Biologie du développement

Réutilisées d'une procédure à la suivante à six mois d'intervalle, 200 xénopes vont être exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans qu'aucune mise à mort ne soit déclarée à l'issue. Les femelles subissent des ovariectomies, répétées sur le même individu une fois les ovaires régénérés, ou jusqu'à trois injections d'hormone chorionique gonadotrope pour être forcées à pondre, et les mâles sont prélevés de leurs testicules. Le porteur décrit pourtant trois groupes de 140 femelles, 60 femelles et 60 mâles, soit 260 individus pour 200 déclarés. Il présente le xénope comme un "modèle alternatif" qui réduit le nombre de "vertébrés supérieurs" utilisés, dans un projet dont les points limites vont de la torpeur à l'érosion des doigts jusqu'à l'os et aux saignements des yeux.

Objectifs

Les cellules répondent aux stimuli en déclenchant des réseaux de signalisation qui définissent des propriétés permettant le développement précoce. Les stress externes (exemples : les métaux lourds, les médicaments chimiothérapeutiques) dérèglent la division cellulaire et la décision du destin cellulaire, favorisant des défauts de développement et diverses maladies. L'objectif central de cette recherche est de démêler les voies de signalisation critiques impliquées dans la méiose, la mitose et l'embryogenèse. Les travaux de recherche se concentrent sur l'interaction entre ces réseaux de signalisation et les ajout de sucres ou de fixation de sucres sur des molécules clefs. En utilisant Xenopus laevis comme modèle principal, le projet vise à identifier les principales cibles moléculaires et à déchiffrer les mécanismes d'action associés aux dérégulations conduisant à l'infertilité et à des pathologies telles que les parasitoses ou les cancers.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la compréhension fondamentale des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement et la reproduction, avec des retombées potentielles pour la recherche médicale et la santé humaine. Les résultats pourraient ainsi contribuer à la lutte contre l’infertilité, les maladies parasitaires et certains cancers.

Procédures

Nos procédures impliquent : - le prélèvement des ovaires ; - l'induction de l'ovulation par injection d'hormone chorionique gonadotrope, - la manipulation d'embryons obtenus par fécondation externe : les ovocytes sont obtenus par ponte (stimulation par injection d’hormone chorionique gonadotrope) et les spermatozoïdes sont obtenus après prélèvement des testicules. Les animaux ayant été injecté pour stimulation de la ponte ovarienne et les anmiaux subissant l'ovariectomie ne sont pas les mêmes.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées entraînent des douleurs légères de courte durée et ne provoquent pas d’effets indésirables notables à long terme. Les risques associés aux procédures chirurgicales seront évalués quotidiennement : torpeur, perte rapide de poids, tension de l’abdomen et gonflement, hémorragies cutanées. 

Devenir

La réalisation de l'induction par injection d'hormone chorionique gonadotrope peut être répétée, pour stimuler chez un même individu (6 mois d'intervalle, au minimum, et ce afin de permettre la régénération des ovaires). 3 stimulations sont considérés, au maximum, et dans l'optique de réduire le nombre des animaux utilisés. Les femelles ayant subi 3 prélèvements et 3 injections sont considérés peuvent être de nouveau considérées pour une procédure d'ovariectomie ou d'injection hormonale, en fonction de leur état et dans une perspective de réduction du nombre d'animaux utilisés. La décision est prise par le responsable du projet, en concertation avec les membres du SBEA.

Remplacement

Les cellules d’un organisme en développement partagent de nombreux points communs. Tandis que les cellules normales sont sédentaires, différenciées et se divisent peu, les cellules d’un organisme en développement prolifèrent rapidement (prolifération), se déplacent (migration) et possèdent la capacité à se différencier dans de nombreux types cellulaires (différenciation). Les limites inhérentes aux systèmes in vitro ne leur permet pas de récapituler de manière adéquate les événements moléculaires complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire d’un animal vivant : prolifération, différenciation et migration cellulaires.

