Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système urogénital
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Un ovule de la taille d'un grain de blé est introduit au pouce dans le vagin de souris maintenues par la base de la queue, pendant deux minutes trente, jusqu'à trois fois pour la même femelle. 640 souris vont être utilisées dans ces procédures, classées au niveau de souffrance léger, pour tester si une molécule odorante, le lyral, empêche la fécondation et pourrait fournir une contraception sans hormone. Le porteur écrit que l'expérimentateur exerce un massage doux pour "apporter du bien être à l'animal pendant ce geste" et que la souris ne montre aucun signe de douleur, tout en prévoyant de surveiller pendant deux à trois semaines l'apparition de dermatites et de conjonctivites dues au caractère allergisant du lyral. Les femelles retournent au pool des accouplements après chaque essai, et les souriceaux qui naissent sont mis à mort immédiatement, sans que leur nombre apparaisse.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
650 rats vont être utilisés, chacun logé seul en cage pour que sa consommation alimentaire soit mesurée, quatre jours par semaine pendant six semaines, avec deux heures de retrouvailles quotidiennes ou un week-end en binôme. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue. Jeûne de quinze heures, privation d'eau de six heures, sept passages au maximum dans des tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, jusqu'à cinq prises de sang, quarante-huit heures en cage de collecte d'urines et de fèces, et pour quarante rates deux traites manuelles sous anesthésie après trois heures de séparation de leurs petits. L'enjeu déclaré est d'évaluer les effets de la végétalisation de l'alimentation humaine sur le métabolisme et le comportement, les résultats devant alimenter une collection de données utile aux pouvoirs publics.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Identifiées par ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, 1 320 souris subissent ensuite jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de leur vie, sur animal vigile sous contention. 880 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Le porteur qualifie la biopsie de phalange de non douloureuse au motif que les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées à cet âge, et écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", tout en listant les signes qui déclenchent une mise à mort immédiate : posture inhabituelle, poil hérissé, dos voûté, retrait des congénères. Les souris dont le gène est inactivé dans l'intestin peuvent développer des diarrhées et des troubles de la croissance, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée, ces animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 2/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Identification et genotypage des souris en élevage
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
690 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au sein d'un élevage de lignées modélisant des malformations cardiaques congénitales. Chaque animal est saisi par la queue une dizaine de secondes, le temps d'une biopsie caudale de cinq secondes destinée à vérifier la transmission du gène modifié. Le porteur indique que ces souris sont maintenues en vie pour une utilisation continue dans d'autres autorisations de projet, l'élevage servant à produire les cohortes des expériences suivantes. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" et que le recours à l'animal est "incontournable", cellules in vitro et organoïdes ne rendant pas compte du développement du cœur.
Objectifs
Elevage de souris à des fins de recherches sur les pathologies cardiaques congénitales ( malformations du coeur à la naissance) Nous élevons des souris qui modélisent des pathologies cardiaques congénitales telles que la cardiomyopathie dilatée (dilatation du ventricule gauche ) ou le Syndrome de Cornelia de Lange, une maladie du développement affectant la formation et la fonction de nombreux organes. Ces deux souris modèles nous ont permis de mettre en évidence des pistes thérapeutiques pharmacologiques (identification de médicament utilisés pour la cancérologie) qui feront l' objet de projets cliniques dans un futur proche. Ces souris plus généralement nous permettent également de mieux comprendre la formation du coeur et de chercher l 'origine des malformations qui sont susceptibles de se produire.
