Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Identification de 4 mutations chez la caille : « Rusty », responsable d’une coloration du plumage, « Curly » responsable d’une modification de la structure du plumage et « Blanc » (ou « White Egg ») et « Celadon » responsable de la couleur des coquilles des oeufs.
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Porteuses de mutations spontanées maintenues à l'état homozygote depuis plusieurs générations, des cailles japonaises se voient prélever du sang à la jugulaire pour en extraire l'ADN. 800 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour identifier quatre mutations qui modifient la couleur du plumage, sa structure et la couleur des coquilles d'œufs. Le geste dure quelques secondes et provoque un stress de contention, une douleur locale et un possible hématome, comprimé trente à soixante secondes. Toutes sont remises en élevage pour le renouvellement des lignées, à l'exception des cailleteaux prostrés plus de vingt-quatre heures sans manger ni boire, retirés puis tués.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la stratégie de préservation et de caractérisation des ressources génétiques animales. Il consiste à produire des cailles porteuses de mutations monogéniques afin d’identifier la base moléculaire de ces phénotypes, et de réaliser des prises de sang pour l’extraction de l’ADN. Les quatre mutations d’intérêt sont : "Rusty", responsable d’une coloration particulière du plumage ; "Curly", responsable d’une modification de la structure du plumage ; et "Blanc" et "Céladon", responsables de la couleur des coquilles d’œufs. Ces mutations ont déjà été localisées sur le génome de la caille grâce à un génotypage réalisé sur deux populations F2 (~200 individus chacune), issues de croisements entre animaux présentant ces phénotypes. L’analyse d’association entre génotypes et phénotypes a permis d’identifier les régions génomiques candidates impliquées dans chacun des quatre caractères . Afin de progresser vers une caractérisation fine des mutations causales, il est nécessaire de séquencer les régions génomiques candidates chez des animaux homozygotes pour les mutations concernées. Cette étape de validation par séquençage exige un ADN de très bonne qualité. Pour cela, des prises de sang seront réalisées sur des individus porteurs avérés des mutations, afin d’obtenir un ADN de haute qualité et d’optimiser le séquençage des régions génomiques d’intérêt.
Bénéfices attendus
Les technologies de séquençage actuelles permettent d'obtenir des données sur plusieurs individus à des coûts plus raisonnables. Ce projet a donc pour but de finaliser le programme qui avait permis de localiser les 4 régions candidates sur le génome de la caille, en identifiant les mutations causales et en assurant la valorisation. L’identification des mutations causales ouvrira la voie à la mise en place de tests de génotypage directs, utilisables dans des programmes potentiels de sélection ou de conservation. Des analyses fonctionnelles pourront ensuite être entreprises pour comprendre finement les mécanismes moléculaires sous-jacents. Cette démarche s’inscrit dans une stratégie plus large de compréhension des bases génétiques de caractères visibles chez la caille.
Procédures
Une prise de sang qui ne durera que quelques secondes à la jugulaire sera réalisée une seule fois.
Impact sur les animaux
La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome.
Devenir
Suite à la procédure de prise de sang, les animaux seront conservés pour le renouvellement des lignées.
Remplacement
L'objectif du projet est d'identifier des mutations portées par des animaux maintenus à l'état homozygote depuis plusieurs générations. Le phénotype (couleur ou forme des plumes, couleur de coquille) ne peut être observé que sur des animaux vivants. Cette étude ne serait donc pas réalisable sans ces animaux.
Réduction
Chaque lignée de caille est constituée de 30 femelles et 20 mâles par génération. Cet effectif correspond à un effectif génétique qui représente le minimum nécessaire pour maintenir la variabilité génomique de la lignée et limiter l’augmentation de la consanguinité à environ 1 % par génération.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux cailleteaux de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher . Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite (c’est-à-dire animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les cailleteaux retirés seront euthanasiés en respectant la réglementation en vigueur . Un arbre de décision visant à faciliter la gestion quotidienne des animaux (atteinte ou non du point limite) sera fourni aux techniciens chargés du suivi des animaux. Cas de la prise de sang à la jugulaire : Un point de compression de 30-60s sera effectué pour limiter la formation d'un hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée de la caille par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Ceci permettra de limiter les mouvements éventuels des animaux susceptibles d'engendrer un échec de la prise de sang. Les personnes affectées à cette tâche seront des personnes habituées à la contention et à la prise de sang sur la volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang à la jugulaire ont reçu une formation spécifique à ce geste et sont des personnes le réalisant régulièrement afin de maximiser la fluidité des gestes. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement. Les animaux prélevés seront remis en élevage.
Choix des espèces
Le projet vise l’étude de 4 mutations spontanées chez la caille qui sont impliquées pour l’une dans la coloration du plumage, l’autre dans la structure du plumage et pour les autres, des colorations des coquilles des œufs. Ces travaux nécessitent une approche globale et ne peuvent donc être abordés que par une approche sur les animaux de cette espèce. La caille japonaise a été choisie comme modèle, car c’est l’espèce agronomique cible du projet, celle dans laquelle les mutations sont apparues spontanément. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur, puis les animaux seront élevés jusqu’à 50 jours avant prélèvements.
Etude des cellules souches lors du développement des épithéliums glandulaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
735 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'acte infligé se limite à une injection unique de dix secondes sur animal vigile, pratiquée sur des femelles gestantes dont les embryons sont mis à mort vingt-quatre heures plus tard, aux stades E12, E15 ou E18,5, pour mettre leurs tissus en culture. L'objectif est de comprendre comment se forment les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques, et ce qui, déréglé, favoriserait des tumeurs. Le porteur affirme que les organoïdes modifient le comportement des cellules épithéliales une fois détachées de leur tissu, qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la régénération, et conclut que la souris est "nécessaire" à l'étude.
Objectifs
Certaines cellules adultes peuvent, dans des contextes particuliers, retrouver des caractéristiques qu’elles n’avaient plus depuis le stade embryonnaire. C’est ce qu’on observe notamment dans le développement de certains cancers. L’une de ces caractéristiques est la multipotence, c’est-à-dire la capacité d’une cellule à se transformer en plusieurs types de cellules différents. Nous nous intéressons à quatre types de tissus glandulaires : les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Chez l’adulte, ces tissus sont composés de cellules spécialisées qui ne produisent qu’un seul type cellulaire. Mais pendant le développement embryonnaire, certaines cellules retrouvent temporairement cette capacité à se diversifier. Or, dans les cancers de ces tissus, les cellules tumorales semblent réactiver ce programme de manière incontrôlée. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces tissus se forment pendant l’embryogenèse. En étudiant les mécanismes qui contrôlent le passage d’un état cellulaire flexible (multipotent) à un état plus stable et spécialisé, nous espérons identifier ce qui, lorsqu’il est déréglé, peut favoriser l’apparition ou la progression de tumeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’étudier le comportement des cellules souches et leur état de différentiation pendant le développement normal des embryons de souris dans les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Nos résultats aideront à identifier les mécanismes régulant le destin des cellules souches. Ces mécanismes étant déstabilisés lors de la formation de tumeurs, nous pensons qu’à long terme nos recherches contribueront à une meilleure compréhension du processus tumoral dans les tissus glandulaires étudiés.
Procédures
Une injection unique sera réalisée sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes).
