Biologie du développement

Tués dès la fin de la procédure pour les uns, gardés jusqu'à douze mois puis mis à mort pour les géniteurs et génitrices, 16 950 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet consiste à créer et maintenir des lignées génétiquement modifiées pour étudier les protéines qui structurent les neurones. Chaque poisson subit à quatre mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale destiné au génotypage, geste que le porteur décrit comme sans dommage tout en reconnaissant qu'il peut induire du stress et de la douleur. L'effectif reste sans justification statistique, le porteur indiquant qu'aucune méthode n'a pu servir à le déterminer puisque aucune expérience n'est menée sur les poissons adultes.

Objectifs

Notre programme de recherche porte sur l’étude de neuropathies héréditaires humaines caractérisées par des atteintes neurologiques sensitives et motrices. La prise en charge clinique des patients est actuellement symptomatique et aucun traitement curatif n’existe à ce jour, ce qui pose l’urgence de développer des modèles animaux précliniques pour la mise au point des thérapies. Nous nous intéressons aux protéines qui forment l’architecture du neurone et qui sont mutées dans nombre de maladies neurologiques. Notre programme de recherche vise à comprendre le rôle physiologique de ces protéines structurelles et leur régulation. Afin de mener ce projet à bien, nous avons choisi le modèle du poisson zèbre, qui constitue un modèle/outil de choix pour l’étude du système neuromusculaire, similaire à celui de l'Homme et déjà fonctionnel dès le stade larvaire précoce. En outre, la transparence de l'animal durant le développement nous permet de capturer les processus dynamiques qui nous intéressent par imagerie dans un modèle in vivo. Pour réaliser ce projet, nous créerons et maintiendrons des lignées poisson zèbre transgéniques. Ces lignées nous permettront de générer des embryons dans le but d’étudier les protéines structurelles des neurones par des techniques de microscopie ou de biochimie à des stades larvaires (

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre les fonctions des protéines contrôlant l'architecture des neuroneset leur implication dans des mécanismes pathologiques. L’objectif à long terme (>5ans) est de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

La création et le maintien de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux transgéniques. Cette procédure d'identification nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Ce prélèvement, d’une durée inférieure à 5 minutes, sera réalisé sous anesthésie une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Classiquement, cette technique ne génère pas de dommages ni de mortalité. Il s’agit la du seul geste invasif qu’auront à subir les poissons zebres une fois dans leur vie.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à ce que les protéines étudiées induisent des nuisances dans les lignées transgéniques créées. Seule les formes mutées, avec des mutations retrouvées chez les patients, ont le potentiel de générer un phénotype dommageable (défauts sensorimoteurs). Ces défauts pourraient induire un défaut de nage chez ces poissons n’entrainant pas, au vu de la littérature sur les patients, de mortalité ou de conditions d’hébergement particulières. Nous porterons une attention particulière aux déficits moteurs en évaluant la qualité de la nage des poissons générés (notamment observable lors du nourrissage) et à l’apparition de signes de souffrance. Pour les autres lignées transgéniques, un suivi des poissons zebres sera réalisé afin de s’assurer qu’aucun d’entre eux ne développe de phénotype dommageable dans le temps. Lors de la création de ces lignées, un certain nombre de poissons zebres seront amenés à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification qui peut induire du stress et de la douleur.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 12 mois puis mis à mort. Les autres seront mis à mort dès la fin de chaque procédure afin de ne pas garder d’animaux génétiquement modifiés , non nécessaires à la conduite de ce projet et ne pouvant pas être replacés (adoption ou autre projet).

