations avant leur entrée dans le projet; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. Pour éviter, par exemple, les inflammations génerées, nous varierons les sites d’injection autant que possible et assurerons une surveillance précise des animaux pour limiter la persistance d’effets indésirables provoqués en suivant nos règles de point limites. Nous utiliserons, aussi, le matériel d’administration adapté à l’espèce, au poids et l’âge des animaux ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important. Elle sera réalisée par du personnel dûment formé et quanlifié régulièrement avec utilisation d’un analgésique ; La procédure 2 peut par : *-La nature des animaux GMs, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptômatiques. Nous adapterons, tout de même, notre surveillance et nos points limites en fonction des symptômes possibles pout anticiper toute apparition précoce de douleur, qui ne devraient pas se declencher avant leur mise à mort et nos enrigistrements dans ce projet ; La procédure 3 peut par : *-la nature des opérations faites sur les animaux reçus et opérés par notre partenaire, induire des problèmes de type post-opératoire. Nous contrôlerons avec notre partenaire que les animaux opérés sont stables et aptes à être transportés, deux semaines après leur chirurgie. De plus, les conditions d’hébergement ainsi que les points de surveillance spécifique enrichieront nos points limites et nos points de surveillance au cours des 3 semaines d’hébergement des animaux. .

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Tous les animaux génétiquement modifiés de la procédure2 et tous les animaux opérés de la procédure 3 sont mises à mort pour enregistrement électrophysiologique, ex vivo. Ces mis à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégéneratives et nos protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale que nous maitrisons.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ».Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato encephalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne sgnificativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils béneficent d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le founisseur ou le partenaire. Pour les animaux opérés, ils seront adaptés au mieux et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. Les animaux utilisés en Procédure 1 seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur inoccuité. Les animaux seront surveillés deux foix par jour et pesés. Pour la procédure 2, les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptomes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deça de la limite préetablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Pour les animaux opérés (Procédure3), les conditions d’hébergement seront transmises par notre partenaire. Les animaux seront reçus après une complète récuperation de la chirurgie. Toutefois, un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera exercé. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée ou opérée (Procédure 2 et Procédure 3) fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques ou ayant pleinement récupérés de leur chirurgie. Toutefois, la connaissance des phénotypes et chirurgies ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limite modifiés pour palier à des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux. Les animaux, des procédures 1 et 3, seront exclusivement des animaux post sevrage. L’âge des animaux de la procédure 2 dépendra de l’âge de l’apparition des symptômes de la maladie.

8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie intracérébrale d'environ quatre heures pour l'injection d'un vecteur viral, puis six mois de suivi avec huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, avant d'être tué pour analyse histologique. Le porteur destine ces données de toxicologie à une demande d'essai clinique auprès de la FDA et de l'ANSM. Sur le remplacement, il affirme que le cerveau du primate est le plus proche de celui de l'humain et que le recours au "gros animal" est exigé par l'agence réglementaire.

Objectifs

Les vecteurs adeno associés (AAV) sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Huntington. Le but de cette étude est de completer les données de toxicologie d’évaluer la faisabilité/efficacité de l’administration par voie chirurgicale intracérébrale (IC) dans la région du cerveau qui concerne la pathologie en question, de façon à choisir le type d’AAV le plus adéquat pour une pathologie donnée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont l'obtention de toutes les données de tolérance à long terme pour l'application immédiate en recherche clinique à la fin de cette étude afin de répondre aux demande de la FDA (Food and Drug Administration) afin d'obtenir l'autorisation pour un essai de phase I/II et ainsi traiter les patients Huntington.

Procédures

- Une procédure chirurgicale (environ 4h) - 8 prelevements sanguins, 7 prelevements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang + LCR maximum 15min), - 6 Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 45min). Dans ce projet, comme decrit precedemment, une meme anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + EMG ou IRM selon le timepoint d'étude).