Impact sur les animaux
Pour l’analyse du développement embryonnaire, nous utiliserons des embryons au stade E12 ou E18.5 pour l’étude de la glande mammaire et de la glande salivaire ou E15 lors de l’étude de la glande lacrymale ou de la prostate. Les embryons seront mis à mort, pour pouvoir mettre en culture leurs tissus, 24h après l’injection d’un traitement à leur mère permettant l’activation de mutations de certains gènes. Aucune des mutations induites sur une si courte période n’a de phénotype dommageable à ce stade de développement embryonnaire. Les nuisances attendues sont uniquement liées au geste de l’injection elle-même du traitement chez les mères.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Au fil des années, beaucoup d'efforts ont été déployés pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes ou les explants embryonnaires, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement. Cependant, les cellules épithéliales modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches glandulaires. De plus, les animaux seront essentiels pour suivre les cellules souches lors de la régénération tissulaire, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler le processus global de régénération. L’absence de structure similaire aux glandes étudiées dans des modèles de vertébrés non mammifères rend l’utilisation de la souris nécessaire à notre étude.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, des informations seront obtenues au niveau des organes, cellulaire et moléculaire à partir du même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques seront réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris avec le génotype souhaité. Pour chaque souris plusieurs organes seront collectés (chez les mâles: glande salivaire, lacrymale et prostate; chez les femelles: glande lacrymale, salivaire et mammaire). Le nombre d'animaux de notre étude est déterminé à l'aide de tests statistiques.
Raffinement
Les mères gestantes seront manipulées le moins possible. Aucune nuisance liée à l’injection chez les mères n’a été rapportée. Nous avons tout de même établi une grille de score. Les souris seront suivies quotidiennement pour détecter des signes de mal-être
Choix des espèces
L'organisation générale, le développement et le fonctionnement glandes étudiées ici sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la régénération. De la même manière, les évènements cancéreux survenant chez l’homme et chez la souris suivent les mêmes étapes dans les différentes glandes étudiées ; perte d’identité cellulaire, activation de traits embryonnaires, prolifération non contrôlée. Les animaux utilisés lors de l’étude du développement embryonnaire seront des souris femelles adultes gestantes permettant d’étudier des embryons à un stade ou le phenotype dommageable ne s’est pas encore développé . Ces stades correspondent à la période où chacun des tissus est spécifié et est composé de cellules souches multipotentes
Comprendre les causes de l’arrêt respiratoire dans le syndrome d’Ondine (maladie génétique qui touche le contrôle de la respiration) grâce à des souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souriceaux de ce projet naissent avec une mutation qui les empêche de respirer normalement, apnées, respiration faible et absence de réaction à l'excès de gaz carbonique dans le sang. 464 souris vont être utilisées, 180 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 264 modéré et 20 léger, toutes tuées à l'issue. Chaque nouveau-né est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour les mesures cardio-respiratoires, subit le prélèvement de deux à trois millimètres de queue avant son quatrième jour de vie pour le génotypage, et est manipulé toutes les deux heures le jour de sa naissance pour vérifier sa vitalité. Les souriceaux sont tués par décapitation au quatrième jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, le porteur ayant retenu comme critères le score d'adaptation à la vie extra-utérine et le comportement de la mère envers sa portée.
Objectifs
Nous voulons comprendre comment et pouquoi des mutations aboutissent au syndrome d'Ondine. Cette maladie se manifeste à la naissance par une apnée, une respiration faible et une absence de rélfexe respiratoire (pas d'augmentation de la respiration à une élévation de la teneur en gaz carbonique dans le sang). Ces problèmes se manifestent pendant le sommeil ce qui est dangeureux pour le nouveau-né. Il s'agit d'identifier les structures qui ne se forment pas et/ou les structures qui sont malformées à l'expression de la mutation et leurs conséquences sur la respiration.
Bénéfices attendus
Le projet pourrait avoir un impact fondamental par l’identification des circuits neuronaux impliqués dans les déficits respiratoires du syndrome d'Ondine. Le projet pourrait également apporter de nouvelles connaissances sur les structures du cerveau impliquées dans le maintien de la respiration pendant le sommeil, informations critiques à la compréhension du développement du syndrome d'Ondine et plus largement des pathologies respiratoires du sommeil comme les apnées obstructives.
Procédures
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire 2/ Le prèlèvement d'un morceau de queue de 2-3 mm et d'une durée de 3 secondes pour l'identification du statut génétique est réalisée avant quatre jours de vie (souriceau sans poils) 3/ vérification de la vitalité du souriceaux (durée : 1 min par souriceau) le jour de naissance toutes les deux heures sur 6h d'observations puis deux fois par jour. Aucune necessité de recourir à de l'anesthésie.
Impact sur les animaux
1/ angoisse à la séparation maternelle d'une heure pour les mesures respiratoires 2/ Douleur au prèlèvement de 2-3mm de queue pour l'identification du statut génétique 3/ détresse respiratoire liée à la mutation 4/ angoisse à la vérification de la vitalité du souriceau (1 min par souriceau) 3 fois en 6h (le jour de naissance et 2 fois par jour juqu'à P4. 5/Stress lié à la detresse respiratoire engendrée par mutation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Les souriceaux sont euthanasiés par décapitation à la fin de la procédure (4 jours de vie) ou en cas d'atteinte de point limite. S'il y a un besoin de prélèvement d'organes notamment du cerveau sur les souriceaux nouveau-nés, ça sera en postmortem.
Remplacement
Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. Cependant, les modèles génétiques murins sont disponibles pour élaborer et/ou affiner les stratégies thérapeutiques. Si les avancées obtenues par les recherches sur les cultures cellulaires permettent d'éclaircir les mécanismes et les conséquences de la mutation à l'échelle moléculaire et cellulaire, une validation sur des animaux en développement est nécessaire pour comprendre la maladie et les conséquences fonctionnelles sur un organisme entier. L’utilisation de l’animal ne peut alors être évitée.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle mortalité à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif sera réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. Pour les mesures, nous utilisons une technique non invasive (animal non anesthésié) et contrôlée (durée de la mesure, température constante dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure au maximum. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance réglementaire quotidienne des espaces d'hébergement et de toutes les cages.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pour l'étude du développement du cerveau humain. Plus largement, la souris génétiquement modifée contribue à la compréhension d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. C’est une maladie qui se manifeste dès la naissance. Nous avons des outils adaptés pouvant prendre en charge les modèles murins dès la naissance permettant ainsi de tester et d’évaluer des stratégies thérapeutiques. De plus, le recours aux modèles animaux en développement constitue une des recommandations de l'Agence Européenne du médicament pour évaluer les médicaments à visée pédiatrique. Les souriceaux sont étudiés dans la période juste avant et après leur naissance, jusqu'à leurs 4 premiers jours de vie.
