Diagnostic des maladies
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Imagerie par résonance magnétique de tumeurs cérébrales.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
58 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 12 réutilisés en l'absence de tumeur et le reste tué. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans le cerveau puis jusqu'à six séances d'IRM par semaine, avec cathéters dans la veine caudale, pour comparer des agents de contraste. Le porteur classe la procédure sévère faute de pouvoir garantir l'absence de signes cliniques liés au développement tumoral. Les rats non réutilisés sont tués une fois le suivi terminé ou à l'atteinte d'un point limite.
Objectifs
Le Gold Standard en imagerie diagnostique concernant les pathologies cérébrales est l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) avec injection d’agents de contraste (AC) à base de gadolinium. En effet, les tumeurs cérébrales sont mises en évidence via l’accumulation des AC au sein des tumeurs selon les caractéristiques de ces dernières (nécrose, vascularisation…). La détermination de l’efficacité de nouveaux ACs sur la détection tumorale est primordiale pour permettre de détecter le plus tôt possible les tumeurs afin de mettre en place les traitements appropriés. Dans cette étude, l’utilisation d’un modèle oncologique rongeur va permettre de déterminer l’efficacité de divers agents de contraste de nouvelle génération en comparaison avec des ACs de référence d’ores et déjà utilisés en clinique chez l’Homme. Dans le cadre de ce projet d’une durée de 3 ans, un total de 58 animaux (rats) sera utilisé. L’expertise du centre expérimental ainsi que les compétences/expériences des intervenants dans ces différentes procédures garantissent une prise en charge optimale du bien-être de l’animal.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité de nouveaux AC sur la détection de tumeurs in vivo. La comparaison de nouveaux AC entre eux et par rapport à des agents déjà commercialisés ou en développement dans ce modèle animal a pour but de déterminer leurs performances et leurs limites. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients. En effet, il va permettre de déterminer l’efficacité de nouveaux produits de contraste utilisés à doses réduites pour la détection de tumeurs cérébrales.
Procédures
Injection de cellules tumorales au niveau cérébral (une fois) et imagerie par résonance magnétique (jusqu'à 6 par semaine).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels qui pourront être observés sur les animaux seront principalement dû à la répercussion du modèle oncologique mis en place. En effet, des signes cliniques peuvent apparaître à partir 3 semaines post-implantation tumorale. Cependant, le développement tumoral n’est pas obligatoirement associé à l’apparition de signes cliniques. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement et une grille d’évaluation par scoring sera mise en place (2fois/semaine). Concernant les produits qui seront injectés aux animaux, ce sont des agents de contraste destiné à l’usage chez l’Homme. Les produits de contraste ont globalement un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide très majoritairement par les reins. Concernant les effets potentiels chez l’animal, ils sont considérés comme très faibles : ces produits ont en effet suivi toutes les phases de développement et présentent un excellent profil de sécurité. Par conséquent, il n’est pas attendu de toxicité particulière dans cette étude chez le rat. Concernant les voies d’administration intraveineuses choisies. La mise en place de cathéters au niveau de la veine caudale à plusieurs reprises pour l’injection des produits de contraste peut entraîner un hématome.
Devenir
La procédure sera considérée modérée en cas d’absence de pousse tumorale. La pousse sera contrôlée par 2 ou 3 sessions d’imagerie différentes. Dans le cas d’une absence de pousse tumorale, l’animal pourra être réutilisé. Tous les animaux non réutilisés seront euthanasiés une fois que leur suivi en imagerie sera considéré comme terminé ou lors de l’atteinte d’un point limite.
Remplacement
Pour limiter l’utilisation d’animaux dans l’étude, un modèle vitro sera mis en place pour étudier les propriétés de diffusion des différents agents de contraste. Cependant, pour s'assurer de l'efficacité réelle des agents de contraste, des tests in vivo sont indispensables. En effet, le recours aux animaux permet de reproduire un modèle oncologique proche de l’Homme soulignant ainsi l’aspect translationnel des résultats. Une telle étude permet de standardiser un protocole pour comparer dans les meilleures conditions possibles différents agents de contraste au sein de mêmes individus. En effet, ce projet évaluera l’efficacité de plusieurs agents de contraste injectés chez un même animal. La conception du protocole de cette étude se base sur de précédentes études effectuées en interne pour évaluer l’efficacité d’agents de contraste. Le projet sera conduit sur des rats Sprague Dawley à partir de 150 g.
Réduction
Les procédures seront réalisées par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie, de la chirurgie et de l’euthanasie chez le rat. En se basant sur la littérature des groupes de 8 animaux sont suffisants pour conclure de façon statistiquement pertinente sur les propriétés d’efficacité d'un agent de contraste. De plus, le modèle oncologique utilisé est un des plus référencés dans la littérature. Cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux obtenus avec d’autres agents de contraste utilisés à diverses doses.. Cette approche permet de limiter les biais liés à la variabilité intrinsèque d’un modèle tumoral (ex : taux de nécrose, micro-architecture tumorale..) Le calcul du nombre d’animaux nécessaire a été déterminé selon l’expertise du laboratoire et en s’appuyant sur des analyses rétrospectives d’études similaires. Ces retours d’expérience permettent de s'assurer d’une meilleure inclusion des animaux. Un total de 58 rats sera nécessaire sur la durée totale du projet de 3 ans.
Raffinement
Des actions seront mises en place pour assurer le suivi et le bien-être des animaux. Lors de la chirurgie, la prémédication pré-opératoire ainsi que le suivi peropératoire et post-opératoire sont mis en place afin de limiter au maximum la douleur pouvant être infligée aux animaux entrant dans ce projet. Dans ce modèle, l’apparition des premiers signes cliniques s’effectue à partir de 3 semaines post implantation. Les animaux seront imagés dans les 21 jours suivants l’induction tumorale, aucun signe clinique n’est donc attendu. Cependant, un suivi régulier des animaux sera mis en place. Si toutefois des signes cliniques apparaissent, cela conduira à la mise en place d’actions pouvant aller jusqu’à l’euthanasie pour soulager l’animal en cas de souffrance. Pour déterminer les actions à mettre en place, un scoring clinique de l’état de l’animal sera réalisé 2 fois par semaine à partir d'une grille d’évaluation comprenant plusieurs catégories (apparence, abreuvement et alimentation, comportement naturel, comportement provoqué). Selon le score obtenu lors de l’examen clinique, des actions thérapeutiques peuvent être mises en place en accord avec le directeur d’étude et/ou le vétérinaire.
Choix des espèces
L’utilisation des modèles rongeurs permet d’intégrer les caractéristiques de la pathologie humaine ou au moins un grand nombre de ces caractéristiques (expansion tumorale, caractère invasif de la tumeur, vascularisation…). Le modèle de gliome C6 chez le rat est un modèle très référencé dans la littérature par conséquent très utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche en cancérologie pour l’évaluation de nouvelles molécules qu’elles soient à portée du diagnostic ou thérapeutique. Dans ce modèle, l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de nouveaux AC à détecter une tumeur tout en recherchant la dose de produit de contraste minimale à injecter pour permettre l’obtention d’une performance de détection équivalente aux agents de contraste utilisés à dose clinique. Ces nouveaux agents de contraste seront comparés aux agents de contraste déjà existants et reconnus sur le marché comme les plus efficaces et les mieux tolérés dans l’indication ‘’tumeur cérébrale’’. Les rats seront utilisés à partir d’un poids de 150g g.
Angiographie par résonance magnétique avec injection d’agents de contraste
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
27 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés dans d'autres études internes. Ils reçoivent jusqu'à cinq injections d'agents de contraste par semaine, avec pose de cathéter dans la veine de l'oreille, pour évaluer ces produits en angiographie par IRM. Le porteur justifie le maintien en vie par l'élimination rapide des agents de contraste chez des lapins sains. Il décrit les tests in vivo comme "indispensables" pour établir des protocoles d'imagerie robustes.