Réduction

3 groupes sont prévus : - 1 groupe pour les ovariectomies, composé de 140 femelles. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'ovariectomie peut être répétée sur un même individu, après une intervalle d'au minimum six mois. - 1 groupe pour les inductions d'ovulation, composé de 60 femelles. Chaque femelle peut être stimulée 3 fois, à des intervalles de 6 mois, et ce afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. - 1 groupe pour le prélèvements des testicules, où 60 mâles sont nécessaires si l'on considère que chaque prélèvement sert à la réalisation de 4 fécondations in vitro. En conclusion, par année seront réalisées (1) au minimum 30 ovariectomies (60 maximum pour les années 2 à 5, en considérant le prélèvement chez des animaux déjà opérés une fois ; le total du nombre d'ovariectomie se portera donc à 30 pour la première année et 60 maximum chaque année suivante année 1), et (2) au maximum 48 fécondations in vitro (le prélèvement des testicules chez les mâles constituera le facteur limitant du nombre possible de fécondation). Les nombres d'animaux enrôlés dans les deux premiers groupes tiennent compte d'un pourcentage d'animaux qui ne donneront pas de pontes correctes. Ce modèle "alternatif " aux mammifères permet de raffiner les expérimentations qui pourront être faites sur des modèles de vertébrés inférieurs, et réduire ainsi le nombre de vertébrés supérieurs utilisés à des fins d’expérimentation animale. Les résultats obtenus dans ces modèles sont transposables chez les mammifères, dans la mesure où les mécanismes étudiés sont hautement conservés au cours de l'évolution. L'utilisation des amphibiens s'inscrit dans une démarche visant à diminuer le nombre de mammifères impliqués en expérimentation animale, et à diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les points limites sont définis chez les amphibiens, comme indiqués ci-dessous: - Postures d’effondrement, reconnaissables à l’exposition vers l’extérieur de la partie interne de la palmure des pattes postérieures - Perte rapide de poids, visible grâce à la formation de groupes d’animaux de tailles comparables voire identiques du cloaque ou rostre. - Torpeur et absence de réaction lorsque les animaux sont légèrement pincés - Abdomen tendu et gonflement - Hémorragies cutanées - Érosion des doigts avec les os effleurant la peau - Usure des mâchoires - Perforations de la peau sur la partie dorsale. - Saignements au niveau des yeux et des membranes. En présence d’un de ces points limites, l’euthanasie est considérée .

Choix des espèces

Les cellules d’un organisme en développement partagent de nombreux points communs. Tandis que les cellules normales sont sédentaires, différenciées et se divisent peu, les cellules d’un organisme en développement prolifèrent rapidement (prolifération), se déplacent (migration) et possèdent la capacité à se différencier dans de nombreux types cellulaires (différenciation). Les limites inhérentes aux systèmes in vitro ne leur permet pas de récapituler de manière adéquate les événements moléculaires complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire d’un animal vivant : prolifération, différenciation et migration cellulaires. L’espèce Xenopus constitue un modèle largement caractérisé et établi pour l’étude des événements du développement embryonnaire depuis près d’un siècle. Les ovocytes, des œufs et les embryons de ces espèces offrent de nombreux avantages : développement externe, fortes concentrations de protéines, synchronisation physiologique, fortes capacités de synthèse protéique et forte conservation des mécanismes moléculaires de contrôle du cycle cellulaire. Ce modèle animal s’impose également comme un modèle de choix dans les approches de criblage pharmacologique ou toxicologiques. Ce modèle alternatif permet de raffiner les expérimentations qui pourront être faites sur des modèles de vertébrés inférieurs, et réduire ainsi le nombre de vertébrés supérieurs utilisés à des fins d’expérimentation animale. La régénération des ovaires chez cette espèce permet de réduire le nombre d'animaux femelles utilisés dans le protocole. Des individus des deux sexes sont nécessaires pour obtenir des oeufs fécondés et des embryons précoces.

Un trou est percé dans le crâne de chaque souris à l'aide d'un scalpel circulaire, au cours d'une opération de dix minutes sous anesthésie. 50 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélever les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois passages au micro-scanner. Il s'agit de comparer la réparation osseuse obtenue avec des hydrogels de collagène enrichis en verre bioactif, associés ou non à des cellules souches de pulpe dentaire ou de gencive. Le porteur annonce des douleurs modérées pendant environ trois jours après l'opération et un taux d'échec de 4 % dû à l'anesthésie, dans une intervention qu'il décrit comme bien maîtrisée au laboratoire.