Etude des cellules souches lors de la régénération des épithéliums glandulaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Vingt minutes de scanner et d'irradiation localisée sous contention et anesthésie, une injection de moins de dix secondes : 420 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leurs glandes. Le porteur qualifie l'irradiation d'indolore tout en signalant que les animaux peuvent développer de légères inflammations, et écrit qu'aucune nuisance n'a été décrite sur une période aussi courte tout en ayant établi une grille de score pour celles observées à plus long terme. L'objet du projet est fondamental, comprendre comment des cellules glandulaires retrouvent temporairement la capacité de se diversifier après une blessure. Plusieurs organes sont prélevés sur chaque animal, glande salivaire, lacrymale et prostate chez les mâles, glande lacrymale, salivaire et mammaire chez les femelles, la souris étant retenue parce que les vertébrés non mammifères n'ont pas de structures glandulaires comparables.
Objectifs
Certaines cellules adultes peuvent, dans des contextes particuliers, retrouver des caractéristiques qu’elles n’avaient plus depuis le stade embryonnaire. C’est ce qu’on observe notamment dans le développement de certains cancers. L’une de ces caractéristiques est la multipotence, c’est-à-dire la capacité d’une cellule à se transformer en plusieurs types de cellules différents. Nous nous intéressons à quatre types de tissus glandulaires : les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Chez l’adulte, ces tissus sont composés de cellules spécialisées qui ne produisent qu’un seul type cellulaire. Mais lors de la réparation d’un tissu endommagé, certaines cellules retrouvent temporairement cette capacité à se diversifier. Or, dans les cancers de ces tissus, les cellules tumorales semblent réactiver ce programme de manière incontrôlée. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces tissus se régénèrent après une blessure. En étudiant les mécanismes qui contrôlent le passage d’un état cellulaire flexible (multipotent) à un état plus stable et spécialisé, nous espérons identifier ce qui, lorsqu’il est déréglé, peut favoriser l’apparition ou la progression de tumeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’étudier le comportement des cellules souches et leur état de différentiation pendant la régénération tissulaire dans les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques chez la souris. Nos résultats aideront à identifier les mécanismes régulant le destin des cellules souches. Ces mécanismes étant déstabilisés lors de la formation de tumeurs, nous pensons qu’à long terme nos recherches contribueront à une meilleure compréhension du processus tumoral dans les tissus glandulaires étudiés.
Procédures
Une injection unique sera réalisée sur animaux vigiles (durée du geste inférieure à 10 secondes). Les animaux seront traités par un scanner et une irradiation localisée indolores, sous contention et anesthésie (durée totale traitement d’environ 20 min) et injecté par une injection unique (durée du geste inférieure à 10 secondes)
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la régénération chez les souris adultes, une irradiation est réalisée. A la suite de cette irradiation les animaux peuvent développer des légères inflammations (gêne de courte durée). Aucune des mutations induites sur une si courte période n’a de phénotype dommageable
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Au fil des années, beaucoup d'efforts ont été déployés pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de la régénération tissulaire. Cependant, les cellules épithéliales modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches glandulaires. De plus, les animaux seront essentiels pour suivre les cellules souches lors de la régénération tissulaire, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler le processus global de régénération. L’absence de structure similaire aux glandes étudiées dans des modèles de vertébrés non mammifères rend l’utilisation de la souris nécessaire à notre étude.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, des informations seront obtenues au niveau des organes, cellules et molécules à partir du même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques seront réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris avec le génotype souhaité. Pour chaque souris plusieurs organes seront collectés (chez les mâles : glande salivaire, lacrymale et prostate; chez les femelles : glande lacrymale, salivaire et mammaire). Le nombre d'animaux de notre étude est initialement fondé sur les données de la littérature.
Raffinement
Pour les procédures d’irradiation, un délai d’une semaine sera respecté entre la réception des souris par la plateforme d’irradiation et la mise en œuvre de la procédure. Ce délai d’acclimatation doit permettre aux souris de s’habituer à leur nouvel environnement et de limiter leur stress avant toute procédure. Les protocoles d’irradiations nécessitant une contention contraignante seront intégralement réalisés sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux seront analysés entre 1 et 7 jours après irradiation. Aucune nuisance liée à l’irradiation n’a été décrite dans une si courte période. Nous avons tout de même établi une grille de score comportant les nuisances les plus souvent observées à plus long terme après ce type d’irradiation. Les souris seront suivies quotidiennement pour détecter des signes de mal-être
Choix des espèces
L'organisation générale, le développement et le fonctionnement glandes étudiées ici sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la régénération. De la même manière, les évènements cancéreux survenant chez l’homme et chez la souris suivent les mêmes étapes dans les différentes glandes étudiées ; perte d’identité cellulaire, activation de traits embryonnaires, prolifération non contrôlée Les animaux utilisés pour l’étude de la régénération tissulaire seront âgés de 10 à 12 semaines. Les glandes de ces animaux sont alors constituées de progéniteurs unipotents qui réactivent la multipotence suite à l’irradiation
Etude de l’effet de traitements pharmacologiques sur le foie de souris ayant une maladie métabolique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Issues des mêmes croisements que les souris témoins, les souris mutantes de ce projet naissent avec un retard de croissance et une hypoglycémie inscrits dans leur génome. 621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. À 48 heures de vie, certains nouveau-nés reçoivent une toxine injectée dans l'estomac, tous subissent une coupe du bout de la queue pour génotypage, puis les juvéniles reçoivent gavages et injections intrapéritonéales chaque jour pendant quatorze jours, avec une coupure hebdomadaire de la queue pour mesurer la glycémie. Les adultes reproducteurs sont tués eux aussi, après les mois d'accouplement imposés pour obtenir les portées.
Objectifs
La malformation des voies biliaires est une maladie rare du foie (chez les nouveaux nés et les jeunes enfants). Son origine est à l'heure actuelle inconnue c'est pourquoi nous devons comprendre les mécanismes moléculaires impliqués afin de développer de nouvelles thérapies. Le but de ce projet est de tester des traitements pharmacologiques dans des souris génétiquement modifée et servant de modèle préclinique de la maladie.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de définir de nouvelles thérapies dans un modèle de maladie métabolique rare et sans réel traitement. De plus ces thérapies seront testées à différentes doses afin d’avoir une dose thérapeutique efficace transposable à l’Homme. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie avec l’utilisation de toxines en complément du facteur génétique pour le déclenchement de la maladie.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de sera prélevé pour le génotypage. Certains nouveaux nés recevront une toxine par injection (quelques secondes) dans l'estomac 48h après la naissance. Les animaux juvéniles auront des administrations de molécules par gavages et par injections intrapéritonéale (quelques secondes) répétées tous les jours pendant 14 jours. Pour mesurer la glycémie les animaux seront prélevés d'une goutte de sang drainée de la pointe de la queue une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Notre modèle de souris génétiquement modifiée présente un phénotype dommageable qui doit être pris en compte lors de l’élevage de ces souris. Notamment le retard de croissance, le poids en dessous de la norme à 5 semaines d'âge et une hypoglycémie pour les souris mutantes. Egalement l’extrémité de la queue des souriceaux sera coupée pour avoir une biopsie permettant le génotypage des animaux (douleur légère et de courte durée). Lors des procédures le gavage est un mode d’administration stressant et peut entraîner une douleur modérée. De même l’injection intrapéritonéale entraine une douleur légère et passagère. Certains nouveaux nés recevront une toxine par injection dans l'estomac 48h après la naissance qui entraine une douleur légère. La prise de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang à la base de la queue et nécessite donc une légère coupure entraînant une douleur légère.
