Diagnostic des maladies
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
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- Maladies des plantes
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- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
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- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Précision de la reconnaissance du cancer colorectal avec un fluorophore ciblé pour améliorer la surveillance et réduire une chirurgie inutile.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de lignées de cancer colorectal humain, subissent une ou deux chirurgies sous anesthésie, des résections de tumeur et pour certaines cinq séances d'irradiation, avant d'être tuées pour prélèvement. Le projet évalue un dispositif d'imagerie par fluorescence censé guider le chirurgien, le porteur reconnaissant inflammation, perte de poids et douleur postopératoire. Il affirme que la validation du dispositif rend l'étape animale "indispensable" avant tout essai clinique.
Objectifs
Le cancer colorectal est l’un des cancers les plus fréquents et mortels chez les hommes et les femmes avec un taux de survie de 63 % à 5 ans malgré la mise en place d’un programme de dépistage. Des cancers colorectaux (CCR), 30 % sont localisées dans le rectum (CR). Le CR nécessite un diagnostic et un traitement spécifiques. La résection chirurgicale est le traitement de référence, mais elle induit une morbidité importante et une qualité de vie réduite. Les chirurgiens doivent se reposer sur leurs sens de la vision et du toucher afin de distinguer les tissus malades devant être retirés des tissus sains à préserver. Cette absence de guidage est critique ; une identification inadéquate des zones de résection peut être responsable du développement de métastases, d’une récidive locale et de la diminution de la survie. Pour répondre à cette problématique, l’imagerie est devenue un domaine de recherche majeur, notamment autour de l’imagerie de fluorescence. Cette technique non-irradiante est adaptée aux contraintes d’un bloc chirurgical. Elle nécessite l’usage d’un fluorophore sensible et spécifique au tissu malade ciblé. La stratégie « Watch and Wait » (observer et attendre) est une approche permettant de préserver les organes. Un suivi précis de ces patients est crucial pour identifier toute (re)croissance tumorale locale ou dans des organes avoisinants. C'est pourquoi de nouvelles technologies de surveillance ont été développées afin de permettre un suivi plus précis et plus objectif et de minimiser le risque de récidive et d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif l’évaluation d’un nouveau système d’imagerie avec un fluorophore cible comparé à différents systèmes d’imagerie et à d’autres fluorophores. Pour ce faire, un modèle murin de xénogreffe de cancers colorectaux permettant de reproduire les conditions du cancer colorectal humain sera utilisé. Ce nouveau dispositif d’imagerie, s’il est validé, pourrait être utilisé au cours d’une chirurgie CRC ou d’une coloscopie afin d’aider les chirurgiens dans leur prise de décision. Ce projet sera donc réalisé sur un effectif total de 850 animaux dans le respect de la règle des 3 R.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser les thérapies chirurgicales des cancers colorectaux en réduisant le nombre d'opérations inutiles après une réponse clinique complète et d'assurer un meilleur suivi des patients. En effet, le traitement à visée curative du cancer colorectal consiste en une chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d'une résection chirurgicale. Cette technique a permis de diminuer la récidive avec de meilleurs résultats à long terme. Toutefois, il est difficile pour les chirurgiens de distinguer les tissus cancéreux des tissus sains. Ainsi, de nouveaux outils d'imagerie diagnostique pourraient améliorer le contraste entre les tissus cancéreux et les tissus sains adjacents pendant la chirurgie. L'imagerie moléculaire ciblée sur la tumeur est une technologie émergente qui pourrait répondre au besoin d'évaluation nécessaire aux chirurgiens. Cette technique innovante peut permettre une visualisation peropératoire en temps réel de la tumeur en mettant en évidence de manière sélective les cellules cancéreuses. Ainsi, cette étude pourrait permettre la mise en place d’essais cliniques chez l’homme et fournir de meilleurs outils d'orientation aux chirurgiens traitant des patients atteints de cancers colorectaux.
Procédures
Les animaux des différentes procédures expérimentales seront soumis à : - Implantation d’une lignée cellulaire au niveau des deux flancs sous anesthésie générale gazeuse sur 72 animaux (PE1, partie 1) - Implantation de 3 lignées cellulaires sous anesthésie générale gazeuse sur 778 animaux (PE1, partie 2 et PE2-PE9) - 1 chirurgie sous anesthésie générale gazeuse pour exposer la tumeur sur 666 animaux pendant environ 1 heure (PE1, 2, 3, 4, 5, 7 et 8) - 2 chirurgies sous anesthésie générale gazeuse sur 184 animaux pendant 1 heure (PE6 et 9) - 1 résection de tumeur complète sous anesthésie générale gazeuse sur 697 animaux pendant 1 heure (PE2, 3, 4, 5, 6 résection totale, 7, 8 et 9) - 1 résection de tumeur incomplète sous anesthésie générale gazeuse sur 69 animaux pendant 1 heure (PE6 résection partielle) - imagerie (non invasive) sous anesthésie générale gazeuse sur 850 animaux pendant 5 minutes - 5 séances d’irradiation sous anesthésie générale gazeuse sur 46 animaux pendant 10 minutes une séance par jour pendant 5 jours - Euthanasie prélèvements d’organes terminaux sous anesthésie générale sur tous les animaux (850).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui pourraient être observés sur notre modèle de souris de cancers colorectaux sont : - Inflammation ou nécrose de la tumeur, - Perte de poids, - Douleur suite à la chirurgie. Une grille d’évaluation de la souffrance/points limites des souris établies tous les 2-3 jours permettra de détecter et suivre la totalité des effets secondaires et de les gérer en cas de besoin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever les tissus pour des études et validations post-mortem.
Remplacement
Après un début de développement du dispositif d’imagerie grâce à des approches « in silico » (numériques) et « in vitro » (substrats de synthèse, tissus, organes isolés), le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de cette nouvelle technologie. Il s’agit de démontrer l’efficacité du dispositif d’imagerie en temps réel au cours d’une chirurgie, en validant des paramètres spécifiques dans différentes procédures expérimentales réalisées sur un modèle de cancers colorectaux. L’objectif principal est de démontrer que le nouveau dispositif d’imagerie permet de distinguer les tissus sains des tissus cancéreux pour guider le chirurgien lors de son opération. Cette étape sur l’animal est indispensable afin de pouvoir envisager, par la suite, la mise en place d’essais cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre de mesures réalisées par animal a été optimisé (plusieurs systèmes d’imagerie seront utilisés sur un même animal) afin de réduire le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les études seront réalisées par étapes, avec des phases préalables de validation et d’optimisation des modèles sur de faibles effectifs avant de passer aux étapes suivantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec du matériel pour la nidification. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement quelques jours avant de démarrer les procédures expérimentales ; la mesure de leurs tumeurs et leur poids sera réalisée 3 fois par semaine. L’implantation des tumeurs, les chirurgies et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. L’usage d’analgésie avant les opérations permettra une meilleure gestion de la douleur. Une partie des animaux sera sacrifiée sans réveil après la chirurgie. Les animaux qui seront réveillés après chirurgie seront suivi quotidiennement afin de pouvoir détecter et gérer la douleur en cas de besoin. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chirurgiens. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. Il est ainsi possible d’obtenir un modèle standardisé optimal de tumeurs colorectales, modèles plus difficiles à réaliser chez d’autres espèces. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Nous utiliserons des souris nude. Ce modèle de souris permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs. Ces souris sont connues pour être de bons modèles pour le développement de tumeurs sous-cutanées. Les animaux seront livrés à partir de l'âge de 5 semaines. A cet âge, nous pourrons réaliser les analyses prévues sur les tumeurs. L’utilisation de souris nude, sans poils, fera en sorte que la couleur de la peau et les poils n'interfèrent pas avec les différentes technologies d'imagerie utilisées.