Objectifs

La partie du crâne et du visage peut subir des pertes de tissu osseux à cause de traumatismes, de cancers ou de malformations présentes dès la naissance. Ces pertes de tissu peuvent entraîner des problèmes à la fois physiques et psychologiques, ce qui affecte la qualité de vie des personnes touchées. Les traitements actuels pour réparer ces pertes sont souvent invasifs et ont un taux d'échec élevé. Il est donc crucial de développer de nouvelles solutions thérapeutiques. Les recherches récentes se concentrent sur des biomatériaux innovants, qui peuvent contenir ou non des cellules capables de former de l'os. Par exemple, des hydrogels à base de collagène, contenant des cellules souches de pulpe dentaire, ont montré leur capacité à favoriser la réparation osseuse dans des modèles de défauts osseux du crâne chez les rongeurs. De plus, des cellules souches provenant des gencives ont démontré, en laboratoire, leur capacité à se transformer en cellules osseuses. Ces cellules sont facilement accessibles sans causer de traumatismes, ce qui les rend très intéressantes pour des applications cliniques. Par ailleurs, les verres bioactifs sont des biomatériaux particulièrement utiles grâce à leurs effets stimulants sur la croissance osseuse et leurs propriétés antimicrobiennes. Des études précliniques ont montré que ces verres ont un potentiel prometteur pour réparer des défauts osseux, bien que leurs mécanismes d'action ne soient pas encore totalement compris. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet sont d'analyser, dans un modèle de défaut osseux chez la souris, la capacité de réparation osseuse des hydrogels de collagène enrichis en verre bioactif, associés ou non à des cellules souches de pulpe dentaire ou de gencives. L'objectif est de mieux comprendre leurs mécanismes d'action au niveau cellulaire et moléculaire. À terme, ce projet vise à établir les bases de traitements régénératifs plus efficaces et accessibles pour la réparation osseuse de grands défauts crânio-faciaux.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des informations essentielles sur l'utilisation de gels à base de collagène contenant des cellules souches de la bouche et/ou enrichis en verre bioactif pour traiter de grandes pertes osseuses au niveau du crâne et du visage. Il permettra d'acquérir de nouvelles connaissances sur la rapidité et l'efficacité de la réparation des os grâce à ces gels modifiés. De plus, il aidera à mieux comprendre le rôle des différentes cellules impliquées dans la régénération du tissu osseux.

Procédures

Chaque souris subira une opération de 10 minutes pour créer un défaut dans le crâne. L'intervention consiste à inciser la peau du crane puis à réaliser un trou au niveau de l'os du crane à l'aide d'un scapel circulaire de taille standardisé. De plus, chaque souris passera trois examens d'imagerie par micro-scanner, chaque examen durant 3 minutes. Aucun préléevement n'est envisagé sur animal vivant.

Impact sur les animaux

Un risque de baisse de température pendant l'anesthésie, que ce soit par injection sous la peau, dans le ventre ou par gaz. Un peu de stress et une légère douleur de courte durée à cause des piqûres et de l'anesthésie gazeuse. Des douleurs modérées après l'opération pendant environ 3 jours.

Devenir

À la fin de l'expérience, tous les animaux sont euthanasiés par une méthode rapide et indolore. Cela permet de récupérer les tissus nécessaires pour les recherches.

Remplacement

La capacité des cellules souches issues de la bouche à supporter la réparation osseuses et à réagir aux différents biomatériaux a été préalablement validée au laboratoire. Cependant, pour étudier comment ces cellules réagissent dans un environnement plus proche du corps humain, il est nécessaire d'utiliser des modèles animaux comme les souris. Pour l'instant, il n'existe pas de méthodes en laboratoire ou par ordinateur qui puissent reproduire fidèlement les interactions complexes qui se produisent dans un organisme vivant.

Réduction

Nous utilisons des souris de la même famille génétique, ce qui signifie qu'elles sont presque identiques génétiquement. Cela permet d'avoir des résultats plus cohérents et de réduire le nombre de souris nécessaires pour nos études sur les cellules de la pulpe dentaire et des gencives. Une étude a montré que 6 souris suffisent pour voir une différence significative dans nos résultats, soit 12 souris si on inclut des mâles et des femelles. Ces chiffres sont en accord avec nos résultats précédents. De plus, cette opération est bien maîtrisée dans notre laboratoire, avec un très faible taux d'échec (environ 4 %), principalement dû à des complications liées à l'anesthésie.

