Biologie du développement

Les souris de ce projet portent une recombinase qu'une injection déclenche, pour marquer certaines cellules du cœur et suivre leur descendance. 224 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, sur deux jours consécutifs quand la seconde est jugée utile, les femelles gestantes étant injectées entre le sixième et le treizième jour de gestation. Toutes sont ensuite tuées pour prélever des organes, alors que le porteur écrit n'avoir jamais observé d'effet délétère chez les animaux injectés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier les gènes et cellules qui participent au développement du système cardiovasculaire chez l'embryon et au maintien de l'homeostasie du cœur chez l'animal adulte afin de mieux appréhender l'étiologie des cardiopathies congénitales et acquises qui se développent après la naissance. Le développement du cœur et l’homéostasie cardiaque dépendent de l'expression d'un nombre important de gènes et la contribution de différents types cellulaires. Dans cet objectif, nous utiliserons des souris transgéniques chez lesquelles on peut induire l'activité d'une recombinase qui permet la détection des cellules recombinées et de leurs dérivées. Différentes lignées sont ciblées: les progéniteurs cardiaques, les cellules dérivées de l’épicarde, les cellules des crêtes neurales et enfin les cardiomyocytes. Les études sur le développement cardiaque nécessiteront l’induction au cours de la gestation tandis que les études après la naissance seront réalisées par des inductions chez les mâles et femelles. Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement et le maintien du système cardiovasculaire ainsi que sur l'étiologie des pathologies congénitales et acquises.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur le développement cardiaque depuis les stades précoces du développement cardiaque. Il étudiera l’importance de ces évènements précoces sur le maintien du système cardiovasculaire. Les résultats attendus doivent également permettre de mieux aborder l’étiologie des pathologies cardiaques congénitales et acquises.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections intrapéritonéales. Si deux injections sont réalisées, elles seront réalisées sur 2 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Nous n'avons jamais observé d'effet délétère sur les animaux injectés lors de nos expériences précédentes. Une possible infection peut apparaître au site d'injection, mais cela n’a jamais été observé lors de nos expériences précédentes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation de modèle in vitro ne permet pas de reproduire le développement cardiaque ni celle du coeur dans leur compléxité physiologique chez l'animal. Les stratégies de remplacement n'existent pas et l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés telle que présentée ici est la seule approche qui nous permette actuellement de répondre à nos objectifs de suivi des cellules qui contribuent au développement et à l'homéostasie du coeur.

Réduction

Nous nous efforçons à limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des controles et à utiliser au maximum les données de chaque animal. L’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Nos études précédentes nous montrent qu’il faut en moyenne 10 souris par groupe pour avoir des données exploitables. Nous arrêterons de générer des animaux aussitôt que nos résultats seront exploitables statistiquement..

Raffinement

La réglementation est appliquée selon la législation en vigueur pour tous les animaux en procédure pour ce qui concerne l’hébergement, la surveillance et la mise à mort. Les injections sont toujours des actes planifiés à l'avance et rapides ce qui permet de limiter le stress de l'animal. L'apparition d'infection au site d'injection si elle a lieu sera traitée par un antiseptique. Si l’animal présente un signe de souffrance il recevra une injection d'anti-inflammatoire. Une grille de score avec les différents points limites est disponible et adaptée aux besoins du projet.

Choix des espèces

Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du coeur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Les souris génétiquement modifiées représentent donc un modèle pertinent pour nos recherches fondamentales afin d'appréhender au mieux les maladies humaines. Les femelles gestantes seront injectées au plus tôt au stade embryonnaire de 6.0 jours après l'accouplement, stade qui correspond à l'identification des premiers progéniteurs cardiaques, et au plus tard avant le 13ème jour embryonnaire, la gestation chez la souris étant de 21 jours. Lorsque l'étude s'adressera à des animaux après la naissance, les injections seront réalisées entre le stade P0 et P3 ou au stade adulte lorsque requis, entre 8 et 12 semaines. Les animaux seront injectés deux fois sur deux jours consécutifs lorsque nécessaire afin de s'assurer de la recombinaison de l'ensemble des cellules ciblées. La nécessité de deux injections pour une recombinaison fiable résulte de l'expérience acquises au cours des années et est en faveur de la règle des 3R car cela permet d'obtenir des résultats plus stables rapidement et de réduire le nombre d'animaux injectés.