Objectifs
Nous avons pour objectif d'évaluer de nouveaux agents de contraste afin d'optimiser l’imagerie par résonance magnétique (IRM) des vaisseaux sanguins. Le but est de déterminer les performances des agents de contraste de nouvelle génération sur la visualisation des vaisseaux sanguins. Leur utilisation dans les pathologies vasculaires n’a pas encore été évaluée, ni en clinique, ni en préclinique chez l’animal. Il apparait donc important d’évaluer leur efficacité en angiographie par résonance magnétique (ARM) en comparaison avec des ACs d’ores et déjà utilisés en routine clinique pour ce type d’application. En effet, différentes doses seront étudiées afin d'évaluer leur efficacité.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité d’un nouvel agent de contraste en IRM sur le réhaussement des vaisseaux sanguins. La comparaison du nouvel agent de contraste par rapport à des produits déjà commercialisés et utilisés en clinique dans ce modèle animal a pour but de déterminer leurs performances et leurs limites. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients. En effet, il va permettre de déterminer l’efficacité de nouveaux agents de contraste utilisés à doses réduites pour la visualisation de la vasculature en IRM. Le praticien hospitalier pourra alors déterminer la meilleure posologie à attribuer aux patients tout en préservant les mêmes performances de détection des lésions vasculaires retrouvées chez des patients.
Procédures
Imagerie par résonance magnétique avec injection d'agents de contraste. Sur une semaine d'imagerie, les animaux pourront recevoir jusqu'à 5 injections d'AC ( =5 examens IRM). Ce plan expérimental pourra être renouvelé au moins 5 fois sur les 2 ans du projet.
Impact sur les animaux
Une diminution de la prise alimentaire et hydrique peut être observée suite aux anesthésies répétées chez des lapins sains. Concernant les produits qui seront injectés aux sujets, ce sont des agents de contraste destiné à l’usage chez l’homme. Les agents de contraste ont globalement un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide. Concernant les effets potentiels chez l’animal, ils sont considérés comme très faibles : ces produits ont en effet suivi toutes les phases de développement, incluant des études de toxicologie soulignant un excellent profil de sécurité des produits testés. Par conséquent, il n’est pas attendu de toxicité particulière dans cette étude chez le lapin. Concernant les voies d’administration intraveineuses choisies. La mise en place de cathéters au niveau de la veine auriculaire pour l’injection des produits de contraste ainsi que les médicaments administrés en IV peuvent entrainer un hématome.
Devenir
A la suite de l'unique procédure classée légère, les animaux pourront être réutilisés dans d'autres études en interne. En effet, l'élimination rapide des agents de contraste chez les lapins sains permet de les inclure dans d'autres études scientifiques.
Remplacement
Pour s'assurer de l'efficacité réelle des agents de contraste, des tests in vivo sont indispensables. En effet, le recours aux animaux permet d’établir des protocoles d’imagerie robustes. Cela permet également de prendre en considération la biodistribution et la cinétique des agents de contraste au sein des différents organes. Une telle étude permet de standardiser un protocole pour comparer dans les meilleures conditions possibles différents agents de contraste au sein de mêmes individus. Le projet sera conduit sur des lapins New Zealand matures (à partir de 8-10 semaines d’âge).
Réduction
La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie et de l’euthanasie chez des modèles lapins. En se basant sur la littérature un groupe de 8 animaux est suffisant pour conclure de façon statistiquement pertinente sur les propriétés d’efficacité d'un agent de contraste. De plus, des lapins sains ont déjà été utilisés dans plusieurs études utilisant des protocoles d'imagerie par résonance magnétique des vaisseaux sanguiins. Le choix de cette espèce nous permettra de comparer nos résultats aux données de la littérature. Au total, 27 animaux ont été prévu en se basant sur la littérature et l’expertise de notre laboratoire.
Raffinement
L’unique procédure de l’étude n’entraine pas de nuisances majeures pour les animaux. En effet, nous avons fait le choix de passer par la veine auriculaire pour l’injection des produits de contraste afin de limiter au maximum la douleur pouvant être infligée à l’animal. En outre, les divers examens en ARM réalisés sur chaque animal seront espacés d'un délai minimum pour éviter des anesthésies trop rapprochées. Les séquences en angiographie par résonance magnétique dès l’injection du produit de contraste sont très courtes (20-30 sec) ce qui permet de répéter les mesures tout en limitant la durée totale de l’anesthésie. Des mesures seront prises dès la prise en charge de l’animal jusqu’à la réalisation de la procédure en imagerie in vivo. Puis, ils seront remis dans leur cage individuelle avec des cloisons ajourées pour qu’ils puissent voir leurs congénères. Une surveillance quotidienne sera effectuée.
Choix des espèces
Nous avons décidé d’utiliser des lapins New Zealand sains à partir de 8-10 semianes d’âge. Cette espèce du fait de sa taille permet une bonne visualisation des vaisseaux sanguins par imagerie IRM. En effet, des vaisseaux de multiple diamètre peuvent être étudiés. Dans notre étude nous allons nous intéresser à l’arbre artériel notamment l’aorte abdominale ce qui rend ce modèle d’étude pertinent. Cette espèce est une des plus grande utilisable dans des IRM préclinique. Des lapins New Zealand sains à partir 8-10 semaines d’âge seront utilisés dans l’étude.
Les techniques d’embryologie réalisées sur des modèles génétiquement modifiés
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 12000
87 000 rongeurs, 75 000 souris et 12 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie tuée en fin de procédure et les femelles réimplantées avec succès transférées en élevage. Ils subissent vasectomies, réimplantations d'embryons et chirurgies sous anesthésie, avec prélèvements sanguins et injections, pour créer, congeler et régénérer des lignées génétiquement modifiées destinées à la communauté scientifique. Le porteur présente la cryoconservation et la fécondation in vitro comme des avancées réduisant le nombre d'individus utilisés. Il affirme que seul le recours à des "organismes entiers" vivants permet d'étudier les conséquences d'une modification génétique.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la création, la cryoconservation et la redérivation de lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche ou pour le développement de médicaments. À la vue du nombre croissant de modèles génétiquement modifiés, la cryoconservation de ceux-ci est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux vivants utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle …
Bénéfices attendus
La création de lignées par réimplantation d’embryons permet l’obtention de modèles génétiquement modifiés ciblant un ou des gênes d’intérêt, modèle capital dans la compréhension des mécanismes physiologiques et physiopathologies des maladies, des médicaments et autres domaines de recherche. La cryoconservation des modèles génétiquement modifiés est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle… La redérivation de lignées génétiquement modifiées par réimplantation d’embryons permettra aux chercheurs d’avoir des animaux dont le statut sanitaire sera maitrisé et évitera ainsi tout éventuel impact du statut sanitaire sur l’expression du phénotype. Les résultats des essais réalisés sur cette lignée redérivée seront alors plus précis et limiteront donc le nombre d’animaux utilisés. La stimulation des femelles par traitement hormonal permet de synchroniser les individus et augmenter le nombre d’ovocytes collectés par femelle. Cette approche présente une avancée éthique considérable.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans le cadre de vasectomie ou de réimplantation d’embryons seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de 20 minutes à 1 heure sous anesthésie générale. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Selon le besoin des projets, les animaux pourront être soumis à des injections intrapéritonales. Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions,aux injections de stimulations (72h max) et aux transferts entre les différentes zones. Douleur, stress et perte de poids dûs aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (12h max).