Remplacement

Le projet vise à acquérir une meilleure compréhension fondamentale des protéines controlant l'architecture des neurones. Bien qu'il existe des systèmes d'étude de cellules in vitro, ces modèles sont fortement limités car les neurones ne sont pas matures et ne permettent pas d'étudier complètement les fonction de ces protéines. Par conséquent, il n'existe actuellement aucun système in vitro qui réponde aux deux critères de complexité et de transparence des tissus, nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cela nous rend dépendants de l'utilisation de systèmes in vivo. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents, qui est déjà fonctionnel au stade larvaire et qui a une transparence tissulaire ce qui en fait un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques. Nous souhaitons établir des lignées poisson-zèbre transgéniques afin de disposer d’outils pour étudier la biologie des neurones.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre de poissons à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des techniques utilisées sera réalisée sur des oeufs de poisson zèbre sauvages à 24-48h heures post fécondation. Nous limiterons également au maximum le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification en réalisant les prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres. Ainsi, dès lors que le nombre d’animaux nécessaires à la génération des lignées sera obtenu, les prélèvements seront stoppés. Pour le maintien des lignées créées, seul le nombre de poissons zèbres nécessaire au maintien de chaque lignée sera conservé, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Étant donné qu'aucune expérience ne sera réalisée sur les poissons adultes, aucune méthode statistique n'a pu être utilisée pour déterminer le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a donc été déterminé sur la base du nombre de couples reproducteurs requis.

Raffinement

Tous les poissons adultes seront élevés en aquarium en conditions d’hébergement standard, avec une surveillance hebdomadaire. Les individus devant subir la procédure d'identification par prélèvement de nageoire caudale seront placés sous analgésie avant la procédure. Pendant cette procédure, l'exposition à l'anesthésique sera minimisée en effectuant rapidement les manipulations tout en s'assurant que le poisson est suffisamment sédaté pour ne pas sentir les manipulations. Une sédation adéquate sera confirmée en vérifiant l'absence de réaction de fuite provoquée par le toucher. Le plus petit morceau de nageoire possible sera prélevé afin de faciliter la cicatrisation et minimiser l’impact de cette procédure sur les animaux. La récupération de l'anesthésie sera étroitement surveillée : si le réveil n'est pas observé dans les 10 minutes, l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous réduirons au minimum le temps d'isolement des animaux (24h à 48h maximum). Les animaux seront traités par lots de 16 ce qui permet de former des bancs réduisant ainsi le stress des poissons. Les poissons ayant subi la procédure seront surveillés pendant 15 jours soit le temps minimum de cicatrisation afin que tout comportement ou aspect anormal puisse être évalué lors des contrôles de routine effectués par les soigneurs. Des points limites précoces et adaptés aux modèles d'étude ont été définis (points limites d'altération de la morphologie ou de comportement). En cas d'atteinte d'un seuil limite, les poissons seront euthanasiés.

Choix des espèces

Grâce à la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme, le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier les fonctions des gènes et des protéines qui sont pertinentes pour la physiologie et la pathologie humaines. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents pour nos questions biologiques. En outre, la transparence des embryons de poisson zèbre permet de suivre des processus dynamiques dans un contexte d'organisme entier à l'aide de techniques non invasives.

40 jeunes bovins vont être utilisés pendant huit à dix mois, 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 16 dans un niveau léger. Trois séries de prélèvements comprennent 18 mL de sang à la veine caudale, une fouille rectale et 400 mL de jus de rumen recueillis par sonde gastro-œsophagienne, geste qui peut irriter l'œsophage. Quinze jours à l'attache en stalle complètent la mesure de digestibilité. L'additif testé doit réduire les émissions de méthane entérique, et les 24 animaux du volet digestibilité sont abattus pour que leur carcasse soit évaluée, les 16 autres vendus sur pied. Le porteur indique avoir déjà mené les tests in vitro sur la fermentation du rumen et revendique un "besoin" d'animaux expérimentaux pour confirmer les effets in vivo.