Devenir
Les animaux qui recevront les injections et les gavages seront mis à mort à la fin de la procédure. Les animaux adultes des croisements seront mis à mort après les plusieurs mois d'accouplement nécessaires pour générer les souris utilisées dans les procédures.
Remplacement
Nous utilisons des cellules de foie issus de patients en parallèle de nos modèles de souris pour ce projet. Néanmoins les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études sur souris qui sont indispensables pour les essais précliniques pour évaluer la réponse thérapeutique aux traitements pharmacologiques.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les souris contrôles et mutantes proviennent des mêmes croisements. Nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour ces souris. Nous analyserons de multiples paramètres pour chaque souris. Sur la base de nos études précédentes nous estimons que 10-20 animaux par génotype et par conditions seront suffisants au niveau statistique pour les analyses. Afin de vérifier que nos résultats sont statistiquements significatifs nous utiliserons des tests adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour notre lignée à phénotype dommageable nous avons des points limites adaptés et spécifques. L’injection sera faite avec une aiguille adapté à la taille et au poids de l'animal. De plus en cas d'inflammation locale due à la répétition des injections les animaux recevront une crême anti-inflammatoire. Le gavage chez les animaux sera effectué avec des sondes adaptées à la taille de l’animal. Des aiguilles de taille adaptées seront utilisées lors des injections intragastrique. Pendant toutes nos procédures des points limites ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi du poids des souris deux fois par semaine et de leurs glycémies une fois par semaine en plus de suivi journalier des animaliers qui préviennent le responsable de projet lorsque qu’une souris présentes des symptômes de souffrance ou de perte de poids. Une perte de poids rapide ou une glycémie trop basse, si prolongées, conduiront à une mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation du métabolisme du foie entre l'humain et la souris. En particulier,le développement du foie et des canaux biliaires sont similaire entre les deux espèces. Les souris juvéniles (5-7 semaines) seront utilisées car c’est à cet âge que notre modèle de souris génétiquement modifiée à les symptômes les plus prononcés reproduisant la maladie humaine. Les traitements seront faits durant cette période afin d’évaluer les différentes thérapies. Les souris à 48h après la naissance seront utilisés pour la maturation du système biliaire et étudier l’effet de toxines dans notre modèle génétique.
Cryo-préservation, redérivation et reproduction assistée pour un archivage et une gestion sanitaire de lignées murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 545
Injectées deux fois à deux jours d'intervalle pour provoquer une superovulation, des femelles sont tuées à la fin de la procédure. D'autres souris sont stérilisées par une chirurgie de vingt minutes, les mâles vasectomisés étant ensuite isolés puis accouplés chaque semaine aux futures mères porteuses. 8 960 souris et 545 rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 6 300 d'entre eux et modéré pour 3 205. Le service revendique un "changement de paradigme" au bénéfice des animaux non-humains grâce à la congélation des gamètes, et prévoit de tuer les mâles vasectomisés et les femelles stérilisées "lorsque trop âgés pour assurer la fonction".
Objectifs
Les prestations de reproduction contrôlée et cryoconservation (congélation de semence ou d’embryons) offrent aux unités de recherches un soutien dans la gestion de leurs projets de productions expérimentales. Elles permettent d’intégrer les étapes inhérentes à l’introduction des lignées dans le plan de production global du projet. Le service répond aux besoins des projets des équipes de recherches concernant les méthodes d’archivage (stockage de semence/gamètes) et de reproduction assistée (FIV : Fécondation in Vitro) de lignées murines (souris & rat). Il réalise des importations & exportations de lignées vivantes ou congelées (semence). Les missions sont : -Prise en charge systématique des lignées murines arrivant dans les animaleries du site universitaire pour protéger leur patrimoine génétique originel et garantir un environnement sanitaire général de qualité nécessaire au bon déroulé des projets de recherche. –Congeler le sperme ou les embryons de l’ensemble des lignées murines de la communauté scientifique afin d’assurer un archivage sécurisé et remplacer des animaux par des produits congelés lors des imports/exports. Limiter l’élevage aux lignées impliquées dans des projets de recherche les autres étant en stock congelé. -Proposer la FIV comme technique de reproduction assistée ou la décongélation d’embryons préalablement stockés en masse pour produire des lots expérimentaux. -Remplacer des rafraichissements génétiques par croisement naturel par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération antérieure qui seront réveillés lorsque nécessaire. Ces missions s’inscrivent dans la réduction du nombre d’animaux utilisés et présents.
Bénéfices attendus
Par l’ensemble de ces techniques nous assurons un changement de paradigme dans la gestion de la production animale au bénéfice de tous ; : chercheurs, hébergeurs/producteurs et surtout animaux. Celles-ci permettent d’appliquer pleinement les 3Rs à différents niveaux de la gestion de colonies et surtout réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques.
Procédures
1/Superovulation : Douleur légère & stress lors des injections. durée deux fois 30 secondes.2/ Males vasectomisés : Douleur légère ou modérée lors de la chirurgie. Une seule fois, durée 20 minutes de chirurgie. Pas d’effet à long terme. 3/Mères porteuses & femelles stérilisée : Douleur légère ou modérée lors de la chirurgie. Pas d’effet à long terme.Une seule fois, Durée de la chirurgie 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les actions de contention lors des injections (hormones, anesthésie, analgésie) génèrent du stress. Nous effectuons pour les superovulations, deux contentions à deux jours d’intervalles. Pour la chirurgie deux contentions à l’initiation du protocole (anesthésie, analgésie) Les conséquences des chirurgies : sutures, cicatrisations génèrent un inconfort limité, une douleur légère. Les mâles vasectomisés sont isolés et accouplés aux futures mères porteuses chaque semaine. Les souris étant des animaux grégaires, leur isolement génère du stress. En période de non-activité de plus d’une semaine, une femelle de compagnie est ajoutée dans la cage du mâle isolé.
Devenir
Superovulation : mise à mort à la fin de la procédure. Mâles vasectomisés : mise à mort lorsque trop âgés pour assurer la fonction Mères porteuses : mise à mort à la fin de la procédure Femelles stérilisée : mise à mort lorsque trop âgée pour assurer la fonction
Remplacement
La congélation d’ovocyte permet de remplacer des femelles superovulées par des lots d’ovocytes pour les FIV. Ajustement plus précis entre besoin et consommation. Les différentes congélations de gamètes (sperme –ovocytes-embryons ) permettent de réduire le nombre de lignées respirantes en congelant les lignées non utilisées, tout en ayant la possibilité de la réveiller ou d’assurer une fécondation via la FIV. Congélation/décongélation : Remplacer des étapes de production et de croisements par des FIV ou des décongélations. Réduire les étapes de rafraichissements génétiques par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération plus faible.Remplacer des producteurs par des paillettes de spermes/embryons : Congeler des lots d’embryons et les réveiller par petite quantité pour répondre a des besoins précis. Exemple une femelle gestante issue de la réimplantation d’embryons congelés pour disposer tous les 2mois de petits sans avoir de colonie respirante. Produire une cohorte par an par décongélation ou FIV /réimplantation massive sans avoir de colonie respirante.
