Troubles gastrointestinaux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Formation des professionnels de santé à l’utilisation des dispositifs médicaux innovants.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 100
Moutons : 200
Bovins : 10
325 animaux non-humains, 200 moutons, 100 cochons, 15 chiens et 10 bovins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures que le porteur classe en gravité légère. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation chirurgicale d'un dispositif médical et des examens d'imagerie pouvant durer plusieurs heures, avant une euthanasie destinée à parachever la formation par l'examen de l'organe et du dispositif implanté. L'objet déclaré est de former des professionnels de santé à l'usage de dispositifs implantables, pas de produire des connaissances. Le porteur affirme que ces gestes ne s'apprennent que sur un animal vivant aux organes de taille humaine, tout en mentionnant l'existence de simulateurs et d'organes explantés.
Objectifs
Chaque année de nouveaux dispositifs implantables issus de la recherche sont disponibles pour les professionnels de santé (en cardiologie, en gastro-entérologie, en neurologie et urologie par exemple) et permettent de compenser, compléter/remplacer les fonctions vitales d’un organe défaillant pour prolonger la survie des patients et leur confort de vie. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Les professionnels de santé ont l’obligation de se former à l’utilisation de ces nouveaux dispositifs. L’utilisation d’un dispositif médical par un professionnel de santé ou un patient ne peut se faire sans une information de l’utilisateur, voire une formation préalable, elle requiert un apprentissage permettant d’utiliser le matériel, afin d’optimiser ses performances et de s’approprier les gestes permettant d’assurer à l’utilisateur une sécurité maximale d’utilisation. Un même produit, s’il est utilisé ou non conformément aux recommandations du fabricant, aura ou non la performance validée lors de son évaluation. Les dispositifs médicaux sont définis comme des produits «utilisateur-dépendant». La directive 93/42/CE modifiée relative à l’évaluation de ces dispositifs en vue de leur accès au marché européen, soumet les industriels à des obligations en matière de gestion des risques pour le produit mais également son environnement, prend en compte ce caractère «utilisateur-dépendant». Les industriels sont, à ce titre, responsables du recueil, de l’évaluation, de la mesure et du développement de tout élément susceptible de permettre une utilisation optimale des produits qu’ils commercialisent et d’assurer leur sécurité. Performances et sécurité des dispositifs médicaux sont corrélées à la formation et à l’expérience de l’utilisateur. De plus, les conditions d’utilisation des dispositifs ne peuvent se réduire à des questions d’observance. Sur tous ces points, le dispositif médical doit être différencié du médicament, y compris pour son utilisation par un professionnel de santé ou un patient. Ce projet vise à former les professionnels de santé à l’utilisation des dispositifs médicaux innovants en situation réelle sur un animal anesthésié.
Bénéfices attendus
Répondre à l’obligation de formation des professionnels de santé à la technique d’implantation d’un nouveau dispositif médical, à sa bonne utilisation et à son évaluation fonctionnelle pour la sécurité pour les futurs patients.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - La douleur durant l'intervention en fonction de l’invasivité de la technique, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour la réduire au maximum comme par exemple la mise en oeuvre systématique d'un protocole d'anesthésie générale et d'un protocole d'analgésie avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur morphiniques.
Devenir
Pour répondre à l’obligation de formation des professionnels de santé à la technique d’implantation d’un nouveau dispositif médical, à sa bonne utilisation et à son évaluation fonctionnelle pour la sécurité des futurs patients, il est nécessaire de procéder à l'euthanasie de tous les animaux du projet en fin de procédure pour parachever la formation en réalisant les prélèvements et analyses ex-vivo et permettre aux professionnels d’évaluer macroscopiquement l’organe et le dispositif juste implantés.
Remplacement
La formation des professionnels de santé aux méthodes d’implantation des dispositifs médicaux regroupe les notions de maîtrise du geste chirurgical mais aussi d’évaluation fonctionnelle en temps réel au moment de l’implantation grâce à l’imagerie. La réponse de l’organisme lors des différentes phases de l’implantation du dispositif et son suivi simultané par des méthodes d’imagerie pour en permettre l’évaluation fonctionnelle nécessite une formation sur un animal vivant. Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l’homme dans des conditions fonctionnelles qui reproduisent la fonction de l’organe vivant dans l’organisme afin de mimer au mieux la réalité d’une intervention.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet et aux besoins de formation. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie peu invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les professionnels de santé en formation reçoivent généralement une formation théorique en amont de cette formation pratique. Pour répondre à ce même objectif de réduction, les partenaires qui développent les dispositifs médicaux ont également développés des outils d’apprentissage avec simulateurs ainsi que des procédures permettant de travailler sur des organes explantés. La précision croissante des outils d’imagerie fonctionnelle permet également de gagner en précision dans les techniques d’implantation et d’évaluation des dispositifs, ce qui augmente le raffinement des procédure et limite le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble de la procédure est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant la procédure, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Pendant les phases d’acclimatation, les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation).
Choix des espèces
Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l’homme dans les conditions fonctionnelles de l’organe vivant dans l’organisme pour mimer au mieux la réalité d’une intervention. Pour répondre à l’obligation de formation, le modèle animal utilisé sera fonction du dispositif et de son indication. Les différences interspécifiques de nature tissulaire, de forme, de taille anatomique et de fonction requièrent l’emploi de différentes espèces de grande taille. Pour chaque formation le modèle animal retenu sera identifié préalablement en fonction de ces spécificités et similitudes avec l’Homme et sera la brebis pour les formations intéressant les domaines de la cardiologie, de la chirurgie vasculaire et de la neurologie principalement, le porc pour les formations intéressant les domaines de la gastro-entérologie, de l'ophtalmologie et de la cardiologie principalement, plus spécifiquement le chien pour la chirurgie des auricules cardiaques et les veaux pour les dispositifs d'assistance cardiaque. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Etude de molécules dans la prévention des lésions intestinales induites par un médicament immunosuppresseur
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
204 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 168 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur microbiote est remplacé par un microbiote humain, elles reçoivent par canule un immunosuppresseur provoquant diarrhées et lésions intestinales, avec des prélèvements de fèces répétés, au besoin par introduction d'une canule dans l'anus. L'objectif est de tester des molécules déjà autorisées comme médicaments pour prévenir cette entéropathie, avec un bénéfice annoncé à moyen terme. Le porteur affirme que seul l'animal permet de reproduire cette atteinte, impossible selon lui à modéliser in vitro.
Objectifs
Lorsqu’un organe vital est défectueux, il est possible de le remplacer par la transplantation d’organe. Cette intervention chirurgicale s’accompagne nécessairement d’une prise d’immunosuppresseur à vie pour le patient, afin de diminuer les risques de rejet de l’organe greffé par le système immunitaire. L’immunosuppresseur le plus utilisé chez les patients transplantés provoque des troubles intestinaux, définis comme entéropathie, tels que des nausées, des diarrhées voire même, dans les cas les plus graves, des ulcères hémorragiques pouvant mettre en jeu leur pronostic vital. Cet immunosuppresseur est aussi utilisé chez des patients présentant des maladies dites auto-immunes ; chez ces individus, les effets indésirables intestinaux sont aussi présents. De récentes recherches mettent en évidence le rôle du microbiote intestinal dans le développement des lésions intestinales associés à la prise d’immunosuppresseur. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes qui colonise notre tube digestif et est indispensable au bon fonctionnement de l’organisme. Les traitements immunosuppresseurs altèrent la composition du microbiote intestinal et favorisent la prolifération de certaines bactéries qui produisent des enzymes spécifiques connues pour transformer l’immunosuppresseur. Différentes études apportent des arguments solides qui incriminent l’immunosuppresseur transformé dans le développement des troubles intestinaux. Dans ce contexte, l’enzyme du microbiote intestinal impliquée dans la transformation de l’immunosuppresseur devient une cible de choix pour prévenir les lésions intestinales associées. Grâce à une étude exhaustive de la littérature et à des tests réalisés in vitro, nous avons identifié, dans une collection de produits chimiques, des molécules capables de bloquer spécifiquement l’effet de cette enzyme bactérienne. A noter que la collection de produits chimiques utilisée contient des molécules qui sont utilisées en Europe ou aux Etats-Unis comme médicaments pour différentes maladies. Notre objectif est de démontrer que ces molécules identifiées dans la collection empêchent la survenue des lésions intestinales induites par l’immunosuppresseur chez la souris. Chaque espèce ayant un microbiote particulier, nous avons choisi un modèle, décrit dans la littérature et défini comme humanisé, dans lequel le microbiote de la souris sera remplacé par celui de l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter une stratégie thérapeutique pour prévenir, chez les transplantés, l’entéropathie qui est un effet indésirable des médicaments immunosuppresseurs. Lorsque l’entéropathie survient, la seule option est de diminuer la dose ou la fréquence de prise d’immunosuppresseur au risque de perdre le greffon. La stratégie thérapeutique étudiée dans le présent projet permettra d’améliorer la qualité de vie des patients transplantés et également de tous les patients traités par immunosuppresseur, comme les sujets atteints de maladies auto-immunes. De plus, l’enzyme bactérienne responsable de la transformation de l’immunosuppresseur est aussi mise en cause dans la modification de médicaments anticancéreux (irinotécan, régorafenib), d’anti-inflammatoires non stéroïdiens (diclofenac, ibuprofen), de la morphine, et dans leurs effets indésirables intestinaux. Ainsi, le projet permettra aussi de proposer des solutions pour prévenir l’entéropathie médicamenteuse. Si l’étude proposée ici donne les résultats attendus, le bénéfice pour les malades pourrait être obtenu à moyen terme. En effet, notre stratégie consiste à repositionner une molécule déjà approuvée comme un médicament par les autorités sanitaires européennes ou américaines. L’approbation par les autorités sanitaires n’est donnée que si la molécule montre qu’elle ne présente pas de toxicité dans un certain nombre de modèles animaux (phase d’étude préclinique) puis chez des volontaires sains (étude clinique de phase I). Notre projet devrait permettre de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques sans passer par les études précliniques et de phase I très chronophages.