Devenir
Les animaux sont transférés en zone d’élevage interne pour les femelles réimplantées avec succès. Tous les autres animaux sont mis à morts en fin de procédure expérimentale ou dans le cas d’atteinte d’un point limite.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne peut remplacer ce projet qui vise à fournir aux scientifiques les animaux qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. L’intérêt de disposer d’organismes vivants et entiers est de pouvoir observer ceci dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques.
Réduction
Basé sur nos données historiques, nous évaluons le nombre d’animaux requis pour répondre aux besoins des scientifiques. La technique de production d’embryons par Fécondation In Vitro pour les souris présente une avancée éthique considérable pour la réduction du nombre d’individus utilisés comparée à une technique d’accouplement naturel. La cryoconservation du potentiel génétique permet de réduire le nombre d’animaux requis pour la conservation ou la redérivation d’une lignée. La réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet repose sur : l'expertise de l’équipe embryologie et sa maitrise des procédures, les conditions expérimentales, le suivi des données techniques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé lors des procédures chirurgicales par une administration d’analgésique avant et après la chirurgie ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée après la chirurgie pour tous les animaux. La technique chirurgicale est régulièrement raffinée (dilacération plan musculaire vs incision …) afin de minimiser les nuisances liées à l’acte. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes Pour la stimulation hormonale, sont concernés que les animaux de 3 semaines minimum, dont la taille et le poids sont compatibles avec l’injection d’hormones, selon les recommandations éthiques en vigueur. Pour la vasectomie, sont concernés des animaux de 3 à 10 semaines. Pour la réimplantation d’embryons, sont concernés des animaux de 7 à 14 semaines
Création de modèles de cathétérisation vasculaire et non vasculaire chez le rongeur destiné à des études toxicologiques, pharmacodynamiques ou pharmacocinétiques
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 12000
15 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale pour poser à demeure un cathéter dans un vaisseau, un organe ou le cerveau, puis peut recevoir jusqu'à quatre prélèvements sanguins ou gavages par jour, avec un hébergement isolé jusqu'à sept jours. L'établissement décrit une activité de fourniture de rongeurs cathétérisés "prêts à l'emploi", les animaux étant ensuite expédiés vivants aux laboratoires ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Il justifie l'élevage d'animaux "surnuméraires" par les taux d'échec chirurgical et conclut que la complexité des mécanismes exclut un modèle in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) de cathéters dans des vaisseaux, des organes ou le cerveau permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit le prélèvement de fluides biologiques (sang, bile, liquide cérébro spinal)
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles cathétérisés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques grâce au prélèvement de fluides biologiques comme le sang, la bile ou le liquide cérébro spinal chez l’animal tout en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des injections ou des prélèvements de manière répétée à différents sites d’injection ou de prélèvement. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (devenir d’un médicament dans le corps, toxicité d’un médicament, maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, ...) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel cathétérisé. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins ou à des gavages (maximum 4 prélèvements sanguins/gavages par jour). Les actes de prélèvements, de gavages et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 7 jours. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place du cathéter suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel cathétérisé. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles cathétérisés a pour objectif de mettre à disposition des modèles prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou leurs interactions face à une substance, de comprendre la vie d’une substance à l’intérieur d’un organisme ou sa toxicité, ce qui entraine l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les cathétérisations permettent le suivi de paramètres biologiques ou encore l’administration de substances répétées ou en continu en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des prélèvements ou des injections répétés à différents sites. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation (en fonction du stress observé de l’animal à réception, par exemple). Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel cathétérisé, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Caractérisation longitudinale par IRM et SRM quantitatives de la sclérose en plaque sur le modèle murin EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent deux injections induisant une encéphalomyélite auto-immune, modèle de sclérose en plaques, qui provoque une paralysie progressive des membres, puis des séances d'IRM avant prélèvement du cerveau et de la moelle épinière. Le porteur décrit une paralysie qu'il présente comme réversible et n'attend pas d'effet indésirable de l'imagerie. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la maladie et que le modèle animal en est la "seule alternative".
Objectifs
De nos jours, l'IRM diagnostique de la sclérose en plaque repose principalement sur la visualisation de manière qualitative des plaques au niveau du cerveau. L’idée de ce projet est de réaliser une étude quantitative afin de calculer un certain nombre de paramètres quantitatifs issus des images IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et des spectres SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique). Ceci devrait nous permettre de mieux comprendre la pathologie au cours de son développement tant sur le plan cérébral qu’au niveau de la moelle épinière ou du nerf optique. Ce projet n’a pas fait l’objet d’une évaluation par d’autres instances.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la mise en place de la pathologie dans le modèle particulier EAE (Expérimental Autoimmune Encephalomyelitis) de réponse autoimmune au niveau du cerveau et de la moelle épinière. Ces résultats seront corrélés avec ceux de nos collaborateurs qui étudient le rôle des lymphocytes Treg dans la mise en place et l'évolution de la sclérose en plaques.
Procédures
La réalisation du modèle EAE implique deux injections : * une première injection de MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) - durée 30s * une deuxième injection de 200ng de toxine de pertussis - durée 30s L'IRM de perfusion nécessite l'injection de DOTAREM (agent de contraste utilisé en routine clinique) : injection en 10s- durée de l'IRM : 1h30 maximum
Impact sur les animaux
Les signes cliniques dans le modèle EAE consistent en une paralysie progressive des membres antérieurs et postérieurs qui apparait dans les 10-14 jours après injection. Cette paralysie est réversible. Aucun effet indésirable n'est attendu pour l'imagerie et la spectroscopie. En effet l'IRM et la SRM sont deux techniques non invasives et atraumatiques largement utilisées en recherche préclinique pour des études longitudinales.
Devenir
Pour chaque procédure ,les animaux seront maintenus en vie jusqu’à J30 pour un suivi longitudinal. A la fin de chaque procédure ils seront mis à mort. Le cerveau et la moelle épinière seront prélevés.
Remplacement
Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la sclérose en plaque (SEP). Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le déclenchement de l’inflammation chronique du système nerveux central (SNC). Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP. Nous ne réaliserons pas de tests in vitro avant sur des cellules cérébrales ou de moelle épinière
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de la SEP ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 240 souris. L’étude IRM se fera par mesure des intensités de signal sur les images. Des tests non paramétriques Mann-Whitney seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs.
Choix des espèces
Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adaptés à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire
Impact de l’acidose ruminale sur le microbiome digestif de la vache laitière et étude des mécanismes inflammatoires déclenchés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
14 vaches laitières vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rejoindront le troupeau de l'établissement. On leur provoque une acidose ruminale par un régime riche en amidon, avec prélèvements par fouille rectale, prises de sang et sondage gastro-oesophagien. Le porteur indique que les prélèvements peuvent provoquer une gêne ou une souffrance et qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ce désordre. L'objectif inclut des recommandations d'usage de probiotiques en élevage.
Objectifs
Explorer in vivo l’effet de l’acidose ruminale et l’impact de levures probiotiques au-delà du rumen sur le pathobiome fécale (ensemble des microbes (incluant leurs génomes) susceptibles de provoquer une maladie - cela inclut les agents pathogènes spécialisés et opportunistes) et des marqueurs de l’inflammation. Le suivi du pH ruminal, de la rumination et du comportement alimentaire nous permettont également de caractériser le bien-être de l’animal. Enfin, nous évaluerons l’intérêt de prélèvements dans la cavité buccale pour représenter l’environnement ruminal (microbiote notamment).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre l’impact d’un désordre digestif sur la prévalence de pathogènes à risque pour l’animal mais aussi de pathogènes responsables de zoonoses chez l’Homme, via une approche de métagénomique. Par ailleurs il permettra de décrire l’effet et les modes d’action d’une supplémentation en levure probiotique, via l’alimentation, au-delà du rumen et ce jusqu’au lait ce qui permettra de mieux définir des recommandations d’utilisation de ces additifs en élevage. Un effort sera particulièrement apporté au niveau de l’analyse du lait, avec mesure du profil en acides gras, de la caséine, et de premiers essais de purification d’exosomes du lait dont les compositions peuvent varier en situation de challenge alimentaire. Les méthodes développées dans le cadre de cette expérimentation sont susceptibles d’être appliquées en situation d’élevage. Les recherches conduites dans cet essai devront permettre d’identifier des marqueurs périphériques au rumen qui devraient faciliter le diagnostic de l’Acidose Ruminale Sub Aigüe (ARSA) sur le terrain et d’objectiver son impact sur la santé et le bien-être des animaux. Les résultats de cette étude pourront être disséminés via les écoles vétérinaires, les lycées agricoles, les écoles d’ingénieurs et pourront être directement utilisés par les techniciens d’élevage.