Objectifs

L'objectif de cette expérimentation, menée chez le jeune bovin engraissé avec des régimes à base d’ensilage d’herbe, est de mesurer les émissions de méthane entérique, les performances zootechniques (in vivo et à l’abattoir), la digestibilité de la ration, la partition de l'azote alimentaire, ainsi que les modifications du métabolisme protéique et de la structure du microbiote ruminal induites par la supplémentation de la ration avec un additif anti-méthanogène. Un objectif secondaire consistera à confirmer ou identifier des proxies plasmatiques, urinaires, fécaux et ruminaux permettant de prédire les émissions de méthane, la digestibilité de la ration et les rejets d'azote urinaire chez le bovin engraissé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de confirmer l'effet anti-méthanogène de l'additif, d'identifier les mécanismes d'action de l'additif sur le microbiote ruminal et d'évaluer les effets secondaires de cet additif sur la digestion, les rejets d'azote, le métabolisme, les performances et la qualité de la carcasse de l'hôte. L’ambition est d'implémenter des bases de données incluant des données phénotypiques de bovins, tels que l'émission de méthane entérique, la digestibilité de la ration, et les rejets d'azote, ainsi que des prédicteurs de ces phénotypes d'intérêt zootechnique (microbiens, analyse fécale (spir), abondance naturelle isotopique, métabolites sanguins) difficiles à mesurer en pratique avec des méthodes de réference.

Procédures

Durant les 8-10 mois de l'expérimentation, 3 prélèvements de sang, de fécès et de jus de rumen auront lieu en début, milieu et fin de période. Le volume de sang prélevé au niveau de la veine caudale sera à chaque fois de 18 mL. La prise de sang durera moins de 3 minutes. La collecte de fécès sera de 500g et se fera en quelques secondes lors de la déféquation de l'animal. Le prélèvement de jus de rumen d'un volume de 400 mL sera réalisé en 3 minutes par prélèvement gastro-oesophagien. La fréquence des prélèvements exclue tout type de complications liée à la récupération des animaux. La phase de digestibilité durera 15 jours (5 jours d'habituation à l'environnement et 10 jours de mesures).

Impact sur les animaux

Différents prélèvements (collecte de jus de rumen, fécès, sang) sont prévus pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des bovins allaitants. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagien (PGO) et pourrait engendrer une légère iritation de l'oesophage. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les de prélèvements de fèces par fouille rectale. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort (léger à modéré) pendant la manipulation. La fréquence des prélèvements des 3 matrices (fécès, sang et jus de rumen) sera limitée au minimum nécessaire à savoir en début, milieu et fin d'expérimentation pour mesurer une cinétique d'action du produit. Au total, les animaux seront prélevés 3 fois pendant l'essai qui durera entre 8 et 10 mois. La contention de l'animal pour ces 3 prélèvements durera 10 minutes maximum. Concernant la digestibilité, les animaux seront à l'attache durant 15 jours dont 5 jours d'habituation. (cf préconisations consortium Eu-smartcow)

Devenir

A l'issue de cette expérimentation, les 16 animaux de la procédure 1 seront vendus sur pieds. Les 24 autres animaux (ceux ayant participé à la procédure 2) seront abbatus car leur carcasse sera évaluée pour l'étude des performances zootechniques à l'abbatoir.

Remplacement

La réponse concomittante de l'hôte et du microbiote ruminal à l'additif ne peut à ce jour être remplacé par aucune stratégie in vitro ou in sillico. L'un des objectifs du projet est d'identifier et de valider des indicateurs ou biomarqueurs capables de prédire la digestibilité de la ration et les rejets d'azote, deux paramètres qui nécessitent actuellement l’utilisation de cages de digestibilité. En conséquence, nous avons besoin de méthodes de référence qui ne peuvent être remplacées par la procédure en cours. À terme, ces indicateurs pourraient être proposés comme alternative aux méthodes de référence nécessaires en recherche. L'utilisation des techniques in-vitro pour étudier l'effet de l'additif sur la fermentation ruminale a été déjà réalisée et par conséquent nous avons besoin d'animaux expérimentaux pour confirmer les effets in-vivo.

Réduction

Pour cette expérimentation, 40 jeunes bovins seront mobilisés. Ce chiffre est basé sur les résultats obtenus au préalable par notre équipe chez le jeune bovin Charolais en engraissement alimentés avec des régimes comparables. Pour les mesures de digestibilité notre objectif est de démontrer l'absence de différence entre les deux traitements (test d'équivalence). Pour cela nous avons obtenu 20 animaux par traitement en considérant une absence d'effet lorsque la différence entre les deux traitements est inférieur à 2%. Dans le cadre cette expérimentation, les émissions de méthane seront mesurées au moyen de 2 collecteurs et analyseurs d'air (GreenFeed), une alternative toute aussi précise mais moins contraignante que les chambres respiratoires pour les animaux.