Procédures
Les interventions s’étaleront sur une période de 6 à 7 semaines. Les animaux seront manipulés 39 jours dans le cadre des expériences. Ils seront soumis à 3 préhensions pour pesée puis contention pour habituation à la canule pour administration orale, 1 préhension pour pesée puis contention pour habituation à la canule et prélèvement de fèces, 16 préhensions pour pesée puis contention pour administration orale via une canule, 9 préhensions pour pesée puis contention pour administration orale via canule et prélèvement de fèces. Le prélèvement de fèces peut être spontané lors de la contention ; si la défécation n’est pas spontanée, elle sera provoquée en introduisant délicatement, sur moins d’1 mm, 1 canule dans l’anus. Toutes ces manipulations se feront sur les animaux vigiles et s’enchaineront ; l’animal sera manipulé au maximum pendant 10 minutes lors des jours de manipulations. La dernière intervention prendra 15 minutes et consistera en la contention pour prélèvement de fèces et pour administration d’un anesthésique et antalgique sur animal vigile suivie d’un prélèvement de sang et mise à mort pendant que l’animal est anesthésié.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - un stress léger et momentané lié à la contention pour la pesée, pour le prélèvement de fèces, pour l’administration orale de traitement à l’aide d’une canule, et pour l’anesthésie, -une gêne légère et momentanée lors de la défécation provoquée, lors de l’administration orale avec une canule, et lors de l’introduction de l’aiguille pour l’anesthésie et l’antalgie éventuelle, - et dans le cas des animaux traités par l’immunosuppresseur sont une perte de poids modérée, une douleur modérée jusqu’à l’administration d’un antalgique, et potentiellement de la diarrhée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements, notamment du tube digestif, nécessaires à la mise en évidence d’un effet bénéfique des molécules testées.
Remplacement
En amont de ce projet, l’effet bloquant des molécules sur l’enzyme bactérienne responsable de la transformation de l’immunosuppresseur sera validé sur des selles humaines provenant de sujets sains. Une fois ce point vérifié, nous utiliserons l’animal qui, seul, permet de mimer l’entéropathie qui résulte d’une interaction complexe du microbiote intestinal avec le tube digestif et avec le reste de l’organisme, que l’on ne sait pas reproduire actuellement dans des modèles in vitro.
Réduction
La stratégie choisie de repositionner un médicament, si elle est concluante, elle permettra d’éviter les études de toxicité préclinique qui utilise de nombreux animaux. Dans ce projet, nous utiliserons des souris consanguines pour limiter la variabilité génétique inter-individuelle et par conséquent le nombre de souris à utiliser. Ce projet comprend 2 étapes : une étude pilote suivie de l’étude à proprement parler de l’effet des molécules d’intérêt sur l’entéropathie induite par l’immunosuppresseur. L’étude pilote permettra de mettre au point le modèle animal humanisé sur la base d’une revue exhaustive de la littérature et d’une collaboration avec une équipe experte du modèle de souris humanisé pour le microbiote. Cette étude pilote permettra de limiter le nombre d’animaux utilisé dans la seconde étape. Le nombre d’animaux nécessaire par condition expérimentale pour obtenir des résultats significatifs et robustes a été évalué à l’aide d’un test dit de puissance. Dans l’étude pilote nous prévoyons au maximum de tester 6 conditions expérimentales de 6 animaux par lot ; au plus, 36 souris seront donc utilisées. Les conditions expérimentales seront testées deux à deux en parallèle en comparaison à un lot contrôle pour évaluer les deux méthodes d’administration. Si les conditions expérimentales du premier essai sont satisfaisantes, l’étude pilote sera arrêtée avant d’avoir réalisé le deuxième essai. Dans la procédure 2, 14 conditions expérimentales seront nécessaires, de 12 animaux par lot, soit 168 souris seront utilisées. L’efficacité des molécules sera vérifiée en comparant les résultats des différentes conditions à l’aide du test statistique ANOVA suivi d’un test post hoc.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d'hébergement contrôlés quotidiennement et en accord avec la réglementation pour respecter leur bien-être, c’est-à-dire : statut sanitaire ; température ; hygrométrie ; lumière ; et état général des animaux. L’hébergement sera réalisé dans une animalerie dont le statut sanitaire est régulièrement contrôlé et adapté à des animaux dont le microbiote est perturbé. Les animaux seront hébergés en groupe ; le groupe restera le même du début à la fin. De l’enrichissement est systématiquement présent dans les cages, la litière est changée régulièrement et la nourriture et l’eau sont en permanence disponibles. Les animaux seront acclimatés à l’environnement de l’animalerie pendant une période de 14 jours ; sur cette période, ils seront aussi habitués à l’expérimentateur et à la préhension et à la contention nécessaires pour certaines interventions. Pendant toute la durée des expériences, tout un panel de paramètres sera évalué quotidiennement pour chaque animal, des points limites gradés seront donc définis, afin de repérer au plus tôt les signes de mal-être de l’animal, qui seront pris en charge immédiatement et adapté pour chaque point limite qui atteint. L’ensemble des expériences seront réalisées par un personnel compétent.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour l’étude de l’entéropathie induite par l’immunosuppresseur. Les troubles et les lésions intestinales miment fidèlement les caractéristiques cliniques des patients transplantés. De plus, l’humanisation du microbiote est bien décrite et efficace dans cette espèce. Les animaux seront reçus à l’âge de 2 mois (8 semaines), le protocole expérimental dure 54 jours dont 14 jours d’habituation des animaux à l’environnement de l’animalerie. Nous utiliserons des souris au stade jeune adulte comme décrit dans la littérature à la fois pour le modèle de microbiote humanisé et pour le modèle d’entéropathie induite par l’immunosuppresseur.
Étude pilote sur la cinétique de la toxine diphtérique dans des modèles de souris déficientes en SUMO.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage puis une injection de toxine diphtérique destinée à détruire les cellules de leur épithélium intestinal, pour étudier la régénération de la paroi de l'intestin. Le porteur décrit une simple étude pilote visant à établir la dose de toxine, en amont d'un projet ultérieur. Il affirme que l'infection provoque une colite modérée et transitoire et qu'aucune alternative non animale n'est possible pour ce processus.
Objectifs
Il s'agit d'une étude pilote visant à évaluer les effets de la toxine diphtérique chez les animaux sauvages par rapport aux animaux déficients en molécule SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), vise à déterminer l'importance de la sumoylation dans le processus de régénération de l'épithélium intestinal après une lésion induite. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Grâce à cette étude pilote, nous allons déterminer la cinétique de la toxine diphtérique dans le modèle de souris déficient en SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier). Cela nous permettra de réaliser un projet ultérieur, dans lequel nous administrerons de la toxine diphtérique à ce modèle pour générer une lésion intestinale, ce qui nous permettra de déterminer le rôle de SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que ces maladies sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Ce modèle murin offre ainsi une bonne opportunité pour explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la maladie puisqu’il permet d’induire une lésion ponctuelle et ciblée dans l’intestin, qui entraînera la mort des cellules épithéliales associée à une inflammation marquée et d’ainsi reproduire chez la souris un phénotype proche de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration orale de tamoxifène par gavage (20s), trois frois ; une tous les 5 jours puis il y aura une seule injection intrapéritonéale de toxine diphtérique à J17 (5s).
Impact sur les animaux
Le projet soumis est basé sur l'étude de la régénération intestinale à la suite d’une lésion induite par injection de toxine diphtérique, qui entraîne l'élimination de tous les types de cellules épithéliales de l’intestin. Les effets attendus seront ceux provoqués par la perte de l'épithélium intestinal. Comme aucun autre type cellulaire n'est affecté par la toxine, nous n’attendons ainsi que des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent néanmoins souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, comme aucun effet secondaire n’est induit par le tamoxifène ou son véhicule et que les animaux seront maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration de toxine diphtérique, nous n’attendons pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période. Le stress lié au gavage/contention, douleur au point de piqure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure afin de récupérer les organes pour étudier les effets de la toxine diphtérique en fonction des doses sur l’animal. Dans le but de déterminer pour l’avenir, la dose idéale à utiliser afin d’étudier les processus de régénération musculaire sans induire de souffrance aux souris.