Procédures
Les animaux seront soumis pendant une semaine à une modification de régime alimentaire susceptible d'entraîner l'apparition d'acidose chronique. L'objectif du projet étant de monitorer les modifications du microbiote digestif et des marqueurs de l'inflammation de l'animal, nous réaliserons des prélèvements de fèces par fouille rectale (n=8) , des prises de sang à la veine caudale (n=6) et des prélèvements de liquide ruminal par sondage gastro-oesophagien (n=5). L'ensemble des prélèvements dure moins de 10 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’acidose ruminale chronique ou subaiguë (ARSA) est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière, induisant notamment une acidification du contenu ruminal. Il est attendu que les animaux éprouvent ce désordre, mais sans atteindre le stade clinique de la maladie, via le monitoring du pH ruminal. Si une baisse anormale du pH ruminal et/ou une altération du comportement alimentaire au-delà des seuils rapportés pour l’acidose ruminale sub-aigue étaient observées, l’arrêt de la distribution du granulé riche en amidon et le retour immédiat à un régime classique seront décidés. Par ailleurs, une gène ou une souffrance pourra être ressentie par les animaux lors de la mise en oeuvre des prélèvements (sondage gastro-oesophagiens, prélèvements de fèces et prises de sang)
Devenir
Etant données la sévérité et la fréquence des procèdures inclues dans le projet, il n'est attendu aucune gêne, stress ou souffrance résiduelle chez l'animal à la fin de l'expérimentation. Les animaux pourront donc rejoindre le reste du troupeau de l'établissement utilisateur et retrouver les conditions de logement, d'alimentation et de vie classique du troupeau laitier.
Remplacement
L’acidose ruminale chronique ou subaiguë (ARSA) est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière. Aucun modèle in vitro / in silico n’est actuellement disponible permettant de reproduire de façon fiable et précise ce désordre. L’évaluation de solutions de prévention du risque d’ARSA, comme les probiotiques, doit se faire chez l’animal afin de démontrer leur efficacité et ainsi pouvoir les recommander en élevage.
Réduction
Il s'agit d'un projet exploratoire visant à identifier des biomarquerus d'ARSA facilement utilisables en condition de terrain et réduisant le stress et la douleur liés aux prélèvements (remplacement du prélèvement de contenu ruminal par sondage par des biomarqueurs prélevables dans d'autres comportiments, tels que les fèces, le sang ou le lait). D'après notre expérience concernant la variabilité individuelle du microbiote, notamment ruminal, et les résultats de tests statistiques préliminaires, le nombre d'animaux recrutés (2 lots de 7 vaches laitières) est réduit au maximum, sans compromettre la mise en évidence de différences statistiques entre les deux lots. Ce nombre est par ailleurs justifié au regard de données de la littérature, rapportant l'utilisation de 6 à 8 vaches par lot dans un design experimental comparable.
Raffinement
Les conditions de logement des animaux en stabulation répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. Cet essai a également pour but d'évaluer l'intérêt de la mesure de paramètres non invasifs dans le lait ou dans la cavité buccale, ou de la mesure du comportement alimentaire qui pourraient être considérés comme marqueurs de l'ARSA et/ou de l'effet bénéfique de la solution microbienne testée. De ce point de vue le projet est également respectueux de la règle des 3R puisque la mesure d'indicateurs non invasifs pourrait à terme remplacer les mesures susceptibles d'altérer le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
L’acidose ruminale chronique ou subaiguë (ARSA) est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière. Aucun modèle in vitro / in silico n’est actuellement disponible permettant de reproduire de façon fiable et précise ce désordre. L’évaluation de solutions de prévention du risque d’ARSA, comme les probiotiques, doit se faire chez l’animal afin de démontrer leur efficacité et ainsi pouvoir les recommander en élevage. L’acidose ruminale chronique n’est pas une pathologie mais un désordre digestif fréquent chez les bovins en production.
Effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur le métabolisme cardiaque
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.
Objectifs
Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.
Impact sur les animaux
La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.
Remplacement
A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.
Réduction
Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.
Raffinement
Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.
Choix des espèces
Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.
Immunisation de camélidés pour la génération d’anticorps
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
20 lamas et alpagas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et immunisés de façon répétée pendant des années plutôt que tués. Chaque animal reçoit jusqu'à vingt-quatre injections et douze prélèvements sanguins par an, sur animal vigile, pour produire des anticorps de camélidés transformables en nanocorps. Le porteur indique que les immunisations peuvent entraîner une fatigue temporaire et qu'un entraînement médical limite le stress des manipulations. Il affirme qu'aucune technique alternative n'existe à ce jour pour produire ces anticorps à domaine unique, les animaux étant utilisés de 1 an jusqu'à leur retraite à 15 ans.
Objectifs
Les lamas et les espèces animales qui leur sont apparentées possèdent une forme unique d’anticorps, ces substances défensives secrétées par le système immunitaire lorsqu'une infection ou des cellules anormales envahissent l’organisme. Comparativement aux anticorps humains ou à ceux de nombreuses autres espèces animales, ces anticorps possèdent une architecture plus simple et peuvent être transformés en laboratoire en anticorps à domaine unique, substances aussi dénommées « nanobodies » ou « nanocorps », dont la taille est dix fois plus petite que celle des anticorps monoclonaux conventionnels. Leur petitesse pourrait leur permettre d’atteindre des cibles pathologiques dans l’organisme humain qui sont inaccessibles aux anticorps traditionnels et de produire des protéines capables d’atteindre plusieurs cibles simultanément. Ces nanocorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies et ouvrent des perspectives fascinantes pour la prise en charge de multiples pathologies.
Bénéfices attendus
La génération d’anticorps de camélidés permet notamment d’optimiser divers technologies existantes (diagnostic in vitro/in vivo, immunothérapie ciblée, ciblage cellulaire, microscopie…). Les bénéfices pour les êtres humaines relèvent de l’optimisation des techniques de soins de différents cancer, de leurs détection précoce pour une meilleure prise en charge, mais également de l’amélioration de l’habitat, avec la possibilité de doser les polluants dans l’environnement par des techniques de dosage immunologiques. Enfin, cela génère également des bénéfices directement au sein de la recherche, par l’optimisation des techniques optiques et de diagnostic.
Procédures
Injection et prélèvement sur animaux vigiles – une procédure sur 6 semaines. Pour un animal sur la durée de la procédure, il sera soumi à 24 injections maximum par un et à 12 prélèvements sanguins maximum par an. La durée des injection est d'approximativement 5 minutes sur animal vigile, et la durée d'un prélèvement est estimé à 10/15 minutes sur animal vigile également.
Impact sur les animaux
Suite aux immunisations, les animaux peuvent avoir une réaction immunitaire normale, et donc présenter des signes temporaires de fatigue.