Réduction
Archivage : Les différentes congélations de semences (sperme –ovocytes) permettent de réduire le nombre de lignées respirantes en congelant les lignées non utilisées, tout en ayant la possibilité de la réveiller ou d’assurer une fécondation via la FIV. Congélation/décongélation : Réduire les étapes de rafraichissements génétiques par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération plus faible. FIV : Réduire le nombre de mâles en fécondant massivement via des paillettes. Amplifier rapidement en utilisant peu d’animaux Superovulation : réduire le nombre de femelles donneuses d’ovocytes en superovulant. Synchronisation . Le cheptel de femelles nécessaire est ainsi réduit de 30 à 40%. Idem pour les mâles vasectomisés car il faut moins de couples pour avoir autant de femelles porteuses. Stérilisation des femelles de disposer de femelles compagne pour mâles isolés, permet de valoriser ces femelles plutôt que de les mettre à mort .
Raffinement
L’utilisation d’aiguilles 30G : permet de limiter la douleur lors des injections. Congélation d’ovocytes Lorsque la production commune destinée à l’ensemble des usagés produit un excédent de femelles mais qu’aucune FIV n’est programmée à la même période, nous pouvons superovuler les femelles et congeler les ovocytes. Lors d’un besoin pour FIV ces stocks serviront à affiner les quantités ou remplacer une superovulation. FIV : Une paillette de sperme permet de féconder plusieurs lignées d’ovocytes en même temps, ceci accélère et synchronise les croisements. Un sperme d’animal homozygote permet d’accroitre les rendements
Choix des espèces
Nous avons développé nos compétences sur les deux modèles animaux expérimentaux présents dans nos structures de productions et d’expérimentations. Ils sont les plus Les équipes de recherche pour lesquelles nous avons développé ce service travaillent sur les espèces rat et souris. Nous avons donc développé nos compétences sur les deux modèles animaux expérimentaux présents dans nos structures de productions et d’expérimentations. Elles sont les plus fréquemment utilisées en recherche animale et pour lesquels les techniques de manipulation et congélation des gamètes sont les plus abouties. La vasectomie s’effectue à l’âge de 6 semaines. Après 3 semaines de récupération post opératoire les mâles sont mis en accouplement pour confirmer la stérilité pour être utilisé jusqu’à environ l’âge de 26 semaines – 6 mois. Réimplantation –transfert d’embryons : Les mères porteuses sont utilisées dès l’âge adulte (8 semaines), jusqu’à l’âge de 3 mois (15 semaines) période qui est optimale entre 8 et 12 semaines d’âges Superovulation : Les femelles doivent de préférence être pré-pubères pour que l’effet de contrôle du cycle hormonal soit optimum. Selon les fonds génétiques cela se situe entre 4 et 6 semaines d’âge. Mais la stimulation d’adulte est envisageable en cas de nécessité.
Effet de la température sur la spermatogenèse du médaka et transmission multigénérationnelle – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Cinq semaines à 32 °C pendant tout un cycle de spermatogenèse : 903 médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles sont anesthésiés, sortis de l'eau et pressés sur le ventre pour recueillir un à deux microlitres de sperme, opération répétée sur plusieurs générations. Les poissons exposés à la chaleur et leurs descendants sont tous tués, et parmi les témoins 214 seulement pourront être réutilisés, les autres étant tués pour prélever leurs testicules. Le médaka est retenu pour son court temps de génération et parce que son spermatozoïde à histones le rapproche des modèles mammifères, l'objectif étant de savoir si la chaleur modifie ce que le père transmet à sa descendance.
Objectifs
Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites «méthyle » (groupements CH3), constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. On appelle méthylome l'ensemble des groupes méthyle pour une cellule ou pour un tissu donné. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Dans un contexte de réchauffement climatique, ces résultats soulignent la nécessité de tester comment des variations épigénétiques du spermatozoïde induites par une augmentations de température peuvent impacter les performances des descendants de première (F1), voire puis seconde (F2) génération. L'objectif de ce projet est donc d'aborder le rôle de la méthylation de l'ADN dans la transmission paternelle inter et transgénérationnelle des effets de température chez le poisson. Pour ce type d'étude, l'espèce modèle médaka (Oryzias latipes) est parfaitement adaptée, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Notre première hypothèse de travail : le méthylome de l'ADN du sperme de médaka est sensible à la température d'élevage au cours de de la spermatogenèse. La deuxième hypothèse : le méthylome de l'ADN du sperme contribue au développement embryonnaire et adulte et module les phénotypes. La troisième hypothèse : les altérations du méthylome de l'ADN sont transmises de génération en génération à travers la ligné germinale mâle et persistent même lorsque les individus ne sont plus exposés à la température élevée.
Bénéfices attendus
Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaître les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.
Procédures
Les interventions prévues sont des prélèvements de sperme. Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela,après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 µL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Pour cette procédure, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.
Impact sur les animaux
Une première expérience a permis de déterminer la température et la durée d’exposition. La température d’exposition à 32°C pendant 5 semaines a été validée : les poissons médaka élevés à 32°C pendant un cycle de spermatogénèse présentent une forte diminution de la motilité des spermatozoïdes, mais néanmoins, les mâles testés étaient toujours capables de féconder des œufs et de produire une progéniture, (embryons éclos). D'après la littérature et nos premières observations, l'exposition à 32 °C pendant 5 semaines pendant la spermatogenèse ne produit pas de phénotype dommageable chez la descendance. De plus, aucun comportement de type pathologique n'a été observé après exposition à 32°C lors de notre expérience précédente. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergétique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.
Devenir
Les animaux élevés à 32°C et leurs descendants ne pourront être réutilisés. En effet nous suspectons que ce dispositif expérimental affecte un certain nombre de paramètres biologiques, dont l'épigénétique des poissons. Ils seront euthanasiés. Parmis les animaux contrôles ou issus de contrôles (élevés à 25°C), certains devront être euthanasiés afin de prélever leurs testicules pour des analayses moléculaires ou cellulaires. En revanche, 214 animaux contrôles ou issus de contrôles (élevés à 25°C) pourront être réutilisés après avoir participé au test de fécondance ou à la génération suivante (procédure ne nécessitant pas de prélèvement).
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus. En outre, nous organisons l'emploi des animaux et les méthodes de manière à réutiliser les animaux pour plusieurs approches : les femelles utilisées pour les tests de motilité du sperme seront également utilisées pour la génération des F1, les mâles analysés en motilité du sperme permettront également de réaliser les analyses moléculaires (méthylation ADN et transcriptomique), et les mâles étudiés au niveau histologique seront également testés pour la qualité mitochondriale de leur sperme.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’oeufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (moins de deux minutes par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).
Choix des espèces
Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 4.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois).
Étude de l’activation des mastocytes sur l’activité sécrétrice des plexus choroïdes et sur le développement de la fonction du cerveau
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
4 003 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certaines femelles gestantes subissant une laparotomie de quarante-cinq minutes suivie d'injections toutes les douze heures pendant deux jours en cas de douleur. Des nouveau-nés sont injectés directement dans le cerveau. Les souris menées jusqu'à l'âge adulte passent trois tests cognitifs de vingt minutes sur une à trois semaines, avant une chirurgie terminale sans réveil par perfusion, l'objet étant de savoir comment une réaction allergique induite après la naissance modifie les plexus choroïdes et le développement du cerveau. Le porteur justifie les effectifs par des groupes de cinq à sept animaux répétés en triplicat sur cinq stades de développement, sans détailler comment on parvient à 4 003 animaux.