Remplacement
Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de l'intestin lumen, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.
Réduction
Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois, à des jours différents, pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétition principalement) en utilisant es modèles à effets mixtes. Les animaux témoins seront comparés aux animaux de laboratoire expérimentaux par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus avec suffisamment de puissance. - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.
Raffinement
En ce qui concerne le futur projet, cette procédure nous permettra d'effectuer un affinage important puisque, grâce à cette étude pilote, nous connaîtrons la cinétique de la toxine diphtérique dans notre modèle, et nous établirons les temps d'étude et le dosage, de sorte que dans le projet sur l'étude du rôle de SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier), dans la régénération intestinale, les animaux auront les conditions optimales impliquant moins de souffrance, sans effets secondaires attendus. En ce qui concerne cette procédure : - Les animaux seront gardés dans un nombre maximum de 5 par cage. - Les injections et gavages seront administrés par une personne formée et compétente dans ce type de techniques. - Un criblage de différentes doses de toxine diphtérique sera effectué afin d'établir une dose minimale de toxine qui ne cause ni douleur ni stress aux animaux. - L'état de santé des animaux sera contrôlé 2 fois par jour tous les jours pendant toute la durée de l'expérience. Des points limites seront mis en place, basés sur une observation clinique de l’animal, des seuils d’intervention et des interventions adaptées (utilisation d’analgésique, mise à mort).
Choix des espèces
La souris de laboratoire Mus musculus est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'il n'interfère en aucune façon dans l'obtention de résultats, ainsi qu'ils soient pas trop âgé, de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement ne le fasse pas.
Etude de l’efficacité de médicaments candidats dans des modèles précliniques de cholestases génétiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections de virus sous anesthésie puis des médicaments candidats par voie orale ou intrapéritonéale, avant le prélèvement de leur sang, de leur bile et de leur foie. Le projet teste des molécules censées éviter ou retarder la transplantation hépatique dans des maladies rares du foie de l'enfant. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour tester in vivo l'efficacité de ces médicaments candidats.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de valider à un stade préclinique l'efficacité de médicaments candidats à améliorer la condition d'animaux mimant des maladies hépatiques humaines rares et sévères appelées Cholestases Intrahépatiques Familiales Progressives de type 2 et 3 (PFIC2/3 en anglais). Les molécules candidates qui seront testées chez les animaux auront été sélectionnées au préalable sur la base de tests effectués sur des cultures cellulaires. Afin de mettre en évidence l'efficacité des molécules testées, la composition de la bile d'animaux traités avec ces molécules sera comparée à celle d'animaux contrôles non traités. Ainsi, la molécule la plus pertinente sera considérée comme un médicament candidat, alternative à la transplantation hépatique, procédure lourde et compliquée par le manque de greffons, requise pour la majorité des patients atteints de PFIC2/3.
Bénéfices attendus
La majorité des patients atteints de maladies hépatiques rares et sévères telles que les PFIC (Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis) ont besoin d'une transplantation hépatique avant l'âge adulte, du fait de la faible efficacité des traitements actuellement proposés. Ce projet est une étude préclinique qui vise à évaluer l'efficacité de médicaments candidats à améliorer les paramètres hépatiques d'animaux mimant ces pathologies humaines. Si l'efficacité de ces nouvelles molécules est confirmée, leur transfert vers le patient sera envisagé afin d'éviter, ou au moins de retarder, la transplantation hépatique pour ces malades.
Procédures
Les seules nuisances que les animaux devraient subire sont liées à des injections. Les souris subiront deux injections de virus à intervalle de 7 ou 14 jours sous anesthésie générale, chaque intervention (anesthésie + injection) ne devant pas dépasser une durée de 10 minutes. Les médicaments candidats seront administrées soit par voie orale (30 secondes maximum par animal), soit par injection intrapéritonéale après anesthésie locale (20 minutes maximum par intervention). L'administration des médicaments candidats se fera pendant trois jours avec au maximum deux traitements par jour. Suite à ces traitements, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les échantillons biologiques.
Impact sur les animaux
L'injection des particules virales et des molécules candidates ne devraient pas engendrer d'effets indésirables notables, sur la base de la littérature existante et de nos données obtenues au préalable dans nos modèles cellulaires. Suite à ces injections, les animaux seront suivis afin d'identifier une éventuelle détresse telle que la peur, le stress ou la douleur. Si de tels effets indésirables sont observés, une attention particulière sera apportée afin de limiter au mieux ces nuisances, comme par exemple en modifiant l'environnement et/ou l'enrichissement dont les animaux bénéficieront.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Dans ce projet, le recours à l'euthanasie est indispensable dans le but de prélever et d’étudier les fluides (sang, bile) et tissus (foie) impliqués dans les maladies que nous cherchons à traiter.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet d'étude préclinique, il n’existe pas de méthode alternative pour remplacer l'expérimentation animale, notre objectif étant de tester in vivo l'efficacité de médicaments candidats.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Le nombre d’animaux a été évalué à 8 pour chaque groupe, sur la base de nos analyses statistiques préalables. ce qui permettra d'obtenir des résultats suffisamment fiables pour ne pas avoir à effectuer de nouvelles expériences. Par ailleurs, les conditions expérimentales testées ont été réduites au maximum afin d'utiliser le moins d'animaux possible sur l'ensemble de ce projet.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés pour les injections ainsi que pour la procédure finale (prélèvement et euthanasie). L’environnement sera enrichi, la nourriture et l’eau seront disponibles à volonté. Si l’animal atteint un niveau de souffrance important, il sera tout d'abord soulagé par l’administration d’un analgésique ; et si les symptômes persistent ou sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les animaux seront examinés quotidiennement par du personnel qualifié. Les souris seront accueillies dans une animalerie au statut sanitaire strict et prises en charge par du personnel formé et qualifié.
Choix des espèces
L'utilisation de modèles animaux, en particulier les souris, est très référencée dans la littérature scientifique pour la validation préclinique de médicaments candidats. Leur petite taille permet d'héberger un grand bombre d'animaux dans l'espace confiné d'une animalerie, permettant ainsi l'analyse de nombreuses conditions expérimentales tout en maintenant une importante puissance statistique. De plus, la littérature scientifique rapporte des approches similaires à ce projet dans le cadre de la thérapie génique (injection de virus), soulignant ainsi la pertinence du modèle choisi dans le cadre de notre projet. Les souris utilisées seront de jeunes adultes de 6 à 8 semaines pouvant supporter au mieux la procédure. Les souris seront euthanasiés au plus tard à l'âge de 12 semaines.
Evaluation de la distribution tissulaire des radiotraceurs dans un modèle rongeur.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Rats : 750
1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va de l'absence de réveil à modérée. Sous anesthésie, ils reçoivent un cathéter veineux et fémoral, une injection de composé radiomarqué puis jusqu'à trente prélèvements artériels au cours de séances d'imagerie de deux heures. Tous sont ensuite tués pour extraire leurs organes. Le porteur qualifie les retombées de "majeures" pour la connaissance de la distribution des médicaments et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut évaluer cette distribution tissulaire.
Objectifs
L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments radiomarqués d’intérêt chez le rongeur en utilisant une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant aux isotopes utilisés et qui sont également utilisés en médecine humaine. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés concernent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction et également les neuroprotecteurs. Plusieurs séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le rongeur. Afin d’évaluer intégralement l’exposition tissulaire, la pharmacocinétique du traceur et du candidat médicament seront également étudiés.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations pertinentes sur l’exposition tissulaire et sur les spécificités de la distribution et de l’élimination des médicaments.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Pose d’un cathéter veineux (30 secondes) et fémoral (5 minutes) • Injection d’un radiotraceur associé ou non à un candidat médicament (1min) • Réalisation de prélèvements artériels sous anesthésie gazeuse (30 prélèvements qui durés 2-3 secondes espacés sur 120 minutes au maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : Les rongeurs seront anesthésiés lors des sessions d’imagerie (2h maximum). Lors du réveil les rongeurs peuvent être désorientées et stressées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc..., afin d’évaluer l’exposition tissulaire par le radiotraceur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier l’exposition tissulaire par le radiotraceur en présence et en absence de candidat médicament.
Réduction
L’utilisation des différentes modalités d’imagerie décrites permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.