Raffinement

• Avant la chirurgie, chaque souris reçoit un antidouleur. • Après l’opération, les animaux sont placés au chaud, surveillés jusqu’à leur réveil, puis logés en groupe dans un environnement confortable et enrichi. • Un traitement antidouleur est poursuivi pendant 3 jours, avec une surveillance quotidienne renforcée pendant une semaine. • Une grille d’évaluation permet d’identifier les signes de douleur ou de détresse.

Choix des espèces

La souris est une espèce de laboratoire classiquement utilisée pour l’étude du tissu osseux en raison de la similitude de son tissu osseux avec celui de l’homme. Le modèle du défaut critique de la calvaria de réparation osseuse est classiquement décrit das la littérature et parfaitement dominé au laboratoire. De nombreux outils d’analyses sont donc disponibles et adaptés à ce modèle. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes de 8 semaines. Ce stade de développement est optimal comme démontré par nos expériences antérieures et la littérature pour une bonne capacité de réparation/régénération tissulaire.

Une injection dans le cervelet suivie d'une électroporation, chez des souriceaux de sept à quatorze jours : 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 120 d'entre elles reçoivent en plus des injections dans l'abdomen deux fois par jour, répétées jusqu'à quatorze fois selon le stade étudié. Le porteur veut comprendre comment se développent les cellules granulaires du cervelet, qui représentent la moitié des neurones du cerveau, et rattache ce travail à l'ataxie, à l'autisme et aux tumeurs cérébrales de l'enfant. Toutes sont tuées pour des études histologiques, et 90 souris de plus, écartées faute du bon génotype, sont soit mises en accouplement soit tuées et prélevées.

Objectifs

Le cerveau se construit étape par étape : les cellules nerveuses se multiplient, se déplacent (migration), puis créent des connexions entre elles. Parmi ces cellules, on retrouve les cellules granulaires, très nombreuses dans une zone du cerveau appelée le cervelet, et qui représentent à elles seules la moitié des neurones du cerveau. Le cervelet joue un rôle important dans les mouvements, l’équilibre, mais aussi dans certaines fonctions comme le langage ou l’attention. Quand les cellules granulaires ou leurs connexions ne se développent pas correctement, cela peut entraîner des troubles comme l’ataxie (difficultés à coordonner les mouvements), l’autisme, ou certaines tumeurs cérébrales chez les enfants. Pourtant, on ne comprend pas encore bien comment ces cellules apparaissent et se développent. Nous proposons donc d’étudier la dynamique de développement des cellules granulaires et de leurs connexions neuronales en utilisant le modèle murin (souris normale ou génétiquement altérées sans phénotype dommageable), dont le développement des cellules granulaires est semblable à celui observé chez l’homme. Afin de visualiser les cellules granulaires et/ou de moduler ou suivre leur activité neuronale, nous utiliserons la méthode d’électroporation permettant l'introduction ciblée de matériel génétique dans des cellules spécifiques du cerveau en développement.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de l’activité neuronale des cellules granulaires sur leur développement et la maturation de leur connexions neuronales, processus développementaux essentiels pour le fonctionnement du cervelet et liés à des maladies du cervelet telles que l’ataxie, l’autisme ou même des cancers pédiatriques. De même, à travers ce projet, nous determinerons le rôle encore inconnu d'une protéine candidate dans le développement des cellules granulaires, plus précisément dans leur migration. À long terme, ces connaissances permettront de mieux comprendre ces maladies, ce qui permettra d’améliorer les propositions de traitements qui sont pour l’heure très peu efficaces.

Procédures

Pour ce projet, un type d’intervention invasive est prévue chez les souriceaux: une injection intracérébrale dans le cervelet sous anesthésie générale, immédiatement suivie d'une électroporation. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois (durée : 20 min maximum) pour tous les animaux de la procédure (total 345). Un lot de 120 animaux recevra des injections intrapéritonéales, deux fois par jour répétées entre 1 et 14 fois selon le stade de développement étudié. Cette injection génère un léger inconfort et ne nécessite pas d’anesthésie, elle dure moins de 30 secondes. L’euthanasie des animaux sera réalisée sous anesthésie générale par injection d’un euthanasiant. Elle concerne l’ensemble des animaux expérimentés soit 345 (durée : 15 min par animal).