Une biopsie de l'extrémité de la queue, une injection dans l'abdomen des femelles gestantes : les gestes décrits durent moins d'une minute chacun. Ils concernent 9 321 souris, utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et tuées à l'issue, à l'exception de celles gardées pour la continuité des lignées. Le projet porte sur les cellules des tout premiers stades de l'embryon et sur les gènes qui commandent sa formation, avec des retombées annoncées en médecine régénérative et en thérapie par cellules souches. Le porteur justifie l'effectif par un calcul fondé sur des publications du domaine, sans donner ni la taille des groupes ni le nombre d'expériences prévues.

Objectifs

Au cours des phases précoce du développement embryonnaire, certaines cellules développent des caractéristiques particulières qui sont indispensables à la bonne formation d'un embryon. L'incapacité de ces cellules à exprimer certains gènes entraînent des malformations importantes. Ce projet cherche à déterminer comment ces cellules fonctionnent et comment les molécules qu'elles produisent influencent le développement de l'embryon. Pour répondre à ces questions, des embryons dont certaines cellules auront été modifiées seront étudiés dans les moments précoces de leur développement.

Bénéfices attendus

Le projet proposé est susceptible d'avoir des retombées immédiates ou à long terme pour la recherche sur la médecine régénérative et les thérapies par cellules souches. De plus, ce projet apportera une contribution significative à la compréhension fondamentale du fonctionnement des cellules embryonnaires au début de leur développement.

Procédures

Les animaux subiront une petite biopsie à l'extrémité de la queue pour leur caractérisation génétique (maximum 1 minute). Les femelles gestantes recevront une injection d'un produit pemettant l'activation ou l'inactivation de certaines molécules (30 secondes)

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale, la biopsie pour la caractérisation génétique des animaux peuvent induire un stress et une possible douleur.

Devenir

Certains animaux serviront à la continuité de leur lignée, les animaux soumis à une expérimentation seront mis à mort à la fin de cette dernière.

Remplacement

Ce projet s'intéresse à des phénomènes cellulaires intervenant au cours du développement embryonnaire qui ne peuvent être reproduits totalement par des cultures en laboratoire. Néanmoins, nous disposons d’un modèle de culture de cellules qui pourra être mis à profit pour étudier plus précisément certains phénomènes particuliers identifiés chez les embryons.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à une juste analyse statistique. Ce nombre a été déterminé grâce à l'étude de publications dans le domaine du développement de l'embryon.

Raffinement

Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela inclut une surveillance régulière de l'apparence des animaux. Une grille de score portant sur des paramètres objectifs a été déterminée et des points limites ont été fixés pour évaluer l'état éventuel de stress ou de souffrance des animaux. Leur environnement est enrichi à l'aide de cotons de nidification et de maisonnettes en carton.

Choix des espèces

Les premières étapes du développement de l'embryon chez la souris reflètent ce qui se passe lors du dévelopement de l'embryon humain. Nous utiliserons des animaux âgés d'au moins 8 semaines afin qu'ils aient un système reproducteur mature avant de les mettre en accouplement.

Réutilisées pour la ponte tous les quatre à six mois, soit dix à quinze fois au cours du projet, 150 xénopes femelles reçoivent deux injections d'hormone HCG dans les sacs lymphatiques du dos, sur animal vigile, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Elles retournent ensuite à l'animalerie aquatique, et celles qui ne répondent plus à la stimulation après trois essais successifs sont tuées et remplacées. Les œufs pondus servent à étudier les fonctions embryonnaires de la voie purinergique, les embryons étant partagés entre plusieurs équipes de recherche. Sur les 3R, le porteur écrit que la règle "est surtout applicable au nombre d'animaux utilisés" et que les possibilités de raffinement sont "très limitées", l'enrichissement se réduisant à des sections de tube en PVC.

