Biologie du développement

5 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever dans leur sang des anticorps destinés à la recherche. Chacun reçoit huit injections d'antigène réparties sur cinq mois et subit dix-sept prélèvements sanguins à l'oreille entre le deuxième et le cinquième mois, sur animal vigile. Le porteur qualifie ces anticorps d'outils "indispensables" pour étudier la maturation des ovocytes de xénope, et indique vouloir tester leur production par culture cellulaire. Deux lapins sont proposés à l'adoption après évaluation de leur état, les autres sont tués si la procédure a altéré leur état général.

Objectifs

Notre laboratoire étudie les mécanismes moléculaires régulant les deux divisions cellulaires qui définissent la maturation des ovocytes de xénope. Nous nous intéressons en particulier aux protéines qui contrôlent le bon déroulement de la méiose et à leurs modifications. Pour une étude en profondeur de ces mécanismes, des outils comme des anticorps spécifiques de ces régulateurs sont indispensables. Notre modèle d’étude est tel que nous ne disposons pas dans le commerce d’une large gamme d’anticorps spécifiques de protéines en général et de nos protéines d’intérêt en particulier. Ce projet se déroulera sur 5 ans et nous permettra d’obtenir des anticorps dirigés contre les régulateurs protéiques de la méiose. L’objectif in fine sera de répondre aux questions qui restent en suspens sur le déroulement de la méiose avec des outils biologiques adaptés.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes gouvernant la maturation des ovocytes est un enjeu majeur de la recherche fondamentale. De plus, le modèle de xénope palie l’absence de connaissances quasi totales en recherche sur nos thématiques à partir d’ovocyte humain. Les résultats obtenus grâce à ces outils-anticorps devraient permettre à court terme d’avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces acteurs protéiques, des voies de signalisation qu’ils contrôlent et des régulations qui en résultent. A plus long terme, ils pourraient contribuer au développement de connaissances des mécanismes qui régissent la maturation des ovocytes humains.

Procédures

Le projet comporte deux interventions permettant l’obtention d’anticorps présents dans le sang de l’animal. Ces interventions se dérouleront sur animaux vigiles qui pourront recevoir un analgésique. Il y a l’administration de l’antigène qui compte 8 injections réparties sur 5 mois. La seconde intervention consiste en des prélèvements sanguins qui seront au nombre de 17 répartis du 2ème au 5ème mois de procédure. La phase d'administration de l'antigène dure environ 10 minutes (immobilisation de l'individu, injection de l'antigène et soin). La phase de prélèvement s'effectue aussi en 10 minutes (immobilisation de l'individu, prélèvement sanguin et soin).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour injection d'antigènes peuvent être la peur et le stress. Il peut aussi exister une douleur au point d'injection qui peut persister si une infection survenait. En ce qui concerne le prélèvement sanguin à l'oreille, il peut y avoir une légère douleur au point de prélèvement et un stress si l'animal a eu mal lors des prélèvement précédents.

Devenir

Les lapins hébergés dans l'animalerie et ayant suivi un protocole expérimental seront soit mis à mort si leur état général s'avère altéré par la procédure expérimentale soit proposé à l'adoption. Dans ce dernier cas, l'analyse des paramètres comportementaux et biologiques seront effectués pour connaitre l'état de santé de l'individu avant l'adoption.

Remplacement

Les anticorps polyclonaux obtenus après injection d’un antigène sont des outils indispensables pour effectuer notre recherche et pour répondre aux questions que nous nous posons et pour lesquelles nous avons obtenu un financement. En travaillant sur le modèle des ovocytes de xénope, il n’existe que très peu d’anticorps disponibles dans le commerce qui détectent les protéines endogènes présentes dans ces ovocytes. Toutefois, nous souhaitons trouver un moyen de remplacer l'animal pour obtenir ces anticoprs. Pour cela, la préparation d'anticorps via la culture cellulaire est une alternative intéressante que nous souhaitons tester et mettre en place.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre minimum d’animaux tout en garantissant l’obtention d’anticorps suffisants pour la réalisant des projets de recherche développés par l’équipe. Ainsi, les besoins des utilisateurs en anticorps seront soigneusement étudiés pour limiter le nombre d’animaux en expérimentation. Notre protocole propose d’utiliser un seul lapin par antigène contrairement à la plupart des fournisseurs privés qui, pour augmenter la possibilité de succès engagent 2 lapins par antigène. Nous pensons, par expérience, que le taux de succès provient de la qualité et/ou des propriétés antigéniques de la protéine que l’on injecte, ce qui justifie le rapport un lapin par antigène. Aucune approche statistique ne sera réalisée car inutile ici pour ce projet qui utilise un anticorps dirigé contre une protéine spécifique. .

