Troubles gastrointestinaux

600 souris, dont des souris au foie humanisé, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de virus des hépatites B et C, des plasmides et des composés par gavage jusqu'à deux fois par jour, puis des prélèvements sanguins répétés, pour tester des candidats médicaments. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer douleur, perte de poids et difficultés à se déplacer. Il affirme que les modèles murins constituent une approche "indispensable" quand la culture in vitro ne recrée pas les interactions d'un organe fonctionnel.

Objectifs

Bien qu’un vaccin et des traitements anti-viraux existent contre le virus de l’hépatite B et de l’hépatite C, plus de 250 millions de personnes dans le monde vivent avec une infection chronique, ce qui les exposent à un risque grave de cirrhose voire de cancer. La recherche de nouveaux traitements pour ces maladies est donc essentielle. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d'étude de l'hépatite B et de l’hépatite C, en inoculant le virus à des souris, en particulier des souches possédant un foie humanisé. Ce modèle sera utilisé, non seulement pour la compréhension de cette pathologie, mais aussi pour le développement de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

En utilisant des souris au foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier l'hépatite B et l’hépatite C et d'évaluer les effets toxicologiques et thérapeutiques de candidats médicaments déstiné à lutter contre cette pathologie avec davantage de spécifité de l'espèce cible de ces recherches : l'Homme.

Procédures

Injection intraveineuse d’adénovirus, injection hydrodynamique de plasmides, injection intraveineuse de surnageant. Chacune de ces injections sera d’une durée de 10 à 15 secondes. Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes d'administration seront déterminés sur base du poids de la souris. A titre d’exemple, le volume maximum prélevé sera de 100 μL par semaine pour une souris de 25 gr. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. L’administration de composés de recherche : réalisée par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-musculaire). Les volumes à administrer seront préétablis par le vétérinaire d’établissement et le comité de bien-être. A titre d’exemple, pour une souris de 20 g, la limite d’administration sera de 400 μL per os; 200 μL par voie sous-cutanée; 200 μL par voie intrapéritonéale; 50 μL par voie intramusculaire et 200 μL par voie intraveineuse. La durée des administrations est de 10 à 15 secondes. Le nombre de gavage maximal autorisé sera de 2 par jour.

Impact sur les animaux

De la douleur peut être induite par : l'inoculation virale intraveineuse, l'injection hydrodynamique intraveineuse de plasmides, les prélèvements sanguins et l'injection et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux étant infectés par des virus humains, ils seront euthanasiés.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, lorsqu’il n’est pas possible de recréer in vitro les interactions complexes qui peuvent exister entre un organe fonctionnel, une pathologie et les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux les impliquant, les modèles murins constituent une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 600 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 20 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Celle-ci sera objectivée par une échelle de score adaptée aux études en infectiologie. Le vétérinaire aura pleine autorité pour envisager un traitement anti-douleur ou une euthanasie de la souris pour raison éthique s’il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Deux modèles murins d’infection par le virus de l’hépatite B sont décrits dans la littérature et ont démontré leur efficacité pour prédire l’activité thérapeutique de candidats médicaments. De plus, nous maîtrisons l'humanisation du foie chez les souris. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. La procédure expérimentale requiert des animaux adultes utilisés à l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non- humanisés et 15 à 18 semaines pour les animaux humanisés.

1 800 rats vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue et vingt réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des antibiotiques puis des gavages quotidiens de probiotiques pendant six semaines, avec des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester des produits censés limiter les effets digestifs des antibiotiques. Le porteur indique que les antibiotiques peuvent provoquer perte de poids et diarrhées et que les gavages répétés génèrent stress et irritations, le tube digestif étant prélevé après mise à mort. Il affirme que la physiopathologie digestive ne peut pas être reconstituée hors de l'animal vivant.