Objectifs

Le projet a pour objectif l'étude des fonctions embryonnaires de la voie purinergique, qui fait intervenir les purines extracellulaires, telles que l'ATP, ADP et adénosine. Leurs actions sur les cellules nécessitent un grand nombre d'acteurs (tels que des récepteurs). Cette voie de signalisation constitue un système de communication cellule-cellule universel et régule la physiologie de nombreux organes, tels que les systèmes neural (central et périphérique) et rénal. Elle est aussi impliquée dans de nombreuses conditions pathologiques neurologiques mais aussi rénales et les différents acteurs de cette voie sont devenus des cibles thérapeutiques pour un grand nombre de maladies. Toutefois, les fonctions de cette voie lors de l’embryogénèse demeurent moins comprises, notamment car peu d’études se sont penchées sur le rôle de cette voie de signalisation dans un contexte in vivo. Nous avons montré que les acteurs de cette voie sont exprimés lors de l'embryogénèse et que la mise en place du rein et de l'oeil est controlée par cette voie de signalisation. Les objectifs de ce projet sont d'étudier les fonctions de cette voie dans un contexte embryonnaire, dans l'embryon de l'amphibien xénope, et d’établir les fonctions de la voie de ces purines au cours de l’embryogénèse.

Bénéfices attendus

D'un point de vue fondamental, ce projet devrait permettre d'élucider les fonctions de la voie purinergique dans un contexte in vivo, notammentes mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués lors du développement d'un embryon d'un vertébré. mais également d’un point de vue appliqué afin de mieux appréhender les mécanismes dérégulés dans les conditions pathophysiologiques.

Procédures

Les animaux femelles X.laevis recevront deux injections d'hormones HCG dans leur sacs lymphatiques dorsaux. Cesinjections seront faites sur animal vigile. Cette procédure dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont du stress léger du à l'injection sous-cutanée et à la contention de l'animal durant celle-ci. La quantité d'ovocytes pondus suite à la stimulation hormonale correspond à un nombre d'ovocytes pondus dans le milieu naturel par les femelles. Les animaux adultes femelles sont réutilisées (tous les 4 à 6 mois) pour la ponte d'ovocytes, ce qui est inférieur au nombre de pontes dans le milieu naturel (jusqu'à 4 par année). Chaque femelle sera utilisée 2 fois (maximum 3 fois) par année, soit 10 à 15 fois au cours du projet.

Devenir

Les animaux adultes femelles apres stimulation et ponte sont remises dans l'animalerie aquatique et sont re-utilisées pour la ponte tous les 6 mois (4 mois minimum). En cas de non réponse (3 fois successives) à la stimulation hormonale, les animaux peuvent etre euthanasiées et devront etre remplacées si besoin.

Remplacement

La regle des 3R esr surtout applicable au nombre d'animaux utilisés. Il est clair que l’étude des fonctions embryonnaires de voies de signalisation requiert de pouvoir analyser les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans un contexte in vivo, et que l’embryon ne peut pas être remplacé.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les expériences, nous faisons en sorte de partager les embryons qui sont très nombreux entre les chercheurs de différentes équipes de recherche travaillant avec ce modèle . Une femelle de Xénope peut pondre plusieurs milliers d’œufs, ce qui permet d’obtenir assez d’embryons plusieurs expériences. 2 journées de poonte sont prévues par semaine d'experimentations.

Raffinement

Les possibilités de raffiner les protocoles utilisés sont très limitées. Un programme d’enrichissement a été mis en place dans l’animalerie qui permet aux animaux de bénéficier d’un environnement mimant un habitat naturel (abris constitués de section de tubes PVC).

Choix des espèces

L’embryon de Xénope est un modèle classique d’étude de voie de signalisation complexe au cours de l’embryogénèse de par ses nombreux avantages biologiques : progéniture importante, taille des embryons, développement externe et température dépendant, résistance aux manipulations (micro-injections). De plus, les progrès technologiques permettent d’effectuer facielemnt et rapidement des expériences de perte et gain de fonction. Les animaux males et femelles sont utilisés à l'age adulte, apres acquisition de leur maturite sexuelle.