Bénéfices attendus
un génotypage (c'est à dire la vérification de la transmission du gène modifié dans le modèle de souris à partir des parents) adéquat très important pour la rigueur de nos recherches
Procédures
les souris seront soumises à une légèrepréhension par la queue pendant 10 secondes pour la biopsie de queue qusi ne dure que 5 secondes ce qui pourrait événtuellement entraîner une légère et courte douleur
Impact sur les animaux
les gestes sont très rapides et n'apportent à la souris qu'une gêne à la préhension
Devenir
Ces souris sont élévées pour une recherche continue sur les malformations cardiaques congénitales apparaissant de novo ou associéees à des maladies rares. Les souris sont maintenus en vie, pour une utilisation continue dans des DAP d'expérimentation. Dans seulement les 5 dernières années, nous avons pu mettte en évidence deux cibles médicamenteuses grace à l utilistion de ces souris. Ceci a permis en collaboration avec nos collègues cliniciens le design actuel de deux essais cliniques chez des patients.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la regle des 3R. L’étude des pathologies cardiaques congénitales nécessite de recourir a l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par des cellules in vitro ou des organoides qui ne peuvent rendre compte fidèlement du développement, de la maturation et du fonctionnement du coeur
Réduction
Le recours a l’animal etant incontournable, nous avons reduit le nombre d’animaux au minimum pour le strict maintien de la colonie pour chaque allèle
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid, cartons à ronger)
Choix des espèces
3.4.3. Justifiez la pertinence des espèces animales choisies La souris peut être facilement modifiée génétiquement. Nos modèles murins récapitulent parfaitement le phenotype des patients. Elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour les pathologies cardiaques congénitales
Génotypage invasif des lignées transgéniques murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.
Bénéfices attendus
Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.
Devenir
Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.
Réduction
Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.
Etude des canaux potassiques dans l’activité neuronale du réseau locomoteur spinal chez les souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés sont retirés à leur mère pendant quatre heures au maximum, le temps qu'une injection virale soit faite dans leur colonne vertébrale, puis rendus à une femelle qui peut se montrer agressive à leur retour. 540 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 444 d'entre elles, léger pour 64, et menées sous anesthésie sans réveil pour 32. À partir du cinquième jour suivant l'injection, chaque animal passe trois sessions de tests comportementaux de trois à quarante minutes, et celles issues de la lignée génétiquement modifiée subissent une biopsie de l'extrémité de la queue. Le porteur indique qu'une mauvaise manipulation de l'injection rachidienne peut, rarement, léser la moelle épinière et paralyser les pattes arrière dès le réveil, 508 souris étant tuées pour prélèvement de tissus et 32 gardées vivantes pour l'élevage ou des prélèvements hors saisine.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'équilibre de la balance portée par les fibres nerveuses qui inhibent ou qui excitent le réseau de neurone innervant les muscles des pattes postérieures, est renforcé par les propriétés endogènes de ces neurones. C'est ce jeu d'influence qui dans sa finalité, conduira ou non à une contraction musculaire. L'un des projets de l'équipe est d'étudier, dans les conditions normales, les mécanismes moléculaires qui conduisent à cette réponse musculaire. Une protéine est principalement ciblée. Elle existe sous différentes formes et s'exprime à la surface des neurones. Ces différentes versions seraient susceptibles de jouer un rôle dans l'activité électrique de la cellule nerveuse. Des approches génétiques, biologiques, seront employées pour caractériser la contribution individuelle ou collective de ces protéines sur le modèle murin, des études comportementales analyseront leur effet global sur la posture et la locomotion de l'animal.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables de l'activité des cellules nerveuses dans un réseau sain. En ciblant spécifiquement une protéine d'intérêt par l'outil génétique sur le modèle de la souris, ces études approfondies fourniront des données solides sur le rôle de cette protéine dans les conditions normales. Enfin, ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté scientifique.
Procédures
Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection du virus pendant 4h maximum car c'est toute la portée qui est concernée, l'injection proprement dit se fait en moins d'une minute mais la préparation en post injection et pré-injection nécessite 20 min par animal. Plus tard dès le 5eme jour post injection, les animaux injectés vont suivre des sessions d'expérimentations non invasives à une fréquence de 3 sessions par animal sur l'ensemble de l'étude, couvrant les 3 premières semaines postnatales. Ces tests comportementaux durent entre 3 et 40 min maximum en fonction des tests, les enregistrements vidéo durent 3 min maximum par animal. Chez les souris génétiquement modifiées, pour distinguer précocément celles qui le sont de celles qui ne le sont pas, il est nécessaire de faire un test génétique à partir d'un fragment (
Impact sur les animaux
Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection virale, puis plus tard lors des tests comportementaux et des enregistrements vidéos. Les manipulations et les changements de lieux des animaux pour ces tests peuvent également engendrer du stress. Bien que l'injection dans la colonne vertébrale soit généralement sûre, dans de très rares cas , une mauvaise manipulation peut entraîner une lésion de la moelle épinière, pouvant causer une paralysie partielle ou totale des membres postérieurs, visible dès le réveil. Les animaux injectés peuvent perdre du poids. La mère peut être stressée du fait de l'enlèvement de la totalité de ses petits et peut avoir des signes d'agressivité au retour des souriceaux qui auront subi une injection virale à la naissance. Le phénotype éventuel attendu serait un déficit moteur qui pourrait potentiellement se manifester par un affaissement de l'arrière train, des tremblements des pattes postérieures. La biopsie de l'extrémité de la queue des souriceaux provenant de la lignée de souris génétiquement modifiée, peut induire du stress chez l'animal et un léger saignement.