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour favoriser le bien-être des animaux dans le cadre de ce projet. Les lapins sont élevés (maintenus) dans une animalerie agréée où ils bénéficieront d’un environnement social et physique enrichi en étant regroupés par deux dans une animalerie hébergeant plusieurs individus visibles les uns des autres. Cet agencement favorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur tranquillité. Une phase de training (2/3 semaines) à la contention/manipulation sera effectuée avant le démarrage des procédures. Lors de la phase d’injection des antigènes, l’animal est pris dans les bras et tranquillisé. Il est ensuite disposé dans une cage à contention pour lui éviter tout risque de blessure. L’injection est réalisée en sous cutané (SC). Une surveillance quotidienne sera effectuée afin de vérifier l’évolution de la réaction au niveau du point d’injection. Il en sera de même pour suivre l’état général de l’animal qui sera comparé avec son comportement avant son entrée en expérimentation. Lors de cette phase expérimentale, la manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre une phase post injection sans stress. Lors de la phase de prélèvement sanguin à l’oreille, l’animal sera à nouveau disposé dans une cage à contention. Les prélèvements seront réalisés par alternance sur l’une des deux oreilles afin d’éviter une répétition trop rapprochée entre deux prélèvements. Nous disposerons 2 individus par cage. Une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la compatibilité et la bonne entente entre eux. Si ce n'était pas le cas, nous ferons constater la situation par notre vétérinaire référent afin de valider un isolement. Une augmentation des enrichissements dans la cage dans ce cas mise en place (Balles, blocs à ronger..)

Choix des espèces

Le lapin est connu pour être un modèle de choix pour l’obtention d’anticorps polyclonaux dans des quantités optimales pour les projets de recherche. En d’autres termes, l’obtention de sérum, plusieurs dizaines de millilitres, est à comparer avec quelques millilitres pour la souris et le rat. Pour pouvoir réaliser l’injection d’antigènes et le prélèvement de sang, les lapins seront âgés de 3 mois et plus pour un poids de 2,5-3Kgs.

Des souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer certaines molécules du réseau lymphatique, mais aussi des nouveau-nés, des femelles gestantes et des embryons : 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés de cinq à onze jours subissent deux gavages et une biopsie de la queue, les adultes jusqu'à cinq prélèvements sanguins, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. Le porteur indique que l'immunisation peut provoquer une ulcération au site d'injection et une perte de mobilité des membres inférieurs, et que les transports entre sites partenaires ajoutent du stress. Toutes sont mises à mort en fin de projet pour analyse post-mortem, le porteur affirmant que la culture cellulaire ne reproduit pas ces mécanismes de façon juste.

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré. Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin sous maxillaire nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.

Toutes tuées à la fin du projet pour des analyses post-mortem, 520 souris, dont des nouveau-nés et des femelles gestantes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés deux fois et subissent entre leur 5e et leur 11e jour une biopsie de la queue pour le génotypage, et les adultes, selon les groupes, jusqu'à cinq prises de sang, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. Le projet porte sur des souris génétiquement modifiées dont le réseau lymphatique est défaillant, pour comprendre son lien avec la taille et la structure des ganglions. Le porteur signale que l'immunisation peut provoquer, rarement, des ulcérations et une perte de mobilité des pattes arrière, et que le transport entre les sites partenaires peut générer un stress. Il affirme qu'il "n'est pas possible de remplacer les animaux", les mécanismes étudiés ne pouvant être reproduits en culture cellulaire "de manière reproductible et juste".

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré. Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin sous maxillaire nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.