2 930 des 3 000 souris de ce projet sont tuées, soit parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, soit une fois les expériences terminées, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus faible. Chaque année, 600 animaux subissent une biopsie de la queue pour le génotypage, une biopsie de l'oreille s'y ajoutant en cas de second prélèvement, et 50 à 100 femelles reçoivent des injections d'hormones pour qu'on leur prélève trente à quarante ovocytes au lieu de la dizaine obtenue après une ovulation naturelle. Le porteur présente cette superovulation comme une mesure de réduction et signale que l'invalidation du gène étudié rend probablement les femelles infertiles. Les 70 souris restantes sont maintenues en vie pour entretenir la lignée, et resteront disponibles pour les croisements suivants.

Objectifs

L'objectif du projet est de comprendre les mécanismes moléculaires contribuant à la bonne qualité des cellules reproductrices femelles (ovocytes). Nous étudierons le rôle d'un gène particulier en utilisant comme modèle d'étude l'ovocyte de souris. Notre approche consistera à empêcher le fonctionnement de ce gène dans les ovocytes murins par modification génétique. Nous étudierons les conséquences de cette modification sur la croissance des ovocytes, leur aptitude à être fécondé, la qualité du développement embryonnaire, et la fertilité des souris. Nous réaliserons notamment des expériences de microscopie sur des ovocytes isolés. Ce projet nécessitera : 1) de caractériser le profil génétique des souris génétiquement modifiées afin d'optimiser les stratégies d'élevage ; et 2) de stimuler hormonalement la production d'ovocytes afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet pourraient être transférables à la médecine reproductive humaine, car les mécanismes fondamentaux de la production d'ovocytes semblent largement conservés chez les deux espèces. Ainsi, dans le but de restaurer la fertilité chez des femmes souffrant de ménopause prématurée, certains laboratoires ont mis en place des protocoles prometteurs, susceptibles d'agir via le gène que nous proposons d'étudier. Notre projet apportera des éléments nouveaux dans la compréhension du rôle de ce gène dans la physiologie de l'ovocyte et la fertilité.

Procédures

Deux types d'interventions seront mis en oeuvre : 1) biopsie caudale pour prélèvement d'un échantion de queue (durée 5 secondes) : 600 animaux par an. Si besoin d'un second prélèvement, une biopsie auriculaire sera réalisée (durée 5 secondes) ; 2) injection intrapéritonéale d'hormones (durée : 20 secondes) : 50-100 animaux par an.

Impact sur les animaux

L'invalidation du gène d'intérêt dans les ovocytes est susceptible d'entraîner une infertilité chez les femelles, sans autre type de nuisance. Pour l'obtention d'ovocytes isolés, et pour limiter le nombre d'animaux à expérimenter, nous procéderons à une superovulation des femelles par injection intra-péritonéale d'hormones ; cette procédure sera susceptibles de générer une gêne passagère due à la piqûre de l'aiguille. Pour identifier les animaux porteur du bon génotype après croisements, nous procéderons à une biopsie de queue pour réaliser une caractérisation génétique des individus ; cette procédure sera susceptible de générer de l'inconfort chez l'animal. Cette gêne est passagère et n'entraîne pas de complication.

Devenir

Certains des animaux présentant le génotype recherché seront maintenus en vie pour maintien de lignée. Tous les autres animaux ayant fait l'objet des procédures seront euthanasiés pour une des raisons suivantes : 1) animal ne présentant pas le génotype d'intérêt ; 2) animal ayant servi aux expérimentations.

Remplacement

A ce jour, il n'y a pas d'alternative non-animale pour l'étude de la physiologie de l'ovocyte de mammifère. L'espèce souris est à l'heure actuelle le modèle le plus répandu pour l'étude des mécanismes moléculaires de la fertilité chez les mammifères.

Réduction

La stimulation hormonale des souris femelles vise précisément à réduire le nombre d'animaux requis pour la réalisation des expérimentations sur ovocytes isolés. Sans stimulation hormonale, le nombre d'ovocytes recueillis après ovulation dépasse rarement la dizaine. En revanche, après stimulation hormonale (superovulation), nous obtiendrons en routine 30 à 40 ovocytes par souris. De plus, au moment du prélèvement des ovaires ou oviductes, nous prélevons régulièrement d'autres organes tels que foie et cerveau, qui serviront à réaliser des échantillons protéiques contrôles pour les approches biochimiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions optimales : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum. Aucun animal ne sera hébergé seul dans sa cage, avec un maximum de 5 animaux par cage. Des jouets en plastique sont rajoutés systématiquement pour enrichir l'environnement. Une surveillance quotidienne des animaux est en place, et des points limites ont été définis pour chacun des deux types d'intervention. Nous appliquerons une grille de score pour détecter d'éventuels signes d'inconfort ou de douleur, et y remédier. De plus, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage alternatives à la biopsie caudale, telles que le prélèvement de poils, de salive ou de fèces.