Raffinement
Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue après à la réception des animaux. Ils seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés en groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions, avec un maintien et une surveillance de la température et du rythme respiratoire. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ces espèces présentent l’avantage d’être particulièrement adaptées aux études d’imagerie par TEP (Tomograhie par émission de positons) précliniques. Un certain nombre d’étude ont déjà été publiées dans la littérature ce qui nous permettra de limiter le recours aux rongeurs. L’évaluation de la distribution tissulaire nécessite des tissus pleinement développés (récepteurs, transporteurs, fonction hépatique etc..) et donc les rongeurs utilisés seront au stade adulte (5 semaines à 8 semaines). Le projet sera conduit sur des individus adultes (maturité et développement complet atteint).
Impact d’interventions nutritionnelles sur les structures du microbiote digestif et les réponses immunes associées en condition basales, de dysbiose et inflammatoires.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 350 d'entre elles, modéré pour 200 et sévère pour 700. Elles subissent des colites provoquées chimiquement par le DSS ou le TNBS, avec douleur, perte de poids, diarrhée et saignements digestifs, associées à des gavages et des prélèvements sanguins, pour évaluer des interventions nutritionnelles et vaccinales sur le microbiote intestinal. Le porteur indique que l'effectif est un maximum estimé pour les projets et contrats à venir du prochain quinquennat, prestations industrielles comprises. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer la souris comme modèle intégré de physiologie digestive.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une thématique générale d’évaluation de multiples interventions susceptibles de moduler l’homéostasie générale des muqueuses et les réponses immunes locales et systémiques, en conditions basales et divers contextes physio-pathologiques chez la souris. L’étude permettra de renseigner sur l’efficacité de traitements préventifs ou thérapeutiques ainsi que la compréhension des mécanismes associés aux protections mises en évidences, en particulier en modifiant transitoirement ou durablement la structure du microbiote intestinal et/ou l’immunité de l’individu. Il s’agit d’un projet intégré combinant plusieurs procédures distinctes, rassemblées ici, et ayant pour la plupart déjà fait l’objet d’autorisations antérieures, en vue d’un renouvellement. Les interventions préventives ou thérapeutiques envisagées comprennent (i) des conditions nutritionnelles, consistant en l’apport de microorganismes de qualité alimentaire (vivants, inactivés ou sous forme de fractions), de matrices alimentaires, prébiotiques (fibres de nature polysaccharidique et/ou substances protéiques), vitamines ou minéraux, acides biliaires et analogues, seuls ou en combinaisons, tous considérés comme sans dangers (microorganismes de classe I) ; (ii) d’immunisations par microorganismes vivants, inactivés ou sous forme de fractions purifiées. Les divers contextes physio-pathologiques modélisés sont (i) des colites expérimentales induites chimiquement (DSS pour sodium de dextran sulfate) et TNBS pour trinitrobenzène d'acide sulphonique), mimant les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ; (ii) des colonisations intestinales par différents microorganismes non pathogènes, issus du microbiote murin ou humain (Escherichia coli, Enterobactéries spp., levures, bactériophages) ou isolées d'un écosysteme alimentaire (produits fermentés). Ces études documentent ainsi les potentialités anti-inflammatoires et homéostatiques de stratégies nutritionnelles ciblées (probiotiques, prébiotiques, métabolites alimentaires) et vaccinales, en considérant le rôle du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Identifier les potentialités anti-inflammatoires et homéostatiques de molécules ou microorganismes (probiotiques, prébiotiques, métabolites alimentaires), en considérant le rôle du microbiote intestinal ;
Procédures
Seuls des gavages non invasifs/non traumatisants sont réalisés sur animaux vigiles; les différents prélèvements sanguins uniques sont réalisés sous anesthésie ou post-mortem;
Impact sur les animaux
La sévérité des colites expérimentales implique potentiellement douleur, perte de poids, diarrhée, saignement digestif d’une durée moyenne variable de 5 jours dans les modèles aigus (DSS, TNBS), et 3 fois 10 jours (altérnés de périodes de rémission) dans les modèles chroniques. Cette sévérité est ici relative car les modèles sont déclinés pour autoriser des colites de faible intensité, permettant d'objectiver les potentialités thérapeutiques.
Devenir
Les animaux sont mis à morts pour prélèvements multiples post-mortem
Remplacement
Il n'est malheureusement pas possible de remplacer le modèle intégré de physiologie digestive, nutritionnelle et immunitaire que représente la souris. Toutefois nous développons actuellement au laboratoire des méthodologies alternatives utilisant des invertébrés tels que le nématode Caenorabditis elegans ou encore Galleria
Réduction
Le nombre prévisionnel d’animaux dépend des projets et contrats de recherche ; il sera reconsidéré à la baisse aux vues du quinquennat précédent lors du renouvellement de la demande d’autorisation. Par ailleurs, l’intensité des colites étant variable selon les lots d’animaux et les périodes de l’année (probablement dûe aux variations de microbiote intestinal), nous testons maintenant dans une expérience préliminaire de 4 à 5 jours sur quelques animaux (3 à 5) une dose de Sulfate de dextran sodium (DSS) orale ou de Trinitrobenzene sulfonic cid (TNBS) intrarectale pour chaque nouveau lot de souris commandé. Ceci permet d’évaluer l’intensité moyenne de la colite induite et d’anticiper la dose optimale ; une colite trop faible ou générant une mortalité inattendue étant ininterprétable. Cette methodologie épargne substantiellement des animaux (3R) et limitent une surmortalité; le developpement de la modélisation in vitro d'organoïdes intestinaux permet également de réduire en amont le nombre des animaux utilisés. Pour chaque série d'experience de colite expérimentale (DSS ou TNBS), un maximaum de 5 groupes expérimentaux de n=10 animaux sont comparés entre eux en regard d'un groupe controle positif d'induction de la colite sans traitment (n=10) et d'un groupe controle négatif sans inductiuon de colite (n=8 à n=10); Cette puissance statistique est nécessaire et suffisante pour conclure evec certitude sur l'efficatioé ou non d'un traitement, s'appuyant sur la dispersion des valeurs des différents paramètres étudiés (expression de gènes pro-inflammatoires, scores histologiques, perte de poids des animaux cf point 2.4.10. Ces effectifs de n=10 par lots sont unanimement reconnus et validés par de nombreuses publications scientifiques, autorisant des test non paramétrique de type Mann & Withney et Kruskall-Wallis, appropriés à la comparaisons de 5 à 6 groupe de petits echantillons (n
Raffinement
L'amélioration de l'enrichissement et des conditions d'hébergement sont des soucis constants de la logistique et du comité du bien-être animal et des utilisateurs de notre plateforme d'animalerie, incluant la formation initiale et continue du personel. S'il n'est pas possible d'uiliser des molécules anti-inflammatoies pour ne pas interferer avec l'objet de l'expérimentation, l'observation bi-quotidienne des animaux permet de définir les points limites (cf procédures) et de recourir le cas échéant à une mise à mort pour épargner d'éventuelles souffances aux animaux. Cest points limites concenent l'observation et l'inteprétaton gaduée des signes de mal-être par la prise alimentaire et de boisson /masse pondérale, la posture, la vocalisation et l'espect du pelage.
Choix des espèces
La souris représente le modèle le plus accessible et le plus pertinent pour modéliser la physiologie digestive des vertébrés supérieurs à sang chaud. En particulier, le systême immunitaire complexe et la diversité des microbiotes sont relativement proches. Les animaux utilisés sont adultes, âgés de 6 à 8 semaines, offrant une physiologie digestive mâture (absorption intestinale et intégrité épithéliale) et des systèmes intégrés de détoxification, immunologiques et de stress oxydatifs optimaux.
Étude de l’origine immunologique de l’hépatite auto-immune dans un modèle murin préclinique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
6 048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère (4 320 modéré, 1 728 sévère). Réparties sur neuf protocoles, elles subissent jusqu'à quatorze actes (prélèvements sanguins, injections intrapéritonéales, intramusculaires et intraveineuses), dont une injection hydrodynamique d'un volume proche de 9 % du poids corporel qui provoque dilatation du foie, montée de pression et arythmie. Le porteur estime lui-même que cet acte sévère peut tuer jusqu'à 5 % des animaux concernés. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier le foie in vivo, le diagnostic humain de l'hépatite auto-immune étant trop tardif.