Objectifs
Le cerveau a longtemps été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, notamment par les cellules immunitaires. Parallèlement, certaines barrières du cerveau ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes.
Bénéfices attendus
Cette analyse permettra de mieux comprendre comment la mise en place physiologique du système immunitaire après la naissance façonne le développement de la fonction cérébrale via les cellules étudiées. Plus particulièrement, le but de notre projet est d’identifier comment une réaction inflammatoire de type allergique au cours du développement post-natal, modifie la physiologie des cellules étudiées, altère la composition de certains tissus et entraîne l’apparition de maladies neurodéveloppementales. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que sont les cellules étudiées et qui reste encore très peu étudiée, particulièrement au cours du développement après la naissance. Cette analyse permettra d’identifier les facteurs produits par les cellules étudiées et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité cérébrale au cours d’une réponse de type allergique et favoriser à terme la mise au point d’immunothérapie permettant de mieux lutter contre les maladies neurodéveloppementales.
Procédures
Une injection (quelques secondes) sera réalisée aux souris 16h avant une autre injection (quelques secondes). Une laparotomie sur femelles gestantes (environ 45 min de chirurgie) sera réalisée sous. A leur réveil, de nouvelles injections seront réalisées 6h après l’intervention puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. 1 à 3 injections de quelques secondes seront réalisées en l’espace de 24h. Sur certains des animaux une injection supplémentaire de quelques secondes aura été réalisée 6 jours auparavant. Les animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte seront testés pour leur capacité cognitive (30min-1h/jour). Trois tests de 20min chacun seront réalisés, à raison d’un test maximum/jour sur une période d’1 à 3 semaines. A la fin de la procédure, dans les heures suivants la dernière injection ou plusieurs semaines plus tard, la procédure s’achèvera par une dernière injection. Des injections dans le cerveaux des nouveaux nés seront réalsiées. Une chirurgie terminale sans réveil sera réalisée (perfusion).
Impact sur les animaux
Les injections en elles-mêmes pourront causer un peu de stress aux animaux mais peu ou pas de douleur. L’induction d’une inflammation de type allergique par les molécules injectées pourront augmenter le niveau d’anxiété des animaux dans la première demi-heure après injection ainsi qu’une légère hypothermie avant de revenir à la normale au bout d’une heure. Les chirurgies pourront s’accompagner d’une douleur légère à modérée pendant 4 à 5 jours, d’un inconfort et d’une légère augmentation du stress des animaux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par à la fin de chaque procédure soit pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition, soit car les effets de la procédure que les animaux ont subie pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable/confondre les résultats de toute étude ultérieure.
Remplacement
Notre but est d’étudier comment certaines cellules agissent sur le développement du cerveau après la naissance. Le recours à l’animal est nécessaire car il n’existe aucun système in vitro qui puisse reproduire la complexité cellulaire de l’interface barrière du cerveau que nous étudions : les cellules étudiées sont en effet composées de plusieurs types cellulaires et tissus en intéraction. De plus, la fonction sécrétrice de l’épithélium des cellules étudiées est modulée par l’activation des cellules que nous cherchons à étudier varie avec l’âge et la réponse immunitaire locale et périphérique, et est spécifique de la première semaine après la naissance et ne peut être reproduites et étudiée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu dans ce projet se base sur notre précédente expérience et des tests statistiques. Un des tissus étudiés est très petit et ne peut être utilisé que pour une seule analyse à la fois. Les analyses de la composition d’autres tissus et zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les même animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (animaux maintenus jusqu’à l’âge adulte). Nous prévoyons pour chaque groupe de souris nouveau-nées 5 animaux par analyse, et 7 animaux adultes pour les tests de comportement, mâles et femelles. Des tripliquas d’expérience seront réalisés, à l’exception de certaines analyses pour lesquelles nous avons observé que 5 animaux par groupe permettaient l’acquisition de résultats significativement solides. Certaines études seront réalisées en comparant 5 stades de développement (5 variables). Les effectifs proposés (5x3 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet forte à très forte. L’étude de certains effets sur l’activité du cerveau sera réalisée selon les cas en comparant 2 variables (5x3 individus par groupe seront néecessaires) ; en comparant 4 variables et 6 variables (5x3 individus par groupe nouveaux nés ou 7x3 individus par groupe adulte seront nécessaires).
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Des points limites spécifiques et précoces sont appliqués pour chaque protocole, pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, et nous rechercherons à minimiser la douleur par injection d’antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives car de nombreuses lignées sont disponibles et est génétiquement modifiable. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproduction facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le nombre des cellules étudiées évoluant après la naissance, nous étudierons leur phénotype à différentes périodes du développement post-natal, de la naissance à l’âge du sevrage : P0/P1, P6, P10, P15 et P21. Le phénotype induit par nos expériences n’est analysable qu’au minimum 6-7 jours après injection. Afin d’étudier l’effet sur le développement du cerveau, nous injecterons des souris embryonnaires au stade E14-15 afin d’en étudier les effets chez les souris âgées de 0 à 2 jours, puis chez l’adulte enfin d’en étudier les effets à long terme sur la fonction cognitive.
Etude du développement et de la plasticité de l’unité gliovasculaire (1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Une chirurgie d'amincissement du crâne ouvre la voie à l'imagerie du cerveau au microscope biphotonique à travers l'os, pendant quatre-vingt-dix à cent quatre-vingts minutes. 984 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Il s'agit de suivre les contacts entre astrocytes et vaisseaux sanguins corticaux à cinq stades, de 7 à 60 jours après la naissance, une des lignées présentant un retard de développement pouvant aller jusqu'à des calcifications cérébrales et des troubles moteurs. Le RNT chiffre à 864 les souriceaux d'un ou quatre jours recevant une injection sous-cutanée et à 864 les souris subissant l'amincissement du crâne, pour un effectif total déclaré de 984.
Objectifs
Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiels à la physiologie cérébrale et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent notamment avec les vaisseaux sanguins où ils participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Ils forment ainsi avec les vaisseaux l’unité gliovasculaire (UGV), qui est perturbée dans l’ensemble des maladies touchant le cerveau. Parmi les déficits actuels en santé publique, les pathologies liées au développement du cerveau et à l’établissement de ses capacités plastiques, comme les troubles du spectre autistiques, les maladies neurodéveloppementales ou psychiatriques, ont une place importante. Cependant les étiologies de ces maladies sont encore largement méconnues. En particulier, un possible rôle des astrocytes reste à démontrer. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur les dynamiques de l’unité gliovasculaire au cours de la vie et les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire cérébral. Cette étude permettra de caractériser les mécanismes de plasticité des contacts astrocytaires sur les vaisseaux sanguins corticaux dans de multiples conditions de développement physiologiques et pathologiques à l’aide d’analyses histologiques et d’enregistrements dynamiques en temps réel par vidéomicroscopie. Cela permettra une meilleure compréhension des dynamiques de l’unité gliovasculaire et du rôle des astrocytes au cours de la vie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Cette étude nécessite l’utilisation de 984animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les dynamiques et les fonctions de l’unité gliovasculaire, dont les défauts sont un facteur important des pathologies neurodéveloppementales et neuropsychiatriques.