Choix des espèces

Les études chez la souris ont montré que les mécanismes fondamentaux de l’ovogenèse, la folliculogenèse, la fécondation, étaient similaires à ce qui est décrit chez l’humain. De nombreuses études chez la souris ont été le point de départ de découvertes et progrès remarquables en reproduction humaine (fécondation in vitro, maturation in vitro, culture d'embryons ...). A l’inverse, la recherche sur ovocytes humains se heurte à la rareté du matériel, et soulève des questions éthiques évidentes. De plus, l’espèce souris offre la possibilité de générer des lignées génétiquement modifiées, permettant d’interroger le rôle spécifique de gènes d’intérêt. Nous utilisons des souris adultes car nous souhaitons étudier la physiologie des ovocytes matures aptes au développement.

Toutes tuées pour que leurs embryons soient prélevés, 1 747 souris femelles vont être utilisées dans une procédure déclarée d'un niveau de souffrance léger. La superovulation leur est provoquée par deux injections intrapéritonéales d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle, de façon à porter à vingt ou trente le nombre d'embryons prélevés sur chaque femelle. Le porteur écrit que ces injections sont "dénuées de tout effet nocif" tout en reconnaissant une douleur, un inconfort et un stress de courte durée. Il indique que ses travaux antérieurs sur cellules souches embryonnaires ne récapitulent pas la ségrégation des lignages dans l'embryon et qu'il doit désormais tester ses conclusions directement sur des animaux.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de clarifier les rôles joués par une classe de facteurs capables de contrôler l’expression de gènes, dans le développement de l’embryon de souris. Après la fécondation, les embryons de mammifères doivent générer rapidement tous les types de cellules nécessaires pour s'implanter dans l'utérus et se développer. Ce processus dépend de la mise en route de l’expression de gènes (en anglais: zygotic genome activation, abrévié ZGA), et sur la réinitialisation de l'état de l'ADN hérité des parents. Cette opération est nécessaire pour effacer l’origine parentale de l’ADN au début de la vie et comprend la nécessité de réparer et d'étendre les extrémités des molécules d'ADN, dans des régions connues sous le nom de télomères. Les récepteurs nucléaires ont été impliqués dans ce processus, mais il reste à prouver qu’ils ont un rôle essentiel. Une fois la ZGA achevée et après les deux premières divisions cellulaires, des cellules différenciées émergent et vont donner naissance au trophectoderme, qui formera une partie du placenta, l'endoderme primitif, qui contribue au sac vitellin, et l'épiblaste, qui génère tous les tissus constituant le corps adulte. Ce potentiel immense de l’épiblaste est qualifié de pluripotence. Nos travaux antérieurs in vitro sur des cellules embryonnaires souches, lignées cellulaires issues de l’embryon qui conservent le même potentiel immense de différenciation, ont montré que deux récepteurs nucléaires, sont ensemble indispensables au maintien de la pluripotence. Il est donc important de comprendre si l'acquisition de la pluripotence repose aussi dans le contexte du développement embryonnaire naturel sur l'activité de cette classe de gènes. Bien que les résultats publiés sur l’inactivation des gènes de récepteurs nucléaires ne montrent pas d’effet sur les premiers jours du développement, nous pensons que l'importance de ces gènes a été masquée par la capacité de l’embryon à compenser l’absence de l’un des gènes par un autre gène de la famille. En utilisant de souris génétiquement modifiées nous allons définir le rôle synergique de plusieurs récepteurs nucléaires dans la réinitialisation et l’activation du génome, la spécification de différents types cellulaires embryonnaires, et en particulier dans l’acquisition de la pluripotence. L'objectif principal de ce projet est donc de générer de nouvelles connaissances scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le rôle d'une classe importante de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, dans la coordination des premiers jours du développement embryonnaire, qui aboutit à la formation entre autres d’une population de cellules capable de donner naissance à tous les types de cellules constituant le corps adulte. L’embryon permet d’obtenir des cellules qui peuvent être cultivées et maintenues en laboratoire in-vitro: les cellules souches embryonnaires, ou « ESCs ». Comme les cellules de l’embryon préimplantatoire, les ESCs sont aussi pluripotentes et capables de générer de nombreux types cellulaires. Cette propriété remarquable suscite beaucoup d’espoir dans le domaine médical dans le cadre de thérapies de remplacement cellulaire. Une des retombées de nos travaux sur les embryons est d’identifier les conditions permettant de dériver des modèles cellulaires de type ESCs, mais plus immatures et donc possédant des potentialités accrues de différenciation. Ainsi, en plus de générer des connaissances de base pour mieux comprendre le développement embryonnaire de la souris, mais également d’autres mammifères, nos résultats pourraient faire progresser de manière significative notre capacité à utiliser les ESCs dans la clinique.

