Troubles gastrointestinaux

7 020 animaux non-humains, 5 460 souris et 1 560 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les modèles, ils subissent une ligature chirurgicale du canal biliaire, des injections répétées de tétrachlorure de carbone ou d'autres composés, puis des traitements par de multiples voies pouvant aller jusqu'à deux administrations par jour, pour reproduire des maladies chroniques du foie. Le porteur affirme que ces maladies ne sont pas associées à une douleur chez l'humain et n'en attend donc pas chez l'animal, malgré l'induction d'inflammation et de fibrose hépatiques. Il conclut au caractère de "stricte nécessité" du modèle animal, jugé irremplaçable pour examiner l'"animal entier".

Objectifs

Les maladies hépatiques cholestatiques chroniques regroupent 2 formes majeurs chez l’adulte : la cholangite biliaire primitive (PBC) et la cholangite sclérosante primitive (PSC). Ce sont toutes les 2 des maladies rares qui endommagent les canaux biliaires entrainant une accumulation de bile au niveau du foie. Cette accumulation entraine de l’inflammation, de la fibrose et peut éventuellement mener à la cirrhose du foie et à une insuffisance hépatique. Concernant la PBC, seuls les canaux intra-hépatiques sont touchés alors que ce sont les canaux intra- et extra-hépatiques qui sont impactés par la PSC. Ces maladies sont asymptomatiques au stade précoce puis les personnes atteintes peuvent présenter un état de fatigue, du prurit, la jaunisse et un inconfort abdominal. L’estimation de la survie moyenne à partir du diagnostic de la maladie est de 15 à 20 ans. A ce jour, il n’existe qu’un seul traitement capable de traiter la PBC et approuvé par les autorités américaines: l’acide ursodesoxycholique (UCDA). Malheureusement, plus de 40% des patients traités n’y répondent pas et nécessitent l’ajout d’un traitement de 2eme intention (comme l’acide obéticholique) engendrant beaucoup de toxicité et d’effets secondaires. De plus, même après une transplantation hépatique de dernier recours, il y a une forte probabilité de récurrence de la maladie. En ce qui concerne la PSC, aucun traitement n’a encore été approuvé et il devient donc urgent de développer de nouveaux médicaments permettant de traiter et d’améliorer la qualité de vie des patients touchés par ces pathologies. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la maladie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies hépatique cholestatiques chroniques avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans les cholestases chroniques hépatiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs enzymatiques, anticorps) ou par analyse histologique (inflammation et fibrose du foie).

Procédures

Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit des injections systémiques toutes les 2 semaines de 2OA-BSA et 3 injections d’αGalCer (procédure 1), soit des injections systémiques 2 fois par semaine de tétrachlorure de carbone (procédure 3), soit une ligation du conduit biliaire par méthode chirurgicale (procédure 4) pour induire la pathologie. Les procédure 1 et 3 se feront sur animaux vigiles et de manières répétées tandis que pour la procédure 4, l’induction se fera chirurgicalement de manière unique sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront de l’adjuvant de Freund et du sérum physiologique ou de l’huile de maïs ou opéré à blanc selon la procédure correspondante. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutané, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique (procédure 5). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une maladie hépatique cholestatique chronique associée à une élévation des enzymes hépatiques et des complications aux long terme telle qu’une hypertension portale et des dommages ou de la fibrose du foie. Cette condition n’est habituellement pas associée à une douleur chez l’homme et n’est donc pas non plus attendue chez l’animal. Aucune complication sévère au long terme, ni autres effets indésirables, ne sont attendus aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer différents organes, dont le foie, pour analyses histologiques ou autre.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation et la fibrogenèse implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie des cholestases chroniques hépatiques. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages hépatiques pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée avec le test des rangs de Kruskal et Wallis (nonparametric Kruskal-Wallis one-way analysis of variance (Dunn’s post test)). Si deux groupes sont comparés, un test t pour séries non appariés (Mann-Whitney) sera réalisé. Une valeur significative sera considérée si p < 0.05.

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’analgésiques n’est pas nécessaire pour les modèles inductibles chimiquement étant donné que ce sont des modèles chroniques à long terme et qu’ils ne sont pas supposé induire de douleur notable chez les animaux. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de cholestases chroniques en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat SD est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6, Balb/c et SWISS représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime enrichi en DDC leur provoque une cholestase du foie, puis elles reçoivent sept injections intra-péritonéales hebdomadaires et subissent sept prélèvements sanguins par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, avant un prélèvement terminal par ponction cardiaque. Le projet teste un anticorps pour élargir les indications d'un traitement déjà en développement clinique. Le porteur affirme qu'aucun test sur cellules ne reproduit la fibrose du foie et que les maladies hépatiques "ne sont pas douloureuses".