Evaluation in vivo par imagerie TEP d’un inhibiteur spécifique de DYRK1A : application à 2 modèles animaux sur-exprimant cette enzyme.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 15
25 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent l'injection d'un radiotraceur marqué au carbone 11 sous anesthésie, suivie d'une imagerie IRM et TEP, pour évaluer un marqueur de l'enzyme DYRK1A impliquée dans la maladie d'Alzheimer et la trisomie 21. Le porteur décrit une procédure peu douloureuse et prévoit une analgésie en cas de douleur, les animaux étant tués en fin d'étude pour des prélèvements. Il affirme que le devenir d'un radiotraceur dans un organisme vivant ne peut pas être étudié in vitro.
Objectifs
L’imagerie fonctionnelle TEP (Tomographie par Emission de Positons) est un outil clinique aujourd’hui indispensable pour le diagnostic de nombreuses pathologies. Le principe est d’injecter une molécule radioactive au patient afin de suivre sa distribution dans l’organisme grâce à la caméra. Le développement de nouveaux radiotraceurs est donc d’un intérêt majeur pour venir compléter la gamme d'outils diagnostiques dont disposent les médecins. La tyrosine kinase DYRK1A est connue pour être impliquée dans certaines maladies neurodégénératives, comme Alzheimer ou la trisomie 21. Le projet a pour but de développer un radiotraceur marqué au Carbone 11 (11C) à partir du composé prometteur EHT-1610, possédant une excellente affinité et sélectivité pour cette enzyme. Il n'existe pas de technique permettant d'étudier cette cible de façon spécifique et non invasive, bien que cela puisse être un outil pertinent afin de mieux comprendre son implication dans divers maladies. La synthèse du [11C]EHT-1610 est opérationnelle et le radiotraceur a été testé avec succès chez le rongeur sain. Ces travaux nécessitent maintenant d’être complétés par des études dans un cadre pathologique. Cette demande d'autorisation porte donc sur l'étude du comportement du radiotraceur chez 2 modèles murins transgéniques, un de rat et un de souris, présentant une surexpression de DYRK1A. La première étape consiste à étudier la distribution du composé chez le rat pathologique, afin de comparer ces résultats aux données dont nous disposons déjà pour le rat sain. Dans un second temps, nous sommes actuellement en train d’étudier la spécificité de la fixation du radiotraceur à DYRK1A chez le rat sain, par mise en compétition avec d’autres molécules connues ayant une affinité pour la cible, et nous souhaitons reproduire ces travaux chez les rats pathologiques. Il sera ainsi possible de comparer les niveaux de captation dans les différents organes entre les animaux sains et pathologiques, avec ou sans administration de compétiteur. Enfin, le comportement d’un radiotraceur pouvant être différent d’une espèce à l’autre, nous souhaitons étudier la distribution du radiotraceur chez la souris sur-exprimant la cible dans les mêmes conditions expérimentales. Nous disposerons alors d’un panel complet de tests permettant de valider l’intérêt de notre méthode d’imagerie.
Bénéfices attendus
La validation du [11C]EHT-1610 comme marqueur pour l’imagerie TEP permettra de mieux comprendre l’implication de DYRK1A dans les processus physiologiques et pathologiques et d’aider au traitement des maladies du système nerveux central.
Procédures
Injection d'un radiotraceur sous anesthésie générale suivi d'une imagerie IRM/TEP. Les rats sont imagés 2 à 3 fois (partie haute et basse du corps séparément puis, si les résultats sont concluants, une troisième fois en présence d’un compétiteur) et les souris 1 fois (et seulement si les résultats chez le rat sont concluants). Pour chaque session d'imagerie, l'animal est anesthésié environs 1h, incluant environs 10 min d'imagerie IRM et 30 min d'imagerie TEP auquel s'ajoute le temps de préparation de l'animal (mise en place de l'abord veineux et positionnement dans le berceau d'imagerie).
Impact sur les animaux
En théorie, faible. Les animaux sont manipulés sous anesthésie générale. Les seules nuisances attendues sont donc le stress à l’induction de l’anesthésie et au réveil et une éventuelle douleur au point d’injection (jamais observée jusqu’à aujourd’hui dans nos expériences ultérieures). Concernant l’étude de compétition, la littérature scientifique et nos résultats préliminaires avec l’EHT-1610 ne montrent pas de toxicité aigüe dans nos conditions expérimentales et les animaux seront mis à mort sans réveil afin de réaliser des prélèvements d’échantillons post-mortem.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de projet pour prélèvement d'échantillons biologiques post-mortem.
Remplacement
Pour comprendre le devenir d’un radiopharmaceutique dans un organisme vivant, les essais in vitro sont pour l’instant insuffisants (grande complexité des processus physiologiques) et l’évaluation ne peut se faire que sur l’animal vivant. L’EHT-1610 a cependant déjà fait l’objet de nombreuses études in vitro permettant d’attester de son excellente affinité en tant qu’antagoniste (IC50 = 0.36 nM et validation de la méthode de blocage de la fixation de l’ATP à l’enzyme par cristallographie) et sélectivité pour DYRK1A (en comparaison de 339 autres kinases), ce qui en fait déjà un candidat médicament prometteur.
Réduction
Avant de débuter cette étude sur des modèles pathologiques, des travaux préliminaires ont été réalisés chez le rongeur sain afin de vérifier la faisabilité technique de l'utilisation de la molécule radio-marquée en imagerie TEP. Les imageurs TEP précliniques, mis en service à partir des années 2000, permettent de valider un nouveau radiotraceur avec un nombre limité d’animaux, en réduisant fortement le besoin de recourir aux méthodes ex vivo. Le protocole étant peu invasif, un même animal pourra être réutilisé pour plusieurs sessions d'imagerie, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaire. Les études de compétition ne seront réalisées que si les résultats en amont sont concluants. La littérature scientifique et nos résultats préliminaires avec l’EHT-1610 ne montrent pas de toxicité aigüe dans nos conditions expérimentales. Les animaux seront commandés par petit groupe et le projet prendra fin lorsque nous disposerons de suffisamment de données, limitant ainsi le nombre total d’animaux.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés en animalerie conventionnelle respectant leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les caméras μTEP/μIRM ainsi que l'ensemble de l'environnement technique sont adaptés aux rongeurs, permettant ainsi d'étudier in vivo le devenir d'une molécule tout en respectant leurs besoins physiologiques. Afin de limiter leurs mouvements durant l'imagerie et de maintenir des conditions physiologiques correctes, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane dans un mélange O2/N2O) avec un monitoring de température et un suivi de la fréquence respiratoire. Les administrations se font sans recours à la chirurgie. Un radiotraceur devant, par définition, être formulé en solution injectable et administré à dose « traceuse », c'est à dire sans effets biologiques ou radiologiques, aucune douleur n'est attendue suite à son administration. Si, malgré ces précautions, une douleur est constaté, des antidouleurs seront administrés. Pour cela, nous surveillerons le comportement de l'animal durant les 24 heures suivants l’imagerie afin de contrôler l'absence de signes visibles de douleur (prostration, perte de poids, état anormal du poil ou des yeux, ...) ou de problème au niveau du point d'injection (démangeaisons, état anormal de la peau, ...). Pour le rat, il est prévu un traitement à la buprénorphine adapté, sur la base de 0,05 mg/kg sc 2 à 3x/jour, pendant 2 jours. La non-résolution de cette douleur est considérée comme un point limite et entrainera une mise à mort de l'animal. Les souris n’étant imagé qu’une seule fois, l’apparition d’une douleur entrainera une mise à mort anticipé comme prévu en fin de protocole. Lors de nos essais préliminaires, l’EHT-1610 était bien toléré lors de son utilisation comme compétiteur.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les 2 espèces de référence pour ce type d'étude et nous disposons de matériel et de protocoles expérimentaux bien adaptés aux rongeurs. La souris présente l'avantage de pouvoir être imagée en intégralité dans notre caméra TEP, ce qui est particulièrement intéressant pour étudier globalement la distribution d'un nouveau radiotraceur. La taille plus importante du rat permet d'imager des parties du corps plus petites, comme les structures cérébrales. Des différences de comportement du radiotraceur entre espèce sont aussi parfois observées, même entre rongeurs. Le suivi de l'évolution du modèle animal durant la vie des individus ne présente pas d'intérêt pour notre étude. En effet, le niveau d’expression de la cible reste stable au cours du temps. Nous nous focaliserons donc sur de jeunes adultes de façon à avoir des animaux en bonne santé (et limiter les risques d'incidents durant l’expérimentation) et d’un poids raisonnable (compatible avec le volume restreint du berceau de l’imageur).