Procédures
2 types d’interventions sont prévues dans ce projet : 1. Injection en stade périnatal : un réactif est injecté en voie sous-cutanée chez des souriceaux nouveau-nés de 1 ou 4 jours. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois. Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est effectuée dans l'EU1.Nombre d’animaux concernés : 864 (durée : 1min). 2. Procédure d’amincissement du crâne et imagerie in vivo au microscope biphotonique : Les souris subiront une intervention chirurgicale d’amincissement du crâne pour permettre l’enregistrement du signal fluorescent par microscopie biphotonique à travers l’os. L’intégralité de la procédure est faite sous anesthésie et analgésie. Elle est effectuée dans l'EU2. Nombre d’animaux concernés : 864. (durée : 90 à 180 min).
Impact sur les animaux
Une des lignées de souris présente des caractéristiques dommageables pouvant entrainer des nuisances, notamment un léger retard de développement pouvant aboutir sur des altérations du système visuel et cardiovasculaire ainsi que l’apparition de calcifications cérébrales pouvant engendrer des problèmes moteurs chez certains individus. Certains lots de souris subiront des interventions chirurgicales qui peuvent entrainer des effets modérés (douleurs post-opératoires) qui seront minorées par l'administration d'analgésiques.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après chaque procédure afin de récupérer leur cerveaux pour faire les analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants . Dans le cas des pups remis en cage avec leur mère, les manipulations des animaux seront limitées autant que possible afin d’éviter leur rejet par la mère. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).
Choix des espèces
La souris partage 98% de son génome et permet ainsi dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus cette espèce de petite taille présente une courte durée de gestation et génère un grand nombre de petits dans ses portées, ce qui en fait un modèle mammifère idéal. Les différentes étapes du développement cérébral et sa plasticité chez la souris étant bien décrites et similaires à l’humain, ce modèle est approprié à la recherche neurodéveloppementale. Les animaux seront utilisés à 5 stades développementaux postnataux : 7, 15, 21, 30 et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moment clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.
Impact de modifications du micro-environnement sur le développement de l’embryon pré-implantatoire de lapin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Six injections d'hormones espacées de douze heures, dont une dans la veine de l'oreille sous contention, sont administrées à chaque lapine pour déclencher une superovulation. 547 lapines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Leur mise à mort sert à récupérer ovocytes et embryons, le porteur indiquant qu'aucun prélèvement in vivo n'est possible assez vite chez cette espèce pour préserver le développement embryonnaire. Il décrit une douleur temporaire possible au moment des piqûres et une stimulation ovarienne, puis affirme que les soigneurs n'ont jamais observé de signe de douleur ou d'inconfort chez les lapines suivant ce traitement.
Objectifs
L’environnement dans lequel se développe un embryon, même dès les tout premiers jours après la fécondation, peut avoir des effets durables sur sa santé une fois adulte. C’est ce que l’on appelle les origines développementales de la santé et des maladies (DOHaD). Par exemple, si une future mère ne mange pas assez ou suit un régime déséquilibré au tout début de la grossesse, cela peut entraîner des problèmes de santé chez l’enfant, notamment au niveau du cœur et du métabolisme. Aujourd’hui, on utilise de plus en plus des techniques de laboratoire pour concevoir des embryons, que ce soit chez l’humain pour aider à la procréation ou chez les animaux pour améliorer certaines espèces. Mais ces embryons sont souvent cultivés dans des conditions de laboratoire (en termes de nutriments, d’oxygène, de température, etc.). Seuls les embryons capables de s’adapter à ces conditions survivent, ce qui pourrait influencer leur développement à long terme. On connaît encore mal les mécanismes biologiques derrière cette capacité d’adaptation et ses conséquences futures. Pour mieux comprendre ces phénomènes, les chercheurs utilisent des modèles animaux. Le lapin est particulièrement intéressant car son développement embryonnaire ressemble beaucoup à celui de l’humain. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment les conditions de culture en laboratoire influencent le développement de l’embryon, et à identifier les méthodes les plus adaptées pour limiter les effets négatifs.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre comment les conditions de laboratoire (in vitro) influencent le développement des embryons tout au début de leur vie, avant même qu’ils ne s’implantent dans l’utérus. Pour cela, les chercheurs utilisent le lapin, car son développement est proche de celui de l’humain, ce qui permet d’en tirer des conclusions utiles pour la santé humaine. À court terme, l’objectif est d’améliorer les conditions dans lesquelles les embryons sont cultivés en laboratoire, pour garantir la bonne santé des bébés qui naîtront grâce à ces techniques. À moyen terme, les chercheurs veulent créer des modèles d’embryons simplifiés (appelés "embryoïdes") ou des cellules spécifiques pour mieux étudier le développement, tout en limitant l’utilisation d’animaux dans la recherche. À long terme, l’objectif est de mieux comprendre comment les changements dans l’environnement de la mère (comme un régime trop gras, trop sucré, ou exposé à des substances nocives) peuvent influencer le développement de l’embryon. En modifiant la composition du milieu dans lequel l’embryon est cultivé en laboratoire, les chercheurs peuvent simuler l’effet de ces régimes ou de ces expositions, et observer les conséquences. Cela permettra de mieux accompagner les femmes avant et pendant la grossesse pour favoriser la santé de leurs futurs enfants.
Procédures
Chaque lapine sera soumise à 6 injections (une injection toutes les 12h, sur animal vigile). Chacune des 5 injections sous-cutanées prend 1 à 2 seconde, ce qui correspond à une mobilisation de l’animal au total d’une trentaine de secondes (préhension, contention, injection, réconfort et repose dans la cage). La mobilisation de l’animal pour l’injection intraveineuse dure de l’ordre de 2-3 minutes pour permettre le placement dans la boîte de contention et l’injection dans la veine marginale de l’oreille (3 à 5 secondes d’injection).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce protocole, les lapines subissent quelques changements pour favoriser la production d’ovules. Une semaine avant le début du traitement, on modifie la durée de lumière qu’elles reçoivent chaque jour, ce qui peut provoquer un léger stress. Ensuite, elles reçoivent plusieurs injections d’hormones pour stimuler l’ovulation. Ces injections peuvent entraîner un léger stress lié à la manipulation des animaux, mais les lapines sont habituées à être manipulées régulièrement dans leur élevage. Il peut aussi y avoir une légère douleur temporaire au moment des piqûres ou à cause de la stimulation des ovaires. Toutefois, les soigneurs n’ont jamais observé de signes de douleur ou d’inconfort chez les lapines suivant ce traitement.
