Diagnostic des maladies

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des déficits de mémoire, elles reçoivent deux molécules par gavage ou injection pendant 21 jours, puis subissent des tests comportementaux dont des épreuves de nage dans une eau à 22 degrés. Le porteur n'annonce qu'un inconfort lié à la contention et attend des molécules qu'elles restaurent la mémoire, les souris étant tuées pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne peut remplacer l'animal entier, un passage en clinique restant conditionné aux résultats.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier l’effet bénéfique de molécules pharmacologiques à potentiel thérapeutique dans des maladies du cerveau (démence fronto-temporale, maladie d’Alzheimer, tauopathie). Deux molécules seront testées et elles seront injectée par deux voies d’administration différentes dans deux lignées de souris modèlisant ces maladies du cerveau (et de leurs contrôles). Nous mènerons ensuite une série de tests comportementaux visant à évaluer si ces différents traitements (molécules actives, molécules contrôle) favorisent la formation de la mémoire chez ces animaux. Des analyses du tissus cérébral (obtenu post-mortem) permettront d’avancer sur la compréhension des effets de ces traitements au niveau cellulaire. Pour comprendre leurs mécanismes d’action, des études moléculaires seront menées en parallèle sur ces tissus obtenus post-mortem à partir d’autres groupes d’animaux traités. Ces études permettront de démontrer si l’administration de ces molécules par voie orale apporte un bénéfice sur le cerveau et s’il l’un de ces traitements (ou les deux) peuvent être ultérieurement appliqués à l’Homme pour des études cliniques.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration par voie orale (per os) de nouveaux médicaments est efficace contre les maladies du cerveau. En effet, la validation du mode d’administration oral pour le traitement pharmacologique avec l’une ou l’autre de ces molécules (ou les 2), permettra leur exploitation vers les phases cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles apporteront des pistes et des preuves d’efficacité pour aller vers les études cliniques chez l’Homme. De plus, en apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de ces molécules sur le cerveau.

Procédures

Le gavage oral sera réalisé sur 360 animaux vigiles, à raison de 1X/jour pendant 3X5 jours suivi de 2 jours de repos, sur une période de 21 jours. Les injections intra-péritonéales seront réalisés sur 240 animaux vigiles, à raison de 1X/jour pendant 3X5 jours suivi de 2 jours de repos, sur une période de 21 jours. Le gavage oral nécessite une habituation à la contention de 30 secondes 1X/jour pendant 3 jours, suivie des contentions répétées 1X/jour pendant 15 jours (sur les 21 au total). Chaque contention est faite sur animal vigile et dure entre 10 et 15 secondes. Comportement réalisé sur 360 animaux vigiles hébergés en cage individuelle avec nid sur une période de 41 jours/animal: Test1 : 48h dans une cage avec peu de litière et sans nid, Test2 : 15min de test/jour dans une boite d’open field sur 5 jours, Test3 : 3X 1min/jour dans de l’eau à 22° C sur 6 jours + 1 min dans l’eau (22°C) 24h après l’entrainement + 1 min dans l’eau (22°C) 21 jours après l’entrainement. Chaque test est séparé du suivant par 3 jours. Les souris transgéniques développent des déficits mnésiques (souris THY-Tau22 à l’âge de 9 mois et souris Thy1-hSNCA à l’âge de 12 mois).