Angiographie par résonance magnétique avec injection de produits de contraste chez le porc
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
6 porcs sains d'environ 40 kg vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Mis à jeun 24 heures, anesthésiés et intubés, ils reçoivent à 48 heures d'intervalle deux produits de contraste par la veine de l'oreille, lors de deux séances d'IRM d'environ deux heures. L'essai compare un produit utilisé en routine à un nouveau candidat, dont l'équipe veut confirmer l'efficacité à demi-dose avant son emploi en clinique humaine. Le porteur prête à ces produits destinés à l'humain "un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide", puis justifie la mise à mort des porcs ainsi : "aucun replacement ni adoption n'est possible après des injections d'agents de contraste".
Objectifs
L’angiographie par résonance magnétique (MRA) avec injection d’un agent de contraste est une technique qui permet de détecter des lésions vasculaires chez des patients atteints de pathologies artérielles, en utilisant l’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM). L’objectif de ce projet est de comparer 2 produits de contraste, un utilisé en routine et un nouveau candidat, potentiellement plus efficace à demi dose. Il s’agit ici de confirmer l’efficience de cette demi dose, afin de garantir son innocuité et sa sécurité d’emploi en clinique humaine, ainsi que son efficacité sur des lésions vasculaires. Dans cette étude le recours à l’animal (porc sain) a été choisi car l’imagerie peut s’effectuer avec des protocoles d’angiographie transposables directement à l’Homme.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité d’un nouvel agent de contraste lors d’une angiographie par résonance magnétique et de déterminer ses performances et ses limites dans cette application médicale. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients, en effet le praticien hospitalier pourra déterminer la meilleure posologie à attribuer aux patients tout en préservant les mêmes performances que les agents de contraste actuellement sur le marché.
Procédures
Les animaux subiront 2 injections par la veine auriculaire, sous anesthésie générale, à 48 heures d'intervalle. La procédure totale dure environ 2h, répétée 2 fois.
Impact sur les animaux
Les complications d’une anesthésie sont rares. En cas d’irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation), un anti inflammatoire non stéroïdien sera administré. Des complications infectieuses pourraient également survenir : un antibiotique serait alors administré. L’injection des produits de contraste à la veine auriculaire ainsi que les médicaments par voie intraveineuse peuvent entrainer un hématome. Les produits qui seront injectés aux sujets sont des agents de contraste destinés à l’usage chez l’homme. Ils ont globalement un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide. Concernant les effets potentiels chez l’animal, ils sont considérés comme très faibles. Par conséquent, il n’est pas attendu de toxicité particulière dans cette étude chez le porc.
Devenir
Une fois la procédure d’imagerie effectuée, les animaux seront euthanasiés. En effet aucun replacement ni adoption n’est possible après des injections d’agents de contraste, et le retour à l'élevage d'origine est impossible pour des raisons sanitaires.
Remplacement
Pour s'assurer de l'efficacité réelle des agents de contraste, des tests in vivo sont indispensables. En effet, le recours aux animaux permet d’avoir des modèles ayant de fortes homologies avec l’Homme, soulignant ainsi le transfert possible des résultats vers l'Homme. Cela permet également de prendre en considération le comportement des agents de contraste au sein des différents organes. Le projet sera conduit sur des porcs ayant un poids d’environ 40 kg. Le modèle porcin est déjà validé pour les études cardiovasculaires. Le choix de cette espèce nous permettra de comparer nos résultats aux données de la littérature et d’avoir des résultats proches de ceux attendus chez l’Homme. Nous avons décidé d’utiliser des porcs sains de 40 kg car ils présentent des homologies avec l’Homme, notamment un rapport poids du cœur sur poids du corps équivalent. En effet, la majorité des études sur le système cardiovasculaire sont effectués chez des porcs compris dans cette fourchette de poids. De plus, l’étude en imagerie in vivo s’effectuera avec des protocoles d’angiographie par résonance magnétique directement transposables chez l’Homme.
Réduction
Un groupe de 6 animaux a été prévu. Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé selon l’expertise du laboratoire d’accueil et de notre laboratoire. En effet, un groupe de 6 animaux est suffisant pour mettre en avant des différences significatives lors de l’évaluation d’un agent de contraste. Afin de limiter le nombre d’animaux, tous les animaux recevront deux injections de produits de contraste différents par voie intraveineuse. Ce protocole expérimental permettra de faire des comparaisons intra-individuelles. L’injection des deux agents de contraste (une référence et le nouvel agent) sera espacée dans le temps de 48H. Le volume d’injection de chaque composé sera ajusté pour être identique afin de ne pas apporter un biais à l’étude. Une telle étude permet de standardiser un protocole pour comparer dans les meilleures conditions possibles différents agents de contraste au sein des mêmes individus. En effet, ce projet évaluera l’efficacité de différents produits de contraste injectés chez le même animal.
Raffinement
La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie et de l’euthanasie chez des modèles porcins. Nous avons fait le choix de passer par la veine auriculaire, et non la veine jugulaire, pour l’injection des produits de contraste afin de limiter au maximum la douleur pouvant être infligée à l’animal. En outre, les deux examens en imagerie réalisés sur chaque animal seront espacés de 48H pour éviter des anesthésies trop rapprochées. Les séquences en angiographie par résonance magnétique dès l’injection du produit de contraste sont très courtes (20-30 sec), ce qui permet de répéter les mesures tout en limitant la durée totale de l’anesthésie. Des mesures seront prises dès la prise en charge de l’animal jusqu’à la réalisation de la procédure en imagerie in vivo : Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 24h avant l’intervention, avec abreuvement à volonté. - Anesthésie (induction par voie intraveineuse), puis intubation, ventilation et maintien de l'anesthésie par voie gazeuse - Per-imagerie - Anesthésie par voie gazeuse. Post imagerie - Les animaux sont logés en cases par groupes de 3 animaux et l’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide d’une quantité de paille suffisante pour qu’ils puissent jouer avec. Ils seront surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Nous avons décidé d’utiliser des porcs sains d’environ 40 à 50 kg car ils présentent des homologies avec l’Homme, notamment un rapport poids du cœur sur poids du corps équivalent. En effet, la majorité des études sur le système cardiovasculaire sont effectués chez des porcs compris dans cette fourchette de poids. Dans notre étude nous allons nous intéresser à l’arbre artériel, notamment l’aorte, ce qui rend ce modèle d’étude pertinent. De plus, l’étude chez le porc peut être effectuée avec des protocoles IRM directement utilisables chez l’Homme. Des porcs compris entre 40-50 kg seront utilisés dans l’étude. A ce stade de développement, le porc présente plus de caractéristiques communes avec l’Homme que le porc adulte pesant entre 80-100 kg.