Devenir
les animaux sont mis à mort pour prélèvement tissulaire. Les 32 animaux gardés en vie seront potentiellement utilisés pour l'élevage ou pour des prélèvements tissulaires pour des procédures hors saisine.
Remplacement
Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal demeure essentielle, car nous étudions la complexité du réseau de neurones innervant les muscles des pattes postérieures dans les conditions normales d'une activité de locomotion où de nombreux paramètres rentrent en jeu.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 540 animaux. Il s'agit d'une poursuite des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. Les études comportementales seront menées longitudinalement, ainsi chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera le nombre d'animaux utilisés. A la fin de cette étude longitudinale, les tissus des animaux âgés de 21 jours seront prélevés, évitant ainsi de rajouter un lot d'animaux supplémentaire pour les études protéiques prévues à la 3eme semaine postnatale.
Raffinement
Une fois injectés, les animaux sont maintenus en fratrie et ramenés à la mère. Pour minimiser les épisodes d'agressivité de la mère envers les nouveau-nés injectés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements stéréotypés ou anxieux. De plus, nous pourrons utiliser des récompenses pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...). Que ce soit pour l'injection virale, les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. A partir du stade juvénile, du gel nourrissant ou des récompenses peuvent leur être fourni dès qu'ils sortent de la zone de stabulation. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur, en observant des points limites pour les jeunes animaux.
Choix des espèces
Cette étude est dans la continuité de nos projets scientifiques précédents. Nous avons une grande expertise de ce modèle, nous avons accumulé de nombreuses données sur lesquelles nous pouvons nous baser. L'injection virale est également un outil que nous maîtrisons sur ce modèle. Les animaux seront utilisés principalement au cours des 3 premières semaines post-natales. La tranche d'âge de la première et deuxième semaines post-natales restent compatibles avec les techniques d'enregistrements de l'activité neuronale sur tissu prélevé tandis que la deuxième et troisième semaines post-natales sont des périodes clés pour l'acquisition de la marche et donc pour nos études comportementales chez l'animal. Nous postulons que le niveau d'expression des protéines d'intérêt est déjà détectable à la naissance, ce qui permet une étude protéique couvrant les 3 premières semaines de vie de l'animal.
Elevage des tiques dures sur lapins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
L'objet réel de ce projet est de nourrir avec du sang de lapines vivantes un élevage de tiques que l'unité entretient depuis quinze ans. 10 lapines vont être utilisées sur cinq ans, cinq tuées et cinq adoptées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tiques restent fixées sur leurs oreilles quatre à sept jours, sans anesthésie ni pendant la pose ni les jours suivants, et chaque lapine sert trois fois en quatre mois pour couvrir un cycle complet du parasite. Le devenir dépend du caractère de l'animal, celles que le porteur juge trop agressives seront tuées après avis du vétérinaire, les plus dociles proposées à des particuliers.
Objectifs
L’élevage des tiques est bien établi dans l’unité depuis 15 ans. L’objectif principal de ce projet est d’établir et de maintenir des élevages de tiques qui sont les vecteurs de certaines maladies humaines et animales et d’étudier le rôle des tiques dans l’acquisition et la transmission de certains microorganismes aux humains et aux animaux.
Bénéfices attendus
Cet élevage permettra de maintenir des espèces de tiques nécessaires pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et les vecteurs (tiques) pour la compréhension de la transmission des maladies humaines et animales (zoonose).
Procédures
Une lapine sera utilisée pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (oeufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Les lapines ne sont pas anesthésiées ni durant la pose des tiques, ni les jours suivants. Les tiques restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont dues à la piqure des tiques qui restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement de la tique. Cette fixation provoque des lésions peu importantes et parfois des démangeaisons.