Objectifs

En clinique, il existe différents effets secondaires induits par un traitement antibiotique : par exemple, une diarrhée survient chez 10 à 25% de patients traités avec l’association amoxicilline/acide clavulanique qui est très largement prescrite dans le monde. 5 à 10% des patients traités à l’ampicilline ont également des diarrhées. Il existe d’autres effets secondaires comme les crampes abdominales, une fièvre ou une leucocytose. Un traitement antibiotique peut également provoquer un risque accru d’infection par des organismes pathogènes. Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui peuvent avoir un effet protecteur sur les effets délétères induits pas les antibiotiques. Ce projet a pour but d’étudier les effets protecteurs de molécules probiotiques sur les effets secondaires gastro-intestinaux induits par différents antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de produits sur les effets secondaires induits par l’utilisation d’antibiotiques sur certains paramètres physiologiques (prise alimentaire, consistance des fèces, altération de la barrière intestinale) et sur la composition du microbiote et du métabolome intestinal. Ces données permettront de supporter le développement ou l’utilisation de produits pour limiter les effets secondaires de l’usage d’antibiotiques.

Procédures

Certains traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 6 semaines maximum. Certains paramètres mesurés nécessitent un prélèvement sanguin. L'animal sera anesthésié avant celui-ci. Le prélèvement sanguin aura lieu au maximum une fois par semaine avec une semaine de récupération entre chaque prélèvement minimum et au maximum pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’administration d’antibiotiques peut entrainer une perte de poids et des diarrhées. Les rats seront observés attentivement pour respecter les points limites. L’administration répétée par gavage peut générer du stress et entrainer des irritations. Les traitements seront effectués par une personne expérimentée afin de limiter l'angoisse des animaux au maximum et à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérience car leur tractus digestif doit être prélevé pour des études histologiques. Dans la phase de mise au point certains animaux n'ayant pas reçu d'antibiotiques pourront être réutilisés.

Remplacement

La physiopathologie du tractus digestif est complexe et ne peut pas être reconstituée dans des modèles non in-vivo.

Réduction

La variabilité des réponses aux effets d’un traitement antibiotique justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus.

Raffinement

Les rats seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels pour qu’ils puissent s’abriter. Ils seront suivis quotidiennement et des points limites sont mis en place pour éviter la souffrance.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs jeunes adultes sont des modèles fréquemment décrits. Eventuellement, si les résultats de la première partie du projet ne sont pas concluants, des adultes plus âgés pourront être utilisés. Le rat a été choisi car les quantités de fèces qu'il génère sont plus importantes que chez les souris, ce qui permet de limiter le nombre d'animaux utilisés.

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par un traitement chimique ou par une modification génétique, pouvant entraîner perte de poids, saignements et diarrhées, avec administration orale quotidienne d'extraits végétaux et deux prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. Le porteur veut formuler une association d'extraits végétaux à visée commerciale contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Il affirme que l'évaluation de ces maladies "ne peut pas être réalisée in vitro".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de formuler une association d’extraits végétaux permettant de limiter le développement de maladies chroniques de l’intestin (MICI) chez la souris. La formulation sera validée sur un modèle MICI pharmacologique induit par un traitement au dextran sulfate de sodium (DSS) puis la dose optimale sera déterminée dans une nouvelle étude sur ce même modèle. Afin de renforcer les résultats, la formule sera également évaluée sur un 2eme modèle MICI génétique faisant intervenir des souris IL10 KO. Ce projet a également pour objectif de renforcer les connaissances sur les bienfaits des extraits végétaux dans la prévention des MICI et d’identifier les mécanismes d’action mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de formuler une association d’extraits végétaux pouvant avoir une action bénéfique sur la prévention d’inflammation / dysbiose intestinale. Cette formulation pourra être portée au niveau clinique chez l’homme et permettre à terme d’aider les personnes souffrant de MICI. Ce projet permettra également de renforcer les connaissances sur les MICI et d’identifier les mécanismes d’actions apportés par certains actifs végétaux sur la prévention de ces maladies.

Procédures

Les animaux recevront une adminiastration orale d'extraits végétaux quotidiennement du début à la fin de l'étude. Cet acte a une durée de moins de 10 seconde, contention comprise. Deux prélèvements de faibles volumes sanguins (en début et fin d'étude) sont également prévus. Cet acte a une durée de moins d'une minute, contention comprise.