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. Cependant celui-ci sera minimisé par la mise en place d’une habituation à la contention, réalisée 1X/jour pendant 3 jours avant les différents types d’administration. La voie d'administration par gavage oral a été retenue car il s'agit de celle qui serait utilisée chez l’Homme dans les phases cliniques. La voie d'administration intrapéritonéale est la voie qui a déjà été utilisée chez l’animal dans des études pilotes et servira de contrôle à l’administration par gavage oral. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Ces deux modes d’administration sont opérés par une personne qualifiée et spécialement formée sur ces gestes techniques, minimisant ainsi le stress auquel les animaux sont soumis. Enfin, aucun effet secondaire (indésirable) n'est attendu avec les deux molécules testées, car des études antérieures ont déjà montré qu’elles n’avaient pas d’effet toxiques, même lors d’injections répétées/chroniques. Cependant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement par du personnel spécialement formé lors des administrations des molécules et lors des tests comportementaux. Les souris transgéniques développent des déficits mnésiques entre 9 mois et 12 mois. Notons que l’administration des molécules devraient, selon notre hypothèse de travail, minimiser ces nuisances (par exemple, restaurer la mémoire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes (voir chronogramme décrivant les groupes d’animaux). Enfin, nous avons créé les lots d’animaux de cette étude en tenant compte des études antérieures qui avaient déjà montré l’impact de ces molécules sur les groupes contrôles et cela nous permet de réduire le nombre total d’animaux de 720 à 600.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration d’une molécule : la surveillance des souris est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge adulte, soit 9 et 12 mois selon les modèles, cela correspond environ à la moitié de la vie d’une souris de laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond également au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène, subissent des tests sensoriels et moteurs sur animal vigile, une mesure de la conduction nerveuse par électromyographie sous anesthésie et une hyperglycémie provoquée après six heures de jeûne. L'objectif est de comprendre le rôle de l'enzyme PCSK9 dans les nerfs périphériques et d'évaluer un risque possible des traitements anti-cholestérol qui la bloquent. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux animaux vivants et d'"inestimable" le système génétique employé, la neuropathie étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Le projet a pour objectif principal de comprendre le rôle de PCSK9 dans le système nerveux périphérique. PCSK9 est une enzyme fortement exprimée dans le foie où elle joue un rôle clé dans le métabolisme lipidique. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter des patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Nos précédents travaux ont pu mettre en évidence que PCSK9 est également exprimé dans le système nerveux périphérique au niveau des nerfs où son role reste pour l'instant totalement inconnu. Suite à cette observation, il est essentiel de déterminer la fonction de PCSK9 dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des thérapies bloquant son activité sur les fonctions sensorielles et motrices des patients traités. Afin d’étudier la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant d'éliminer spécifiquement son expression dans différents tissus. Nous évaluerons les fonctions sensorielles et motrices des animaux en réalisant des tests comportementaux. Nous évaluerons également le bon fonctionnement des nerfs sensoriels en faisant des mesures de la vitesse de conduction par la technique de l'électromyographie.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles données sur la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter les patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques de type 2. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Suite à la mise en évidence de l'expression de PCSK9 dans les nerfs périphériques, il est essentiel de déterminer sa fonction dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des inhibiteurs de PCSK9 sur les fonctions sensorielles et motrices chez les patients traités. Ce projet permettra de déterminer le rôle de PCSK9 dans les nerfs périphériques et de déterminer si son inhibition en clinique peut avoir un impact sur le développement de neuropathie chez les patients traités.

Procédures

Le prélèvement de tissus pour le génotypage des souris et la mise en place d’une bague d’oreille numérotée sera réalisé sous anesthésie générale sur l’ensemble des animaux et la technique sera d’une durée de 5min par animal. Les tests comportementaux seront réalisés sur animaux vigiles sur l’ensemble des animaux et le geste technique sera d’une durée de 20min par animal. La vitesse de conduction nerveuse sera effectuée sous anestéshie générale et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 20 min par animal. L’hyperglycémie provoquée se fera sur animaux vigiles et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 120 min par animal avec des prélèvements à différents temps. L’exsanguination sera effectuée sur l’ensemble des animaux du projet qui seront mis sous anesthésie générale et la procédure durera 5min par animal.

Impact sur les animaux

Concernant les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux, nous avons identifié certaines manipulations qui pourraient entrainer des nuisances ou des effets indésirables sur les animaux. L’injection de tamoxifène sur animal non anesthésié peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés par des expérimentateurs formés à la préhension et à la contention des animaux de laboratoire. Le tamoxifène est un anti-estrogène administré dans le cancer du sein de la femme. Même si quelques effets secondaires peuvent être observés tels qu'une mortaité embryonnaire, une infertilité temporaire ou un blocage intestinal, en recherche, elle est couramment utilisée chez la souris pour activer la recombinase Cre dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Au vu des doses utilisées et de la période d’injection (5 jours), nous ne nous attendons pas à des effets indésirables sévères. Concernant les tests sensoriels et moteurs, l’isolement des animaux pour effectuer les tests peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter ces effets, les animaux seront habitués à la salle de test, à son environnement et au matériel pendant 3 jours consécutifs (30 minutes par jours). Pour l'hyperglycémie provoquée, la mise à jeun de l’animal pendant 6 heures peut entrainer des effets indésirables. Afin de limiter le stress, la mise à jeun se fera pendant la journée afin que les expérimentateurs puissent surveiller le comportement des animaux pendant cette période.