Objectifs
L’hépatite auto-immune (HAI) est une pathologie du foie caractérisée par une attaque immunitaire contre l’organe qui peut entraîner une défaillance hépatique, des cirrhoses ou même des cancers. Les traitements immunosuppresseurs non-spécifiques (combinaison de corticostéroïdes et d’azathioprine) entraînent une rémission complète en 18 mois chez 75% des patients HAI. Cependant, ces traitements présentent de nombreux effets secondaires et 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après l’arrêt du traitement. Par ailleurs, l’HAI est une pathologie dont l’origine reste méconnue. Les lymphocytes T CD4+ (LT CD4) constituent la population de cellules immunitaires classiquement considérée comme responsable des lésions hépatiques. Mais l’étude des LT CD4 dits spécifiques d’antigènes hépatiques, c’est-à-dire les LT CD4 qui reconnaissent des molécules présentent spécifiquement dans le foie, reste limitée chez l’Homme. De plus, le diagnostic de l’HAI n’étant que tardif dans l'évolution de la pathologie, l’étude des évènements à l’origine de la maladie n’est pas réalisable chez l’Homme. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’HAI et qui permettent d’étudier le rôle des LT CD4 spécifiques d’un antigène hépatique dans les temps précoces de l’atteinte du foie. Dans ce projet, notre objectif est de décrire les signaux immunologiques impliqués dans le contrôle d’une réponse immunitaire contre un antigène hépatique et pouvant favoriser l’attaque immunitaire du foie sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons moduler l’environnement hépatique dans : (1) un modèle de tolérance de l’antigène hépatique, (2) un modèle d’hépatite aiguë transitoire et (3) un modèle d’hépatite chronique.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un antigène hépatique, ainsi que des pistes solides concernant l’origine immunologique de l’hépatite auto-immune. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie. Nous espérons également pouvoir mettre en lumière une marque prédictive précoce de la sévérité et de l’évolution de l’hépatite auto-immune.
Procédures
Les animaux subiront entre 3 et 14 actes sur une période allant de 10 à 60 jours en fonction de la procédure : Procédure 1 = Les animaux recevront, sur une période de dix jours, 1 prélèvement sanguin (durée : 1 minute, animal anesthésié), 1 injection intrapéritonéale (i.p., durée : 30 secondes, animal vigile) et 3 injections intraveineuses (i.v., durée : 1 minute, animal anesthésié) à 3 jours d’intervalle. Procédure 2 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection intramusculaire (i.m., durée : 30 secondes, animal anesthésié), 1 injection i.p. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 3 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 1 injection i.p., 2 injections i.m. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 4 = Les animaux recevront, sur une période de dix jours, 1 prélèvement sanguin, 1 injection i.p. et 1 injection intraveineuse hydrodynamique (HTVi, durée : 10 secondes, animal vigile). Procédure 5 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection i.m., 1 injection i.p. et 1 injection HTVi. Procédure 6 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 1 injection i.p., 2 injections i.m. et 1 injection HTVi. Procédure 7 = Les animaux recevront, sur une période de douze jours, 1 prélèvement sanguin, 6 injections i.p. et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 8 = Les animaux recevront, sur une période d’un mois, 2 prélèvements sanguins, 1 injection i.m., 6 injections i.p. en douze jours et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Procédure 9 = Les animaux recevront, sur une période de cinq semaines, 3 prélèvements sanguins, 2 injections i.m., 6 injections i.p. en douze jours et 3 injections i.v. à 3 jours d’intervalle. Les procédures 1, 2, 3, 4, 5 et 6 se terminent à un temps précoce ou tardif. Dans le cas d’une fin de procédure à un temps tardif, les animaux recevront un prélèvement sanguin une semaine après le dernier acte subi.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Durant les injections intrapéritonéales, les animaux pourront ressentir un inconfort local et limité dans le temps. En fonction de la procédure, ce geste sera reproduit jusqu’à 6 fois sur une période de deux semaines. Pour les actes subis tels que l’injection intraveineuse, l’injection intramusculaire ou le prélèvement sanguin, les animaux seront anesthésiés par un anesthésique gazeux ce qui pourrait engendrer un stress chez l’animal. Du fait de l’injection intraveineuse par la veine caudale d’un grand volume de solution dans la circulation systémique, une analgésie locale sera appliquée au site d’injection. L’injection hydrodynamique d’environ 9% du poids corporel en volume, conduit à une dilatation massive mais transitoire (inférieure à 30 minutes) du tissu hépatique, une augmentation de la volémie globale, une forte augmentation de la pression sanguine et une arythmie cardiaque courte (durant 30 à 60 secondes). Du fait de la sévérité de cet acte, une perte maximale de 5% des animaux impliqués dans ces procédures est estimée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.
Remplacement
Dans ce projet, nous interrogeons l’origine immunologique de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela nous permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 6048 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. À l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. À nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, au cours de ce projet, nous bénéficions de souches génétiquement modifiées déjà en place au laboratoire. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. À des âges plus avancés, le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.
Mise au point d’un modèle de syndrome du côlon irritable induit par un stress modéré lié à une contention.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont immobilisés par contention lors de neuf séances de deux heures pour provoquer un stress censé reproduire le syndrome du côlon irritable, avec deux prises de sang, avant d'être tués pour analyse des tissus. Le porteur attend un transit accéléré, des selles molles et une inflammation intestinale légère. Il cherche à valider ce modèle pour évaluer ensuite des compléments alimentaires à base d'extraits végétaux et de probiotiques destinés aux patients.
Objectifs
Le syndrome de l'intestin irritable (IBS) est une maladie complexe qui affecte le système nerveux et le microbiote intestinal. Ses mécanismes ne sont pas encore complètement compris. Les patients souffrent de douleurs abdominales et de troubles digestifs tels que la diarrhée et/ou la constipation, souvent associés à des problèmes psychologiques tels que l'anxiété et la dépression. Le stress et certains aliments peuvent déclencher l'IBS, c'est pourquoi les premières recommandations médicales pour le traitement incluent une gestion améliorée du stress, de l'exercice physique et des changements alimentaires. Dans cette perspective, l'utilisation de compléments alimentaires contenant des extraits végétaux et des probiotiques peut aider à maintenir une santé intestinale équilibrée et prévenir les symptômes de l'IBS chez les patients. Pour tester l'efficacité de ces produits, il est nécessaire d'utiliser des modèles animaux, tels que le rat. Cependant, il n'existe pas actuellement de modèle animal reconnu par la communauté scientifique comme référence pour évaluer le syndrome du côlon irritable, et les modèles utilisés dans la littérature sont très variés. L'objectif de ce projet est de développer et de valider un modèle de syndrome du côlon irritable chez le rat en induisant un stress modéré par une restriction physique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier et à valider un modèle de syndrome du côlon irritable chez le rat, afin d'évaluer l'efficacité des produits de santé destinés aux patients. Si les résultats démontrent l'efficacité de l'une ou plusieurs des combinaisons d'extraits végétaux et de probiotiques, des études précliniques (chez l’animal) pourront être suivies par des études cliniques (chez l’homme), offrant ainsi aux patients des solutions complémentaires pour lutter contre l'IBS. Ce projet revêt donc une importance pour répondre aux besoins non satisfaits des patients souffrant du syndrome du côlon irritable et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Restriction physique : 9 sessions 2h maximum Contention pour évaluation de la composition corporelle par EchoMRI : 2 sessions de 30 secondes (début et fin d'étude). Prélèvement de sang à la pointe de la queue (200µl) : un prélèvement en début et un en fin d'étude
Impact sur les animaux
Les animaux devraient ressentir un stress modéré se traduisant par une accélération du transit intestinal, des fécès molles ainsi qu’une inflammation intestinale légère visible en histologie. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu avec ce modèle. Les points limites établis dans la procédure n’ont aucune raison d’être atteints.
Devenir
A la fin la procédure les animaux seront mis à mort et différents tissus seront prélevés pour permettre de compléteter les analyses et d’identifier des macanismes d’action.
Remplacement
L'inflammation chronique de l'intestin est une maladie complexe et multifactorielle qui reste encore largement mal comprise. Les modèles murins sont utilisés pour étudier cette maladie car ils permettent de comprendre son contexte global à l'échelle de l'organisme, ce qui n'est pas possible avec d'autres modèles in vitro ou ex vivo
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.
Raffinement
Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation avant de commencer l’étude, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.
Choix des espèces
Le rat wistar est classiquement utilisé dans la litérature pour la mise en place de ce modèle IBS. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (8 semaines). C’est un âge classiquement utilisé dans nos différents projets et sur lesquels nous avons des points de comparaisons.
Production d’anticorps chez le lama immunisé (lama glama)
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Immobilisés dans un couloir de contention par un licol et des sangles passées sous le ventre, les lamas subissent une prise de sang finale de 250 à 400 ml, après six injections d'antigènes et d'adjuvant en général, huit au plus, le tout sans anesthésie. 375 lamas, classés parmi les autres mammifères, vont être utilisés dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger, puis 200 restent à l'élevage et 175, mâles et autres femelles, sont placés chez des détenteurs. Le porteur décrit une "prestation de services" : produire des anticorps "à la demande de clients", qui mènent leurs propres recherches thérapeutiques. Il indique que les injections peuvent provoquer des "douleurs aiguës transitoires", et que l'impact léger des procédures "ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux à usage thérapeutique. Les anticorps polyclonaux ont plusieurs cibles sur l'antigène, tandis que les anticorps monoclonaux n'en ciblent qu'une seule. Après plusieurs étapes de sélection, un anticorps monoclonal sera sélectionné parmi la masse d’anticorps polyclonaux sur la base de son potentiel thérapeutique, par example le traitement de maladies inflammatoires comme la myasthénie grave. Les anticorps polyclonaux sont obtenus par immunisations de lamas, car les anticorps du lama ont une structure très proches des anticorps humains, ce qui pourrait de fait limiter les risques de rejet thérapeutique chez l’homme et accélérer le développement pré-clinique. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors d’une stimulation spécifique. Le lama ne sera pas utilisé pour la production en masse du produit thérapeutique, mais celle-ci se fera en laboratoire. L’objectif de ce projet est donc de produire des anticorps à la demande de clients (prestation de services) à but thérapeutique dans le cadre des recherches translationnelles ou appliquées réalisées par ceux-ci. La recherche translationnelle (ou recherche de transfert) se situe entre la recherche fondamentale, dont le travail consiste à comprendre les mécanismes à l’origine du développement d’un cancer par example, et la recherche clinique (ou appliquée) qui vise à évaluer l’efficacité et thérapeutique dans des champs d’application aussi variés que: La prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé ou d’autres anomalies, ou de leurs effets chez l’homme, les animaux ou les plantes. L’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez l’homme, les animaux ou les plantes. Le bien-être des animaux et l’amélioration des conditions de production des animaux élevés à des fins agronomiques. La protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal.