Devenir
Repos de 4 à 6 semaines puis répétition de la procédure. Les nouveaux nés sont exclus de l’expérimentation. Nous pouvons utiliser les jeunes sevrés (au delà de 1 an) car ils vont avoir une meilleure réponse immunitaire que les adultes. Les adultes seront également immunisés jusqu’à l’âge de 10 ans. (Durée de vie moyenne entre 15 et 20 ans). Les animaux de plus de 10 ans ne seront plus immunisés mais serviront à la génération de banque immunitaires (uniquement prélèvement sanguin 3 fois par an). Les femelles gestantes/allaitantes ne seront jamais utilisées en expérimentation. A l'issu de la procédure autorisée pour 5 ans, deux de nos animaux actuels (agés de 6 et 5 ans) seront réutilisés uniquement pour la génération de banque naïve car ils auront atteint l'âge de 10 ans. Notre 3ieme alpaga agé aujoud'hui de 2 ans, sera réutilisés pour l'expérimentation.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’est pas possible d’utiliser une technique alternative de production d’anticorps à domaine unique. Mais une veille scientifique est en place dans notre structure permettant de rester informé des innovations dans ce domaine.
Réduction
La mise en place d’un cheptel de minimum 20 individus nous permet de faire une rotation dans l’utilisation des animaux, afin de garantir le minimum de soufrance et de stress sur l’année. Augmenter le nombre d’individus dans le cheptel nous permet de réduire le nombre de procédure/an/individu, et cela sans perdre de vue les objectifs scientifiques.
Raffinement
Un training médical est mis en place tout au long de la vie des animaux, afin de limiter le stress des manipulations expérimentales. Les lamas et alpagas seront élevés et stablués dans le respect de leurs besoins biologiques et sociaux. L’enrichissement environnemenal et alimentaire est assuré par la nature même de l’enclos herbacé et boisé (paturage naturel) et les diverses structures et accessoires disponibles sur le terrain (abris, brosses, branches de saules, branches de sapin…) participant à leur bien-être au quotidien. Un cheptel de minimum 20 individus sera mis en place : ce sont des animaux fondamentalement grégaires qui vivent en groupe avec une structure sociale forte et hiérarchisée. Au pâturage, quelques éléments guetteurs du groupe se placent en périphérie du reste du troupeau en position d’éveil, à l’affut du danger. Les communications intra-spécifiques se basant sur des modifications de posture de la tête, de la queue et des oreilles principalement,ce mode de communication intra individus est utile aussi à l’observateur qui les côtoie afin de détecter des postures d’attaque ou de bien-être. Par exemple, un alpaga présentant des oreilles campées sur la nuque, le museau relevé et la queue dressée à la verticale est en posture d’attaque, alors qu’une posture de bien-être sera plutôt marquée par des oreilles dressées vers l’avant et une queue posée sur le périnée. Si l’animal présente des signes de stress intense, une sédation légère pourra être effectuée afin de limiter l’angoisse de la procédure : Sedivet intraveineux 0,8 ml/80kg ou Domosedan gel oral 0 ,5 ml/80 kg
Choix des espèces
Mis à part les camélidés, ce type d’anticorps n’existe pas chez d’autres espèces, à l’exception curieuse des requins et autres poissons cartilagineux, mais d’un point de vue pratique, ces espèces n’ont pas été retenues pour notre projet. Les camélidés seront utilisés entre l'âge de 1 an et l'âge de la mise en retraite à 15 ans
Prélèvement de moelle osseuse chez des veaux pour établissement d’une lignée cellulaire à des fins de culture bactérienne
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
46 veaux non sevrés vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque veau subit un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale, d'une durée d'environ vingt minutes, avant d'être mis à mort. Le porteur indique choisir de jeunes veaux car la proportion de cellules souches diminue avec l'âge, et justifie l'anesthésie par le confort de l'animal et des manipulateurs. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro pour obtenir ces cellules bovines, l'objectif étant à terme d'établir une lignée cellulaire pour s'affranchir de l'animal.
Objectifs
Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracellulaire stricte (se développant dans les cellules), majoritairement transmise par les tiques. En Europe, c'est une bactérie d’importance économique majeure, notamment dans les élevages bovins où elle provoque des avortements. In vivo, cette bactérie infecte une catégorie de globules blancs mais qu'il n'est pas possible de maintenir en culture ou de cultiver sur le long terme. In vitro, les souches humaines et les souches équines et canines peuvent être maintenues en culture au sein de cellules de moelle osseuse immortalisées humaines ou de tiques. En revanche, les souches infectant les ruminants ne peuvent actuellement être cultivées que sur cellules de tiques. Or les cellules de tiques se divisent lentement et supportent mal les techniques de conservation par le froid, ce qui représente un obstacle à leur utilisation pour la culture bactérienne. De plus elles ne permettent pas d’étudier les interactions entre A. phagocytophilum et la cellule hôte des vertébrés. L’absence de lignées de cellules de moelle osseuse bovines limite aussi l’étude des facteurs responsables de la spécificité de souche pour certains hôtes vertébrés. Il est donc nécessaire d'établir une lignée cellulaire immortalisée de moelle osseuse in vitro pour la culture des Anaplasma infectant les bovins. L’utilisation de lignées cellulaires présente de nombreux avantages, elles permettent notamment de s’affranchir de l’obligation de réaliser régulièrement des prélèvements pour renouveler les cultures, ce qui leur confère aussi un intérêt en terme de bien-être animal. Une fois établies, les lignées sont composées d’une population cellulaire homogène permettant une standardisation des conditions de culture et des expérimentations pour une meilleure répétabilité.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : Cette étude conduira au développement d’une lignée de cellules permettant la culture des souches bovines d'une bactérie ne poussant que dans des cellules, A. phagocytophilum. Ce projet aboutira au dépôt de la/des lignée(s) cellulaire(s) dans une banque de cellules. Bénéfices à long terme : A plus long terme, comprendre les interactions entre la bactérie et les cellules bovines pour développer des moyens de lutte sanitaire ciblés contre cette bactérie dans les troupeaux de bovins. Ces cellules pourront aussi être utilisées par la communauté scientifique pour réduire certaines expérimentations in vivo dans d’autre domaines (autres agents pathogènes ou études de toxicité par exemple). Les techniques mises en œuvre dans ce projet pourraient aussi être appliquées à d’autres espèces animales pour lesquelles une lignée cellulaire n’est pas encore disponible alors qu'elle pourrait présenter un intérêt pour l’étude des interactions mammifère-A. phagocytophilum ; c'est le cas des cervidés sauvages.
Procédures
Les veaux prévus pour ce projet auront un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale et locale. La procédure dure au totale environ 20 min.
Impact sur les animaux
Possibilité de douleur ou stress pour l’animal : La ponction de moelle osseuse est un acte réalisé sur animal sédaté le plus souvent, avec ou sans anesthésie générale en pratique vétérinaire, l’animal étant en box de contention et/ou immobilisé à l’aide de cordes ou en décubitus latéral si le format de l’animal le permet. Par souci de confort et de sécurité pour l’animal et pour les manipulateurs, pour ce projet, la ponction sera réalisée sur animal anesthésié.
Devenir
Les veaux seront mis à mort en fin de procédure pour retour dans le circuit pédagogique.
Remplacement
Actuellement, il n'y a pas de méthode in vitro permettant la culture les souches de ruminants d'Anaplasma phagocytophilum et l'étude des intéractions hôté vertébré - agent pathogène. Le but de ce projet est in fine de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants pour la culture d’A. phagocytophilum et pour l’étude des interactions hôte vertébré – agent pathogène. Le tissu hématopoïétique est très sensible d’une part à l’hypoxie (en cas de mort de l’animal) et aux médicaments, ce qui nous interdit le recours à des cadavres d’animaux tout juste décédés. Notre but est d’obtenir le plus de cellules souches hématopoïétiques possible pour pouvoir attendre de ce projet qu’il soit fructueux.