Caractérisation du pouvoir pathogène et infectieux des coronavirus aviaires et étude de la barrière d’espèces sur les oiseaux d’élevage
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Dindes : 640
Autres oiseaux : 1280
2 560 oiseaux, 640 poulets, 640 dindes et 1 280 autres oiseaux, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont inoculés avec des coronavirus aviaires puis soumis à des écouvillonnages oraux, cloacaux et trachéaux répétés, à des prises de sang et à la récolte de liquide lacrymal jusqu'en fin d'expérimentation. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhées, prostration et amaigrissement, et précise que le recours aux antidouleurs "n'est pas envisageable" car il interférerait avec l'infection virale. Il présente ces données comme "indispensables" à une meilleure gestion sanitaire des élevages.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est de mieux caractériser les différents coronavirus aviaires circulants au sein des espèces principales de volailles d'élevage. Plus précisément, il s'agira d'étudier i) le pouvoir pathogène et infectieux de souches isolées de coronavirus aviaires (virus de la bronchite infectieuse, coronavirus de la dinde, coronavirus de la pintade, coronavirus du canard) sur l’espèce à partir de laquelle le prélèvement d’origine a été obtenu, et ii) la capacité de franchissement de la barrière d’espèces de ces coronavirus aviaires sur diverses espèces d’oiseaux d’élevage.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une caractérisation fine in vivo pour une meilleure compréhension du comportement des souches de coronavirus aviaires inoculées chez l’hôte cible et chez des hôtes voisins afin d’étudier la capacité de ces souches à infecter d’autres espèces aviaires et de pouvoir apporter des éléments indispensables à une meilleure gestion des mesures sanitaires et à un meilleur contrôle de la diffusion de ces agents dans les élevages.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Contention : sur tous les animaux, dès qu’une observation rapprochée des signes cliniques ou dès qu’un prélèvement s’avèrent nécessaires (environ 5 min par animal, dépendra du nombre de prélèvements à réaliser au moment de la contention) - Inoculation : sur tous les animaux, a lieu une seule fois en début d’expérimentation (1 min par animal) - Ecouvillonnages oraux et de l'orifice des voies génitales et urinaires : sur tous les animaux, quotidiens jusque 14 jours post-inoculation puis bi-hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (2 min par animal) - Ecouvillonnages trachéaux : sur tous les animaux, fréquence bihebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (1 min par animal) - Récolte du liquide lacrymal : sur tous les animaux, fréquence bi-hebdomadaire jusque 14 jours post-inoculation puis hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (2 min par animal) - Prises de sang : sur tous les animaux, fréquence bi-hebdomadaire jusque 14 jours post-inoculation puis hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (1 min par animal) - Mise à mort pour récolte d’organes : sur 3 sujets avec une fréquence hebdomadaire sur 5 semaines flexibles durant l’expérimentation, et sur les animaux restants en fin d’expérimentation
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus varient selon les virus inoculés. Cela peut être des râles et des éternuements pour le virus de la bronchite infectieuse, et des diarrhées, de la prostration, une diminution de la motilité et/ou un amaigrissement pour le coronavirus de la dinde, le coronavirus de la pintade et le coronavirus du canard. Outres les signes cliniques attendus suite à l'inoculation du virus, d'autres nuisances pour l'animal sont attendues : irritation passagère des tissus oro-pharyngés, trachéaux, cloacaux et oculaires suite aux écouvillonnages et à la collecte du liquide lacrymal, stress passager lors de la contention, léger hématome suite aux prises de sang, potentielles blessures contre les grillages des parcs d'hébergement.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux restants seront concernés par la mise à mort pour empêcher toute possibilité de répandre dans l'environnement les agents infectieux utilisés dans ces conditions expérimentales.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale n’a lieu que lorsque cela s’avère strictement nécessaire. Même si certains types cellulaires ou des systèmes in ovo existent pour la réplication des coronavirus aviaires, ces modèles ne sont pas applicables concernant la connaissance des maladies provoquées par ces virus chez l’animal et l’étude du tropisme d’hôte.
Réduction
La stratégie pour réduire au minimum le nombre d’animaux est basée sur deux éléments indissociables : l'expérience et les statistiques. Concernant l'expérience, le laboratoire peut s'appuyer sur son expertise dans le domaine en se basant sur de précédentes études utilisant le même type de données générées afin de travailler sur un effectif minimum d'animaux. Pour ce projet, compter par exemple sur 10 animaux en fin d’expérimentation devrait permettre d’avoir suffisamment de relevés du poids vif des animaux et de relevés du poids des organes récoltés post-mortem pour rendre les analyses robustes. Ces analyses se basent sur des tests statistiques où les analyses de variances (qui permettent de déterminer si tel ou tel paramètre étudié est statistiquement différent d'une condition expérimentale à une autre) qui seront réalisées nécessitent un effectif minimal pour permettre l'obtention de résultats fiables.
Raffinement
Le recours aux antidouleurs n’étant pas envisageable à cause de l’interférence générée avec l’infection virale, la stratégie appliquée pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse en cours d’expérimentation est la surveillance quotidienne des animaux, la définition de points limites conduisant à une mise à mort compassionnelle en cas d’atteinte, et la réalisation de prélèvements les moins invasifs possible et uniquement lorsque cela permet de répondre aux objectifs du projet. Pour limiter le stress des animaux, toutes les procédures sont faites individuellement sans que le reste des animaux puisse voir l’intervention.
Choix des espèces
Les espèces d’oiseau choisies sont soit l’espèce cible de l’agent viral étudié, soit une autre espèce qui pourrait être sensible à cet agent. Animaux de 1 jour à 30 semaines d’âge, selon la classe d’âge cible de l’agent viral utilisé.
Génération d’hybridomes pour des applications de recherche, de détection et de diagnostic.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes et des prélèvements sanguins, et une partie subit l'injection de cellules d'hybridome déclenchant la formation d'un liquide abdominal, pour produire des anticorps monoclonaux destinés à des tests de diagnostic. Le porteur indique que l'accumulation de ce liquide provoque une douleur abdominale durant cinq à six jours. Il affirme que l'immunisation des souris reste "indispensable" à court terme, les méthodes in vitro ne produisant pas de réponses immunitaires suffisantes.
Objectifs
Le projet vise à la génération et à la production d’anticorps monoclonaux de souris dirigés contre différentes cibles antigéniques dans le cadre de multiples programmes de recherche. Ces anticorps reconnaissent très spécifiquement des antigènes, marqueurs d’agents étrangers à un organisme. La finalité de la majorité des anticorps générés dans ce projet est le développement de tests de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines reliés à des problématiques de maladies infectieuses émergentes ou ré émergentes (ex : Ebola, ZIKA, SARS-CoV2, Variole du singe, etc…) et d’intérêt dans le domaine de la maitrise et la détection des risques biologiques. Les tests développés sont pour l’essentiel des tests rapides antigéniques » (ex : test antigénique COVID19) qui utilisent les anticorps monoclonaux pour permettre la détection spécifique des agents pathogènes (ex : bactéries, virus ou toxines. Les anticorps monoclonaux sont utilisés depuis plusieurs décennies dans ce type d’application, néanmoins de nouveaux tests rapides de diagnostic et de détection doivent régulièrement être mis au point pour suivre les émergences des maladies infectieuses, de différentes pathologies, pour la bio sécurité et la bio sureté. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont la génération de nouveaux anticorps monoclonaux, permettant la mise au point de tests de diagnostic ou de détection de maladies infectieuses émergentes ou ré-émergentes. Dans les exemples récents nous pouvons notamment citer les tests rapides antigéniques rapides et autotests pour la COVID19. L’obtention d’anticorps monoclonaux permet également de développer des tests de diagnostic de différentes pathologies et aussi pour la détection environnementale d’agents biologiques (bactéries, virus et toxines) dans le cadre de la lutte contre les menaces biologiques. Ce projet participe à la lutte contre ces menaces au sens large et permet de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des Autorités de santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes avec une seringue pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois. Les animaux seront soumis à 3 ou 4 prises de sang (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois. Certains animaux seront soumis à une injection d’une substance immunostimulante et de cellules hybridomes (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) déclenchant la formation d’un liquide abdominal dont le prélèvement est réalisé après euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Douleur au point d’injection induite par l’injection de substances non pathogènes destinées à immuniser les animaux contre un antigène. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. Douleur abdominale induite par l’injection d’une substance immunostimulante. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. Douleur induite par l’accumulation d’un liquide abdominal. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de 5 à 6 jours.