Procédures

Nous utiliserons la superovulation, une technique basée sur 2 injections consécutives d'hormones par voie intrapéritonéale, nécessitant l'immobilisation de l'animal pendant moins d’une minute, à 48 heures d'intervalle.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux seront dues à deux injections d’hormones dans l’abdomen. Ces injections sont dénuées de tout effet nocif dans les conditions d’utilisation prévues. Néanmoins, elles peuvent entrainer une douleur, inconfort et stress de sévérité légère de courte durée sans impact sur la santé ou le bien-être animal.

Devenir

Toutes les femelles seront mis à mort pour prélever des embryons.

Remplacement

Nos travaux antérieurs ont largement utilisé les cellules en culture (ESCs) et ont permis d’identifier une classe de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, qui pourraient être impliqués dans les processus de différenciation cellulaire. Bien que l'étude in vitro des lignées de cellules pluripotentes présente un intérêt indéniable, ce modèle de différenciation ne récapitule pas complètement les mécanismes qui contrôlent la ségrégation des différents lignages embryonnaires, et les résultats obtenus en culture doivent être vérifiés et développés dans le contexte du développement naturel. C'est précisément pour ces raisons que nous devrons maintenant tester directement sur des animaux les conclusions de nos études précédentes.

Réduction

Notre travail est basé sur la comparaison entre des embryons témoins et des embryons porteurs de mutations dans différents gènes. Pour réduire le nombre de souris femelles utilisées, nous avons : • optimisé les croisements, de sorte que chaque femelle produit à la fois les embryons témoins et des embryons porteurs des mutations étudiées, dans les proportions désirées. • Nous prévoyons aussi d'utiliser la superovulation, une technique permettant d'obtenir, à partir de chaque femelle 20-30 embryons. Nous chercherons également à utiliser le moins d'embryons possible pour chacune des approches expérimentales : • Nous devrons évaluer l'expression des gènes dans les embryons et la capacité de l'ADN à être lié et modifié par des facteurs régulant le développement. Pour ces techniques basées sur le séquençage ADN, les exemples existants dans la littérature font souvent état de l'utilisation de centaines d'embryons par échantillon. Nos données préliminaires suggèrent que des données informatives sont obtenus à partir d'embryons uniques, bien que le bruit de fond et les effets de lot soient dans ce cas substantiels. Des améliorations techniques ont été implémentée, pour maximiser la reproductibilité, permettant l'utilisation de seulement 5 embryons par condition, répétée en 5 expériences indépendantes. • Nous devrons également visualiser par microscopie la présence et la localisation des facteurs contrôlant la spécification et la prolifération de chaque type cellulaire de l’embryon précoce, ainsi que suivre les extrémités des molécules d'ADN présentes dans chaque cellule, les télomères, et les protéines actives à ces régions. Nous utiliserons aussi la microscopie pour mesurer les niveaux d'expression génique globaux, et ceux de gènes spécifiques. Pour analyser chacun de ces facteurs/gènes par microscopie, entre 5 et 10 embryons sont nécessaires, et les analyses doivent être répétées au moins 3 fois. Néanmoins, 3 marqueurs peuvent souvent être analysés sur chaque embryon en même temps. Nous veillerons donc à coupler la détection de plusieurs marqueurs par embryon, et nous analyserons le moins de marqueurs possible, tout en obtenant des résultats informatifs. Enfin, des modèles de culture cellulaire pourront nous aider à établir des priorités ou d'éliminer certaines sections expérimentales tout au long de l'exécution du projet.