Devenir
Les animaux qui sont trop agressifs pour être adoptés et ceux qui auront d’autres anomalies seront euthanasié après avis du vétérinaire de notre laboratoire. Par contre, les animaux en bonne santé et les moins agressifs seront adoptés pas des particuliers.
Remplacement
Les tiques sont des acariens strictement hématophages à tous les stades de développement. Actuellement, aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des tiques n’est disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisé dans notre laboratoire pour gorger les tiques sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire.
Réduction
Un lapin sera utilisé pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (œufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 3 à 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Un lapin sera donc utilisé 3 fois/an/espèce de tiques. Donc, seulement 2 lapins seront utilisés par an (un pour chaque espèce de tiques de notre élevage) soit 10 lapins pendant la durée totale de ce projet (60 mois).
Raffinement
Pendant la période d’engorgement nous allons proposer le gel Diet Energy de Safe dites qui est un aliment hydraté contenant 63% d’eau. Après engorgement des tiques les oreilles des lapins seront nettoyées avec de la bétadine et les jours suivants jusqu’à guérison des lésions causées par les tiques. Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec des foins, des jouets en bois.
Choix des espèces
Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les trois stades de développement des tiques, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage des tiques au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille des adultes permettra de les manipuler facilement et de nourrir plus de tiques sans utiliser d'animaux supplémentaires. La grande taille des oreilles permet un nourrissage d'un grand nombre d'individus. De plus, cette taille d'oreille nous permet une fixation facile des chaussettes et carcans.
Démonstration de l’existence in vivo du modèle de transport Sushi-go-round
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune opérée du cerveau deux fois, une première injection virale avant l'âge de quatre jours, une seconde entre vingt-quatre et vingt-huit jours. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère jusqu'à deux heures pour la première intervention. Le porteur identifie le cannibalisme maternel comme le principal problème de ses procédures et énumère cinq parades, dont des friandises données aux femelles pour qu'elles associent son intervention à quelque chose de positif. L'enjeu est de vérifier dans un cerveau vivant un mécanisme de transport cellulaire déjà décrit sur des cultures de neurones, les retombées médicales étant renvoyées à d'éventuelles pistes futures.
Objectifs
Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.
Bénéfices attendus
Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.
Procédures
Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.
Impact sur les animaux
- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.
Devenir
Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.
Remplacement
Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.
Réduction
Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.
Raffinement
Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).
Choix des espèces
Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.
Rôle de forces mécaniques dans le développement du système nerveux chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux, 3 120 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 180 d'entre eux. Une partie subit un prélèvement de nageoire caudale pour génotypage et un prélèvement de gamètes sous anesthésie, gestes dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent être douloureux au réveil. D'autres sont exposés trente minutes à des molécules odorantes dont certaines sont connues pour leur effet répulsif, ou immobilisés une heure pour l'imagerie de l'activité neuronale, l'isolement lié au génotypage et à l'analyse de nage étant lui aussi compté comme une nuisance. Les poissons sont tués par excès d'anesthésiant ou par refroidissement rapide, faute de porter le génotype voulu, à la limite d'âge de 24 mois fixée par l'animalerie ou en fin d'expérience, à l'exception de 360 gardés en vie pour des projets ultérieurs.