Devenir
Tous les animaux inclus dans une procédure sont euthanasiés en accord avec les protocoles scientifiques publiés pour la génération et la production d’hybridomes et d’anticorps monoclonaux de souris.
Remplacement
Le développement d’hybridomes à des fins diagnostiques ou de détection nécessite l’immunisation d’animaux afin d’obtenir les lymphocytes immuno-stimulés par l’antigène. Le niveau d’immunisation recherché correspond à un état d’hyper immunisation. Les méthodes d’immunisation in vitro avec des lymphocytes naïfs ne permettent pas aujourd’hui d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes. Les autres technologies basées sur l’utilisation, notamment, de phages ne permettent pas la génération de réactifs de qualité suffisante pour permettre la mise au point de tests diagnostiques répondant aux spécifications attendues par les autorités de santé. Dans une vision moyen terme, le laboratoire souhaite débuter des études visant à mettre au point des organoïdes en culture permettant la maturation de lymphocytes, avec l’objectif dans plusieurs années, de pouvoir obtenir des réponses immunitaires in vitro de haute affinité. Dans l’immédiat l’immunisation des souris reste indispensable. Le criblage et la caractérisation des anticorps produits par l'ensemble des hybridomes générés ne peut se faire en parallèle qu'avec une méthode de production identique pour chaque anticorps. Il est impossible dans le cadre de ce criblage d'optimiser les conditions de culture cellualire et l’adaptation à un milieu de culture spécifique pour permettre une production in vitro de ces hybridomes. Nous avons besoin à ce niveau d’une garantie de résultats. En dehors de ces circonstances, des méthodes de production in vitro en bioréacteur sont réalisées pour les productions massiques d’anticorps.
Réduction
Les études statistiques ne sont pas adaptables à ce type de projet. Les résultats sont évalués par rapport au nombre d’hybridomes attendus et au nombre d’anticorps estimés à produire. Cette estimation tient compte de notre expérience passée dans ce type de projet et du constat que dans le projet précédent, nous avons utilisé moins de 30% de ce que nous avions estimé à priori. Quoi qu’il en soit, tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, notamment pour le degré sévère.
Raffinement
Les prise de sang seront réalisées après anesthésie des animaux. Les animaux seront hébergés à 4 par cage avec cycle diurne-nocturne de 12 heures. L’eau et la nourriture seront fournies à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel sous la supervision permanente du responsable du bien-être animal. L’hébergement animal est organisé en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Si un des points limites établis est proche d’être atteint, l’animal pourra être euthanasié afin de lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont un choix obligatoire car les cellules de myélome (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules) employées pour fusionner les lymphocytes sont des cellules de souris. Différentes souches de souris pourront être utilisées en fonction des antigènes injectés car elles peuvent avoir un répertoire immunologique différent qui peut modifier le niveau de réponse immunitaire. Ces choix seront faits selon les données bibliographiques et l’expérience passée du laboratoire. Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires. Jeunes adultes (6 à 8 semaines). Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées d'un gène, elles développent une myopathie avec une espérance de vie d'environ trois semaines et des organes anormaux, et subissent jusqu'à 28 tests de force, d'endurance et de locomotion avant une mesure musculaire sous anesthésie suivie de la mise à mort. Les animaux ayant servi à l'élevage de la lignée sont eux aussi tués une fois l'effectif atteint. Le porteur cherche à valider le rôle de ce gène dans une myopathie humaine et affirme qu'une étude sur cellules ne suffirait pas à évaluer l'atteinte de l'organisme entier.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité, de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs pour la réparation et le remplacement articulaire, ligamentaire et musculo-tendineux
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cochons : 25
Chèvres : 50
Moutons : 50
140 chiens, cochons, chèvres et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité va de légère à sévère, 37 étant opérés puis tués sans réveil. Ils subissent des implantations chirurgicales, des prélèvements et des séances d'imagerie répétées pour tester des dispositifs de réparation des articulations, ligaments et tendons destinés au marché. Le porteur présente le suivi comme calqué sur le "cheminement d'un futur patient" et une obligation réglementaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et qualifie l'expérimentation sur "l'organisme entier" d'"indispensable" et d'"incontournable".
Objectifs
L’évaluation et le développement des nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement chirurgical des affections articulaires tendineuses et ligamentaires, par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessite une phase de recherche et développement qui permet de mettre au point le dispositif et/ou la technique développées. En effet, les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Le raffinement des prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) est la phase initiale du projet, elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
L’avantage escompté est une amélioration des capacités diagnostiques ou par exemple de la durabilité des implants, en permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci (et ainsi en éviter les réopérations parfois multiples des patients), réduire le traumatisme tissulaire, permettre une récupération plus rapide. Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences médicales / techniques mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, et plateau technique de bloc opératoire et d’imagerie de pointe). La chronologie classique d’implantation et de suivi clinique et d’examens complémentaires permettra d’assurer un cadre d’évaluation scientifique pertinent mais aussi un suivi rapproché et poussé de l’évaluation de l’état de santé générale et du bien-être des animaux implantés impliqués dans ces procédures.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Des prélèvements sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine. -Des procédures d’imagerie telles décrites dans la procédure n°1. La fréquence des examens d’imagerie post-implantation (de contrôle) pouvant être couramment d’un examen par semaine. -Une procédure d’implantation chirurgicale telle que décrite dans la procédure n°2, pour une partie des animaux du projet -Une procédure d’évaluation finale avec euthanasie et autopsie telle que décrite dans la procédure n°3, pour l'autre partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont en tous points similaires à ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun de l’animal préalablement à l’anesthésie, la préparation de l'animal à l’anesthésie (quelques minutes), - le réveil de l’anesthésie avec états de confusion possibles (quelques minutes) -les suites post-opératoires (inflammation, douleur : quelques minutes à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), des mesures de raffinement sont mises en place pour minimiser ces effets (voir plus haut).
Devenir
A l'issue de la procédure d'imagerie non invasive, tous les animaux sont maintenus en vie. Cette procédure consistant en une étape de sélection (screening) ou de contrôle (suivi fonctionnel) des animaux utilisés dans le projet. Pour les autres procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit une évaluation complète des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients represente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasive sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Cette étape de screening permise par l'imagerie, permet de selectionner les animaux présentant l'anatomie la plus adaptée et de ce fait de réduire le risque de procédures infructueuses ou dont les résultats seraient scientifiquement contestables.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). Durant les interventions sous anesthésie, les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe ou individuellement pour les besoins de l'étude et ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire, physique). La plateforme d'imagerie permettant les screenings et les contrôles fonctionnels est située sur le site d'hebergement afin de supprimer le stress induit par des transports.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité, de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs pour la réparation et le remplacement osseux et dentaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cochons : 25
Moutons : 50
90 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité va de légère à sévère, 24 étant opérés puis tués sans réveil. Ils subissent des implantations chirurgicales, des prélèvements et des séances d'imagerie répétées pour tester des dispositifs de réparation osseuse et dentaire destinés au marché. Le porteur présente le suivi comme calqué sur le "cheminement d'un futur patient" et une obligation réglementaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et qualifie l'expérimentation sur "l'organisme entier" d'"indispensable" et d'"incontournable".