Impact sur les animaux

L’utilisation de souris IL10 KO et le traitement au DSS auront pour objectif de développer une dysbiose intestinale et une inflammation du colon. Cette dysbiose si elle est trop importante pourrait entrainer une perte de poids, des saignements ou des diarrhées.

Devenir

À la fin de chaque procédure, les tissus seront prélevés pour permettre la réalisation d'analyses complémentaires. Les animaux seront donc euthanasiés.

Remplacement

L’évaluation des MICI dans leur contexte global ne peut pas être réalisée in-vitro. Le recours à l’animal ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.

Raffinement

Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.

Choix des espèces

La souris B6.129P2-Il10tm1Cgn/J est une souris mutante qui développe spontanément une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Cette souche est adaptée à l’objectif recherché et est décrite dans la littérature. La souris C56BL/6 est largement utilisée dans la recherche sur les maladies métaboliques. Lorsque ces animaux sont exposés à du DSS dans de l’eau de boisson, ils développent également une inflammation de l’intestin. Ce modèle est également bien décrit dans la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (6-8 semaines en début de procédure). Pour les souris DSS c’est à cet âge que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature en début d’induction. Pour les souris IL10 KO, l’inflammation apparait au cours du temps. En intervenant sur des jeunes adultes on intervient en amont de la maladie ce qui est l’objectif recherché dans ce projet.

1 140 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ la moitié tuée à l'issue, l'autre moitié réutilisée ou rendue à l'élevage. Ils subissent une sensibilisation par contention stressante de deux heures ou par instillation rectale d'acide acétique, puis l'insertion d'un ballonnet dans le rectum pour un test de distension colorectale, avec un risque de saignement anal. Le porteur indique qu'aucun gel lubrifiant n'est utilisé pour ne pas fausser le test, et que le groupe témoin non sensibilisé n'est pas proposé aux clients afin de réduire le nombre d'animaux. Il conclut que la preuve de concept doit être obtenue sur "animal entier".

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est un trouble fonctionnel intestinal dans lequel des douleurs abdominales sont associées à des troubles du transit (diarrhée ou constipation prédominante voire une alternance des 2) et une hypersensibilité viscérale. Les origines du SII, probablement multifactorielles, ne sont pas clairement connues. C'est un trouble fréquent qui touche environ 5 % de la population française. Même si les symptômes sont sans gravité majeure, leur chronicité est responsable de l’altération de la qualité de vie des personnes qui en souffrent. Si de nombreux traitements sont déjà disponibles pour essayer de mieux contrôler les différents symptômes du SII, leur efficacité est souvent limitée, très variable d’un patient à l’autre et leur utilisation s’accompagne fréquemment d’effets indésirables. L’objectif de ce projet consiste donc à évaluer, chez le rongeur, l’efficacité de nouveaux candidats médicaments, ou de nouvelles stratégies thérapeutiques, sur un modèle de distension colorectale. Le test de distension colorectal (CRD) est précédé d’une phase de sensibilisation ayant pour objectif d’abaisser le seuil de sensibilité viscérale comme c’est le cas pour les patients atteints de SII et souffrant d’hypersensibilité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouvelles molécules ou thérapies sur le modèle rongeur du SII. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant de douleur viscérale.