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier le potentiel thérapeutique d'un anticorps monoclonal ciblant la protéine de jonctions serrées Claudine-1 pour le traitement des cholestases hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet doit nous permettre de démontrer l'eeficacité de notre anticorps anti-Claudine 1 dans les cas de fibrose induits suite au développement d'une cholestase hépatique. Cet anticorps étant déja en développement clinique pour le traitement de la fibrose dans les cas de stéato-hépatite non alcoolique et pour le traitement du carcinome hépatocellulaire, cette étude nous permettrait d'envisager une extension des indications thérapeutiques afin de faire bénificier un maximum de patients de cette option de traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection IP hebdomadaire sur animal vigile pendant 7 semaines, soit 7 injections. Les animaux subiront un prélèvement sanguin hebdomadaire, sur animal anesthésié à l'isoflurane et ayant reçu une analgésie locale à la tétracaïne 1% en collyrepar, voie rétro-orbitaire pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole, sur animal anesthésié à l'isoflurane, par ponction intracardiaque trans-thoracique.

Impact sur les animaux

Les animaux qui seront sous nourriture + DDC pendant 8 semaines, vont développer une cholestase hépatique rapide en 2 à 4 semaines. Les maladies hépatiques ne sont pas douloureuses est sont compatibles avec une vie normale, sauf en cas extrême de décompensation des fonctions hépatiques, ce qui ne sera pas le cas avec le protocole adopté dans ce projet. Les animaux recevront un total de 7 injections IP d'anticorps ou de véhicule, soit 1 par semaine pendant 7 semaines, ce qui ne devrait engendrer aucune douleur ni souffrance sur la durée du protocole.

Devenir

Afin d'analyser l'effet thérapeutique de notre anticorps sur la fibrose hépatique, tous les animaux de chaque groupe devront être sacrifié afin de procéder à la collecte du foie et à un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvement nous permettront d'analyser les fonction hépatiques (sérum) et le niveu de fibrose hépatique suite au traitement (marquage histochimique du foie).

Remplacement

Il n’existe actuellement aucun test in vitro capable de récapituler la complexité du développement de la fibrose hépatique, notamment dans les cas de cholestases hépatiques qui impliquent l’obstruction des voies biliaires. Ainsi l’évaluation thérapeutique de nouvelles approches pour ces maladies hépatiques ne peut se passer de l’utilisation d’animaux.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’activité anti fibrotique de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. Nous utiliserons un total de 60 animaux répartis en 3 groupes, traité anticorps spécifique, anticorps isotypique et non traité.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi (souris + nourriture 0,1% DDC) permet de récapituler au plus proche les caractéristiques histologiques des cholestases hépatiques humaines en 4 à 8 semaines. Hormis le modèle de ligature du canal biliaire, beaucoup plus invasif, c’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une cholestase hépatique. Les animaux seront utilisés à un âge de 8 semaines afin d’induire une cholestase hépatique adulte.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin leur est provoquée par un agent chimique, par gavage d'une bactérie ou par injection de cellules inflammatoires, puis des composés leur sont administrés par gavage. Le porteur indique que les animaux développeront les signes des maladies inflammatoires de l'intestin, diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours aux modèles animaux d'"indispensable" pour tester des molécules déjà "testées et validées in vitro", les bénéfices pour les patients restant renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires. Certains de ces modèles utiliserons des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable.. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analagésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la toxine cholérique par gavage une fois par jour pendant quatre jours, avec un double gavage le dernier jour, puis sont mises à mort six heures après pour prélever l'intestin, afin de comparer des substances mucoprotectrices contre la diarrhée. Le porteur indique que la toxine peut provoquer diarrhée, déshydratation, douleur intestinale et perte de poids, effets qu'il décrit comme transitoires et réversibles. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal donne une image intégrée des dommages intestinaux que les approches sans animaux ne reproduiraient pas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’évaluer et de comparer les effets de différentes substances mucoprotectrices (polysaccharrides naturels qui adhèrent au mucus) et leurs associations sur la sécrétion d’eau provoquée par la toxine cholérique dans un modèle d’anse intestinale ouverte chez la souris C57Bl6J.