Devenir

L'ensemble des animaux est maintenu en vie au cours des procédures 1 à 7. A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux subiront une exsanguination suite à une ponction cardiaque après anhestésie à l’isoflurane.

Remplacement

Les objectifs de cette étude sont de déterminer le rôle de PCSK9 de manière spécifique dans le système nerveux périphérique. Elle nécessite donc l’utilisation de lignées de souris transgéniques dans le but de supprimer l’expression de la protéine PCSK9 dans différents types cellulaires composant le nerf. Par ailleurs, le recours à l’expérimentation sur des animaux vivant est indispensable car la neuropathie est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (ex : culture cellulaire), de même que les tests de phénotypage sensoriel et moteur. De plus, le système Cre-loxP est un système inestimable pour le contrôle de la délétion de différents gènes au niveau du système nerveux chez la souris et est très fréquemment utilisé chez les modèles de souris transgéniques. Les études seront systématiquement optimisées d’après la littérature et/ou les observations réalisées au laboratoire.

Réduction

L’utilisation des animaux sera réduite au maximum et les expériences seront planifiées et réalisées les unes après les autres afin d’éviter des pertes inutiles. L’application de cette politique de réduction mise en place permettra d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer un maximum d’information d’un minimum d’animaux. Le nombre d'animaux minimum a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les protocoles ont été établis afin de réduire la douleur et la détresse de l’animal. Les animaux seront sous la surveillance de personnes habilitées et la diffusion par ces personnes de leur savoir-faire permettra de réaliser nos expérimentations dans le respect du bien-être animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Pour les tests sensoriels et moteurs, les souris bénéficieront d'une acclimatation à la salle de test (30 minutes/jour pendant 3 jours) afin d’éviter le stress de l’animal. Les tests seront effectués sur plusieurs jours dans le but de limiter le nombre de stimulations (mécaniques, nociceptives et motrices). Si lors d'une procédure des signes de douleur ou de détresse sont observés alors l'animal se verra administré une dose d'analgésique (buprénorphine) à 0,01 mg/kg en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne des zootechniciens et expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être et de détecter tout signe éventuel de douleur (prostration, isolement, passivité, pelage, respiration, vocalisations)

Choix des espèces

La souris représente une espèce validée dans l’étude des neuropathies. Elle permet l’évaluation des déficits sensoriels et moteurs par la possibilité d’effectuer des tests sensoriels et moteurs non invasifs établis de longue date chez ce modèle animal et récapitulant les tests sensoriels réalisés chez l’homme. Nous utilisons des souris car elles sont déjà à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris transgéniques permettant l’étude de protéines d’intérêt impliquées dans les neuropathies. Nous utiliserons des souris âgées de 10 semaines. Nous avons choisi ce stade de développement car le système somatosensoriel est mature et fonctionnel à partir de 8-10 semaines.

12 macaques, six crabiers et six rhésus, vont être utilisés puis réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une IRM puis quatre séances d'imagerie TEP par candidat médicament, sous anesthésie générale pouvant durer 300 minutes, avec pose d'un cathéter artériel et prélèvements sanguins. Le porteur indique un stress lié à la contention et au réveil, et signale que le produit de contraste, un oxyde de fer, peut élever le taux de fer sanguin. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la distribution d'un médicament dans un "organisme entier" proche de l'humain, et conclut à la nécessité du primate.