Des constricteurs posés autour des carotides pour réduire peu à peu le débit sanguin du cerveau, une pompe implantée sous la peau pour élever la pression artérielle : 894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont génotypés à dix jours par tatouage des phalanges, et les adultes passent cinq jours d'apprentissage d'une tâche avant une injection rétro-orbitaire de traceur et un prélèvement de liquide céphalo-rachidien. Le porteur qualifie l'hypertension et la baisse de flux sanguin qu'il provoque de pathologies "asymptomatiques", tout en listant comme complications possibles des accidents cérébro-vasculaires reconnaissables au déplacement en cercle et des infarctus cardiaques laissant l'animal prostré. Toutes sont tuées à la fin des trois procédures pour prélever leurs organes.

Objectifs

La découverte de barrières biologiques, telles que la barrière hémato-encéphalique (BHE), la barrière hémato-encéphalique (BCSFB) a montré comment le cerveau est séparé et protégé du reste du corps. La première barrière, BHE, est une structure spécialisée formée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, qui tapissent les capillaires cérébraux. Cette barrière est cruciale pour maintenir le microenvironnement cérébral en contrôlant l’entrée et la sortie de diverses substances. Le plexus choroïde est une autre structure critique du système vasculaire du cerveau, responsable de la formation de la barrière hémato-céphalorachidienne (BCSFB). Le plexus choroïde est constitué d'une couche de cellules épithéliales qui tapissent les ventricules du cerveau et produisent le liquide céphalo-rachidien (LCR). Elle se retrouve à l’interface entre le liquide cérébro-spinal et le cerveau. Ces barrières sont des composants essentiels des mécanismes de protection du cerveau, assurant un environnement contrôlé pour la fonction neuronale et protégeant contre les agressions toxiques. Lorsque cette intégrité est altérée, la fonction de barrière est compromise, ce qui peut initier des problèmes de dégénérescence neuronale. On parle alors de démence vasculaire. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes cellulaires régulant les fonctions physiologiques de la barrière hémato-encéphalique. Ce projet utilisera des modèles murins de souris mutées génétiquement pour des cibles régulant la fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous analyserons l’impact de cette délétion sur la formation postnatale de ces plexus, en physiologie et en pathologie (modèle de rétinopathie induite). Chez l’adulte, nous développerons des modèles pathologiques chez la souris créant soit (1) une hypertension modérée par une diffusion continue d'un vasoconstricteur puissant soit (2) une hypoperfusion graduelle du cerveau.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Ce projet élucidera les mécanismes moléculaires par lesquels le gène Mcc régule les voies de signalisation Wnt dépendante dans les cellules endothéliales et maintient l'intégrité de la barrière sang-cerveaux. Comprendre ces processus est crucial pour développer des thérapies ciblées contre les troubles neurologiques impliquant un dysfonctionnement de la barrière.

Procédures

Nous analyserons le développement des plexus vasculaires chez le souriceaux chez des animaux modifiés génétiquement et nous développerons 2 modèles pathologiques chez la souris adulte afin de créer (1) un stress d’hypertension systémique (2) un stress d’hypo perfusion cérébrale. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement (en analysant la mémoire et les fonctions exécutives à l'aide de test de déplacement), et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle de développement néonatal : Nombre d’animaux : 384. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 240. Les animaux auront une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse (durée 10 min) puis 3 semaines après lils seront évalués pour chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retroorbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gaseuse avec euthanasie des animaux. Modèle d’hypo perfusion cérébrale : Nombre d’animaux : 270. Les souris adultes (2 mois) auront une implantation de constricteurs autour des carotides sous anesthésie gazeuse (durée 10 min) puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retro orbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gazeuse . Tous les animaux inclus ont été génotypés à 10 jours après la naissance par une méthode de tatouage sur les phalanges.

Impact sur les animaux

Le modèle post natal : nos données préliminaires montrent que la délétion précoce du gène Mcc dans le lit vasculaire n’induit pas de retard de croissance. Mais les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Chez l'adulte, les pathologies d'hypertension artérielle générée et de baisse de flux sanguin sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigûes pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les manifestation aigues du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience. Le génotypage par tatouage induit une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des 3 procédures dans le but de prélever leurs organes sur lesquels nous ferons des analyses post mortem.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des barrières vasculaires du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles transgéniques de knockout de gènes d'intérêt. Pour réduire le nombre des animaux sacrifiés, aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, puis analyse de la permeabilite puis euthanasie pour analyse histologique).