Bénéfices attendus

La gastro-entérite aiguë caractérisée par une diarrhée reste un motif fréquent de consultation en Occident, et demeure une cause de mortalité dans les pays en voie de développement. La réhydratation orale est le traitement de première intention pour la prévenir ou la traiter. Cependant, la thérapie de réhydratation orale ne réduit pas la fréquence des selles et la perte de liquide et ne raccourcit pas la durée de la maladie. Ainsi les professionnels de la santé s'intéressent à la mise au point de nouveaux produits, à visée préventive et curative, efficaces et peu coûteux qui pourraient renforcer l'effet de la thérapie de réhydratation orale.

Procédures

Les animaux sont soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 4 jours (0.15 ml) et, le dernier jour, un deuxième gavage est effectué 20 min après le premier (0.1 + 0.1 ml). Ils sont mis à mort 6 heures après le dernier gavage.

Impact sur les animaux

La toxine cholérique chez la souris induit une hypersécrétion d’eau dans l’intestin 6 heures après son administration par voie orale. Cela peut donc entrainer, une diarrhée, une déshydratation, une douleur intestinale, une diminution d’activité, une perte de poids. Ces effets sont en général transitoires et réversibles sans autre traitement.

Devenir

Les souris seront sacrifiées 6 h après traitement par la toxine cholérique et des analyses post-mortem seront effectuées. D'une part l’intestin sera clampé au niveau du pylore et du caecum, débarrassé du tissu mésentérique et prélevé. La quantité d’eau secrétée dans la lumière intestinale sera évaluée par pesée du segment intestinal clampé plein, moins le poids de celui-ci vidé. L’état de la muqueuse intestinale par établissement de scores histologiques à partir d’un segment intestinal prélevé après la fin de la mesure de la quantité d’eau secrétée.

Remplacement

Le modèle animal mime les principales caractéristiques de la diarrhée induite par des toxines bactériennes incluant la toxine cholérique et donne une image intégrée des dommages intestinaux provoqués. Parmi ces caractéristiques figurent la sécrétion d’eau et les altérations de la muqueuse intestinale associées (altération des villosités, infiltration par des immunocytes augmentation de la perméabilité intestinale par rupture du complexe des protéines de jonctions serrées intercellulaires…) qui sont les résultats des régulations neuro-humorales et de ce fait observable à l’aide du modèle intégré qu'est le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur des études utilisant le même modèle. Ces effectifs (n=12) sont suffisants pour atteindre une validité statistique.

Raffinement

Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées optimales et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger et un abri en inox leur permettra de s’y loger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.

Choix des espèces

Les souris C57Bl6 sont communément utilisées pour mimer des conditions physiopathologiques observées chez l’homme et appréhender les mécanismes d’action impliqués. Elles sont ainsi utilisées pour l’exploration de la physiopathologie digestive. Le modèle de diarrhée induite par la toxine cholérique ainsi que le modèle de anses ouvertes chez la souris C57Bl6 est décrit et validé par la communauté scientifique (Finkelstein, R 1976, Stephen H. et al. 1983, R.A.Fenton 2019). Les animaux seront des souris C57Bl6J adultes de 5 à 6 semaines (environ 20 à 25g). L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer différentes substances mucoprotectrices sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte

200 primates non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 150 macaques à longue queue, 25 macaques rhésus et 25 singes vervets. Chaque animal reçoit une administration de virus AAV par voie intraveineuse ou intrathécale, suivie de prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, certains protocoles retirant jusqu'à 20 % du volume sanguin, avant une mise à mort pour analyser la répartition du virus dans les organes. Le porteur juge peu probables les effets secondaires des AAV rendus non réplicatifs et signale surtout un stress lié aux contentions et aux gestes. Il affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" et retient le primate pour sa proximité immunitaire avec l'humain, au service du développement de thérapies géniques.

Objectifs

Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution dans les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Les virus adéno-associés (AAV) sont un vecteur viable de transfert de gènes. Ils peuvent être conçus pour transporter des séquences d’ADN thérapeutiques dans le noyau de différents types de cellules (hépatiques, musculaires, ou nerveuses par exemple). Leur nature réplicative-déficiente et l'inactivation des outils moléculaires liés à l'inclusion de ces virus dans le génome humain leur donnent un profil de sécurité particulièrement intéressant pour leur utilisation clinique chez l'homme. Selon les types d'AAV, naturels ou chimériques, leur tropisme et leur profil d'infection dans divers organes va être complètement différent. Les phases de développement d'un AAV thérapeutiques passent donc par une phase de "screening" de candidats virus, dont le but est d'évaluer la biodistribution de ceux-ci dans diverses structures biologiques d'intérêts. La proximité immunitaire des singes avec l'humain fait de ces espèces un modèle intéressant et prédictif de la biodistribution attendue chez les patients.