Objectifs

L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments pour traiter des maladies telles que le diabète, certains cancers et des pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Pour y parvenir, nous synthétiserons des analogues radiomarqués de ces candidats médicaments que nous injecterons à des primates non humains. La distribution tissulaire sera suivie grâce à une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de candidat médicament radiomarqué par différents isotopes utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des candidats médicaments peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant aux isotopes utilisés et qui sont également utilisées en médecine humaine. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le candidat médicament étudié lors d’une administration. Les candidats médicaments étudiés concernent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction et également les neuroprotecteurs. Deux séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux du candidat médicament. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire du candidat médicament étudié. Le candidat médicament radiomarqué sera co-administré avec une molécule à usage humain dont on sait qu’elle interagit de manière spécifique avec la cible pharmacologique du candidat médicament étudié. Typiquement, cette étude sera réalisée en co-injectant le radiotraceur avec son analogue « froid », afin qu’il rentre en compétition avec la fixation tissulaire du radiotraceur. Les doses de médicament « froid » seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations pertinentes sur l’exposition tissulaire et sur les spécificités de la distribution et de l’élimination des candidats médicaments étudiés. Ces résultats peuvent être extrapolés chez l’Homme.

Procédures

Les animaux auront une séance d’imagerie anatomique (IRM) puis quatre séances d’imagerie dynamique (TEP) par candidat médicament étudié. Toutes les imageries (IRM et TEP) se dérouleront sous anesthésie générale (durée 300 minutes maximum) pour une acquisition d’une durée de 240 minutes maximum. Il n’y aura pas de prélèvements sanguins pendant l’imagerie IRM. En revanche, il y aura des prélèvements sanguins à chaque imagerie TEP qui seront séparés de 15 jours au minimum. Une voie artérielle sera positionnée en début d’anesthésie (durée de la pose inférieure à 5 minutes) afin de faire les prélèvement sanguin (durée inférieure à 5 secondes) durant l’examen. Pour 2 des 4 imageries TEP, les animaux recevrons une dose pharmacologique du candidat médicament par injection intra-veineuse sur 1 minute.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable prévu est un stress associé à la contention physique (durée inférieure à 2 minutes) précédent l’injection de l’anesthésie par voie intra musculaire ainsi qu’un stress pendant la phase de réveil (durée inférieure à 1 heure). Présence d’anesthésies répétées et relativement longues avec injections des médicaments et prélèvements sanguins.

Devenir

Le protocole expérimental ne nécessite pas d’euthanasier les animaux. Les animaux pourront être réutilisés sur décision du vétérinaire à la fin de l’étude.

Remplacement

Compte tenu de la complexité des phénomènes étudiés, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les effets d’un candidat médicament sur un organisme entier et donc d’extrapoler les résultats chez l’Homme. Afin d’obtenir des données convaincantes d’un point de vue clinique, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier dont l’organisation se rapproche au maximum de celle de l’Homme. Cette étude ne peut être envisagée qu’in vivo chez des primates non humains dont les déterminants pharmacocinétiques et la physiologie sont plus proches de l’Homme que celle des rongeurs.

Réduction

L’approche statistique envisagée permet la comparaison des deux conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable d’un point de vue pharmacocinétique. Cette estimation prend en compte la variabilité des mesures observées lors d’études précédentes réalisées chez les primates non-humain. Dans une perspective de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude, seulement 12 primates non-humain seront inclus. Chaque animal participera à 4 examens par molécule étudiée afin d’obtenir des données répétables et représentatives des phénomènes étudiés.

Raffinement

Pendant toute la durée de cette étude, il y aura une mise en place d’un renforcement positif avec un remplacement hebdomadaire (physique) et journalier (alimentaire, sensoriel) des enrichissements. Une surveillance quotidienne des primates non humains sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Tous les examens se réalisent sous anesthésie générale. Juste avant le début de l’examen un examen clinique de l’animal sera systématiquement réalisé. Durant les examens d’imagerie, la température corporelle est monitorée et maintenue à l'aide d'une couverture chauffante à air (42°C) et une maintenance hydrique, réchauffée à 37°C, est suppléé. Les paramètres physiologiques et de ventilation sont suivis et sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Durant ces examens la surveillance des animaux est renforcée jusqu’au réveil complet de l’animal (animal debout). Certains animaux possèdent une sensibilité aux agents anesthésiants. Des protocoles ont été mis en place afin d’identifier et de prévenir ces sensibilités.