Procédures

Dans le cadre de ces études, les rats peuvent être administrés avec le candidat médicament du sponsor soit par voie intrapéritonéale (IP), par gavage (PO), par voie sous-cutanée (SC), intra-rectale (IR) ou intraveineuse (IV). Les traitements sont faits le jour du test et/ou en chronique au maximum 3 semaines avant le test. Une sensibilisation sera réalisée par un stress de contention de 2h ou par l’administration IR d’acide acétique. Dans les deux cas, l’animal sera isolé pendant 2h. L’animal sera ensuite placé dans un tunnel de contention et un ballonnet sera inséré dans son rectum afin de procéder au test de distension colorectale. Ce test est précédé de 30 min d’habituation et dure 20 minutes. Des prélèvements de fèces peuvent être réalisés à intervalle de quelques jours pendant la phase de traitement et/ou pendant la phase de sensibilisation (2h). Des prélèvements de sang peuvent être réalisés à la fin du test de distension colorectale. Un prélèvement sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (induction 4%, entretien 2,5% mix air et oxygène) par ponction directe à la veine jugulaire est préconisé. Si le volume de sang souhaité par le sponsor est important (maximum 15% de la volémie), un prélèvement en intracardiaque est alors réalisé sous anesthésie gazeuse et est immédiatement suivi de la mise à mort de l'animal par surdose de produit euthanasiant.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. La sensibilisation est induite soit par un stress déclenché par une contention partielle et un isolement de 2h, soit par une administration rectale d'acide acétique. Le stress de l’isolement et de la contention est considéré comme aigu et fait partie intégrante de l’induction du SII chez le rat. La mise en place du ballonnet est également une nuisance pour l’animal. Si l’animal est agité, un saignement au niveau de l’anus peut être observé. Malheureusement, un gel lubrifiant ne peut être utilisé car le risque d’expulsion du ballonnet pendant le test de distension colorectale (CRD) serait augmenté.

Devenir

Les animaux maintenus en vie seront utilisés dans le cadre de formations internes ou d’améliorations de nos procédures (raffinement) ou bien seront réhabilités. Nous estimons que la moitié des projets ne nécessitera pas la mise à mort des animaux et donc que 570 animaux seront gardés en vie. Les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes ou suite à un prélèvement de sang en intracardiaque dans les cas où ces échantillons seront nécessaires pour des analyses complémentaires réalisées par le sponsor.

Remplacement

Le SII est un trouble fonctionnel très complexe, même si ses origines exactes ne sont pas clairement définies à ce jour. Différentes observations mettent cependant en évidence l’implication de facteurs à la fois périphériques (modifications de la flore intestinale, perturbation de la motricité digestive, historiques d’épisodes infectieux, etc…) et centraux (hypersensibilité du tube digestif, influence du stress et de certains états psychologiques) dans l’apparition du SII. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, il est clair que, dans le processus de développement de candidats médicaments, des preuves de concept doivent être obtenues sur animal entier.

Réduction

La réponse au stress est très variable d’un individu à un autre. Il est donc recommandé d’inclure 12 animaux afin d’optimiser les chances d’obtenir une différence significative. Ce nombre a été déterminé par un calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N), sur la base de données internes obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Du fait du risque d’expulsion ou de fuite du ballonnet au moment du test de distension colorectale, 1 animal supplémentaire est inclus dans les groupes traités au véhicule et avec les candidats médicaments. Les rats du groupe composé de référence étant beaucoup plus calmes, il n’est pas nécessaire d’ajouter un animal. Par ailleurs, le groupe non sensibilisé, permettant de valider l’induction du modèle, n’est pas recommandé à nos sponsors afin de réduire le nombre d’animaux par projet.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance toute particulière sera portée au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations. Les administrations seront réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Le matériel utilisé sera adapté à l’espèce (aiguille, canule de gavage, etc.). Pour les injections intrapéritonéales, afin de ne pas provoquer d’inflammation locale, le site d’injection sera alterné entre la gauche et la droite de l’animal. Une habituation des animaux aux tunnels en plexiglass est réalisée pendant 30 minutes quotidiennement au moins 3 jours avant le test. La sensibilisation et l'insertion du ballonnet dans le rectum de l'animal est réalisée sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (induction 4% pendant 3 min dans un mélange air/O2).

Choix des espèces

Les modèles de SII développés chez le rat sont très pertinents et permettent d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments. Le CRD qui est également pratiqué chez l’Homme peut être facilement reproduit chez le rat. En effet, d’un point de vue pratique, la taille du rat permet l’utilisation de petits ballonnets de distension. Enfin, une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus chez le rat et les données cliniques. Des rats de 5 à 8 semaines pourront être utilisés. Le ballonnet utilisé est calibré pour des rats idéalement de 6 ou 7 semaines (pesant environ 250 grammes). Cependant, pour certains projets, l’impact du test de distension colorectale sur des rats plus jeunes sera recherché. Inversement, pour des protocoles nécessitant un traitement chronique avec une longue durée de traitement, le test de distension colorectal sera réalisé sur des animaux plus âgés. Le facteur limitant est la taille des tunnels de contention utilisés. En dessous de 180 grammes, l’animal pourra se retourner à l’intérieur et risquera de se blesser. Au-delà de 350 grammes, l’animal sera trop serré dans le tunnel et il y a un risque d’étouffement.