Bénéfices attendus

Les AAV sont utilisés en thérapie génique comme "moyen de transport" pour amener du matériel génétique dans les cellules cibles. Cette étude permettra de sélectionner les « constructions » d'AAV pour traiter des maladies spécifiques, grâce à la distribution d'un transgène thérapeutique dans un tissu particulier.

Procédures

Après une période d’acclimatation de 15 jours minimum, les animaux recevront une unique administration de l’AAV par voie intraveineuse ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre et en accord avec les procédures de l’entreprise. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur selon la voie d’administration utilisée (iv bolus : 5mL/kg maximum et IT bolus : 1mL/animal maximum). Les administrations étant des bolus, elles seront de courte durée (< 5 minutes). Les administrations intraveineuses seront réalisées dans la mesure du possible sur animal vigile, les administrations intrathécales seront réalisées sous anesthésie. Suite à chaque administration, des prélèvements (principalement de sang ou LCR) seront effectués afin d’analyser les biomarqueurs liés à l’infection par l’AAV dans le sang. Les recommandations suivantes seront suivis pour la récolte de sang (7,50 % du VSC suivi d’un repos de 7 jours ; 10% du VSC suivi d’un repos de 2 semaines; 15% du VSC suivi d’un repos de 3 semaines; 20% du VSC suivi d’un repos de 4 semaines ou suivi d'une euthanasie dans les 24h). Les prélèvements de sang sont de courte durée (

Impact sur les animaux

Les AAV injectés étant des espèces non pathogènes, il est peu probable d’avoir des effets secondaires. En effet, les possibles transgènes inclus dans ces virus sont soit des séquences "rapporteuses" permettant l'identification ou la localisation du virus, ou bien des gènes codant pour des protéines humaines. En termes de contamination et multiplication, ces virus sont rendus inoffensifs et n'ont pas la possibilité de se reproduire ou de s'intégrer au génome de l'hôte. Mise à part des réactions locales au niveau des sites d'administrations et éventuellement une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations. De plus, la procédure d'injection elle-même peut potentiellement induire des effets secondaires en cas de mauvaise manipulation. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude dans le but de récolter les organes et analyser la biodistribution des AAV dans les différents tissus.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapie. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique.

Réduction

Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables. Une sérologie sera réalisée sur plus d'animaux que necessaire à l'étude. Au jour de l'infection, seul le nombre d'animaux necessaire à l'étude seront injectés. Au vu du faible nombre d'animaux par groupe, aucun test statistique ne sera réalisé.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètres hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides pour le suivi du viscérotropisme et du neurotropisme permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations (notamment en cas d'utilisation de la chaise à contention pour habituer l'animal à être dans cette chaise avant le jour de l'administration). Pour certains actes (LCR, administration intratécal,...), les animaux seront anesthésiés (ex: kétamine / midazolam) et recevront un analagésique (type buprénorphine) afin de palier toute douleur lié à l'acte. Les points limites décrits dans le projet permettront de décider l'euthanasie anticipé d'un animal en cas de souffrance.

Choix des espèces

Le primate non humain est un modèle de choix dans l'évaluation préclinique pour évaluer le tropisme des virus recombinants, car les AAV sont connus pour infecter largement les primates non humains et les humains (la preuve en est qu'une forte proportion des singes est séropositives pour certains types d'AAV). Nous devons utiliser des animaux qui sont évolutivement plus proches de l'homme et donc plus susceptibles de représenter fidèlement la machinerie cellulaire impliquée dans la transduction et d'autres aspects de la biologie du virus/vecteur et de l'hôte. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. De juvéniles à adultes matures selon les questionnement scientifique de l'étude.

20 primates non-humains, dix macaques à longue queue et dix macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort à l'issue. Chaque animal subit neuf examens d'imagerie sous anesthésie générale pouvant durer jusqu'à cinq heures, avec pose d'une voie artérielle et prélèvements sanguins, pour suivre la distribution de radiotraceurs et de candidats médicaments. Le porteur reconnaît que ces anesthésies répétées et longues peuvent être fatigantes et prévoit la réutilisation des animaux sur décision du vétérinaire. Il retient le primate non-humain pour la proximité de sa physiologie avec celle de l'humain, afin d'extrapoler les résultats.