Impact sur les animaux

L’incision de la peau lors de l’injection intracérébrale peut induire une douleur modérée et une irritation de la peau le premier jour après la manipulation. Les injections intrapéritonéales deux fois par jour peuvent induire un stress et une légère douleur de courte durée, ainsi qu’une légère sensibilisation de la peau, le site d’injection sera alterné entre droite et gauche afin de diminuer cet effet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour des études histologiques. Les 90 souris non utilisées dans le projet car n’ayant pas le génotype souhaité seront soit mises en accouplement pour le maintien de la lignée, soit euthanasiées par une méthode règlementaire et prélevées pour analyse post-mortem .

Remplacement

L’expérimentation animale sur un modèle murin est essentielle pour nous, car aucun système in vitro ne permet de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. La culture cellulaire, bien adaptée aux cellules granulaires, ne permet ni d’étudier leur migration qui s'effectue de manière multidirectionnelle dans les 3 dimensions du cervelet, ni d’analyser la morphologie très particulière (en T) de leurs axones. Cependant, des études préliminaires ont été réaliséees : des cultures cellulaires ont permis de valider les plasmides utilisés ; et les électroporations ont été testées sur des tissus ex vivo afin de confirmer l’entrée du plasmide dans la population neuronale ciblée, ainsi que la présence des molécules dans ces neurones dès 24h après l’électroporation.

Réduction

Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Nous réaliserons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons et utiliserons des outils informatiques pour calculer la puissance de nos tests. Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les animaux subissant des interventions feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'intervention et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une grille de score a été établie, permettant la mise en place précoce de soin des animaux, évitant leur euthanasie. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des anesthésiques locaux sont également administrés pour limiter toute souffrance à l’animal après son du réveil. De plus, une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et au respect des bonnes pratiques de stérilité pour éviter toute infection. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse de mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Les processus de développement du système nerveux central des souris étant similaire à ceux de l’homme, l’étude chez les souris permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Notre projet concerne le développement des circuits du cervet, qui se déroulent principalement pendant les premières semaines après la naissance. Les animaux seront utilisés à 3 stades développementaux après la naissance correspondant à des moments clés du développement cérébelleux (tels que le pic de prolifération cellulaire à 7 jours de vie, la migration à 11 jours et la formation des connexions neuronales à 14 jours).

Une biopsie de l'endomètre et du placenta réalisée sur animal vigile, sans sédation ni anesthésie, en profitant de l'ouverture du col juste après la mise bas : vingt des soixante brebis gestantes du projet subissent ce prélèvement. 120 ovins au total, brebis et agneaux, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois prises de sang pour les mères et cinq pour les descendants. Les brebis sont placées en conditions de vague de chaleur durant le dernier mois de gestation, ce qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés de thermorégulation et un risque d'avortement ou de mise bas précoce, l'enjeu déclaré étant de mesurer l'effet du dérèglement climatique sur la fertilité des descendants. 90 animaux, les mères et leurs filles, rejoindront le troupeau pour le renouvellement des générations, et les 30 descendants mâles seront abattus pour prélever leurs testicules et leur prostate, leur "reproduction" étant déclarée "compromise".