Bénéfices attendus
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez des patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques. Ils sont particulièrement petits, ce qui leur permet de pénétrer des tissus autrement impénétrables (barrière sang/cerveau) et de plus elles résistent à des environnements hautement acides ou des températures élevées. Leurs qualités se sont avérées très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre de nombreuses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Chaque immunisation a pour but d’augmenter la réponse immunitaire et d’accroitre l’affinité des anticorps générés par le lama pour obtenir une grande variété de candidats anticorps à portée thérapeutique. Plus le nombre de candidats est élevé, plus la chance d’avoir un anticorps efficace en clinique dans une maladie donnée est élevée.
Procédures
Au jour 0, un prélèvement de sang non-encore immunisé est prélevé du lama (durée du geste 1 à 2 minutes), après quoi l'animal reçoit immédiatement la ou les injections d’immunisation qui prennent quelques secondes. La quantité totale injectée ne dépassera pas les 4ml. L'injection du cocktail d'antigènes et de l'adjuvant est effectuée 1x/semaine ou à des intervalles de temps plus longs (2 semaines, ou jusqu’à 4 semaines dans de rares projets pour lesquels le nombre d’injections sera alors réduit à 3), répétée généralement 6 fois, rarement jusqu’à un maximum de 8 épisodes d’injections. Un prélèvement sanguin unique (1 à 2 minutes) ou à intervalles réguliers (2-4 semaines) pendant les séquences de « vaccination » pourra permettre d’évaluer la réponse immunitaire avant la fin de la procédure. Dans un délai de 4 à 14 jours après la dernière injection d'antigène, un prélèvement de sang sera réalisé en bas du cou. La prise de sang finale dure 5 à 10 minutes pendant lesquelles l'animal sera immobilisé dans un couloir de contention à l'aide d'un licol et de sangles sous-ventrières. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile.
Impact sur les animaux
L’utilisation d'un adjuvant lors des immunisations peut provoquer une réponse inflammatoire locale classique, accompagnée d'un gonflement. Comme pour toute vaccination, un épisode de fièvre peut survenir accompagnant cette inflammation. Les injections peuvent provoquer des douleurs aiguës transitoires (selon le produit injecté), ainsi qu’un inconfort dû à la contention légère nécessaire à la réalisation des gestes, un bras autour du cou pour quelques secondes. Même s’il peut y avoir un risque théorique de choc anaphylactique par l’utilisation d’un cocktail antigénique, il est finalement quasi nul, car les antigènes utilisés (protéines ou séquences ADN humaines) n'ont rien en commun avec le lama. Les prises de sang finales nécessitent une immobilisation plus longue, source d’un inconfort, voire d’un stress de 10 à 15 minutes, d’intensité et de durée variable selon les individus.
Devenir
Les femelles resteront en grande partie à l'élevage en tant que reproductrices, les mâles et les autres femelles seront placés chez des détenteurs qualifiés. Ceci après inspection par notre vétérinaire sanitaire en vue de leur état de santé et de leur socialisation.
Remplacement
Il est indispensable, du moins pour le moment, d’obtenir les anticorps polyclonaux en utilisant le système immunitaire d’animaux (in vivo). En effet, les techniques pour produire des anticorps à partir de librairies d’anticorps synthétisées (in vitro) ne sont pas encore au point et leur utilité est limitée à un nombre de domaines restreint (certains experts estiment qu’il faudrait au moins encore une dizaine d’années de recherches pour améliorer leurs capacités même dans ceux-ci). Elles génèrent des anticorps de moins bonne qualité car nous sommes encore loin de la complexité et de l’efficacité des anticorps obtenus via le système immunitaire des mammifères (ou même des humains dans le cas du covid), qui a évolué sur des millions d’années. De produire des anticorps à l’aide d’animaux fait usage d’une série de processus naturels améliorant, entre autres, leur capacité de se lier aux molécules de la maladie. Ceci car l’organisme animal est capable de sélectionner l’anticorps le mieux à même de se lier à une cible spécifique parmi mille milliards d’anticorps à l’aide un processus hautement complex, impossible à réaliser in vitro. Ce processus est déclenché par le démarrage de la réponse immunitaire de l’animal. La plus efficace des techniques in vitro arrive à gérer dix milliards. Étant donné que les anticorps des camélidés sont structurellement très proches des anticorps humains, il n'y aura que des modifications minimes qui seront nécessaires pour convertir les anticorps de lamas en anticorps pleinement tolérés par le système immunitaire humain. Ces qualités rendent les petits camélidés uniques. Les anticorps polyclonaux obtenus par immunisations de lamas sont la base pour les anticorps thérapeutiques sélectionnés (monoclonaux) qui seront séquencés et produits en masse en laboratoire (in vitro) sans utilisation d'animaux. Les anticorps prennent une place de plus en plus importante dans la recherche et les thérapeutiques humaines et vétérinaires, voir même agricoles. Nous avons donc besoin d’anticorps de la plus haute qualité. Naturellement les conditions dans lesquelles ces immunisations sont réalisés doivent obligatoirement se faire sous les meilleures conditions, afin d’éviter toutes souffrances inutiles aux animaux.
Réduction
En utilisant des cocktails de différents antigènes cibles, sous forme de protéine purifiée par exemple, le nombre d'animaux dans les essais est fortement réduit, tout en préservant le rendement expérimental. Nous visons une compatibilité suffisante des différentes protéines pour maximiser le nombre de cibles dans le cocktail. En outre le système immunitaire exceptionnellement robuste des lamas réagit en créant une palette très riche d’anticorps lors de chaque stimulation spécifique. Pour chaque expérience d’immunisation ciblée, 2 à 4 animaux maximum seront utilisés, car un individu seul pourrait produire des réactions atypiques ou non-concluantes. Le nombre d'animaux est basé sur les résultats des expériences précédentes. Des lamas non consanguins sont utilisés; donc des lamas qui sont génétiquement éloignés les uns des autres, ce qui rend leurs systèmes immunitaires plus efficaces.
Raffinement
Toutes nos installations sont conçues pour permettre aux lamas de vivre de sorte que soient respectés le mieux possible leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux sont logés en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Nous élevons des animaux de pâturage et les hébergeons sur nos 30 hectares de prairies permanentes et de bois. Dans le cours des soins de routine, nos lamas sont régulièrement manipulés. Traitements vermifuges par injections sous-cutanées et par solutions administrées oralement, tous les trois mois (Moxidectine, Praziquantel, Fenbendazol). Prises de sang pour les analyses de santé, tonte, coupe des ongles etc. La tonte annuelle étant l’intervention la plus stressante dans ce cadre, mais entièrement réalisée pour le confort des lamas, nous ne commercialisons pas la laine. Ces interventions ont comme effet collatéral d’habituer les animaux aux interventions humaines, ce qui nous permet de limiter le stress ou l’inconfort liés aux gestes d’injection ou de prélèvements sanguins répétés. Comme nos lamas sont destinés à une utilisation en tant qu’animaux de loisirs et de bât, voir de médiation animale, ils suivent également un entrainement à la longe. Nous sélectionnons nos lignées depuis plus de 30 ans selon des critères d’anatomie, de laine, de couleur, mais avant tout de caractère. Même dans ces conditions il y a toujours des individus plus sensibles que d’autres, qui auront droit à des séances d’éducation complémentaires. Nos interventions durant les procédures expérimentales prévues ne dépassent pas le cadre de ce qu’ils sont habitués à subir pour leurs soins courants et sont réalisés sur des animaux vigiles. L’impact léger de ces procédures ne donne pas lieu à prévoir des points limites, ni de traitements antalgiques. Naturellement les animaux peuvent avoir un problème de santé sans relation avec la procédure durant celle-ci, en quel cas la vétérinaire les traitera selon leurs symptômes et décidera, en consultation avec le donneur d’ordre, s’ils doivent être retirés de la procédure. Les gestes réalisés sont de nature à ne provoquer qu’un inconfort voire du stress sur les animaux les plus sensibles au contact, malgré les séances d’habituation lors des soins quotidiens.