Choix des espèces

La physiologie des barrières biologiques des primates non-humains est plus proche de celle des primates humains que de celle des rongeurs. Les niveaux d’expression de nombreux transporteurs de médicaments sont très différents entre les Hommes et les rongeurs. Il a été montré que les primates non-humains constituent un modèle plus prédictif de l’activité de ces transporteurs lors des études de pharmacocinétique. Aussi, afin d’étudier ces effets et extrapoler les résultats chez l’Homme, l’utilisation de primates non-humains est particulièrement pertinente. Le macaque adulte réunit tous les critères requis et constitue le meilleur choix pour notre étude.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dix-huit injections de thioacétamide sur six semaines, une hépatotoxine qui provoque une fibrose puis une cirrhose du foie, avec une perte de poids et une mortalité pouvant atteindre 15 % des animaux traités. Le porteur indique tuer les souris par ponction cardiaque pour prélever le foie, l'objectif étant de mettre au point une méthode d'imagerie 3D de la fibrose sur foie rendu transparent. Il affirme qu'aucun modèle de fibrose hépatique in vitro n'existe et qu'il est "contraint" de recourir à l'animal.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la première cause de maladie chronique du foie et sa prévalence ne cesse d’augmenter. La NAFLD inclus différents stades allant de la simple stéatose à la stéatohépatite non-alcoolique (NASH) caractérisée par de l’inflammation et une progression rapide de fibrose. Les patients atteints de NASH présentent un risque accru de développer une cirrhose ou un hépato- carcinome. De nombreux facteurs augmentent le risque de progression de la NAFLD à la NASH, mais les mécanismes sont encore peu connus. Il n’existe d’ailleurs actuellement aucun traitement contre la NASH. Les modèles précliniques d’étude de la NASH sont encore peu nombreux et ne récapitulent pas parfaitement les lésions observées chez les patients. Dans l’objectif de mieux caractériser le développement de réseau de fibrose, et avec l’émergence des nouvelles technologies d’imagerie, nous proposons de mettre en place une méthode pour caractériser et quantifier le réseau de fibrose hépatique en 3-dimensions par microscopie bi-photonique sur foie transparisé, c’est-à-dire rendu transparent. Pour rendre le foie transparent, nous utiliserons un protocole décrit nommé CUBIC pour « clear unobstructed brain/body imaging cocktails » ou cocktail pour l’imagerie du cerveau/corps clair et non obstrué. Suite à cela, nous visualiserons le réseau de fibrose en 3-dimensions sur des coupes d’organes de plus de 2 mm d’épaisseurs avec un microscope multi-photonique. Le projet vise ensuite à publier cette méthode dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Avec les prélèvements de foie fibrosé, nous envisageons de développer une méthode de transparisation de foie murin avec le réactif CUBIC, suivie de visualisation des fibres de collagène en microscopie multi-photonique en 3 dimensions (sur foie jusqu’à 2 mm d’épaisseur). La microscopie bi-photonique est une méthode d’imagerie basée sur la propriété de certaines molécules à générer des signaux seconde harmonie (SHG, pour second harmic generation) lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde spécifique. Le collagène, la molécule caractéristique de la fibrose est une molécule décrite comme étant propice à la microscopie SHG. Ainsi, la méthode que nous souhaitons développer devrait permettre : 1) Une caractérisation spatiale du réseau de fibrose plus sensible et plus complète que les analyses classiques actuellement utilisées. 2) Une meilleure connaissance de la nature des fibres, avec la possibilité d’orienter l’angle de polarisation du laser pour discriminer différentes fibres. La microscopie bi-photonique avec le SHG est une méthode « label-free », c’est-à-dire qu’elle n’utilise pas de colorants ou d’anticorps. Cela implique donc qu’en plus de réduire les coûts, d’éviter l’exposition à des colorants et produits chimiques nocifs, cette méthode d’imagerie pourrait être couplée à des méthodes d’immunofluorescences classiques sur le même échantillon. On peut donc imaginer d’étudier la colocalisation entre les fibres de collagène hépatique et l’expression de protéines d’intérêt. A la suite de la mise au point de cette méthode, nous envisageons de la publier dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Procédures

Pour mettre au point cette nouvelle méthode d’imagerie en 3 dimensions, nous proposons d’utiliser du foie de souris issues d’un modèle de fibrose hépatique induite par hépatotoxine à savoir la thioacétamide (TAA). Le TAA est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. Les souris seront soumises à 3 injections intra-péritonéales de TAA par semaine pendant 6 semaines (18 au total). Ces injections visent à induire une fibrose hépatique dans le but de notre étude. A la fin du protocole, un prélèvement de sang sera effectué par ponction cardiaque après anesthésie/analgésie chimique.