Objectifs

L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments pour traiter des maladies telles que le diabète, certains cancers et des pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Pour y parvenir, nous synthétiserons des composés radiomarqués que nous injecterons à des primates non humains. La distribution tissulaire sera suivie grâce à une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes à demi-vie courte utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant à chacun des isotopes utilisés. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés ciblent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Il peut s’agir également de candidats médicaments neuroprotecteurs. Trois séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqués dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations indispensables sur l’exposition tissulaire aux doses de radiotraceurs et sur les spécificités de la distribution tissulaire et de l’élimination des candidats médicaments étudiés. Ces résultats peuvent être extrapolés chez l’Homme.

Procédures

Les animaux auront une séance d’imagerie anatomique (IRM) puis trois séances d’imagerie dynamique (TEP) par radiotraceur. Toutes les imageries (IRM et TEP) se dérouleront sous anesthésie générale (durée 300 minutes maximum) pour une acquisition d’une durée de 240 minutes maximum. Il n’y aura pas de prélèvements sanguins pendant l’imagerie IRM, par contre il y aura des prélèvements sanguins à chaque imagerie TEP qui seront séparés de 15 jours au minimum. Une voie artérielle sera positionnée en début d’anesthésie (durée de la pose inférieure à 5 minutes) afin de faire les prélèvements sanguins (durée inférieure à 5 secondes) durant l’examen. Cette voie artérielle sera retirée à la fin de l’examen. Pour 1 des 3 imageries TEP, les animaux recevront une dose pharmacologique du candidat médicament par injection intraveineuse sur 1 minute.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable prévu est un stress associé à la contention physique (durée inférieure à 2 minutes) qui précède l’injection de l’anesthésique par voie intra-musculaire ainsi qu’un stress pendant la phase de réveil (durée inférieure à 1 heure). La réalisation d’anesthésies répétées et relativement longues avec injections des médicaments et prélèvements sanguins, peut être fatigante pour l’animal. La mise à jeun la veille au soir pour le lendemain matin et le contrôle hydrique 2 heures avant l’induction de l’anesthésie, peuvent constituer des stress modérés.

Devenir

Le protocole expérimental ne nécessite pas d’euthanasier les animaux. Les animaux pourront être réutilisés sur décision du vétérinaire à la fin de l’étude.

Remplacement

Compte-tenu de la complexité des phénomènes étudiés, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les effets d’un candidat médicament sur un organisme entier et permettre ainsi d’extrapoler les résultats à l’Homme. Afin d’obtenir des données convaincantes d’un point de vue clinique, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier dont l’anatomie et la physiologie se rapprochent au maximum de celles de l’Homme. Cette étude ne peut être envisagée qu’in-vivo chez des primates non-humains dont les déterminants pharmacocinétiques et la physiologie sont plus proches de ceux de l’Homme que ceux des rongeurs.

Réduction

L’approche statistique envisagée permet la comparaison des trois conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable, global ou régional. Cette estimation prend en compte la variabilité des mesures observées lors d’études précédentes réalisées chez les primates non-humains. Dans une perspective de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude, seulement 20 primates non-humain seront inclus. Chaque animal participera à 9 examens afin d’obtenir des données répétables et représentatives des phénomènes étudiés.

Raffinement

Pendant toute la durée de cette étude, il y aura la mise en place d’un renforcement positif avec un remplacement hebdomadaire (physique) et journalier (alimentaire, sensoriel) des enrichissements de l’environnement. Les primates non-humains seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs. Toutes les procédures expérimentales se réalisent sous anesthésie générale. Juste avant le début de la procédure, un examen clinique de l’animal sera systématiquement réalisé. Durant les examens d’imagerie, la température corporelle est monitorée et maintenue à l'aide d'une couverture chauffante à air, suppléée par une perfusion de liquide à 37°C. Les paramètres physiologiques et de ventilation sont suivis et sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Durant ces examens la surveillance des animaux est renforcée jusqu’au réveil complet de l’animal (animal debout). Certains animaux possèdent une sensibilité accrue aux agents anesthésiants. Des protocoles ont été mis en place afin d’identifier et de prévenir cette susceptibilité.

Choix des espèces

La physiologie des barrières biologiques des primates non-humains est plus proche de celle des primates humains que de celle des rongeurs. Les niveaux d’expression de nombreux transporteurs de radiotraceurs sont très différents entre les Hommes et les rongeurs. Il a été montré que les primates non-humains constituent un modèle plus prédictif de l’activité de ces transporteurs lors des études de pharmacocinétique. Aussi, afin d’étudier les effets de ces transporteurs sur la pharmacocinétique des médicaments et extrapoler les résultats chez l’Homme, l’utilisation de primates non-humains est particulièrement pertinente. Le projet sera conduit sur des individus adultes, car nous avons besoin que l’ensemble des tissus d’intérêts soit pleinement développés (mature).