Choix des espèces
Les lamas produisent 2 types d'anticorps : les anticorps à chaînes lourdes et les anticorps conventionnels. Les anticorps conventionnels sont très similaires aux anticorps humains. Ceci est très important car les anticorps seront utilisés comme médicament chez les patients. Plus les anticorps ressemblent à l'humain, moins il y a de réactions contre ces anticorps et donc moins d’effets secondaires indésirables apparaissent. Les anticorps à chaîne lourde ne se trouvent que dans les camélidés (lamas, alpagas) et possèdent des propriétés uniques telles que leur taille et leur stabilité. Leur spécificité et leur sélectivité se sont avérés très utiles pour diverses applications biotechnologiques. A terme, cela conduira à la mise au point de médicaments contre diverses maladies graves, telles que des cancers et les maladies auto-immunes. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin. Les lamas âgés de plus de 9 mois, mâles ou femelles, sont utilisés parce qu'ils ont un système immunitaire mature et que leur poids permet des prélèvements de sang adaptés à leur volume sanguin, c’est à dire 250ml pour les lamas de moins de 100kg et entre 250 et 400ml pour les individus plus lourds. Nos clients potentiels nous indiquent que 250ml pourraient désormais être la norme et que le maximum de 400ml sera normalement abandonné, ce qui constituerait un raffinement de la procédure.
Nouvelle approche thérapeutique dans la stéatose hépatique non alcoolique (NASH)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent pendant seize semaines un régime carencé destiné à induire une maladie du foie gras (stéatohépatite), puis des injections et des prises de sang sous anesthésie, pour évaluer des composés du laboratoire déjà engagés en essais cliniques. Le porteur indique que l'induction de la maladie provoque une perte de poids progressive, un ictère et des œdèmes, et que les prélèvements peuvent rarement entraîner une cécité. Il juge le modèle animal "indispensable" et affirme que la maladie et son traitement ne peuvent s'étudier que sur un "organisme entier".
Objectifs
La NASH, aussi appelée « maladie du foie gras » est une stéatose hépatique non alcoolique constituant un problème de santé publique dans la société occidentale. Cette maladie se caractérise par une accumulation excessive de graisse dans le foie associée à une inflammation localisée. Cette dérégulation physiologique provoque la formation de lésion et une hyperactivation du système immunitaire. La NASH est une maladie silencieuse et évolutive pouvant atteindre des stades sévères tels que la cirrhose ou le carcinome hépatocellulaire (cancer). Cette maladie touche entre 1.5 et 6.45 % de la population mondiale. Actuellement, aucun médicament n’a été approuvé par la Food and Drug Administration et par l’Agence Européenne des médicaments. La seule alternative thérapeutique efficace pour les patients est la transplantation hépatique. L’alternative médicamenteuse est primordiale pour les patients. C’est pour cette raison qu’il est urgent de développer un traitement efficace et sûr pour les patients atteints de NASH. L’efficacité thérapeutique et l’innocuité de nos composés ont été démontrées avec succès sur des modèles souris de diverses pathologies auto-inflammatoires ou auto-immunes. Grâce à ces études précliniques le laboratoire a pu engager des essais réglementaires chez l’homme. Des études cliniques ont montré que nos composés sont sûrs et bien tolérés chez l’homme. De plus, l’utilisation de thérapie cellulaire a été proposée comme alternative à la transplantation hépatique. En effet, il a été démontré que les thérapies cellulaires ont la capacité de restaurer la fonction de certains organes. Cependant, une des limitations de cette stratégie est le manque de résistance de ces cellules dans l’organisme. Les molécules sécrétées par ces cellules ont également des propriétés thérapeutiques sans les contraintes liées aux thérapies à base de cellules souches. L’objet de nos études est d’évaluer et de valider le potentiel thérapeutique de nos composés pour le traitement de cette maladie du foie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur les patients atteints de NASH. Nos travaux permettront de mieux comprendre le rôle et l’influence du système immunitaire dans le développement de cette pathologie. Nos résultats pourraient contribuer à fournir de nouvelles preuves concernant le ciblage et la régulation de l'inflammation dans la NASH, en tant qu'approche thérapeutique prometteuse. La découverte de nouveaux médicaments pour le traitement de la NASH améliorerait considérablement la qualité et l’espérance de vie des patients.
Procédures
Interventions sur les animaux : - Tous les animaux subiront un régime alimentaire modifié qui ne réponds pas à tous les besoins nutritionnels de l’animal pour induire la maladie (16 semaines maximum). - Tous les animaux subiront trois à huit injections sous anesthésie générale (1 minute/animal). - Tous les animaux subiront deux prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 minutes/animal).
Impact sur les animaux
L’induction de la NASH se manifeste par une perte de poids progressive. La NASH peut conduire à la manifestation d’ictère, d’œdème. De manière extrêmement rare, l'injection et les prélèvements sanguins peuvent conduire à la manifestation d’évènements tels qu’une hypothermie, une inflammation et une cécité. Aucun effet secondaire n’est attendu suite à l’administration des composés d’intérêts.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérience sous anesthésie générale pour le prélèvement d’organes. Nous devons collecter les organes pour réaliser des analyses. Ces analyses vont nous permettre de confirmer que la maladie qui a été induite est similaire à la maladie humaine mais également de voir si nos traitements ont un effet résolutif sur cette maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux dans ce projet est indispensable car l’apparition et la progression de la maladie impliquent le foie mais également le système immunitaire qui joue un rôle majeur dans le développement et la progression de la maladie. De plus, notre stratégie thérapeutique repose sur une modulation du système immunitaire pour réduire la progression et améliorer la résolution de la NASH. Cette étude ne peut être simplifiée en utilisant des systèmes non-animaux. Afin de comprendre le rôle joué par les différents organes et tissus de l’organisme et les mécanismes qui impliquent leur communication lors de la détermination et de la progression de la maladie, il est nécessaire d’étudier un organisme entier. Actuellement, il n’y a pas d’alternative disponible à un modèle non-animal qui puisse nous permettre de répondre à nos questions. Le modèle de souris représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes répondant aux objectifs de cette étude.
Raffinement
Pour garantir le bien-être de l’animal, nous avons défini des seuils de tolérance basés sur le poids corporel, la température corporelle. L’induction de la maladie chez l’animal est longue car nous avons choisi d’induire la maladie à l’aide d’un régime alimentaire modifié et non à l’aide de molécule hépatotoxique. Tous les animaux seront maintenus dans un groupe social et dans des cages enrichies (matériaux de nidification et tubes). Nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Toutes les injections et tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour réduire le stress ressenti par l’animal. En complément d’une anesthésie générale, un analgésique local pourra être utiliser pour limiter la douleur à l’endroit de l’injection et du prélèvement.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux de NASH disponibles, nous avons choisi d’utiliser un modèle induit par une alimentation modifiée. Ce modèle est privilégié en raison de l’apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de l'efficacité de nouvelles thérapies. Le stade de développement des animaux est de 9 semaines (souris adulte) au commencement de l’étude. De plus, il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour évaluer le potentiel thérapeutique de nos composés.
Caractérisation des cellules immunitaires néonatales et de leur rôle dans le développement de maladies chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, une partie d'entre elles tuées sans réveil. Elles reçoivent des injections de cellules et d'antibiotiques, puis des molécules induisant une colite ou une réaction allergique de type asthme, avec perte de poids et inflammation intestinale ou pulmonaire déclarées. Les stimulations sont appliquées au stade néonatal et les effets étudiés à l'âge adulte. Le porteur décrit ces modèles comme reproduisant les maladies inflammatoires humaines et affirme que le modèle animal est "incontournable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant la résidence des cellules immunitaires pendant cette période.
Objectifs
Les objectifs du projet sont : -Identifier des nouveaux types de cellules immunitaires adultes établissant résidence dans les tissus muqueux pendant la période néonatale par injection de cellules marquées chez la souris. - Identifier la capacité des cellules immunitaires adultes établissant résidence dans les tissus muqueux pendant la période néonatale à être régulées par le microbiote sur le long terme par administration d’antibiotiques. -Caractériser la fonction des cellules immunitaires adultes établissant résidence dans les tissus muqueux pendant la période néonatale dans des modèles expérimentaux murins de colite et d’asthme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet expérimental sont doubles : caractériser des nouvelles cellules immunitaires participant à l’inflammation des muqueuses et identifier de nouveaux marqueurs cellulaires pour prédire, diagnostiquer et traiter les maladies inflammatoires chroniques intestinales et l’asthme chez l’homme.