Raffinement

Les souris concernées par cette demande sont les femelles donneuses d’embryons, sur lesquelles deux injections intrapéritonéales seront réalisées. Bien que ces injections ne soient pas dommageables, tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, nous veillerons à ce que les animaux n'assistent pas aux injections d'autres individus, pour ne pas provoquer de stress avant la procédure. Nous immobiliserons les animaux avec précaution, et après qu'il se soient adaptés à la manipulation par l’expérimentateur.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui partage 99% d’homologie avec le génome humain, d’où son intérêt majeur en recherche fondamentale sur le développement. En plus, des souris génétiquement modifiées existent déjà pour les gènes étudiés. Les souris femelles donneuses d’embryons sont des souris âgées de 3 à 12 semaines : la stimulation hormonale est efficace pour induire l’ovulation sur cette tranche d’âge.

Maintenir sur pied des lignées de poules pour de futures expériences et pour l'expertise utile aux sélectionneurs commerciaux : 3 640 poules vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, réutilisées ensuite comme reproductrices ou dans d'autres protocoles. Chaque animal subit une ou deux prises de sang de moins d'une minute, parfois au sinus occipital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut provoquer des lésions cérébrales. Le passage en cage collective ouvre des épisodes de picage pouvant aller jusqu'à des plaies cutanées profondes et des atteintes de l'appareil locomoteur, et les élevages de longue durée entraînent des dégradations d'état général dont la cause reste parfois indéterminée avant autopsie. Le porteur situe l'intérêt de ces lignées dans la coloration du plumage, caractère servant à distinguer les poulets commerciaux sur les marchés à l'export, et dans un déterminisme d'ovulations multiples encore inconnu.

Objectifs

Pour la lignée d'origine égyptienne , le présent projet vise à maintenir son originalité en limitant l'évolution de la consanguinité, inévitable dans une population fermée, et à caractériser son génome de manière approfondie. Pour les génotypes modèles, le projet consiste à produire des animaux de phénotypes contrastés au sein de familles informatives afin d'identifier la base moléculaire de ces phénotypes. Pour tous les caractères morphologiques, le déterminisme monogénique est déjà établi, mais la nature du gène responsable reste à identifier par séquençage du génome et analyses histologiques. Pour la lignée à ovulations multiples, un projet de séquençage est en cours pour identifier les régions du génome contrôlant ce caractère par différence avec les données de séquençage d’autres lignées de race identiques qui ne présentent pas ce phénotype.

Bénéfices attendus

La lignée d'origine égyptienne a déjà été étudiée pour l'étude des mécanismes de résistance à la coccidiose, à la maladie de Marek et a montré un effet d'hétérosis important en croisement avec une lignée commerciale de poules pondeuses à oeufs bruns. C'est un génotype de référence à garder disponible sur pied pour de futures expériences sur l'adaptation à des conditions d'élevage diversifiées ou sub-optimales. Les modèles génétiques donnent lieu à des publications de haut niveau présentant le mode d'action de gènes importants pour le développement ou pour la pigmentation. La coloration est un caractère utilisé pour distinguer différents types de poulets commerciaux et se révèle importante pour les sélectionneurs visant des marchés à l’export. Le maintien de ces modèles permet de conserver une expertise utile pour des collaborations avec les sélectionneurs commerciaux. Le déterminisme des ovulations multiples est encore inconnu, en particulier dans les lignées légères comme la race Leghorn blanche. Le maintien de cette lignée nous permet d’appliquer une approche de génétique inverse pour identifier ce déterminisme et de pouvoir ensuite réaliser des prélèvements pour valider des gènes candidats suggérés par l’approche génétique.