Objectifs

Le déreglement climatique et plus particulièrement l’intensification des vagues de chaleurs imposent une adaptation pour toutes les filières animales. Chez les ruminants, déjà peu adaptés à la chaleur du fait des fermentations du rumen, l’aptitude à produire est corrélée négativement à la résistance à la chaleur. Des effets délétères d’un index combinant la température et le taux d’humidité (THI), ont ainsi été démontrés sur la santé, la production ou la fertilité des individus touchés. Si l'effet de la température et de l'humidité peut être direct sur les animaux en croissance ou adultes, il pourrait également s'appliquer durant le développement fœtal, perturbant l’organogenèse et la fonction placentaire. Le stress thermique, réduit en effet la croissance d'organes spécifiques chez les veaux mâles et femelles et en particulier la taille des ovaires. Mais à l'heure actuelle, l'impact sur la construction du phénotype de fertilité des descendants et sur leurs performances de reproducteur à l’âge adulte reste inexploré. De tels impacts, s’ils étaient avérés, pourraient fortement limiter la diffusion du progres génétique des troupeaux et réduire les performances globales de l’élevage. Des perturbations épigénétiques pourraient être le socle soutenant toutes les modifications phénotypiques observées après un stress thermique. Le projet vise à étudier les effets d’un stress thermique en environnement contrôlé, appliqué durant le dernier mois de gestation chez la brebis, sur la construction du phénotype chez les descandants et leur performance à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier les effets du déreglement climatique (et plus particulièrement l’intensification des phases de pics de chaleurs) sur la construction du phénotype de la descendance et sur leurs performances de reproduction à l’âge adulte. Les bénéfices attendus à court termes porteront sur la caractérisation des effets physiologiques et moléculaires d’un choc thermique subi in utero sur le devenir des animaux afin d’améliorer nos connaissances scientifiques sur les mécanismes épigénétiques qui soutendent la construction des phénotypes. A long terme, ce projet devrait fournir des bases de compréhension sur les mécanismes d’adaptation des animaux aux changements environnementaux, ce qui permettrait de développer des leviers positifs attenuant les effets déletères d’un stress thermique.

Procédures

3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). Pour un sous groupe de 20 brebis une biopsie de l’endomètre et du placenta sur animal vigile sera réalisée. Nous profiterons juste apres la mise-bas de l’ouverture du col pour réaliser ce prélèvement. A ce stade physiologique, les voies femelles étant dilatées afin de permettre le passage du nouveau-né, le prélèvement pourra se faire sur animal vigile sans sédation ou anesthésie locomotrice. Concernant les descandants, 5 prises de sang seront effectuées (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois). Tous ces actes ont une durée limitée à de quelques secondes (prise de sang) à quelques minutes (biopsie).

Impact sur les animaux

Une hyperthermie sur les brebis mis en condition de vague de chaleur pourrait survenir, avec des difficultés de régulation de température corporel et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Les femelles biopsée pourraient ressentir une douleur liée au prélèvement. Enfin, le stress generé par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuissance supplémentaire.

Devenir

Les mères ainsi que leurs filles pourront rejoindre leur troupeau d’origine afin de contribuer au renouvellement des générations. Seuls les déscandants mâles seront abatus à la fin de l’expériementation afin de collecter les organes necessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du déreglement climatique. L’etude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’y a pas de remplacement possible puisque l’objectif du projet est d’étudier les impacts d’un stress thermique subit in utero sur le développement embryonnaire, la construction du phénotype et les performances de reproduction à l’âge adulte. Aucune étude ne permet d’ores et déjà de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. Nous n’avons donc pas de données fiables pour remplacer tout ou partie des animaux necessaires. De plus les développements récents d’organoïdes ou de cultures cellulaires 2D ne permettent pas de prendre en compte toute la compléxité d’un organisme biologique [placenta – fœtus – organes spécifiques] ayant subit un stress thermique.

Réduction

Aucune étude ne permet de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. En revanche, concernant le contenu spermatique en petits ARN non codants, des études chez le bovin soulignent une variabilité individuelle sans condition de stress appliquée. C’est pourquoi le nombre d’individus souhaités par groupe de stress permettant de tenir compte de la variabilité individuelle et de visualiser un effet potentiel du stress envisagé est compris entre 12 et 15 pour les deux sexes. Afin de les obtenir, 60 brebis gestantes seront utilisées dans le projet (30 pour le groupe « contrôle » et 30 pour le groupe « stress thermique »). Ces Brebis, porteuses de singleton, donneront naissance au mieux à 60 descendants en sexe-ratio équilibré, soit 15 males et 15 femelles par groupe. Ce nombre permettra de tenir compte de certains aléas de mortalité et d’entrainement à la récolte de semence. Nous choisirons les méthodes d'analyse statistique adaptés pour obtenir des résultats fiables et interprétables.