Raffinement

Les bâtiments sont dotés d'équipements pemettant un enrichissement du confort des bovins (brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Les animaux sont habitués à la cage de contention (passage systématique tous les 15 jours pour effectuer des pesées et notes d’état corporel). De plus, les prélèvements de fecès par fouille rectale ne sont réalisés que si les animaux ne défèquent pas naturellement. Concernant la phase d'étude de la digestibilité, les stalles ont été développées pour répondre aux besoins des animaux en termes de bien-être animal. Elles sont ainsi modulables pour s'adapter à la morphologie de l'animal, sont équipées de tapis et offrent un accès à volonté à l'eau et au sel. Ces stalles ouvertes permettent aux animaux de garder un contact visuel, auditif et olfactif entre eux. Concernant les points limites, l’ensemble des manipulations (contention + prélèvement) n’excèdera pas 10 minutes par animal et dans le cas contraire, sera reporté ou annulé. Pour le prélèvement d'adipocyte, une anestésie locale sera mise en place sur la zone d'incision. Les signes de modification de comportement dans la prise alimentaire, la posture, la réactivité ou/et les vocalisations seront surveillés les jours suivants les prélèvements. Dans le moindre doute, le vétérinaire d'élevage sera contacté et les soins prescrits mis en place et si besoin l'animal sera sorti de la procédure.

Choix des espèces

En France, l’agriculture représente 19% des émissions de gaz à effets de serre (selon le CITEPA), dont près de la moitié provient des élevages bovins lait et viande. Les émissions de méthane entérique, coproduit de la digestion de la cellulose par les ruminants, représentent environ 50% des émissions de GES d’une exploitation bovine. Le méthane entérique des bovins représente donc près de 5% des GES totaux français. Les élevages bovins lait et viande sont ainsi confrontés aux objectifs de décarbonation des activités. Il convient donc d'acquérir des références sur les bovins allaitants pour lesquels, on dispose de très peu de références. Les jeunes bovins seront en croissance dans des conditions similaires à ceux élevés pour la filière commerciale.

Les souris porteuses de deux copies du gène muté développent des difficultés locomotrices, une prostration et une perte de poids à partir de seize mois, un phénotype que le porteur réserve aux lots expérimentaux. 3 086 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité et modéré pour quarante d'entre elles. Le génotypage passe par le prélèvement de l'extrémité de la queue, puis viennent un traitement de sept mois incorporé aux croquettes ou un gavage unique de la mère gestante. Suivent trois séries de deux tests comportementaux, un test de mémoire répété cinq jours et un test de coordination motrice répété trois jours, et pour un groupe jusqu'à quatorze prélèvements de sang sous anesthésie toutes les deux semaines. Les couples reproducteurs sont tués dès que leur reproduction baisse, les autres à la fin de chaque procédure pour récupérer des tissus ou prélever des embryons.

Objectifs

Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale. MODIFICATION : l’allongement du temps de maintien des animaux de 8 à 12 mois implique l’ajout de tests comportementaux et d’un prélèvement sanguin ce qui nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.

Procédures

La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois, ou 4 mois, 8 mois et 12 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.

Devenir

Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.

Choix des espèces

Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 12 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.

Les rates donneuses sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les mères porteuses opérées le sont au plus tard au sevrage de leurs petits, faute de pouvoir être réutilisées après une chirurgie. 3 725 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, seules les femelles dont le cycle a été synchronisé sans opération pouvant repartir vers un autre projet, jusqu'à quatre fois. Les donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle sous contention, les mères porteuses quatre injections et une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, avec un risque d'automutilation de la cicatrice que le porteur signale. L'activité est vendue comme prestation de service, et le porteur écrit que la quantité d'animaux "a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats", sans approche statistique.