Impact sur les animaux

Le thioacétamide (TAA) est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. L’administration de TAA provoque des lésions hépatiques, celles-ci peuvent atteindre le stade de cirrhose, avec ses complications associées. Cependant, celles-ci sont rarement sources d’inconfort pour les animaux. Une perte de poids modérés peut être observée. La mortalité peut atteindre 15% des souris traitées au TAA.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le foie.

Remplacement

La fibrose hépatique est un processus physiologique complexe, multi-cellulaire et dont la spatialisation du réseau de fibrose dans le foie a un impact physiologique (la fibrose péri-portale et différente de la porto-centrale). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de fibrose hépatique in vitro, c’est pourquoi nous sommes contraints d’utiliser un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. L’injection de TAA ne nécessite pas d’injection d’analgésique. Les souris sont hébergées par 2 à 5 par cage pour limiter l’isolement, et les cages seront enrichies en frisotis et d’un dôme en carton. Une observation quotidienne des souris et une pesée hebdomadaire seront effectuées. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose hépatique induite par TAA chez les C57Bl/6J mâles est un modèle de choix et reconnu pour le développement de fibrose. Avec ce modèle, il est très probable que la totalité des animaux traités au TAA soient atteints de fibrose hépatique après 6 semaines de traitement ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 8 semaines au début des injections. Les injections de TAA s’étaleront sur 6 semaines. Ce sont les durées généralement utilisées dans la littérature pour induire de la fibrose hépatique au TAA.

390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.

Remplacement

La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.

840 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des bruits de deux à huit heures par jour pendant jusqu'à 180 jours, exposition pouvant provoquer un stress chronique et des dommages de l'oreille, une partie subissant aussi la pose chirurgicale d'implants cardiaques ou neuronaux. Le porteur étudie les effets du bruit sur les circuits auditifs et choisit la gerbille pour son audition proche de celle de l'humain. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de simuler un système auditif entier de millions de neurones.

Objectifs

On distingue la surdité qui est un terme générique désignant la diminution de l’acuité auditive. La grande majorité des surdités sont neurosensorielles et ont essentiellement pour origine l'oreille interne et la transduction mécano-électrique de la vibration sonore en activité neurale. Actuellement, en l’absence de traitement curatif, la surdité neurosensorielle nécessite d’être compensée par une prothèse auditive. L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de surdité neurosensorielle. Une exposition supérieure à 105 dB d’une heure provoque ainsi des dommages irréversibles. Les dommages dépendent à la fois du niveau de l’intensité sonore et de la durée de l’exposition. La législation du travail a fixé des seuils de tolérance, en prenant comme base un niveau d’exposition moyen sur 8h : • Au-delà de 80 dB SPL (sound pressure level), des dispositifs de réduction du bruit doivent être proposés (casques par exemple). • Au-delà de 85 dB SPL, ces dispositifs doivent être utilisés et contrôlés. • Au-delà de 87 dB SPL (casques inclus), le bruit doit être réduit. La surexposition sonore dans les mégalopoles, constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central des surexpositions au bruit sont peu étudiées. Les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Il existe une grande variabilité individuelle dans la sensibilité aux atteintes auditives déclenchées par le bruit. L’objectif majeur de notre projet de recherche est le suivant : Etudier les conséquences sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus d’un son d’intensité moyenne/forte dans la durée. Nous caractériserons la façon une exposition sonore continue impacte les circuits auditifs centraux chez un modèle animal, la gerbille, dont les gammes de fréquences sont plus similaires à celles entendues par l’Homme que la souris habituellement utilisée. Cette analyse se fera à plusieurs échelles : i) modifications anatomiques, ii) modifications fonctionnelles des réseaux, iii) modifications comportementales et iv) modifications physiologiques. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets globaux du bruit sur la santé en reliant pour la première fois les atteintes physiologiques, cérébrales et comportementales.