Impact sur les animaux

Les 5 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'administration intracerebrale - un risque chirurgical lié à l'administration intracérébrale via des catheters - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, l'ensemble des animaux (n=8) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude Tox GLP permettant la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique afin d'autoriser l'essai clinique chez l'Homme.

Réduction

8 animaux au total: 3 animaux par dose d'AAV et 2 animaux vehicule est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet. L'etude statistique etant assez limité en terme de tox, prinicpalement T test ou Anova. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l'administration intracérébraleréalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté.. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV est parfaitement tolérée (expérience passée sur 20). Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les memes volumes et frequence que decrite dans ce projet) sont menée en routine sur tous les animaux suivis par l'equipe et ne generent pas d'effets néfastes sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suiv, il sera euthanasié avec avis vétériaire.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs adeno associés (AAV) à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du primate non humain (NHP) en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 3 ans et 15 ans selon la disponibilité en elevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau completement developpé.

628 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit, par chirurgie stéréotaxique, une lésion chimique des neurones dopaminergiques reproduisant la maladie de Parkinson et l'implantation de fibres optiques, d'électrodes et d'un implant miniaturisé, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, activité locomotrice, coordination sur tige tournante et épreuve en milieu aquatique, et reconnaît des déficits moteurs induits par la lésion. Sur le remplacement, il affirme que ces déficits ne peuvent être étudiés ni sur des organismes moins évolués ni in vitro et juge le recours à la souris nécessaire.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester in vivo l’efficacité d’un implant miniaturisé (de quelques μm3) permettant à la fois de moduler par optogénétique l'activité des neurones d’intérêt au niveau des circuits des ganglions de la base, d’enregistrer les activités neuronales et de libérer des nanovolumes de différentes substances (L-DOPA, anti-inflammatoire) chez les souris vigiles sans contention et de valider ses effets bénétifiques sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et à terme permettre de développer un outil technologique innovant pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxie sous anesthésie générale réalisée une seule fois (durée 30-45 min selon le type d’implantation, grade de séverité: modérée) pour induire la lésion unilatérale des neurones dopaminergique et implantater en même temps des fibres optiques, des électrodes d’enregistrement et/ou un implant miniaturisé, suivit, 2) d'un exemen neurologique (series de 6 tests comportmentaux, grade de séverité: légère) ) pour évaluer les effets bénéfiques de la stimulation optogéntique sur les fonctions motrices et motivationnelles (3-5 semaines d’analyses avec 1 à 2 jours séparant deux tests comportmentaux successifs durant 30 sec-30 min en fonction du test), 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.puis 3) une perfusion intracardiaque (5 min) pour effectuer des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

1) Les animaux seront soumis à la lésion des neurones dopaminergique qui induit certains déficits moteurs. La lésion 6-OHDA a été largement caractérisée par la communauté scientifique et induit certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) de la maladie de Parkinson. 2) Une manipulation lors de la connexion des fibres optiques ou des électrodes d’enregistrent. 3) une exposition à des tests comportementaux évaluant les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et motivationnelles. Ces tests impliquent une mesure de l’activité locomotrice exploratoire spontanée dans differents environnements et une évaluation des capacités de coordination motrice sur une tige tournante et dans un milieu aquatique. L’inconfort généré par chacun de ces tests est réduit au minimum en habituant les animaux au préalable et en raccourcissant la durée d’exposition. 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses au niveau cellulaires

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des ganglions de la base qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche. L'implant prototype doit également être caractérisé chez l’animal vigile avant l’approche chez l’homme.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 628 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 6 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Cet effectif tient compte de notre expérience de nombreuses années dans ce type d’expérimentation et il est basé sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5%. Cependant, il pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux et du nombre de dispositifs à tester. En effet, au vu de la difficulté technique du projet, nous pourrons être amenés à tester moins de prototypes qu’anticipés. En fonction de leur taille finale, ils pourront être implantés dans d’autres structures telles que le cortex moteur ou le striatum également impliquées dans le contrôle du mouvement. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et permettre à terme de développer une technologie nouvelle pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Rimadyl dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique (Annexe 1) est mise en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour cela, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

Le modèle de Parkinson chez le rongeur (injections 6-OHDA) est le plus utilisé au niveau international et considéré comme un bon modèle. L’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à la réalisation de notre projet et permet de cibler slectivement des propulations neuronales d'intêret et elucider leurs contributions dans le developpment des déficits moteurs de la maladie de Parkinson. L'ensemble des études est mené sur des animaux adultes à partir de12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et ceux de la litterature.