Procédures
Des cellules seront injectées aux souris pendant 10 secondes. Les antibiotiques seront administrés dans l’eau de boisson pendant 14 jours. Une molécule permettant de générer une colite sera administrée dans l’eau de boisson pendant 7 jours. Une molécule préparant une réaction du système immunitaire sera appliquée sur la peau pendant 60 secondes. Une molécule provoquant une réaction du système immunitaire sera injectée pendant une durée de 60 secondes sous anesthésie générale. Une molécule provoquant une réaction allergique sera injectée pendant une durée de 60 secondes pendant 20 jours répartis sur 4 semaines sous anesthésie générale. Un prélèvement unique de sang sera effectué et durera approximativement 10 secondes avec analgésie locale.
Impact sur les animaux
5 nuisances : (1) Les traitements antibiotiques peuvent engendrer des diarrhées modérées. Durée : 14 jours (2) Les injections de cellules peut provoquer un stress modéré et bref. Durée : 10 secondes (3) L’administration orale de molécule irritante par l’eau de boisson entraine une réaction inflammatoire de l’intestin et une perte de poids. Durée : 7 jours (4) L’application cutanée suivi de l’injection d’une molécule provoquant une réaction du systéme immunitaire entraine une réaction inflammatoire de l’intestin et une perte de poids. Durée : 8 jours (5) L’administration d’une molécule provoquant une réaction allergique entraine une réaction inflammatoire des poumons. Durée : 28 jours
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus pour analyse.
Remplacement
Il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour étudier la résidence tissulaire pendant la période néonatale. Le modèle animal est incontournable à l’heure actuelle. Les modéles et injections prévues dans notre projet ont été préalablement étudiés et validés chez la souris. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé en première intention est le modèle murin. Les modèles experimentaux murins d’inflammation intestinale utilisés miment les maladies inflammatoires chroniques intestinales humaines. Le modèle murin d’allergie utilisé provoque une réaction inflammatoire mimant l’asthme humain.
Réduction
Les différentes étapes du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Des analyses de données de groupe et des expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité et les expériences seront réalisées en aveugle pour éviter les biais. Les modéles d’inflammation intestinale et d’allergie seront utilisés en fonction de l’identification des cellules cibles. Si un ou plusieurs de ces modèles ne correspondent pas aux critéres d’activation des cellules d’intérêt, ils seront abandonnés. Les mêmes souris seront utilisées pour la préparation des injections pour réduire le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une cage contenant une litière de sciure de peuplier dépoussiérée ainsi qu’un tunnel en carton, un cylindre de cellulose et un bout de bois favorisant l'expression de comportements et d'activités mentales qui sont appropriés à l'espèce murine. Dans ces expériences, les souches de souris et les âges de prélèvement ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation. L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés. Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie lors de l’instillation intranasale, anesthésie avec analgésie lors de l’injection intrarectale, limitation au minimum des temps de contention et surveillance accrue après chaque geste. Une grille de scoring sera utilisée pour évaluer le stress. La procédure sera arrétée et les animaux mis à mort lorsqu’un des points limites sera observé.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de choix pour l’étude des cellules immunitaires en raison de i) l'excellente caractérisation du développement immunitaire murin, ii) la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables, iii) la validation et publication des modéles experimentaux chez la souris mimant les pathologies humaines de maladie inflammatoire chronique et d’asthme. Les souris sont stimulées au stade néonatale et étudiées au stade adulte car ceux sont deux périodes liées au développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales et d’asthme chez l’homme.
Mise en place et caractérisation d’un modèle inflammatoire aigu de l’intestin chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
3 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit dans le rectum, sous anesthésie, une substance chimique destinée à provoquer une inflammation de l'intestin proche de la maladie de Crohn, puis un candidat médicament par injection ou par gavage. Le porteur indique que l'inflammation provoque une perte de poids, des diarrhées et du sang dans les selles, et que le gavage peut entraîner ulcération ou saignement. Il justifie l'usage de la souris par la nécessité d'étudier l'intestin dans un "organisme entier" et reste bref sur le choix de l'espèce, présentée comme "communément utilisée".
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l’intestin et notamment la maladie de Crohn se caractérisent par une inflammation discontinue de la muqueuse intestinale et restent présentes chez les personnes atteintes, sans guérison complète. Les traitements existants permettent d’atténuer les effets secondaires mais sont insuffisants pour un traitement de fond de ces pathologies et peuvent entraîner des complications comme des maladies infectieuses et augmenter les tumeurs malignes. Ce projet a pour but de provoquer une inflammation similaire chez la souris afin de mimer certains symptômes caractéristiques de la maladie chez l’homme et évaluer l’efficacité d’un nouveau composé thérapeutique dans le traitement de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’identifier et reproduire chez le petit animal, les mécanismes impliqués au cours de la maladie chez l’homme. Il s’agit d’une étape préliminaire au développement d’une nouvelle thérapie dans le traitement de l’inflammation afin d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration d’une substance chimique par le rectum sur une minute pour provoquer l’inflammation de l’intestin. Cette administration se fera de façon unique. L’administration de la substance chimique dans le rectum sera conduite sous anesthésie générale. Les animaux recevront un seul traitement de candidats médicaments soit par injection unique dans le péritoine soit par gavage mais de façon vigile dans les deux cas, chacun de ces deux gestes étant réalisé en moins de vingt secondes.
Impact sur les animaux
L’utilisation d’agent chimique pour provoquer l’inflammation entraîne une perte de poids, ainsi qu’une modification de l’aspect et de la consistance des selles. Les candidats médicaments ont été testés au préalable sur des cellules pour s’assurer de la non toxicité de ces produits et de leur efficacité pour bloquer la réponse inflammatoire. Cependant il s’agit de premières études menées chez les animaux et nous ne pouvons exclure le fait que ces candidats puissent entraîner une toxicité chez l’animal au moment de l’injection se traduisant par les symptômes cutanés suivants : irritation, démangeaison, piloérection, gonflement ou rougeur passagère. Des nuisances telles que rougeur, induration, crampes abdominales, ulcération, fausse route, ou encore présence de sang lors du retrait de la sonde de gavage sont à prendre en compte comme effets indésirables liés aux gestes techniques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses post-mortem.
Remplacement
Les modèles cellulaires existants permettent de mimer l’architecture du tissu intestinal et l’interaction entre les cellules. Si ces outils sont efficaces pour étudier les mécanismes simples entre les cellules, ils sont toutefois insuffisants pour modéliser le microenvironnement de l’organe d’intérêt et son interaction dans un organisme entier. Le recours aux animaux permet de modéliser cette interaction à l’échelle de l’organisme de façon plus pertinente. De plus, les symptômes liés aux maladies inflammatoires et l’impact thérapeutique sur l’amélioration de ces symptômes ne peuvent être mesurés que sur des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été calculé pour collecter suffisamment de données qui seront analysées à l’aide d’outils statistiques permettant de répondre aux hypothèses et objectifs scientifiques définis dans ce projet. Cette estimation a été déterminée à partir d’études décrites dans la littérature scientifique faisant référence à ce modèle inflammatoire. Néanmoins les paramètres expérimentaux varient d’une étude à l’autre. Nous avons donc envisagé une étude pilote pour déterminer les conditions expérimentales optimales afin d’obtenir un modèle d’étude stable sur lequel s’appuyer pour évaluer les propriétés anti-inflammatoires de nos candidats médicaments. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe a été estimé afin d’évaluer la réponse inflammatoire au cours du temps selon des analyses statistiques et selon la dose de substance inflammatoire injectée. Le nombre d’animaux est défini selon deux critères : la dose et le temps. 4 doses et six points de temps ont été déterminés à partir de données issues de la littérature. Suite à cette étude pilote, le modèle sera reproduit pour évaluer le potentiel thérapeutique anti-inflammatoire des candidats médicaments. Le nombre d'animaux a été estimé selon les groupes nécessaires à la réalisation de l’étude. Ces groupes sont définis selon le type de candidats et la dose à laquelle ils seront administrés. Les candidats seront évalués selon deux doses chacun. Les résultats attendus à l’issue de ces études sont une atténuation de la réponse inflammatoire et une amélioration des symptômes chez l’animal. Ce projet prévoit une répartition équivalente de mâles et de femelles dans chaque groupe pour vérifier un effet sexe potentiel sur la réponse inflammatoire.
Raffinement
L’environnement des animaux sera enrichi de coton, d'abris et d’objet afin de subvenir au bien-être animal. Une période d’acclimatation de sept jours est prévue à l’arrivée des animaux avant le début de la procédure. Une phase d’habituation à la contention sera également faite sur cinq jours consécutifs afin de limiter le stress de l’animal avant une injection. L’administration de la substance inflammatoire sera réalisée sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle de l’animal. Un suivi quotidien sera effectué et une médication adaptée sera également proposée dans le cas d’effets indésirables. Une grille d’évaluation basée sur l’aspect et le bien-être animal permettra si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal. Les points limites définis dans chaque procédure, permettront si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal.
Choix des espèces
La souris utilisée dans le cadre de ce projet est une espèce communément utilisée car favorable au développement de l’inflammation. Il s’agit d’une espèce particulièrement adaptée au développement du modèle de maladie digestive inflammatoire.