Objectifs

Notre travail est de créer, d’amplifier et d’archiver des lignées de rats génétiquement modifiées. Ces lignées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre coeur de métier est la création, l'amplification et l'archivage de lignées génétiquement modifiées de rats pour le service des chercheurs et de la commumauté scientifique. Notre rôle est de fournir aux chercheurs des lignées précises, établies et robustes en améliorant sans cesse nos techniques afin de répondre aux exigences de réduction et raffinement. La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente.

Procédures

Les rates donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Cet acte rapide se fait sur animaux vigiles et sous contention. Les rates mères-porteuses seront d'abord soumise à une injection de composé chimique pour synchroniser leur cycle (acte rapide, sur animaux vigiles sous contention), puis quelques jours plus tard (J+5), elles recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination artificilelle : Une injection d'analgésique 30 minutes avant l'injection du cocktail anesthésique (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissment suffisamment profond, la chirugie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. Avant le réveil des animaux, une dernière injection d'anti-inflammatoire combinée à une réhydratation sera pratiquée. Chaque femelle mère-porteuse recevra au total 4 injections. (composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire/réhydratation).

Impact sur les animaux

Les rats peuvent ressentir un léger stress de courte durée lors des manipulation/contentions pour réaliser les différentes injections. Lors des injections des différents produits utilisés dans cette procédure (hormones, composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire), les animaux vont sentir une légère douleur de courte durée, le temps de l'introduction de l'aiguille. Les composés injectés sont tous très bien tolérés, mais le site d'injection sera surveillé pour s'assurer qu'il n'y a pas d'inflammation, d'infection ou de lésions de grattage. En post-opératoire, l'animal peut ressentir une gêne, entièrement prise en charge par la couverture antalgique. La plaie générée par la chirurgie sera étroitement surveillée car elle peut s'inflammer ou s'infecter dans de très rares cas. Les animaux en post chirurgie peuvent s'attaquer à leur cicatrice : soit enlever les agrafes, soit ronger la peau autour (automutilation).

Devenir

Les donneuse d'embryons pour la création et l'archivage des lignées créées seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mères-porteuses, dès lors qu'il y a eu la chirurgie de transfert d'embryon ou de gamètes, elle seront mises à mort soit le lendemain de la mise bas théorique (donc à J+23 de la chirurgie) pour pratiquer une césarienne, si elles n'ont pas mis bas naturellement, ou au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie. En revanche, pour les femelles mères porteuses dont le cycle a juste été synchronisé, donc sans avoir été opérées, elle peuvent être réutilisées dans la limite de 4 fois en respectant un temps de repos de minimum 21 jours entre les injections de synchronisation pour un autre projet dans le cadre de nos activités de service.

Remplacement

Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour toutes ces techniques de création, d'amplification et d'archivage de lignées de rats génétiquement modifiées. L'état actuel de nos connaissances ne permettent pas de s'affranchir d'utiliser des animaux en recherche fondamentale ou appliquée.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. L’amélioration des techniques permet sans cesse de répondre aux exigences de réduction et de raffinement. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés. Ces techniques sont utilisées en prestation de service, la quantité d'animaux utilisée a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats avec les clients. Il n'y a donc pas d'approche statistique.

Raffinement

Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour palier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme (effets de l'anesthésie dissipés et reprise de mobilité), dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.

Choix des espèces

Le rat est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Il est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements hormonal de superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes matures. La souche choisie est connue pour être d’excellentes mères, très calmes, qui peuvent donner naissance à de grandes portées de nouveau- nés, ce qui permet de réduire significativement le nombre de femelles mères porteuses utilisées.

Des femelles gestantes gavées cinq fois de suite, des nouveau-nés injectés à 36 et 72 heures de vie, des biopsies de queue prélevées sur des petits éveillés entre le septième et le dixième jour : 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement modéré. Les petits qui développent la maladie présentent une jaunisse et un retard de croissance, et sont tués à 14 ou 21 jours. Le projet vise à créer des lignées de souris reproduisant une malformation des voies biliaires plus tôt dans le développement que les modèles déjà publiés. Le porteur écrit que les nouveau-nés sont tués parce qu'ils sont "nécessaires" à l'étude, et renvoie l'effectif de 912 animaux à des "tests statistiques adaptés" dont il ne donne pas le détail.