Objectifs
L’évaluation et le développement des nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement chirurgical des affections osseuses et dentaires, par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessite une phase de recherche et développement qui permet de mettre au point le dispositif et/ou la technique développées. En effet, les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Le raffinement des prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) est la phase initiale du projet, elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
L’avantage escompté est une amélioration des capacités diagnostiques ou par exemple de la durabilité des implants, en permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci (et ainsi en éviter les réopérations parfois multiples des patients), réduire le traumatisme tissulaire, permettre une récupération plus rapide. Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences médicales / techniques mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, et plateau technique de bloc opératoire et d’imagerie de pointe). La chronologie classique d’implantation et de suivi clinique et d’examens complémentaires permettra d’assurer un cadre d’évaluation scientifique pertinent mais aussi un suivi rapproché et poussé de l’évaluation de l’état de santé générale et du bien-être des animaux implantés impliqués dans ces procédures.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Des prélèvements sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine. -Des procédures d’imagerie telles décrites dans la procédure n°1. La fréquence des examens d’imagerie post-implantation (de contrôle) pouvant être couramment d’un examen par semaine. -Une procédure d’implantation chirurgicale telle que décrite dans la procédure n°2, pour une partie des animaux du projet -Une procédure d’évaluation finale avec euthanasie et autopsie telle que décrite dans la procédure n°3, pour l'autre partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont en tous points similaires à ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun de l’animal préalablement à l’anesthésie, la préparation de l'animal à l’anesthésie (quelques minutes), - le réveil de l’anesthésie avec états de confusion possibles (quelques minutes) - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : quelques minutes à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), des mesures de raffinement sont mises en place pour minimiser ces effets (voir plus haut).
Devenir
A l'issue de la procédure d'imagerie non invasive, tous les animaux sont maintenus en vie. Cette procédure consistant en une étape de sélection (screening) ou de contrôle (suivi fonctionnel) des animaux utilisés dans le projet. Pour les autres procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit une évaluation complète des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients represente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. Il n'existe aucune méthode alternative pour répondre à la question scientifique du projet, l’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux chirurgicalement implantables.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasive sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Cette étape de screening permise par l'imagerie, permet de selectionner les animaux présentant l'anatomie la plus adaptée et de ce fait de réduire le risque de procédures infructueuses ou dont les résultats seraient scientifiquement contestables.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale, tous les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’analgésiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Les animaux sont hébergés dans des conditions d'ambiance maîtrisées et contrôlées et systématiquement en groupe ou individuellement pour les besoins de l'étude. Ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique). La plateforme d'imagerie permettant les screenings et les contrôles fonctionnels est située sur le site d'hebergement afin de supprimer le stress induit par des transports. Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique implique d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Rôle de la cavéoline-1 dans la perméabilité vasculaire lié à l’exotoxine EDIN-B de S. aureus durant la bactériémie
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, une injection de Staphylococcus aureus ou de sa toxine, avec des prélèvements de sang, pour tester si l'absence de cavéoline-1 aggrave l'infection. Le porteur indique que les souris peuvent montrer prostration, apathie, hérissement des poils, perte de plus de 20 % du poids et forte variation de température, et que les effets sont irréversibles. Il affirme que la perméabilité vasculaire au cours de l'infection ne peut être évaluée qu'en système intégré chez l'animal.
Objectifs
Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie fréquemment retrouvée dans le nez, le tractus respiratoire et la peau. Dans certaines conditions, S. aureus peut causer un grand nombre de maladies, allant des infections mineures comme des infections superficielles de la peau et des tissus mous jusqu’à des infections mortelles telles que le syndrome de choc toxique, la pneumonie, la septicémie et l'endocardite infectieuse. C'est toujours actuellement l'une des cinq causes les plus fréquentes d'infections acquises dans les hôpitaux et souvent la cause d'infections postopératoires. Chaque année, environ 750 000 patients dans les hôpitaux de France contractent une infection staphylococcique, soit environ 4 000 décès. Par conséquent, il est crucial de définir les facteurs de risque qui contribuent à l'invasion de l'hôte par S. aureus. Les toxines de S. aureus induisent la formation de pores à travers les cellules qui favorisent la perméabilité des vaisseaux sanguins et la dissémination de la bactérie dans les organes. La protéine cavéoline-1 est un régulateur critique qui limite la formation et l’élargissement de ces pores. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine un doublement du nombre de pores et leur élargissement d’un facteur 3. Ces résultats étant basés sur des études in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à l'infection par S. aureus.
Bénéfices attendus
Les travaux préalables ont permis de montrer un lien causal entre la formation des pores induits par S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires (œdème, hémorragie et aggravation de l’infection). Ce projet doit permettre d’apporter un bénéfice à la compréhension de la formation des pores vasculaires et leur importance dans la régulation de la perméabilité vasculaire . Ceci aura en outre des retombées probables dans la compréhension de certaines formes de maladies vasculaires conduisant à des hémorragies spontanées sans diminution du nombre de plaquettes.
Procédures
L'injection des bactéries aura lieu une seule fois sur animaux anesthésiés (durée d'anesthésie 10 min). Des prélèvements sanguins à la queue seront effectués également après anesthésie et la souris maintenue endormie jusqu'à l'arrêt des saignements (anesthésie totale 15 min). Les expériences d'injection de colorant non toxique pour vérifier l'intégrité des vaisseaux seront effectuées sur animaux sous anesthésie, maintenue pendant 20 minutes, jusqu'au prélèvement de sang en aorte qui entraine l'arrêt cardiaque et respiratoire.
Impact sur les animaux
L’ensemble des résultats obtenus in vitro sur cellules concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des pores cellulaires lors de l’intoxication par la toxine EDIN. On peut anticiper que si les effets in vitro sont reproduits chez l'animal, l'absence de cavéoline-1 devrait aggraver les symptomes lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B. Les animaux pourraient ainsi montrer des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection à travers l'augmentation de perméabilité vasculaire, manifestés par un phénotype caractéristique de prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils ou/et perte de poids de plus de 20%. La multiplication des bactéries pourrait entrainer une modification importante de la température corporelle, soit une fièvre, soit une hypothermie en cas de choc septique. Par ailleurs, concernant les nuisances liées aux actes expérimentaux, les animaux vigiles seront soumis à des actes de contentions afin d'injecter un mélange anesthésiant. Toutes les autres manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les prélèvements non terminaux à l'extrêmité de la queue seront effectués par section < à 0.5 mm et les souris réveillées une fois l'hémostase réalisée afin de minimiser les nuisances au réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue du projet car les effets des bactéries et de la toxine sont irréversibles après l’injection et les animaux ne peuvent être ré-utilisés sous peine de créer des biais.
Remplacement
La cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de pores transendothéliaux induits par l’EDIN-B, une toxine produite lors d'une infection par Staphylocoque. La formation de ces pores corrèle avec l’apparition de complications vasculaires. L’évaluation de la pathogénicité vasculaire de l’exotoxine EDIN-B en terme de perméabilité vasculaire au niveau des différents organes ne peut se faire que par une étude chez l’animal en système intégré.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux nous partirons de nos données antérieures sur l’infection bactérienne induite par Staphylococcus aureus. Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives, la première étape étant la comparaison des sensibilités des souris contrôles ou présentant une absence de cavéoline-1 aux souches bactériennes exprimant ou non la toxine. Si une différence est présente, l'étape-2 servira à confirmer le rôle de la toxine Edin avec des souches mutantes contrôles. Enfin, la perméabilité vasculaire sera examinée après injection i.v. de la toxine EDIN purifiée. Les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Sachant que toutes les souris ne développent pas de bactériémie, pour un risque 5% et une puissance de 80%, nous avons calculé des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.