Bénéfices attendus

Le suivi des animaux pendant et après l’exposition sonore, du point de vue de l’activité neurale, des modifications anatomiques et de l’évolution des performances comportementales, permettra de mieux appréhender les effets physiologiques et cognitifs du bruit auquel sont confrontés les humains quotidiennement. La plupart des études précédentes ont étudié chaque variable séparément, mais c’est bien dans la relation entre ces différents effets que l’on développera une vision d’ensemble scientifiquement pertinente. Un point crucial est que faire plusieurs mesures sur un même animal est donc non seulement scientifiquement utile mais est éthiquement intéressant puisque cela permet de réduire drastiquement l’usage d’animaux. Certaines questions importantes mais peu étudiées comme l’adaptation des performances du cerveau à la présence durable de bruit environnemental quotidien seront ainsi résolues.

Procédures

Tous les groupes d’animaux subiront des expositions sonores de 2h à 8h par jour pendant au maximum 180 jours. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. En parallèle de ces expositions sonores, deux groupes d’animaux sont soumis à trois interventions. Dans la première intervention, des chirurgies ponctuelles à poser des implants physiologiques (activité cardiaque, premier groupe), neuronaux (deuxième groupe) et une puce d’identification (les deux groupes) sont susceptible d’entrainer des douleurs post opératoires minorées par des antalgiques. La pose d’implants et la mesure préalable de l’audition des animaux nécessitent leur anesthésie pendant environ 4h. Si la procédure se déroule bien, les animaux récupèrent de ces chirurgies en quelques jours. La deuxième intervention est une phase d’habituation puis d’enregistrement de l’activité neurale ou cardiaque, elle est réalisée sur l’animal en liberté ou tête fixée, elle s’étale sur plusieurs jours, environ 1 à 2h par jours, sans douleur pour l’animal. La troisième intervention est un suivi comportemental de l’animal, il ne comporte aucune privation hydrique ou alimentaire ni douleur. L’animal est ensuite mis à mort. Pour un troisième groupe d’animaux, l’enregistrement neuronal est fait durant l’anesthésie, celle-ci dure 8h à 9h mais l’animal est ensuite mis à mort. Ces animaux ne subissent donc qu’une intervention.

Impact sur les animaux

Les gerbilles seront exposées à des bruits pendant 2h à 8h par jour. Ces expositions peuvent potentiellement induire un stress chronique et possiblement des dommages de l’oreille. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit, au moins à l’échelle de quelques semaines, chez les rongeurs. Des chirurgies ponctuelles visant à enregistrer l’activité cérébrale, à poser des implants physiologiques (activité cardiaque) ou neuronaux seront effectuées. Les animaux récupèrent de ces chirurgies généralement en quelques jours. Les nuisances associées sont des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans les procédures expérimentales seront mis à mort à la fin de chaque ou plusieurs procédures car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Les animaux seront regroupés pour réduire le stress d’isolement social et des jouets d’enrichissement seront disposés dans la cage. Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. S’il apparaissait un état général de l’animal anormal (notamment suite aux chirurgies) en considérant tous les critères généraux de bonne santé d’un animal de laboratoire (poids - pesée tous les 1 à 2 jours la 1ère semaine de stimulation ou après chirurgie - stress, comportement, pelage), celui-ci sera mis à mort immédiatement. En particulier les points suivants entraineront une mise à mort immédiate : - Chirurgies ou implantation de puces : douleur au niveau des interventions (prurit sévère, saignement infection), absence de prise alimentaire et d’hydratation spontanée. - Stimulation sonore : prostration, douleur au niveau de la tête et des oreilles

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux gerbilles, modèle de laboratoire dont le système auditif et les performances auditives sont très similaires à l’homme. En particulier, les gerbilles, contrairement aux souris ou rats sont capables d’entendre et traiter des sons basse fréquence correspondant aux signaux de parole chez l’homme. D’autre part, sa relative petite taille (deux à trois fois le poids d’une souris) rend la plupart des équipements existants pour la souris compatibles avec la gerbille. C’est donc un modèle animal très bien adapté à l’étude de l’audition au niveau central. Enfin, l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble. Le projet impliquera principalement des animaux adultes prioritairement ET/OU âgés d’au moins P90 (90 jours d’âge) afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif. Dans le cas d’expérimentations visant à établir l’effet des expositions bruyantes sur le développement du cortex auditif, les gerbilles seront éventuellement exposées (via des enceintes acoustiques) en portée avec leur mère avant le sevrage.