99 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pour développer une stéatohépatite non alcoolique, avec une administration orale quotidienne et des prélèvements sanguins étalés, avant des prélèvements d'organes post mortem. Le porteur décrit une étude menée pour un client afin de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un composé. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et les troubles métaboliques.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre la stéatose hépatique non alcoolique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée 2 fois par semaine de D-21 à D-1 - une pesée 3 fois par semaine à partir de D1 - une administration orale quotidienne à partir de D-7 - un prélèvement sanguin à la queue à D1, D29 et D57 - un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale à D-7, D29 et D57

Impact sur les animaux

L'allopécie peut survenir dans ce modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. Elle semblerait être un conséquence phénotypique de cette maladie métabolique. Du moment que la peau a un aspect normal et est intact de toute lésion, aucun traitement n'est requis. Les souris peuvent être utilisé en expérimentation. Les prélèvements à D-7, D29 et D57 (7.5% du volume sanguin total) sont assez espacés dans le temps afin de permettre aux animaux de récupérer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages en groupe, de par le caractère social de l'espèce. Les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères des autres cages et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6NTac est un modèle murin de stéatose hépatique non alcoolique. nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour inactiver le gène CAR, elles sont nourries pendant 40 semaines avec un régime gras induisant obésité et troubles métaboliques, avec trois prélèvements de sang à la joue, un gavage de FITC dextran et des prélèvements à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale. Le porteur décrit une obésité et une intolérance au glucose provoquées "sans souffrance visible", et renvoie les retombées pour les patients, un meilleur ciblage des médicaments, au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de l'axe intestin-foie impose un "organisme entier" et conclut à la "nécessité" de la souris.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la pathologie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. De plus, ces maladies touchent particulièrement les hommes. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 40 semaines, à 3 prélèvements de sang à la joue (représentant moins de 10% de leur volume de sang total) espacés chacun de 10 semaines. Les animaux seront soumis également à un jeûne de 6 heures, à un gavage oral de FITC dextran ainsi qu'à un prélèvement d'une goutte de sang d'environ 5 microlitres à la queue pour chaque mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui seront faite 2 fois au cours de l’expérimentation chacune espacée de 14 semaine.

Impact sur les animaux

Les régimes WD et HFD vont induire une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le seul effet indésirable provoqué par le prélèvement à la joue et l'administration orale du FITC dextran est le stress lié à la contention.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires. Voici les résultats d’une étude de pouvoir statistique basée sur nos résultats préliminaires de mesure d'alanine aminotransférase (ALAT marqueur utilisé en clinique pour évaluer les dommages hépatiques) obtenus sur des souris C57bl6/j sous régime CD versus WD. Variation minimale d’intérêt (Δ): ~50%. ALAT initiales CD : 200 U/L, ALAT WD: 324 U/L, écart type moyen 120 U/L. Calcul du nombre d’animaux (n) nécessaire pour un risque α de 5% avec une puissance de 80% n=16. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 16.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après chaque prélèvement à la joue et également après chaque mesure de la perméabilité intestinale. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local EMLA 5% sur le bout de la queue avant incision à l’aide d’un scalpel 1heure avant chaque intervention, lors de mesure de la perméabilité intestinale. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication avec une injection intrapéritonéale de Xylazine à 10 mg/kg est effectuée par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, on débute l'anesthésie avec 4% d'isoflurane dans une cage à induction volatile. L'anesthésie est maintenue sous masque pendant le prélèvement. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion de nourriture et d'eau); apparence physique externe; signes cliniques mesurables (ex.: changements du rythme cardiaque, du rythme respiratoire et de la nature de ceux-ci); changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin foie) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6j déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique ces modèles existent uniquement chez la souris. Nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturite physiologique. (7 semaines minimum)