Devenir
Après la procédure de superovulation, les femelles sont mises à mort pour collecter les ovocytes ou les embryons. Aucune récupération d’embryons n’est possible chez cette espèce in vivo, sans prélèvement et lavage des voies génitales aussi rapide qu’après une euthanasie. Cette rapidité d’exécution est nécessaire pour éviter des effets délétères sur le développement embryonnaire
Remplacement
Pour étudier l’impact de l’environnement sur le développement de l’embryon, le recours aux animaux pour obtenir des embryons ou des ovocytes est obligatoire. A l’heure actuelle, aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit la complexité du développement embryonnaire. Nous sommes très attentifs aux éventuels développements de nouvelles technologies qui permettraient de remplacer en partie l’utilisation de l’embryon de lapin.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé : nous développons une stratégie in vitro pour étudier l’impact de l’environnement ; les lapines sont super-ovulées afin d’augmenter le nombre d’embryons récoltés par lapine. Le nombre de lapines impliquées dans ce projet est réduit au maximum, tout en restant compatible avec l’utilisation des tests statistiques non paramétriques permettant une exploitation rigoureuse de nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention par l’homme. Les lapines utilisées dans ce protocole sont habituées à être placées dans une boîte de contention afin d’éviter tout stress lors des injections nécessitant l’usage de cette boîte (injections intraveineuses). Les injections sous-cutanées sont réalisées par une simple contention manuelle rapide sans recours à la boîte de contention pour éviter un stress inutile à l’animal. L’eau est disponible à volonté, la nourriture est fournie sous forme de rations quotidiennes de granulés, et les paramètres ambiants sont contrôlés en permanence (température, humidité…). Les lapins sont logés en cages individuelles (conformes en tous points aux normes imposées par la Directive Européenne de 2010 / Décret de 2013), sans contrainte et selon les conditions en vigueur dans l'élevage. Les contacts sociaux (visuels, auditifs et olfactifs) obtenus par l'hébergement des différents animaux dans des cages adjacentes participent à l'enrichissement. Un enrichissement de leur milieu est mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux, par l'apport d'objets (balles, chaînettes, mezzanines, jouets en polypropylène) dans l'environnement et éventuellement un enrichissement alimentaire par apport de faibles quantités de foin stérilisé et de blocs à ronger.
Choix des espèces
Le développement de l’embryon précoce de lapin présente de nombreuses similitudes avec celui de l’Homme (comme la vitesse de développement ou la dépendance aux nutriments). Le lapin apparaît ainsi comme un modèle de choix de l’Humain pour étudier les effets de l’environnement sur le développement embryonnaire. Les lapines adultes seront utilisées à maturité sexuelle entre 6 et 24 mois.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Wistar.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Une injection sous-cutanée par jour, du jour précédant l'accouplement jusqu'à la mise bas ou la mise à mort. 924 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, la seule nuisance retenue par le porteur étant une inflammation locale au point d'injection. Les mères sont anesthésiées puis disloquées, les embryons refroidis sur glace puis décapités entre les stades E14,5 et E20,5, pour prélever cœur, placenta, aorte, reins, poumons, foie et sang. L'hypothèse testée, un lien entre une modification des protéines et l'hypertrophie cardiaque des nouveau-nés de mères diabétiques, reste au conditionnel dans le texte, quand la mise à mort de 924 rats et de leurs portées est, elle, programmée.
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle protéique qui est augmentée lors de stress métabolique chronique, type diabète (hyperglycémie). Elle a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiaque. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication d’une modification des protéines dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse, en lien avec l’altération de la vascularisation placentaire. (2) Identifier les mécanismes impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par une augmentation de la modification des protéines.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
1 jour avant l’accouplement et jusqu’au euthanasie ou la mise bas les animaux recevront une fois par jour, une injection sous cutanée afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation. A la fin de cette période, les embryons sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, placenta, aorte, rein, poumons, foie, sang).
Impact sur les animaux
L’injection sous cutanée peut être à l’origine d’une inflammation localisée, qualifiée de nuisance légère.
Devenir
A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie des embryons, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les développements cardiaque et placentaire sont des processus complexes et intégrés faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque et placentaire par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 924 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques type ANOVA 1 voie seront réalisés après avoir fait une analyse d’égalité des variances.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements (y compris après l’accouplement) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Une semaine d’acclimatation sera alors réalisée. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement, pour les males et par deux pour les femelles dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Pour les mâles servant à la reproduction, ils seront hébergés par 2 à la réception jusqu’à la reproduction. Post accouplement, les rats seront hébergés individuellement. Lors du sacrifice des animaux (sacrifice des mères), une couverture anesthésique sera mise en place, puis l’animal sera disloqué. Les embryons de E14.5 à E20,5 seront anesthésiés sur glace puis euthanasiés par décapitation et prélevés. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recours et qui les maîtrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque et placentaire, différents stades de développement embryonnaires sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire de E5,5 à E20,5, permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et placentaire.
Étude de l’impact d’un activateur de la kinase HRI dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une ischémie cérébrale est provoquée par occlusion d'une artère, suivie d'une thrombolyse vingt minutes plus tard, puis d'un traitement à une heure et à vingt-quatre heures. 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par exsanguination au quinzième jour pour prélever leurs tissus. Le projet teste un composé synthétique, le BTdCPU, sur un deuxième modèle d'accident vasculaire cérébral après des résultats obtenus sur un premier. Le porteur classe en sévères les douleurs postopératoires et les déficits fonctionnels ou cognitifs, et écrit par ailleurs que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et ne présentent aucun "syndrome du comportement malade".
Objectifs
L'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique, résultant de l'occlusion d'un vaisseau cérébral, prive les neurones d'oxygène et de nutriments, induisant un stress majeur du réticulum endoplasmique (RE). Face à ce stress, les cellules neuronales activent des mécanismes de survie, notamment en ajustant la façon dont elles fabriquent les protéines. Une molécule essentielle à la fabrication des protéines est modifiée, ce qui ralentit la production générale de protéines. Ce ralentissement permet à la cellule d'économiser son énergie. Cette modification est un mécanisme clé de régulation de la production de protéines en cas de stress. Elle ralentit la fabrication globale de protéines, permettant à la cellule d'économiser de l'énergie pour survivre dans des conditions difficiles. Plusieurs enzymes peuvent provoquer cette modification en réponse à différents types de stress. L'une de ces enzymes, qui est habituellement liée à un manque de fer, montre une implication croissante dans la physiopathologie neuronale et potentiellement dans la réponse au stress ischémique cérébral. Elle représenterait donc un moyen supplémentaire de réguler la fabrication des protéines. Dans ce contexte, le BTdCPU est un composé synthétique, principalement utilisé en recherche pour son action activatrice sur cette enzyme particulière, notamment dans des études précliniques métaboliques et cancérologiques. Des expériences préliminaires sur neurones montrent que de petites quantités de BTdCPU améliorent la survie des cellules après un manque d'oxygène. Chez des souris ayant eu un AVC, l'administration de BTdCPU a réduit la taille des lésions et amélioré leurs fonctions motrices. Ces résultats prometteurs ouvrent la voie à une étude plus approfondie du rôle de cette enzyme dans d'autres modèles d'AVC chez les souris. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact du BTdCPU, seul ou combiné à l'Altéplase, sur les lésions, l'inflammation et la récupération fonctionnelle dans un modèle murin d'AVC ischémique thromboembolique. Tester ce traitement sur un autre modèle animal d'AVC permettrait de confirmer son potentiel thérapeutique après un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en Plaques (SEP) et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de l’efficacité et du mécanisme d’action de notre candidat nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement à 1 heure et 24 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50 minutes). J0+6 heures : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique moléculaire (durée : 30 minutes). J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle (durée : 10 minutes/session). J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5 minutes/session). J+15 : Exsanguination par perfusion intracardiaque (n=80).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de la procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « syndrome du comportement malade ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de Sclérose en Plaques (SEP) et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.