Réduction
Ce projet nécessite l’optimisation de protocoles utilisés en médecine humaine, en particulier pour les étapes de prélèvement de moelle osseuse, de purification puis de culture des cellules souches hématopoïétiques et enfin d’immortalisation de ces cellules. Chaque animal ne sera prélevé qu’une seule fois et nous estimons que nous aurons recours à un maximum de 46 veaux. La moelle des individus jeunes étant beaucoup plus riche en cellules souches hématopoïétiques que celle des adultes le nombre de veaux impliqués dans cette étude sera plus faible que si ce projet était réalisé avec des animaux adultes. Il est aussi possible que la souffrance occasionnée soit moindre chez les veaux que chez les adultes, les prélèvements étant plus aisés à réaliser. Les personnes impliquées dans les étapes d’isolement des cellules souches hématopoïétiques, leur culture et leur immortalisation vont être formées pour maximiser nos chances de réussite. Une étude préliminaire visant à déterminer si les outils utilisés pour immortaliser les cellules humaines peuvent fonctionner sur des cellules bovines. A chaque étape d’optimisation du protocole, le nombre d’animaux utilisés pour l’étape sera contrôlé. Les prélèvements de bonne qualité après optimisation de l'étape n seront utilisés pour débuter les essais d'optimisation de l'étape n+1.
Raffinement
Les veaux auront un hébergement collectif, par 2, sur copeaux, respectant une alternance jour/nuit (12h/12h). Il seront nourris au seau avec du lait artificiel. Pour réduire au maximum les nuisances au bien-être animal lors des procédures expérimentales, chaque individu ne sera prélevé qu’une seule fois, sous sédation et anesthésie générale. Les animaux seront immobilisés pour éviter leur chute lors de la sédation ou lors de l'anesthésie. Pour prevenir une hypothermie, les animaux seront placés sur tapis chauffant. La totalité de la procédure prendra au maximum 20 minutes incluant environ 5 minutes pour le prélèvement de moelle. Les animaux seront mis à mort immédiatement après le prélèvement. Si pendant l'anesthésie les animaux montrent des signes cliniques d'hémorragie ou de défaillance cardiaque ils seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Il n’y a pas d’alternative à l’utilisation de bovins (Bos taurus) pour l’obtention de cellules souches myéloïdes de cette espèce animale. Les veaux sont des jeunes non-sevrés (1 à 1.5 mois, 40 à 70 kg). Le choix de collecter de la moelle osseuse sur des veaux à ce stade de développement est basé sur deux raisons : - La raison principale a trait au fait que la proportion de cellules souches dans la moelle diminue drastiquement avec la croissance et l’âge des animaux (sur la base des données humaines et vétérinaires disponibles). En effet, au fur et à mesure de la croissance, une partie de la moelle est remplacée par du tissu graisseux, limitant la quantité totale de cellules que l’on pourrait obtenir. Notre but étant d’obtenir un maximum de cellules souches pour les transformer, notre choix s’est porté sur des veaux plutôt que des bovins adultes pour ne pas multiplier les prélèvements chez des animaux adultes tout en maximisant nos chances d’obtenir une grande quantité de cellules souches à transformer. - La seconde raison porte sur l’ossification au cours de la croissance des animaux qui rend inaccessibles, chez les bovins certains sites de prélèvement intéressants pour ce projet, puisque riches en moelle.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris génétiquement modifiées, dépourvues d'une protéine liée à une myopathie humaine, subissent une série de tests moteurs, de la mesure de force à la marche forcée sur cylindre rotatif, avant d'être tuées sous anesthésie pour prélever leurs muscles. Le porteur indique que ce modèle présente une morphologie anormale de plusieurs organes et une faible espérance de vie, la plupart des animaux privés du gène fonctionnel mourant au sevrage vers trois semaines. Il affirme que seule la souris permet de reproduire les défauts musculaires observés chez l'humain, la protéine étant conservée à 97 %.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Développement de nouveaux radiotraceurs de la neuroinflammation par imagerie en tomographie par émission de positons chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Équipés sous anesthésie de cathéters veineux et artériels, des rats reçoivent des radiotraceurs, des médicaments ou des inhibiteurs d'enzymes et passent des séances d'imagerie TEP d'une heure, avant d'être tués par exsanguination sous anesthésie profonde pour l'analyse de leur cerveau. 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue de chaque procédure, et certains reçoivent leurs injections éveillés, immobilisés quelques minutes dans un tube de contention. Une partie d'entre eux sont des rats transgéniques suivis à différents stades d'une maladie d'Alzheimer, ou des rats injectés d'un vecteur viral, sur lesquels l'équipe veut valider de nouveaux traceurs de la neuroinflammation. Le porteur indique que les rats auront "entre 4 semaines et 6 mois", puis que les rats transgéniques et leurs témoins seront utilisés "à l'âge de 6, 12 et 18 mois".
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale non invasive utilisée à l’hôpital pour le diagnostic qui utilise essentiellement le fluorodésoxyglucose marqué au fluor-18. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques donne accès à une imagerie moléculaire de hautes sensibilité et spécificité pour le diagnostic et la thérapie et pour une meilleure compréhension des maladies, notamment celles du système nerveux central. L’objectif de ce projet est de caractériser et de valider chez le rongeur de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP en évaluant leur interaction avec des cibles impliquées dans différentes maladies neurodégénératives associées à la neuroinflammation Trois types de caractérisations seront effectuées au cours du projet : - les caractérisations pharmacologiques in vitro aident au choix du radiotraceur et permettent d’optimiser sa structure chimique ; - les caractérisations ex vivo permettent d’étudier la biodistribution tissulaire du radiotraceur et ses métabolites. Lors de cette étape, nous développerons de nouvelles méthodes analytiques originales pour localiser et quantifier les nouveaux radiotraceurs et leurs principaux métabolites dans le cerveau, en amont des étapes de radiomarquage pour maximiser le transfert en clinique et diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Cette première étape de validation nécessitant des animaux est limitante et cruciale dans la sélection des meilleurs candidats ; - l’évaluation préclinique in vivo nécessite ensuite l’administration du radiotraceur chez l’animal afin d’étudier son métabolisme et sa pharmacocinétique plasmatique ainsi que sa spécificité et sélectivité pour la cible d’intérêt par imagerie TEP et de déterminer les paramètres pharmacocinétiques caractéristiques de cette interaction. Cette étape in vivo est indispensable et nous permet d’obtenir les données nécessaires pour l’utilisation ultérieure du radiotraceur chez l’homme (transversalité).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie de la neuroinflammation associée à différentes maladies neurodégénératives à travers des cibles cérébrales impliqués dans le métabolisme des stéroïdes du cerveau comme le cholestérol. En effet, la modification de ces cibles pharmacologiques a été associée à des pathologies comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, la sclérose en plaques ou encore l’épilepsie. A court terme, la sélection et la validation de nouveaux radiotraceurs évalués en préclinique (sur les animaux) permettront de tester des molécules plus spécifiques chez l’homme dans des protocoles de recherche. A long terme, le développement et l’utilisation en routine clinique de traceursspécifiques de la neuroinflammation pourraient permettre le diagnostic, le suivi et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives pour lesquelles il n’existe que très peu ou pas de traitement efficace, en particulier dans la maladie d’Alzheimer. Ces marqueurs permettront également d’optimiser les traitements en matière de dose et de limitation des effets toxiques potentiels. Cela implique l’étude et la compréhension de l’action des traitements et de leur devenir dans l’organisme.