1 010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie stéréotaxique détruit leurs neurones dopaminergiques à la 6-OHDA et implante fibres optiques et électrodes, avant des tests comportementaux sur plusieurs semaines, une restriction alimentaire pour les tests de Skinner et une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle du zinc synaptique dans la maladie de Parkinson et renvoie d'éventuelles stratégies thérapeutiques au conditionnel. Il affirme que le recours aux souris génétiquement modifiées est "indispensable" faute d'outil pharmacologique ciblant le zinc synaptique.

Objectifs

Ce projet vise a élucider le rôle du zinc synaptique dans le développement des symptômes moteurs et non-moteurs de la maladie de Parkinson. Nous utilisons une panoplie d'outils de pointes de génétiques et d'optogénétiques pour cibler les neurones libérant le zinc synaptique et révéler la mise en jeu du zinc synaptique dans le development des symptôme de la maldie. Ce projet de recherche devrait aboutir à une meilleure compréhension de la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

La chélation du zinc a été proposée comme piste thérapeutique pour la prise en charge des maladies neurovégétatives comme la maladie d’Alzheimer. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension du rôle physiopathlogique du zinc synaptique dans la maladie de Parkinson et pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les neurones gluzinergiques dans le contexte de la maladie de Parkinson et d'autres maladies aparentées.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxique sous anesthésie générale profonde réalisée une seule fois (durée 30-90 min selon le type d’intervention) combinant la lésion des neurones dopaminergique avec une implantation des fibres optiques et/ou des électrodes d’enregistrement, 2) des tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et cognitifs (3-6 semaines d’analyse avec 1 à 5 jours séparant deux test comportementaux successifs durant 5-30 min chacun), 3) une restriction alimentaire légère et temporaire lors des tests cognitifs de Skinner et 4) une perfusion intracardiaque (5-6 min) pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

La procédure lésionnelle utilisée (lésion unilatérale complète ou lésion bilatérale partielle à la 6-OHDA) a été largement caractérisée par la communauté scientifique et elle est considéré comme l’outil de choix pour modéliser certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) et non-moteurs (déficits cognitifs, comportement anxieux et dépressifs).

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour mener des analyses au niveau cellulaires. Les marquages immunohistochimiques sont indispensables pour vérifier l'étendue des lésions dopaminergiques, l'expression des opsines, les localisations des fibres optiques et des microélectrodes au niveau des structures ciblées.

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des GB qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 1010 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 10 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Il repose sur l’utilisation d’une procédure lésionnelle et tests comportementaux robuste et largement validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des données fiables. L’estimation du nombre est basée sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5% . Cependant, l’effectif des groupes pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Caprofène dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique est mise ne place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour celà, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée car elles représentent le modèle expérimental de choix pour étudier à travers des approches génétiques et optogénétiques les mécanismes physiopathologiques des maladies mentales liées à l’atteinte des ganglions de la base. Le recours aux souris génétiquement modifiées est indispensable dans le contexte de ce projet à cause de l’absence d’outils pharmacologiques permettant de cibler sélectivement le zinc synaptique ou empêcher son action sélectivement au niveau d’un type de récepteurs glutamatergiques. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux adultes âgés à partir de 12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.