Raffinement
Les points-limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance, et une surveillance quotidienne des animaux nous permettra de détecter au plus tôt ces points limites. Les souris sont maintenues dans leur groupe, qui aura été mis en place une semaine avant le démarrage des expériences. La cage est enrichie en jouets, et en frisure et coton à déchiqueter pour favoriser la nidation et maintenir la température en cas de refroidissement des animaux. De la nourriture sera systématiquement placée dans le fond de la cage avant le début de l'expérience, et aux premiers signes d'apatie on rajoutera de la nourriture gélifiée, plus apétante et hydratée.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphylococcus aureus. C'est une espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, qui développe des symptomes similaires à ce que l'on observe chez l'homme. De plus dans le cas de cette étude, il s'agit de déterminer le rôle de la cavéoline-1 dans le développement de l'infection, et l'utilisation des souris transgéniques invalidées pour la cavéoline-1, mâles et femelles, nous permettra d'obtenir des conclusions claires.
Evaluation de l’efficacité des produits immunologiques dans le cadre de développements de produits destinés à protéger des espèces domestiques contre un agent pathogène – Avenant à l’autorisation de projet #23290
- Formation professionnelle
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 600
Hamsters dorés : 7000
Chats : 150
Chiens : 1200
Furets : 50
13 000 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Chiens (1 200), chats, furets, souris, cobayes et 7 000 hamsters dorés reçoivent un agent pathogène, virus ou bactérie, puis sont suivis pour la maladie qu'il déclenche, afin d'évaluer l'efficacité de produits immunologiques vétérinaires destinés au marché. Le porteur indique que certains animaux développeront des signes cliniques sévères et douloureux pouvant conduire à la mort et seront mis à mort aux points limites. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est reconnue par la pharmacopée et que l'évaluation sur l'espèce de destination est "requise par la loi".
Objectifs
Dans le cadre du développement de produits immunologiques à destination vétérinaire tels que les vaccins, la démonstration des propriétés protectrices du produit contre la maladie cible est requise par la loi, et réalisée selon des réglementations précises. L’évaluation de l’efficacité du produit vis-à-vis d’une épreuve virulente est également nécessaire pour définir et caractériser le produit candidat (choix de la dose, de la voie d’administration, des adjuvants/excipients…). Toutes ces informations participent au développement et à la constitution finale du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM). Ce projet vise ainsi à présenter 2 procédures expérimentales répétitives ayant pour but d’évaluer l’efficacité de produits immunologiques chez les carnivores domestiques. Ces deux procédures concernent : 1/ la mise au point d’épreuve nécessaire pour cette évaluation, 2/ l’évaluation de l’efficacité en elle-même. A noter que par la suite, pour des raisons de simplification, on parlera par défaut d’animaux vaccinés à la place d’animaux ayant reçu le produit immunologique d’intérêt. Ces deux procédures seront réalisées sur l’animal de destination (chiens, chats, furets) ou lors d’essais préalables sur un modèle rongeur (souris, hamsters essentiellement). Les essais consisteront à administrer le pathogène (type virus ou bactéries), selon une ou plusieurs voie(s) d’administration, à une ou plusieurs dose(s), à des animaux sains préalablement vaccinés ou non et sensibles à ce pathogène. L’efficacité des produits immunologiques sera évaluée par comparaison des données obtenues chez les animaux vaccinés par rapport aux animaux non vaccinés. Il s’agira du suivi des signes cliniques spécifiques de la maladie, associé ou non à un suivi de paramètres biologiques (taux d’anticorps, excrétion virale ou bactérienne…).
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits immunologiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les requis pour la mise sur le marché de ces produits. Ce projet s’inscrit dans la prévention de maladies pouvant être graves et causer de la souffrance animale et des zoonoses. Les produits immunologiques ainsi développés permettent de protéger les espèces domestiques par la réduction des signes cliniques de maladie voire la mortalité ainsi que par la réduction de sa propagation auprès de ses congénères et de l’Homme (dans le cas de zoonoses). Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) et la réalisation des études nécessaires à la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché (AMM).
Procédures
En fonction du produit immunologique testé et donc du type d’agent pathogène inoculé, les animaux seront soumis à différentes interventions nécessaires à la bonne évaluation de son efficacité, selon les réglementations en vigueur. L’ensemble des interventions possibles, et variables selon le produit évalué, sont les suivantes : -Injection(s) de l’agent pathogène (ex, virus ou bactéries) à une ou plusieurs reprises (administrations répétées jusqu’à 4 fois) -Suivi clinique régulier des signes typiques de la maladie inoculée, associé ou non à une prise de température rectale (carnivores) et une pesée, permettant de surveiller et d’évaluer l’état de santé des animaux et nécessaires à l’appréciation de l’efficacité clinique du produit étudié -Prélèvements d’échantillons variés permettant des mesures répétées de marqueurs biologiques et nécessaires à l’appréciation de l’efficacité biologique du produit étudié. Ces prélèvements sont réalisés à des volumes et intervalles réguliers dans la limite des recommandations par espèce. -Euthanasie en fin d’épreuve par une méthode adaptée. La durée de l’épreuve pourra varier de 1 semaine à 2 ans (cas d’une infection lente).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une légère douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du pathogène, d’anesthésique ou de médication liée à l’introduction d’une aiguille. En revanche pour d’autres voies telles que intraoculaire ou intranasale, une anesthésie sera mise en place afin de prévenir tout stress ou douleur. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire et/ou de la douleur transitoire. Des signes cliniques plus ou moins sévères, spécifiques de la maladie et connus (retour terrain ou bibliographie relative aux modèles expérimentaux) pourront être observés, tels que des atteintes de l’état général (hypo/hyperthermies, pertes de poids, déshydratation, dépression…), et/ou plus spécifiques à certains organes type atteintes digestives (diarrhées, vomissements…), respiratoires (toux, éternuements, dyspnée, …), oculaires (conjonctivites…), rénales, neurologiques, dermiques et autres. Dans de rares cas, en fonction de la maladie, les animaux présentant des atteintes cliniques sévères et douloureuses, pouvant conduire à leur mort, seront euthanasiés dès l’atteinte des points limites définis et ceci afin d’éviter ou limiter dans le temps ces altérations graves. Tous ces signes peuvent induire des gênes ou inconforts, voire des souffrances, allant de quelques heures à quelques jours. A chaque fois que cela sera possible, des mesures visant à minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux, en termes de sévérité et de durée, seront mises en place.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode adaptée en conformité avec la loi et ceci pour chacune des deux procédures.
Remplacement
L’efficacité du produit immunologique doit être évaluée sur chacune des espèces de destination conformément aux monographies de la Pharmacopée Européenne. A ce jour, aucune méthode alternative in vitro n’est reconnue par la pharmacopée permettant de répondre à la demande. La réalisation d’essais préliminaires sur modèle rongeur sera privilégiée lorsque cela est possible.
Réduction
Ces procédures s’appuient sur le nombre d’animaux stipulé dans les monographies ou autres textes réglementaires relatifs au produit testé et/ou sur une analyse statistique et/ou des données préliminaires obtenues sur des essais passés ou de la littérature. A chaque fois, le nombre minimum d’animaux est utilisé afin de répondre à l’objectif de l’étude. Chaque fois que cela est possible, deux ou plusieurs produits, pourront être testés simultanément afin d’utiliser des témoins communs (surtout dans le cadre de sélection de produits dans les modèles rongeurs).