Objectifs

l’objectif de ce projet est la création de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces par rapport aux publications précèdentes.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra le développement de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires chez la souris. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie. Cette étude se fera en parallèle avec l’utilisation de cellules du foies dérivées de biopsies de patients. Cela permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourront être testés sur nos nouveaux modèles de souris par la suite.

Procédures

Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé pour le génotypage entre 7 et 10 jours après la naissance. Gavages répétés, 5 fois pendant 30sec, chez la femelle gestante entrainant une douleur modérée et passagère . Injections répétées, 2 fois pendant 10sec, aux nouveaux nés 36h et 72h après la naissance engendrant une douleur légère et passagère.

Impact sur les animaux

Risque de saignement vaginal et perte de poids pour la femelle gestante. Lors des procédures le gavage est un mode d’administration entrainant une douleur modérée et passagère. l’injection entraine une douleur légère et passagère sur un nouveau-né. Dans le cas où les animaux développent la maladie les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés).

Devenir

Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 14 ou 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires en parallèle de nos modèles de souris pour ce projet. Néanmoins les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour l'étude du développement du foie et de la mise en place de la fibrose et de l'inflammation et l'étude de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.

Réduction

Dans un souci de réduction des animaux nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une lampe chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. L’injection et le gavage seront réalisés avec des sondes et des aiguilles adaptées à la taille de l’animal seront utilisés. Des points limites spécifiques ont été établis.

Choix des espèces

Le choix de la souris est lié à la similarité du métabolisme et du développement du foie entre l'humain et la souris. En particulier, le développement des canaux biliaire est similaire entre les deux espèces. Par ailleurs, nous disposons également de nombreux outils spécifiques pour la souris. Les femelles gestantes seront gavées à différents âges de la gestation : 10 et 12 jours de gestation (développement du foie et formation de la vésicule biliaire et du canal biliaire extrahapétique) ainsi que 14 et 16 jours de gestation (maturation du canal biliaire extrahépatique et formations des canaux intrahépatiques). Les nouveaux nés développent les symptômes visibles de la maladie à la naissance comme chez l’Homme. Nous utiliserons donc les animaux entre 1 et 21 jours après la naissance pour évaluer le développement de la maladie.

140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 56 d'entre elles et modéré pour 84. Les femelles reçoivent jusqu'à deux injections hormonales dans l'abdomen à 48 heures d'intervalle, les mâles sont vasectomisés, et une quinzaine de minutes d'incision abdominale sert au transfert des embryons. Le seul bénéfice annoncé est la fabrication de deux lignées mutantes, soit d'autres animaux destinés à de futures expériences sur la pluripotence embryonnaire, le porteur reconnaissant que les effets de la mutation sur les souris ne sont pas connus à ce jour. 130 souris sont tuées, les 10 mâles vasectomisés étant conservés pour resservir dans un autre projet.

Objectifs

LLes cellules souches embryonnaires sont des cellules très particulières qu'on trouve au tout début de la vie, dans l'embryon. Elles sont capables de se multiplier à l'infini et de se transformer en n'importe quel type de cellule de notre organisme (peau, cerveau, cœur, etc.). Grâce à ces propriétés uniques, elles sont très utiles pour mieux comprendre comment un organisme se forme et pour imaginer de nouvelles approches en médecine, notamment pour réparer des tissus abîmés. Ces cellules proviennent d’un stade embryonnaire très précoce, présent quelques jours après la fécondation. Elles permettent aux chercheurs d’étudier en détail comment les cellules se spécialisent pour former les différents organes. Ce processus est contrôlé par des gènes, qui jouent un rôle important, notamment dans la multiplication des cellules et leur spécialisation. Ce projet de recherche vise à étudier l’effet d’un gène particulier en le supprimant chez des souris. Cela permettra de voir ce qui se passe quand le gène ne fonctionne plus du tout et comment il influence le développement des embryons et des fœtus, notamment dans les premières étapes du développement embryonnaire. Il permettra d’apporter des réponses aux problèmes de reproduction, notamment chez l’homme et les espèces d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera un modèle de recherche nouveau pour acquérir des connaissances sur le développement embryonnaire précoce des mammifères.