48 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé par gavage pendant 22 jours puis passent trois tests de mémoire, dont la piscine de Morris où l'animal nage jusqu'à 90 secondes pour rejoindre une plateforme. Le porteur teste sur des souris saines une molécule déjà évaluée dans des modèles d'Alzheimer et de trisomie 21 et renvoie les bénéfices cliniques au long terme. Il indique que l'évaluation du rapport sécurité-efficacité impose des tests comportementaux sur rongeurs.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer le ratio sécurité/efficacité sur l’apprentissage de souris saine d’une molécule ayant déjà démontré des propriétés pro-mnésiques et neuroprotectrices chez des souris ayant développé une maladie de type Alzheimer ou de trisomie 21.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) sont de déterminer le ratio sécurité/efficacité sur la cognition des souris saines d’un produit ayant déjà montré des effets bénéfiques dans des études pré-cliniques basées des modèles murins de trisomie 21 ou de la maladie d’Alzheimer. Les bénéfices à plus long-terme sont de permettre le lancement d’essais cliniques évaluant l’efficacité de ce produit à protéger les patients atteints de trisomie 21 ou de la maladie d’Alzheimer de l’apparition de déficit cognitifs

Procédures

48 animaux seront soumis à une administration quotidienne du produit de traitement par gavage pendant 22 jours. Après 10 jours de traitement avec le produit testé, les animaux effectueront 3 tests comportementaux pour évaluer les différents types de mémoires. Le lendemain du dernier test (au 23ème jour), les animaux seront mis à mort pour pouvoir effectuer le prélèvement du cerveau afin d'évaluer les quantités et mécanismes d'actions du produit testé.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables peuvent venir de l’administration des fortes doses de traitement dans la procédure n°1 mais les études de toxicologies n’ont pas révélées d’effet toxique à ces doses. Cependant les animaux seront observés quotidiennement afin d’évaluer les effets potentiellement indésirables. L’inconfort lié au traitement peut provenir de l’administration du produit de traitement par gavage pendant 22 jours. Afin d’éviter ces effets indésirables, cette administration sera effectuée par du personnel technique qualifié. Le test de la piscine de Morris va induire un important stress lors de la première nage mais l’animal sachant instinctivement nager ne tardera pas à trouver la plateforme pour être retiré de l’eau par l’expérimentateur avec un temps de nage maximum de 90 secondes ce qui est bien en deça de l’épuisement de l’animal. L’observation quotidienne des animaux permettra de déceler toute souffrance animale dès son apparition et d’intervenir le plus rapidement possible pour minimiser au maximum l’inconfort observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour un prélèvement de structures cérébrales à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de déterminer le ratio sécurité/efficacité sur la cognition d’une molécule ayant déjà démontré des propriétés pro-mnésiques et neuroprotectrices in vivo chez des souris développant une maladie de type Alzheimer ou de trisomie 21. L'évaluation de ce ratio nécessite de réaliser des tests de comportement sur des rongeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque expérience a été défini à l’aide de tests de puissance G Power (logiciel G*Power 3.1) réalisés avec des données internes ou issues de publications. Ces analyses ont révélé qu’il était nécessaire d’avoir 12 animaux par groupe. De plus, nous réutiliserons les animaux qui ont fait les tests comportementaux pour les prélèvements de structures cérébrales.

Raffinement

Les souris sont livrées par groupes d’individus qui se connaissent afin d’éviter les bagarres. Des cabanes en carton sont ajoutées en plus de l’enrichissement réglementaire. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs en étant manipulés doucement une minute par jour la semaine précédent les expériences. L’administration orale sera réalisée par du personnel formé avec du matériel adapté. L’état clinique des animaux est vérifié chaque jour et dès qu’une détérioration est constatée, le responsable du projet et le vétérinaire sont informés pour la prise de décision. Si un animal est prostré ou a les yeux mi-clos ou présente des difficultés pour se déplacer/respirer il sera euthanasié pour mettre fin à ses souffrances. Le poids des animaux est relevé 2 fois par semaine et toute diminution de 15% du poids de l’animal entre 2 pesées traduit une souffrance et une euthanasie sera pratiquée.

Choix des espèces

Les études pré-cliniques précédantes ayant démontré les propriétés pro-mnésiques et neuroprotectrices de ce produit ont été réalisées chez des souris adultes ayant développé une maladie de type Alzheimer ou de trisomie 21. Nous gardons donc la même espèce pour cette étude..