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Des jouets/ tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales (implantation de pompe, ajout de constricteurs, injection en retro orbital de traceurs) sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont le système vasculaire est très similaire à celui de l'homme. C'est actuellement la seule espèce de mammifère dont le génome peut être modifié en routine pour créer des modèles de maladies humaines. Des modèles d'hypertension artérielle et de modification du flux sanguin ont été développés et validés chez la souris, montrant leur utilité pour étudier les altérations cognitives et neuronales. Nous prévoyons d'utiliser : Des souriceaux, car la formation des nouveaux vaisseaux se produit dans les organes jusqu'à environ 4 semaines après la naissance. Des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 24 et 29 grammes, car leur réseau vasculaire est complètement développé, notamment dans le cerveau.

Isolés deux heures par jour dès l'âge de quatorze jours, puis séparés un par un après le sevrage, 80 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tués pour prélever leurs tissus intestinaux et leurs muscles. Ils subissent un prélèvement de fèces et deux prises de sang, chaque contention étant limitée à cinq minutes. L'objet du projet est de mesurer la digestibilité de la crème de pois, un coproduit de l'industrie alimentaire aujourd'hui mal valorisé, et son effet sur la croissance des porcelets au sevrage. Le porc est ici à la fois l'animal utilisé et le destinataire annoncé des résultats, le porteur présentant le projet comme un moyen de limiter les diarrhées et l'usage d'antibiotiques en élevage.

Objectifs

En production porcine, le sevrage est une période critique pour le porcelet car à cette période il subit de nombreux stress (séparation avec la mère, mélange avec d’autres portées, changement d’alimentation…). Cela entraîne des désordres digestifs avec notamment des incidences de diarrhées élevées. L’alimentation est un levier majeur pour améliorer cette étape clé du développement. La crème de pois est un coproduit de l’industrie alimentaire, riche en fibres facilement métabolisables et en protéines. De par sa composition et sa texture (entre la phase liquide et solide), la crème de pois pourrait être un aliment intéressant pour améliorer la santé digestive et pour favoriser la transition alimentaire des porcelets lors du sevrage. Dans ce contexte, le projet vise à décrire la digestibilité d’un coproduit du pois (la crème de pois) à étudier l’influence de l’ajout de ce coproduit sur la santé digestive des porcelets au sevrage (absorption des protéines, intégrité de la barrière intestinale), sur leurs performances zootechniques et leur développement musculaire. L’objectif est d’assurer une meilleure transition alimentaire au sevrage pour limiter les problèmes de santé digestive, d’améliorer la croissance des porcelets, et de diminuer/supprimer l’utilisation d’antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances sur la digestion d’un coproduit de pois, qui présente une texture (entre liquide et solide) et une composition (riche en fibres et protéines) pouvant être bénéfiques aux porcelets. Le projet permettra effectivement de déterminer les effets positifs sur la santé digestive (intégrité de la barrière intestinale) et la croissance musculaire des porcelets. Cette expérimentation apportera de nouvelles connaissances sur les différents liens entre les protéines issues de la digestion de la crème de pois et le développement des muscles squelettiques chez le porc. Ce projet permettra également d’optimiser l’utilisation d’un coproduit qui n’est pas totalement valorisé à l’heure actuelle, ainsi limiter les déchets et promouvoir une circularité des systèmes alimentaires. Pour une perspective à long terme, ce projet fournira des pistes pour adapter au mieux les régimes des porcelets, réduire les problèmes digestifs au sevrage et ainsi limiter voire supprimer l’utilisation d’antibiotiques en élevage. De plus ce projet fournira des données (activité enzymatique, pH) qui serviront à mettre au point un modèle de digestion in vitro spécifique au porcelet. Cela permettra par la suite de privilégier l’utilisation de ce modèle in vitro plutôt que celle d’animaux.

Procédures

Les interventions prévues pour les porcelets sont : un prélèvement de fèces, et 2 prélèvements de sang. Ces interventions nécessitent une immobilisation de l’animal qui est limitée à 5 min. La durée de la prise de sang est limitée à 2 min.