Raffinement

Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Un enrichissement adapté sera proposé dans chaque cellule (pour tous les lots) : des miroirs, cônes et un filet de foin suspendu. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Les prises de sang pourraient être alternativement faites à la veine jugulaire droite et gauche pour limiter le risque de phlébite. Un baume décongestionnant pourrait être appliqué en cas de lésions ou de thrombose. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera assurée. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisi en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et proportion des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Les premiers animaux utilisés seront les brebis Ile-de-France gestantes. Le second lot d’animaux sera constitué des agneaux (mâles et femelles) obtenus après la mise-bas. Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

Injectés sous la peau dans leurs premiers jours de vie pour déclencher une modification génétique, 476 souriceaux sont ensuite tués entre deux et vingt et un jours après la naissance pour que leurs tissus soient découpés et analysés. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré. Le projet cherche le rôle d'une molécule dans la formation du réseau lymphatique de l'utérus, un travail que le porteur qualifie d'exclusivement fondamental, avec une suite déjà annoncée sur le cancer de l'endomètre. Pour tirer plus de données de chaque animal, les cornes utérines sont coupées en deux et les expérimentateurs prélèvent en plus le diaphragme et l'oreille des mâles.

Objectifs

Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur au cours de la mise en place de ce réseau lymphatique dans l’utérus. Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt dans un tissu spécifique et à un moment donné. Ce contrôle spatio-temporel permet d’éviter les événements délétères sur les animaux. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et l’organisation des vaisseaux lymphatiques au cours du développement mais également d’ouvrir de nouvelles perspectives d’études dans des conditions pathologiques comme le cancer. En effet, le système lymphatique est impliqué dans la progression métastatique où il est une voie de dissémination pour les cellules cancéreuses, notamment dans les cas de cancer de l’endomètre.

Bénéfices attendus

Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle d’une molécule de guidage axonal et son récepteur dans la mise en place du réseau lymphatique de l’utérus. Si ce projet aboutit à l’identification d’une fonction pour ce couple ligand/récepteur. Nous déposerons une nouvelle demande de projet pour tester ce rôle dans un contexte tumoral (cancer de l’endomètre). En effet, le système lymphatique est connu pour être une voie de dissémination métastatique dans les cancers de l’endomètre.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons uniquement des interventions sur des nouveau-nés. Nous réaliserons une injection sous-cutanée (15 secondes). Enfin, nous prélèverons les tissus post-mortem pour des analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les nouveau-nés recevront une injection sous-cutanée d’un analogue d’une hormone sexuelle afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort, mais plutôt un retard de croissance du système lymphatique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les animaux(histologiques, transcriptomiques).

Remplacement

La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes. Par ailleurs, les cornes utérines seront scindées en deux ce qui permet de diviser par 2 le nombre d’individus. Dans un souci de réduction, nous collecterons également chez les individus mâles le diaphragme et l’oreilles qui sont des modèles d’étude de la mise en place du réseau lymphatique. De la sorte, nous pourrons généraliser nos observations dans l’utérus à l’intégralité de l’organisme.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées à différents âges qui ont été choisis suite à une étude préliminaire qui a montré que le système lymphatique de la corne utérine se développe entre 2 jours post-natals et 21 jours post-natal (le réseau a atteint sa maturité).

Injection dans l'utérus de femelles gestantes après ouverture de l'abdomen, injection déclenchant une naissance prématurée, transfert des nouveau-nés prématurés à une mère adoptive, anesthésie de souriceaux sur la glace, chirurgie stéréotaxique de deux heures sur adultes : 4 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur prévoit des saignements vaginaux, des mises bas prématurées difficiles et le rejet possible des petits par la mère adoptive. Le projet cherche comment une inflammation pendant la gestation ou une naissance prématurée perturbent la construction du cerveau, croisées avec des risques génétiques de troubles neuropsychiatriques. Il annonce des procédures "établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress", après avoir décrit un protocole qui provoque délibérément des naissances prématurées et sépare des nouveau-nés de leur mère.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement, contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous voulons comprendre comment des changements environnementaux au cours du développement (inflammation pendant la gestation et chez le juvénil, naissance prématurée ou absence de cellules immunitaires embryonnaire) perturbent l’élaboration du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques associés aux troubles neuropsychiatriques. Notre projet vise à déterminer le lien entre environnement et prédisposition génétique sur la mise en place du cerveau chez la souris. En combinant la génétique de la souris avec un ensemble d’outil d’analyses biologiques disponible nous souhaitons comprendre comment la naissance prématurée ou les fonctions immunitaires au cours de la gestation provoquent des perturbations pouvant causer de défauts de développement du cerveau associés à des pathologies.