Procédures

Une à 2 prises de sang d'une durée de moins d'une minute

Impact sur les animaux

Le passage en cage collective ou en parquets au sol de groupes de coqs modifie la structure sociale du groupe, entraînant des comportements de dominance-dominé qui peuvent être observés jusqu'à ce que la structure sociale se rétablisse. Le passage à la cage collective comporte intrinsèquement des risques de picage entre les animaux, pouvant entraîner des plaies cutanées plus ou moins profondes et étendues, ainsi que des atteintes à l'appareil locomoteur. Au cours des élevages de longue durée comme celui-ci, une dégradation de l'état général d'un individu peut également être observée, les causes étant parfois indéfinies avant une autopsie. La réalisation d'une prise de sang est susceptible de conduire à la formation d'un hématome. Si elle est effectuée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent survenir. La contention au moment de la prise de sang peut également générer un stress chez l'animal, qui est momentanément privé de ses mouvements (maximum 1 minute).

Devenir

Nous utilisons les individus pour permettre la production d'une descendance. Les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de pouvoir les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus en bonne santé et de génotype connu.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de maintenir une population d'animaux vivants présentant des phénotypes d’intérêt. Cette démarche ne serait pas réalisable sans leur utilisation. Toutefois, il est possible de réaliser de la congélation de semence pour les animaux porteurs de mutations identifiées. Le taux d’éclosion en semence décongelée reste très variable et toujours inférieur à 50%, donc on ne peut utiliser cette solution de remplacement que pour conserver des coqs porteurs d’une mutation déjà identifiée, facile à suivre dans leur descendance. En revanche, pour la lignée Fayoumi, des essais antérieurs de congélation de semence ont montré une faible fertilité après décongélation, donc cette solution est un appoint pour sécuriser la lignée ou reconstituer des familles perdues, mais en aucun cas une solution de remplacement total.

Réduction

Nous avons déjà réduit au maximum les effectifs de reproducteurs pour les génotypes modèles et pour la lignée d'origine égyptienne. Toutefois, au fur et à mesure de l'identification des mutations causales et de leur publication, nous prévoyons de diminuer le nombre d'animaux porteurs, et d’augmenter le recours à la congélation de semence si la qualité de la semence des coqs le permet, afin d’espérer une fertilité suffisante après décongélation.

Raffinement

Hébergement : Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au long de l’élevage. Les animaux en comportement collectif auront à leur disposition divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques, des bandelettes de tissus pour stimuler le jeu, et des isolateurs seront inclus dans certaines cages pour offrir aux animaux des zones de refuge. Pour prévenir le picage, des répulsifs anti-picage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite) a été développé et sera fourni aux zootechniciens en charge du suivi des animaux. Procédure : Dans le cas de la prise de sang au sinus occipital, afin de réduire les risques de lésion cérébrale associés à cette procédure, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille pour éviter toute enfoncée excessive. La facilité de visualisation de ce site d'injection évitera l'arrachage douloureux de plumes pour les animaux. Un point de compression de 30 à 60 secondes sera effectué pour limiter la formation d'hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour assurer une contention appropriée pendant la prise de sang, permettant ainsi de limiter les mouvements erratiques des animaux susceptibles d'entraver le prélèvement. Tout le personnel affecté à cette tâche sera formé à la contention et à la prise de sang sur la volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital recevront une formation spécifique à cette procédure et auront l'habitude de la réaliser régulièrement pour assurer la fluidité des gestes. Dans le cas de la prise de sang effectuée à la veine alaire ou jugulaire, de l'alcool à 70°C sera appliqué pour désinfecter la zone de prélèvement et profiter des capacités de vasodilatation de ce produit, rendant ainsi la ponction plus aisée. De plus, un point de compression sera réalisé et deux expérimentateurs seront mobilisés.

Choix des espèces

Les applications attendues de nos travaux concernent la sélection et la gestion de la diversité génétique des volailles. La poule est l’espèce de volaille la plus utilisée en recherche et en production. C’est aussi celle dont le génome est le mieux connu parmi tous les oiseaux domestiques. Enfin certains phénotypes ne s’expriment que dans cette espèce. Pour toutes ces raisons nous avons choisi l’espèce Gallus gallus. Les animaux sont utilisés au stade jeune, pour l’observation des variants morphologiques, et au stade adulte pour les performances de ponte et de production de semence.