Impact sur les animaux

Quotidiennement, les porcelets seront isolés par groupe de 2 pendant 2 h, à partir de 14 jours de vie, pour accéder à leur régime. De même en post-sevrage, les porcs seront isolés individuellement pour obtenir un suivi précis de l’ingéré. L’isolement d’un groupe ou d’un porc en individuel peut être source de stress. Des prélèvements de sang (1 ou 2 selon la procédure) et de fèces (1) seront effectués sur les porcelets. Ces prélèvements ne sont pas douloureux, mais nécessitent une contention qui peut être stressante pour les porcelets.

Devenir

La mise à mort des porcelets est nécessaire lors des procédures 1 et 2, pour permettre le prélèvement d’organes (tissus intestinaux et muscles).

Remplacement

Les modèles in vitro de digestion sont limités dans leur capacité à reproduire la physiologie complexe du tractus gastro-intestinal et ses nombreuses interactions. A l’heure actuelle, aucun modèle ne permet de reproduire la sécrétion d’hormones digestives, et les mécanismes de régulations suite à l’ingestion d’un aliment. De plus ces modèles ne permettent pas d’étudier plusieurs organes en même temps en réponse à un traitement (exemple : alimentation). L’objectif du projet étant d’étudier les interactions digestives des nutriments et la réponse physiologique qui en découle, il nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants pour explorer ces deux domaines de recherche conjointement.

Réduction

Le nombre de porcelets prévus pour ce projet est de 80 au maximum. Il correspond à 20 porcelets par régimes alimentaires (une étude pilote avec 4 porcelets par régime et 2 répétitions de 8 porcelets par régime pour l’expérimentation finale). Ce nombre d’animaux est suffisant pour observer un effet significatif sur la digestibilité des protéines entre la crème de pois et le contrôle. Le nombre d’animaux a été déterminée grâce à des essais préliminaires réalisés pour ce projet sur la digestibilité in vitro des protéines des différents régimes. Ces essais ont été réalisés suivant le modèle de digestion in vitro utilisé pour le porc en croissance

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué tout au long de l’expérience. Les régimes expérimentaux (crème de pois et contrôles) seront adaptés pour couvrir les besoins nutritionnels des porcelets tout au long de leur développement (quantité, composition en minéraux, protéines…). Tous les porcelets seront surveillés quotidiennement avec des grilles d’évaluation de bien-être, afin de prévenir toute souffrance. Les grilles seront collectives pour la période précédant le sevrage et individuelle en post-sevrage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté, en respectant les durées de contentions (5 min) et de prélèvements (2 min). Le comportement des animaux sera également suivi par caméra surveillance pour veiller au bien-être des porcelets et leur alimentation.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des porcelets jusqu’à leur sevrage et une partie en post-sevrage. Le porc est l’espèce cible du projet qui consiste à déterminer la digestibilité de la crème de pois et d’étudier le lien avec la santé digestive et les performances musculaires des porcs sur le long terme. Les connaissances serviront pour améliorer la transition alimentaire au sevrage du porcelet et limiter les incidences de diarrhées en élevage.abba

Cinquante souriceaux âgés de deux à quatre jours vont être gavés ou piqués sous la peau pour que le personnel maîtrise le geste sur des nouveau-nés. 118 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examiner leurs ganglions lymphatiques au microscope. Chaque animal reçoit trois gavages ou trois injections sous-cutanées sur trois jours consécutifs, avec une contention par la nuque, le gavage pouvant irriter à force de répétition. Le projet valide une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée, et le porteur justifie ses 68 autres animaux par le fait que le génotype reste inconnu à l'âge de l'administration, un quart environ formant les groupes utiles, pour une lecture qualitative de lames sans analyse statistique.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques permettent l’initiation de la réponse immunitaire. Leur structure est formée par des cellules stromales qui forment un espace tridimensionnel dans lequel les cellules hématopoïétiques transitent et se regroupent en zones distinctes. Les cellules stromales mésenchymateuses du ganglion lymphatique organisent ainsi l’organe pour son bon fonctionnement. Des modèles de souris sont requises pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires pour la formation de ces cellules organisatrices. Dans ce projet, nous évaluerons une nouvelle souris génétiquement modifiée pour sa capacité de marquer les cellules mésenchymateuses et suivre leur différenciation.