Raffinement
Des mesures seront prises afin de limiter le stress et la douleur lors de l’expérimentation : -Observation d’une période d’acclimatation et mise en place de séances d’habituation et socialisation des animaux (standard à renforcée), -Hébergement en groupe, et enrichissement adapté, afin de respecter le comportement inné des animaux et les interactions entre individus nécessaires au maintien du bien-être -Observation quotidienne et suivi clinique régulier, effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire, pour surveiller l’apparition de tous signes cliniques d’atteintes de l’état de santé des animaux -Réalisation de certains actes (administrations ou prélèvements) avec anesthésie/analgésie si nécessaire afin de garantir le bien-être animal. Une surveillance sera mise en place jusqu'au réveil complet de l’animal. -Médication pour le traitement de tous symptômes, tant que le traitement reste compatible avec l’objectif de l’étude -Mise en place de mesures compensatoires telles qu’un régime spécial (pâté en cas de perte d’appétence), enrichissement supplémentaire, nettoyages supplémentaires, surveillance accrue et renforcée,… De plus, pour chaque étude, l’état général de l’animal est suivi et l'utilisation de critères d’arrêt de souffrance sera systématiquement mise en œuvre pour réduire douleur, souffrance et angoisse.
Choix des espèces
De par la réglementation, l’efficacité d’un produit doit être établie sur l’espèce de destination (chien, chat ou furet) afin de garantir la fiabilité des résultats. Des essais préalables peuvent être réalisés sur des modèles rongeurs afin de limiter le nombre de carnivores à utiliser. Les études seront réalisées sur des animaux sevrés juvéniles ou adultes conformément à la réglementation.
Dissection des circuits somatosensoriels dans la neuropathie diabétique périphérique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un régime riche en lipides pour induire une neuropathie diabétique, puis subissent des tests sensoriels et moteurs, une anesthésie avec introduction d'une électrode sous-cutanée, des prélèvements sanguins et une perfusion intracardiaque au paraformaldéhyde qui les tue pour prélever leurs organes. Le porteur mentionne des tests sensoriels et moteurs sans préciser lesquels. Les retombées annoncées pour le diagnostic précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable", la maladie étant selon lui "impossible à reproduire" in vitro.
Objectifs
Le présent projet permettra de mieux comprendre comment la neuropathie diabétique affecte des sous-types de neurones sensoriels et les circuits de la corne dorsale de la moelle epinière qui traitent les informations somatosensorielles, et comment ces neurones sont impliqués au cours de la pathologie. Ainsi, le présent projet se décompose en 3 objectifs : Objectif 1 : Développement d’un modèle murin de ND induit par un régime riche en lipide. Nous évaluerons la neuropathie en réalisant des tests sensoriels et moteurs. L'utilisation de modèles murins de ND est couramment utilisée en recherche et présente l’avantage de mimer les déficits sensoriels (perte de sensibilité tactile et douloureuse) ainsi que les lésions périphériques (diminution de l’innervation au niveau de la peau) observés chez les patients diabétiques. Objectif 2 : Caractérisation des sous-types de neurones sensoriels impliqué dans la ND. La ND affecte principalement les fibres nerveuses Aß myélinisées de grand diamètre ce qui entraîne une altération de la détection de la position des articulations, des vibrations et de la sensation du toucher. Afin de cibler les fibres Aß, nous utiliserons différentes lignées de souris génétiquement modifiées. Grâce à des marquages immunohistochimiques nous pourrons ensuite caractériser les terminaisons nerveuses dans la peau et la moelle épinière. Nous évaluerons également l’intégrité des fibres nerveuses Aß myélinisées en mesurant la vitesse de conduction nerveuse. Objectif 3 : Etude du rôle de sous-types de neurones sensoriels au cours de la ND. Afin d’étudier l’implication de soustypes de neurones sensoriels dans les phénotypes observés au cours de la ND, nous utiliserons une stratégie de génétique intersectionnelle afin de supprimer ces neurones. L’évaluation de la ND par les tests sensoriels et moteurs nous permettra ainsi de mettre en évidence si l’absence de ces neurones impacte la mise en place de la ND.
Bénéfices attendus
Le projet proposé ici apportera un nouvel éclairage à certaines questions fondamentales dans le domaine de la neuropathie diabétique, telles que l'impact de cette pathologie sur les sous-types fonctionnels des neurones somatosensoriels et des circuits dans la moelle épinière dorsale. Cette étude permettra de mieux caractériser la pathologie somatosensorielle de la ND et de révéler de nouveaux marqueurs potentiels pour le diagnostic des dysfonctionnements précoces chez les sujets prédiabétiques. Elle permettra de développer et d'améliorer un nouvel ensemble d'évaluations recommandées pour la détection précoce de la ND chez les patients prédiabétiques. En conclusion, notre projet fournira donc des connaissances mécanistiques importantes avec un impact significatif sur le diagnostic précoce, mais définira également de nouvelles cibles thérapeutiques pour des médicaments qui pourraient limiter le dysfonctionnement du circuit somatosensoriel ou qui pourraient restaurer l'activité de certains neurones/interneurones via une stimulation chimique ou électrique.
Procédures
- Tests comportementaux : 30min/animal - Anesthésie générale et introduction d'electrode en sous-cutanée pour mesurer la vitesse de conduction nerveuse : 20min/animal - Prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale : quelques secondes/animal - Perfusion intracardiaque au paraformaldéhyde (4%) à la fin du projet : 5min/animal
Impact sur les animaux
Une forte prise de poids est attendu pour les animaux mis sous régime alimentaire riche en lipide
Devenir
L'ensemble des animaux (n=100) est maintenu en vie au cours des procédures 1 à 4. A la fin du projet, l'ensemble des animaux seront perfusés au paraformaldéhyde (4%) pour le prélèvement des organes.
Remplacement
Les objectifs de cette étude, visant à mieux comprendre comment le diabète de type 2 affecte spécifiquement les différents sous-types de neurones sensoriels et les circuits de la corne dorsale qui traitent les informations somatosensorielles et comment ces neurones sont impliqués au cours de l'évolution de la pathologie nécessite l’utilisation de différentes lignées génétiquement modifiées. Par ailleurs, le recours à l’expérimentation sur des animaux vivants est indispensable car la ND est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (ex : cultures cellulaires). Le modèle murin de ND induit par régime riche en lipide est couramment utilisé en recherche et permet de reproduire les déficits observés chez l’homme. Les études seront systématiquement optimisées d’après la littérature et/ou les observations réalisées au laboratoire.
Réduction
L’utilisation des animaux sera réduite au maximum et les expériences seront planifiées et réalisées les unes après les autres afin d’éviter des pertes inutiles. L’application de cette politique de réduction mise en place permettra d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer un maximum d’information d’un minimum d’animaux.
Raffinement
Les souris seront hébérgées dans des cages respectant les règles de bien-être: 5 souris/cage, boisson et alimentation en illimité, enrichissement de leur environnement et cycle alternance jour-nuit. De plus, les souris feront l'objet d'une surveillance quotidienne des zootechniciens et expérimentateurs afin de s'assurer du bien-être de l'animal et détecter tout signe de douleur (prostration, isolement, passivité, pelage de l’animal, respiration, vocalisations). Les protocoles ont été établi afin de réduire la douleur et la détresse de l’animal. Les animaux seront sous la surveillance de personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoirfaire permettra de réaliser nos expérimentations dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité.
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans l’étude des ND (O'Brien et al., 2014). Elle permet l’évaluation des déficits sensoriels et moteurs par la possibilité d’effectuer des tests comportementaux établis de longue date chez ce modèle animal. Nous utilisons des souris car elles sont déjà à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques permettant l’étude des protéines d’intérêt impliquées dans la ND. Des souris de 8-10 semaines. On a choisi ce stade de développement car le système somatosensoriel est mature et fonctionnel.
Programme d’immunisation de rats en vue de la production d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.
Choix des espèces
Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.