Procédures

Les types d’interventions sur les animaux sont : 1) les injections d’hormones dans la cavité abdominale, et (2) les interventions chirurgicales associées à la vasectomie et au transfert embryonnaire. Pour les injections, chaque souris est injectée au maximum deux fois (avec un intervalle de 48h entre chaque injection). Ces interventions sont rapides (une injection dure quelques secondes). Les interventions chirurgicales (incisions abdominales et cutanées) sont réalisées une fois et durent une quinzaine de minutes. La cicatrisation dure quelques jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris concernent : (1) douleurs liées aux injections, et 2) risques d’infection ou hémorragies et douleurs liées aux interventions chirurgicales. Les injections peuvent provoquer un saignement léger et des douleurs légères, comme celles associées à des blessures superficielles, équivalente à celle d’une piqure ou d’une petite coupure. Les interventions chirurgicales peuvent provoquer des douleurs modérées, essentiellement liées aux incisions et à leurs cicatrisations. Les effets indésirables lié à la mutation ne sont pas connus à ce jour. Nous n’attendons pas de conséquences dommageables pour les souris mais l’expérimentation permettra de déterminer s’il en existe, notamment par l’évaluation du bien-être animal de la lignée créée.

Devenir

Tous les animaux ayant servi à la création des deux lignées seront mis à mort à l’exception des mâles vasectomisés qui pourront être réutilisés dans un autre projet les nécessitant.

Remplacement

Le développement embryonnaire précoce implique de nombreuses interactions cellulaires entre les tissus embryonnaires, extra-embryonnaires et l’environnement utérin maternel. La validation de facteurs identifiés in silico et in vitro dans des lignées cellulaires nécessitent de recourir à l’animal pour valider sa fonction dans ce système complexe, impossible à recréer aujourd’hui in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire au projet a été optimisé pour permettre la production de deux lignées mutantes pour un gène d’intérêt. Ce nombre est basé sur l’expérience du laboratoire pour la production de lignées de souris transgéniques avec ces outils et à l’aide des principes généraux fournis par le guide européen « animaux génétiquement altérés » pour la procédure d’évaluation du bien-être animal des deux lignées créées.

Raffinement

Toutes les souris (mâles, femelles et juvéniles) seront élevées en groupe avec un enrichissement dédié dans chaque cage (maison en carton et coton). Elles seront nourries et abreuvées ad libidum. Si de l'agressivité entre les mâles est observée, ceux -ci seront isolés dans des cages en plastique transparent permettant un échange visuel avec les congénères des cages à proximité. Les souris mâles adultes vasectomisées utilisées pour les accouplements seront hébergés avec des femelles de compagnie (souvent de vieilles femelles) dans des cages en plastique transparent permettant un échange visuel avec les congénères des cages à proximité. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée pour évaluer leur bien-être et en cas de douleur suspectée par l’évaluation quotidienne des animaux, une injection d’analgésique sera administrée en sous-cutanée. Des analgésiques seront administrés en pré-opératoire et si besoin en post-opératoire. Du gel sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire au cours des interventions chirurgicales. Les interventions chirurgicales seront réalisées sur un tapis thermorégulé afin d’éviter toute hypothermie. Des points limites décrits dans les procédures expérimentales seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris est le mammifère modèle pour la réalisation d’invalidation génique par édition des génomes. Les protocoles sont bien maitrisés et le développement embryonnaire extrêmement bien caractérisé. Enfin nous avons montré que le gène étudié était exprimé dans les cellules pluripotentes embryonnaires de souris, non encore spécialisées, tout comme les autres espèces de mammifères étudiés (porc, bovin, humain, mouton). L’utilisation du modèle souris est donc pertinente pour étudier la fonction de ce gène au cours du développement précoce (embryonnaire et fœtal) des mammifères. Pour la production de la lignée génétiquement modifiée, nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles. Pour la caractérisation de la lignée nous utiliserons des souris nouveau-nés à adulte.