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront de valider le nouveau modèle de souris génétiquement modifiée et de faire avancer la recherche sur la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires. Les cellules mésenchymateuses jouent notamment un rôle clé dans la réponse immunitaire humorale impliquant des anticorps contre des maladies infectieuses, ou dans la formation des structures lymphoïdes retrouvées dans des cancers, ou des organes affectés dans des maladies autoimmunes. Ces résultats apporteront ainsi à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné que des thérapies anti-cancer et anti-maladies autoimmunes visent le système immunitaire, ces résultats auront des retombées sur la thérapie anti-cancer et contre des maladies autoimmunes.

Procédures

Trois gavages ou 3 injections par voie sous-cutanée sont réalisés sur animal vigile sur une période de 3 jours consécutifs (duée de chaque injection ou gavage: 2-3 minutes). Le génotypage sera réalisé sur un surplus de tissu provenant de l'identification des animaux ou sur biopsie de queue réalisée post-mortem.

Impact sur les animaux

Le gavage peut être source d'irritation, du fait de la répétition du geste. Les injections répétées par voie sous-cutanée peuvent induire un certain inconfort. Ces voies d'administration nécessitent une contention au niveau de la nuque, source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux à l'issue de la procédure et analyse post-mortem des ganglions lymphatiques par microscopie

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la differenciation des cellules mésenchymateuses dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique, tels que la quantité de tamoxifène à administrer ou le moment choisi dans le développement de l’animal, permettant une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les moyens de l’administration (gavage oral ou injection par voie sous-cutanée) ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Une étude-pilote sera réalisée sur un maximum de 50 souriceaux âgés de 2-4 jours afin de maitriser les gestes techniques chez le nouveau-né, et ainsi minimiser la souffrance qui pourrait être induite lors de la manipulation. La validation de notre modèle sera ensuite réalisée avec un total de 68 animaux, en comparant l’efficacité d’excision suite à l’administration du tamoxifène par voie orale ou par injection sous-cutanée, versus des animaux contrôles qui recevront le véhicule. Ce total de 68 animaux est nécessaire dans la mesure où les produits seront administrés à 2-4 jours d’âge, où le génotype des animaux n’est pas connu. Théoriquement ¼ des animaux constitueront ainsi les cohortes expérimentales, soit environ 22-23 souris (15 animaux expérimentaux + 7-8 contrôles), effectif suffisant pour valider notre hypothèse. Cette validation est notamment basée sur une méthode d’analyse histologique qualitative, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation microscopique des lames.

Raffinement

Les injections sous-cutanées et les gavages sont effectués par un personnel formé et expérimenté. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après injection ou gavage. Les souriceaux sont observés et surveillés dans les minutes qui suivent le gavage afin de s’assurer qu’il n’y a pas eu de fausse route. Un temps de récupération après les administrations est accordé (24h) aux animaux. Le bien-être de l’animal est évalué par un personnel expérimenté, prenant en compte l’attention accordée aux souriceaux par la mère, le lieu d’injection (sous-cutané au niveau de la nuque) et la croissance des animaux, le poids, l’apparence, le comportement, l'hydratation, la respiration et l’aspect des fèces. Lorsque qu’une anomalie est observée, l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la Structure du Bien-Être Animal est contactée et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages (matériel de nidification) et un tunnel sera utilisé lors de chaque manipulation et change.

Choix des espèces

La fonction du ganglion lymphatique et sa structuration sont identiques entre l’homme et la souris. Il existe chez la souris des moyens de suivre la différenciation des cellules par marquage génétique (lineage tracing) et d’invalider des gènes dans un type de cellules afin de pouvoir étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la différenciation des cellules des ganglions lymphatiques à partir des cellules progénitrices. Des nouveaux-nés de 2 à 4 jours seront utilisés, en lien avec le développement du ganglion lymphatique qui commence au stade embryonnaire et se termine environ 5 à 7 jours après la naissance. Des souris adultes (8 semaines) où la différenciation des des cellules des ganglions lymphatiques est complétée, recevront également le tamoxifène et seront utilisées comme contrôles.