Procédures
Dans ce projet, les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane afin de limiter au maximum douleur, souffrance et angoisse. Elles comprennent la pose de cathéters veineux/artériels (environ 15 min) pour les prélèvements sanguins, les injections de produits (durée
Impact sur les animaux
Les radiotraceurs développés dans ce projet seront administrés à doses extrêmement faibles, ce qui limite voire élimine tout risque de toxicité. Concernant les autres molécules utilisée, les doses chez l’animal sont généralement connues dans la littérature, notamment chez les rongeurs, en terme d’efficacité et d’effet secondaires. Ainsi aux doses prévues dans cette étude, aucune toxicité n’est attendue. Cependant, des effets indésirables ou nuisances possibles comme du stress, changement de comportement, douleur éventuelle peuvent provenir des manipulations (en particulier lors de l’injection d’une durée maximale de 5 min ou lors de la phase de réveil d’une durée maximale de 60 min avant l’euthanasie) oudes pathologies induites (animaux AD en particulier).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter le cerveau (et autres organes) pour des analyses ex vivo (radio-HPLC, spectrométrie de masse, immunohistochimie, autoradiographie…).
Remplacement
Nous mettons en œuvre de nombreuses approches in vitro pour les premières caractérisations des radiotraceurs et la sélection des meilleurs candidats. Ces expériences sur membranes, homogénats tissulaires, cellules, protéines recombinantes nous permettent d’estimer leur affinité et leur sélectivité pour une cible d’intérêt et de détecter leurs principaux métabolites et les enzymes responsables de ces biotransformations. Cette étape nous permet aussi de modifier éventuellement la structure des composés pour les rendre plus stables in vivo en diminuant le niveau de métabolisme. En parallèle, des études in silico peuvent également être mises en œuvre pour sélectionner les composés les plus enclins à interagir avec une cible d’intérêt (récepteur/enzyme). Cependant l’étude in vivo sur les rongeurs s’avère indispensable par la suite car les approches in vitro ne sont pas suffisamment quantitativement prédictives de l’affinité/spécificité in vivo et du taux de métabolisme in vivo. L’extrapolation in vitro-in vivo nécessite la mise en place de modèles mathématiques complexes qui ne sont pas adaptés à tous les paramètres pharmacologiques. Par ailleurs, les paramètres d’absorption, de distribution et de pharmacocinétique du radiotraceur dans le sang et les organes doivent être mesurés dans l’organisme de l’animal. Cette étape préclinique est essentielle à l’évaluation du meilleur candidat pour un passage chez l’homme (transversalité).
Réduction
Dans cette étude, le nombre d’animaux prévu a été déterminé d’après des études antérieures réalisées au laboratoire et des articles bibliographiques. Pour les études de biodistribution et de métabolisme, des groupes de 120 animaux ont été prévus, correspondant à l’analyse de 3 animaux/temps (nombre minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs,). Pour les études d’imagerie, les groupes de 6 animaux permettent d’obtenir des résultats significatifs compte tenu des variations interindividuelles observées chez le rat. L’ensemble des études in vitro permettant de caractériser pharmacologiquement les radiotraceurs et de ne sélectionner que quelques candidats présentant des propriétés adéquates pour l’imagerie nous permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux. Parmi ces propriétés, nous vérifierons par des méthodes alternatives que la molécule peut entrer dans le cerveau, présente une haute affinité et sélectivité pour sa cible, peut être radiomarquée avec des isotopes compatibles avec l’imagerie et que son métabolisme n’est pas incompatible avec son développement. Nous développerons par ailleurs des méthodes analytiques de quantification des radiotraceurs et de leurs métabolites, les plus sensibles possibles pour utiliser des volumes de sang ou de tissus les plus faibles possibles et réduire ainsi le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant le début des expérimentations et seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés par paire dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Lors de toutes les expériences in vivo et/ou ex vivo, biodistribution, métabolisme et imagerie, les animaux seront anesthésiés. Dans certains cas particuliers, afin d’éviter toute influence de l’anesthésique sur le métabolisme d’un radiotraceur ou une pollution du signal par l’anesthésique, les injections pourront être réalisées sur animaux vigiles placés dans un tube de contention. Dans ce cas, les animaux seront entraînés à la manipulation de manière à limiter la douleur et le stress le jour de l’expérimentation. Les animaux seront étroitement suivis tout au long de l’étude par du personnel expérimenté, permettant l’application des critères d’arrêt en amont afin d’empêcher toute souffrance animale. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier le rat font partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études de biodistribution, de métabolisme et d’imagerie cérébrale. Il existe par ailleurs de nombreux modèles de maladies neurodégénératives décrits chez le rat (Alzheimer, Sclérose en plaques, Huntington, …) qui nous permettent de tester les meilleurs candidats sélectionnés sur des animaux pathologiques/génétiquement modifiés et d’étudier les modifications de leur interaction avec la cible d’intérêt. Les animaux utilisés dans ce projet auront entre 4 semaines et 6 mois selon les modèles de rats (sains ou pathologiques) et les procédures. Pour les études de métabolisme, des rats jeunes seront utilisés (environ 40 jours). En effet, une diminution du métabolisme avec l’âge a été observée et décrite dans la littérature. Pour les études d’imagerie, le cerveau doit être assez développé. Les rats transgéniques et contrôles seront utilisés à l’âge de 6, 12 et 18 mois afin d’investiguer la capacité des traceurs à détecter leur cible à un stade précoce (6 mois), moyen (12 mois) ou tardif (18 mois) du développement de la maladie d’Alzheimer. Pour le modèle de rat injecté par un vecteur viral l’imagerie sera réalisée entre 5 et 10 semaines après l’injection du vecteur afin de vérifier l’absence de vecteur viral et l’expression du récepteur humain. L’injection du vecteur viral étant réalisée à l’âge de 8 semaines, les rats auront entre 13 et 18 semaines lors de l’examen d’imagerie.
Evaluation de l’extrait méthanolique de graines de Syzygium cumini pour la protection de la microcirculation coronaire dans un modèle de rat obèse (Zucker).
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 rats obèses Zucker vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent un gavage quotidien d'extrait de graines de Syzygium cumini ou de solvant, avec des poses de cathéter dans la veine caudale et des séances d'imagerie cardiaque, avant d'être tués au CO2 pour analyse. Le projet évalue une plante de la biodiversité réunionnaise pour protéger la microcirculation du cœur. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"indispensable", des essais in vitro ayant déjà servi à sélectionner l'extrait.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont responsables d’un tiers des décès dans le monde. La maladie ischémique, définie par un apport sanguin insuffisant au muscle cardiaque, représente la moitié des décès d’origine cardiovasculaire. Elle peut être d’origine macrovasculaire et impacter les gros vaisseaux via le développement de plaques d’athérome. De récentes avancées ont mis en évidence qu’une dysfonction coronarienne microvasculaire (DCM), à savoir une dysfonction des petits vaisseaux composant le système vasculaire cardiaque peut survenir aussi bien indépendamment que parallèlement à une obstruction des gros vaisseaux. La DCM conduit également à une ischémie myocardique, voire à un infarctus du myocarde. A ce jour, peu de traitements, ou de stratégies préventives sont connues contre cette pathologie. A l’île de La Réunion la population locale a souvent recours à la médecine traditionnelle pour prévenir ou traiter les maladies cardiovasculaires et les facteurs de risques qui y sont associés. L’objectif de cette étude est d’évaluer la pertinence de l’utilisation d’un extrait de plante issue de la biodiversité réunionnaise, pour la protection du réseau microvasculaire coronaire. Cette étude sera menée dans un modèle de rat obèse prédiabétique. Ce modèle a été au préalable étudié au laboratoire pour le développement de la dysfonction coronaire microvasculaire. Cette étude menée chez le rat zucker obèse permettrait la validation scientifique de l’utilisation de cette plante pour prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire. Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 24 rats seront utilisés. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. Tout au long des études in vivo, nous respecterons la règle des 3R en tenant compte du fait qu’aucune méthode alternative n’est disponible pour le remplacement. La glycémie et l’insulinémie des animaux seront surveillées une fois par mois, leur poids et leur prise de nourriture une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage (avec enrichissement du milieu de vie) sera adapté en fonction de leur poids. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. La mise en place de points limites adaptés permettra de limiter la souffrance de ces animaux. Les injections seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra l’évaluation de l’extrait de Syzygium cumini sélectionné par des études préalables, pour la prévention de la dysfonction coronarienne microvasculaire.