Bénéfices attendus

Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leur origine dans des perturbations du développement du cerveau, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie prénatale à l'adolescence. Cette complexité provient d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales incluant des perturbations immunitaires (inflammations) lors des étapes cruciales du développement ou une naissance prématurée. Des études ont montré qu’une grande prématurité et des perturbations immunitaires modifient non seulement directement le développement, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques qui ont été identifiés dans divers troubles neuropsychiatriques chez l’homme. Ainsi, comprendre comment des perturbations gène/environnement impact sur les processus développementaux entourant la naissance et sur la formation du cerveau représente un intérêt majeur de santé publique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : 1) Chirurgie sur femelle gestante analgésiées et anesthésiées pour procéder à une injection in utero de molécules dans des embyrons (20 minutes). 2) Injection unique sur femelle gestante ou animal juvenil vigiles d’une solution induisant une inflammation (quelques secondes). 3) Injection unique sur femelle gestante vigile d’une solution permettant d’induire une naissance prématurée par voie basse (quelques secondes). 4) Adoption de nouveaux nés prématurés par une mère adoptive issué d’un autre croisement. 5) Injection répétée quotidiennement d’une substance permettant de moduler les niveaux de sérotonine dans des nouveaux nés (quelques secondes). 6) Anesthésie sur glace et injections de marqueurs neuronaux sur souriceaux (environ 10 min). 7) Chirurgie sur animaux adultes analégésiés et anesthésiés pour injections stéréotaxiques de traceurs axonaux (max 2h).

Impact sur les animaux

Les contentions nécessaires à la réalisation d'une injection peuvent induire un stress chez les animaux, principalement en raison de la manipulation et de la restriction physique temporaire imposées. Ce stress, bien que transitoire, peut perturber le comportement normal des animaux et provoquer des réactions physiologiques liées à l’anxiété. De plus, elles peuvent engendrer une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. Plus spécifiquement : 1) La chirurgie requise sur femelle gestante analgésiée et anaesthésiée pour l’injection in utero de molécules peut avoir un impact sur i) le déroulement de la gestation des femelles en provoquant des saignements vaginaux ou au site d’incision abdominale ; ii) sur le développement des embryons conduisants à des mises bas prématurées et des difficultés de mise bas. 2) Les injections sur femelle gestantes pour déclencher une naissance prématurée ou sur nouveaux-nés pour moduler la sérotonine peuvent engendrer un stress lié à la contention, provoquer un léger saigenement au site d’injection. 3) Le transfert de nouveaux nés prématurés à une mère adoptive peut engendrer un stress chez les petits ou chez la mère pouvant conduire à une reget de celle-ci. 4) Les injections de molécules inflammatoires sur femelles gestantes ou animal juvenile peuvent engendrer un stress lié à la contention, un léger saigenement ainsi qu’une réaction inflammatoire transitoire au site d’injection. 5) Les chirurgies requisent pour es injections de traceurs axonaux i) chez les nouveaux-nés, peuvent provoquer des saignements au point d’incision et d’injection ; ii) chez l’adulte, nécessite une chirurgie de l’animal analgésié sous anesthesie gazeuse qui peut conduire à des effets secondaires lié à l’anesthesie (stress thermique ou respiratoire) ainsi qu’à des saignements au site d’incision.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (4185) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou transcriptomique.

Remplacement

L’étude des interactions des gènes et de l’environnements dans l’élaboration cerveau en cours de développement nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des cellules et leurs interactions avec le tissu. Des signaux hormonaux, immunitaires, de tensions des tissus, de la circulation sanguine, de l’environnement de la mère ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes de culture (in vitro), qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité et des interactions cellulaire nécessaires. Les simulations informatiques, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent les phases précoces de développement du cerveau. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique

Réduction

Un total de 4185 animaux sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animal et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures expérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigueur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à diiférents stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Enfin, les souris juvéniles et adultes seront utilisées pour explorer la persistance et les conséquences à long terme Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.