Procédures
Les animaux seront tous soumis à un gavage quotidien, d'une durée maximum de 5 min par animal, soit d’extrait végétal (S. cumini) pour les animaux contrôles et obèses traités soit de solvant pour les animaux contrôles et obèses non traités. Le traitement sera administré durant l'apparition théorique de la pathologie vasculaire. La glycémie et l’insulinémie seront mesurées une fois par mois par pose de cathéter dans la veine caudale. Cette intervention durera 10 min au maximum par animal. Les mêmes animaux seront soumis à une imagerie échographique cardiaque une fois toutes les 3 semaines pendant 9 semaines et une fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines, afin d’évaluer les changements morphologiques et fonctionnels cardiovasculaires liés au développement de la maladie métabolique en étant traités ou non avec l’extrait de Syzygium cumini. Cette procédure dure au maximum 45 min. Lorsque les animaux seront âgés de 35 semaines, soit 15 semaines après le début des gavages, les animaux seront soumis à l’imagerie TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique) pour la mesure de l’entropie de perfusion myocardique. Cette procédure dure moins de 45 min. En ce qui concerne la mesure de la réserve coronaire en échocardiographie et la mesure de l’entropie de perfusion myocardique en imagerie TEMP les animaux seront soumis à une injection d’agent pharmacologique permettant de mimer une situation d’effort. 3 semaines après l’imagerie TEMP les animaux seront mis à mort par inhalation au CO2.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’imagerie (échocardiographie et imagerie nucléaire TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique)) qui seront mis en œuvre dans cette étude n’entraîneront pas de douleur, souffrance ou angoisse. L’agent pharmacologique permettant de mimer une situation d’effort pour la mesure de la réserve coronaire et de l’entropie de perfusion myocardique a un effet transitoire. Il n’y a donc pas de nuisances ou effets indésirables attendus. Une solution composée d’extrait de plante issue de la biodiversité réunionnaise sera donnée aux rongeurs par voie orale. L’observation d’une prostration, d’un défaut de toilettage, de troubles moteurs, d’un trouble de la conscience, d’un dos vouté fera suspecter une toxicité de l’extrait et sera un point limite. Les animaux concernés seront alors mis à mort.
Devenir
Les animaux seront gardés vivants pour un suivi temporel de leurs fonctions et morphologies cardiovasculaire pendant 18 semaines (imagerie échocardiographique et nucléaire comprises). 3 semaines après l’imagerie TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique), les animaux seront mis à mort pour des analyses ex vivo en l’absence de toute radioactivité résiduelle.
Remplacement
Les techniques ex vivo/in vitro permettant d’étudier la microcirculation coronaire sont peu nombreuses. Elles consistent soit à isoler des vaisseaux coronaires afin d’évaluer leur réactivité en présence ou non de composés pharmacologiques, soit à utiliser des lignées de cellules endothéliales ou musculaires. Ces méthodes nous ont permis d’effectuer une première évaluation de nos extraits, mais uniquement les modèles in vivo permettront de confirmer l’utilisation de l’extrait pour la protection du réseau coronaire microvasculaire et cela en raison de la combinaison de tous les aspects biologiques entrant en compte (e.g : voie métabolique). Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal.
Réduction
Au total 24 rats seront utilisés ici. Il y aura 6 animaux par groupe, il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu (n=6 par groupe expérimental). Les résultats expérimentaux seront analysés en utilisant des tests statistiques pour valeurs non appariés pour comparer les valeurs obtenues entre les quatre groupes. Une étude pilote menée sur des rats obèses a dans un premier temps été réalisée afin de vérifier l’utilisation de ce modèle animal pour la survenue d’une dysfonction coronaire microvasculaire. De plus, des études préliminaires sur différents extraits ont été réalisés ex vivo et in vitro afin de déterminer l’extrait qui aurait le meilleur potentiel pour protéger la microcirculation coronaire. Ces deux études ont permis de réduire le nombre d’extraits et de conditions à tester et donc le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement afin de contrôler leur bien-être. Le poids des animaux ainsi que la prise de nourriture seront surveillés une fois par semaine. Le nombre d’animaux par cage sera adapté en fonction de leur poids. Ils disposeront d’enrichissement de leur milieu de vie (bâton en bois, tunnels, etc…). Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson sera mise en place si les animaux deviennent hyperglycémiques. Les expérimentations prévues lors de cette étude sont des procédures non invasives (imagerie échocardiographie et imagerie nucléaire TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique)). Lors de ces procédures, les animaux sont sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane. Les rats seront soumis à un gavage quotidien avec un extrait de plante issue de la biodiversité réunionnaise.Les études préliminaires menées sur cet extrait n’ont révélées aucune toxicité. Une surveillance quotidienne des animaux reste cependant nécessaire et des points limites ont été établis. Des scores seront calculés selon une grille d’évaluation (voir ci-dessous). Un score total supérieur ou égal à 3 sera considéré comme un point limite et l’animal sera mis à mort. Aucune anomalie n’a été observée lors de l’étude pilote menée précédemment au laboratoire De plus, l’effet de l’agent pharmacologique permettant de mimer la situation d’effort pour la quantification de la réserve coronaire est transitoire, mais une grille de surveillance sera toutefois ajoutée pour la surveillance respiratoire des rats. Cette grille comprendra donc la surveillance de l’apparence physique, du comportement, de la respiration et du changement de poids des animaux. Un score total supérieur ou égal à 3 sera considéré comme un point limite et l’animal sera mis à mort. I. Apparence physique Normale : 0 Manque de toilettage, poil ébouriffé : 1 Poil très ébouriffé, posture anormale : 2 II. Comportement Normal : 0 Changements mineurs : 1 Anormal, mobilité et activité réduites : 2 Animal très agité ou immobile, isolé, agressif : 3 III. Respiration Normal : 0 Essoufflement : 1 Hyperventilation : 2 Anormale, tremblement : 3 Les animaux seront mis à mort selon une méthode appropriée, à savoir par inhalation de CO2.
Choix des espèces
L’évaluation expérimentale in vivo du développement d’une pathologie telle que l’atteinte microvasculaire coronarienne est indispensable à la compréhension de la pathologie clinique. Les atteintes microvasculaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. Le rat Zucker obèse possède spontanément deux allèles récessifs (fa/fa) pour le récepteur à la leptine (régulation des réserves de graisses et de la satiété). Ces rats sont hyperphagiques, hyperlipidémiques, hypercholestérolémiques, insulinorésistants sans être hyper-glycémiques. Ils sont très largement utilisés pour l’étude de pathologies métaboliques. L’étude préliminaire a permis de démontrer une atteinte microvasculaire à des stades tardifs. Il constitue donc un modèle pertinent pour le développement d’outils thérapeutiques/préventifs de la dysfonction coronaire microvasculaire. Le traitement sera administré durant l'apparition théorique de la pathologie vasculaire La caméra TEMP (Tomographie par Emission MonoPhotonique) utilisée et les sondes d’échographie étant destinées au petit animal, ce choix est particulièrement adapté aux caractéristiques techniques du matériel.