Objectifs
Nous étudions le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux. Les mouvements cellulaires sont omniprésents dans le développement des circuits neuronaux : dans l’embryon, les neurones migrent vers leur destination finale et forment de longues protrusions qui s'allongent avant de se connecter au niveau des synapses. L'étude de ces processus s'est jusqu'ici focalisée sur les signaux chimiques qui guident la migration neuronale et la navigation des axones. Or les mouvements des neurones et de leurs protrusions sont aussi influencés par des forces mécaniques, dont la fonction reste largement inconnue in vivo. Disséquer le rôle des forces mécaniques dans l'assemblage des circuits neuronaux représente donc un défi majeur pour les neurosciences modernes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur la construction du système nerveux en mettant en lumière l'importance des signaux mécaniques, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du développement neuronal. Au-delà de son impact fondamental en neurosciences, ce projet a des implications biomédicales dans l'étude de l'origine des maladies du système nerveux et la bioingénierie des tissus. Ici, nous nous concentrons sur la contribution des forces mécaniques dans la migration neuronale et la croissance des axones, deux événements clés de la construction des circuits neuronaux. Si l'un de ces deux processus ne se produit pas correctement, la fonction du système nerveux est affectée, comme en témoignent les troubles neurodéveloppementaux graves résultant de défauts de migration neuronale et de formation des axones, tels que les lissencéphalies, le retard mental, les épilepsies et le syndrome de Kallmann. La contribution des forces mécaniques dans l'origine de ces maladies est loin d'être comprise et nécessite plus d'attention. De plus, décrypter la réponse des neurones aux signaux mécaniques in vivo fournira des informations précieuses pour la conception de systèmes de culture neuronale et d'échafaudages 3D associés dédiés à la réparation du cerveau et de la moelle épinière. Nos travaux alimenteront ainsi potentiellement les développements futurs en ingénierie biomédicale pour aider à traiter à long terme les lésions du cerveau et de la moelle épinière.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements de fragments de nageoire pour identification génétique (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 3 minutes), à des prélèvements de gamètes pour préservation des lignées (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 10 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse du comportement de nage sur animaux vigiles (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse de l'activité des neurones par microscopie sur animaux immobilisés (durée de l'immobilisation : 60 minutes, durée de l'imagerie pendant la stimulation avec des molécules odorantes : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes sur animaux vigiles suivie d'une euthanasie par refroidissement rapide (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 5 minutes), à une euthanasie par excès d'anesthésiant (1/poisson).
Impact sur les animaux
La substance appliquée aux poissons pour l'anesthésie et l’euthanasie provoque un comportement d'aversion et/ou de stress. De plus, même s’il se fait sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale (fin clip) peut générer une douleur après le réveil, ainsi que le prélèvement du sperme et des ovocytes. L’isolement des poissons au moment du génotypage par fin clip ou de l’analyse de la nage représente également une nuisance. Enfin, certains stimulis odorants que nous allons utiliser sont connus pour avoir un effet répulsif sur les poissons, ce qui peut stresser les animaux. L’immobilisation des animaux pour l’imagerie de l’activité neuronale peut également stresser ou générer un inconfort chez les larves analysées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures décrites dans ce projet, exceptés pour 360 d’entre eux qui seront gardés en vie et réutilisés pour des projets ultérieurs dédiés à de nouvelles études du développement de la fonction olfactive chez le poisson-zèbre. Les poissons seront euthanasiés parce qu'ils ne portent pas le génotype d'intérêt, parce qu'ils ont atteint la limite d'âge imposée dans l'animalerie (24 mois), ou en fin de procédure expérimentale (après stimulation olfactive et analyse du comportement de nage ou de l'activité des neurones - il est impossible de les ré-utiliser car ils seront sortis physiquement du système d'élevage, et après stimulation olfactive pour prélèvement/analyse du cerveau sur échantillons fixés).
Remplacement
L’expérimentation sur le poisson-zèbre est essentielle pour répondre à notre question scientifique, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus complexes qui sous-tendent le développement du système nerveux et la contribution des forces mécaniques. L'utilisation du poisson-zèbre comme modèle est notamment essentielle pour étudier les interactions mécaniques entre les neurones en développement et les tissus environnants, car de telles interactions sont encore très difficiles à reproduire in vitro.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place, lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des embryons à des stades précoces (avant 5 jours). Pour chaque expérience, le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à un calcul de puissance. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux employés dans le projet est de 3120.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’élevage des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28 degrés, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2 ou 3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de chasse/prédation. Les étagères pour les bacs de croisements sont recouvertes de posters figurant des galets, de manière à diminuer le stress généré par le changement d’environnement/d’étagères pendant les croisements. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Nous allons mettre en place la congélation de sperme pour conserver les lignées qui sont transitoirement inutilisées. Outre le gain de place, ceci évite de renouveler les lignées et de procéder à des expériences de génotypage qui produiraient des animaux sauvages qu’il faudrait ensuite euthanasier. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de modification du génome en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse (comprendre comment les organes acquièrent leur forme et leur fonction) et de développement du système nerveux. Pour produire des animaux mutants, nous réalisons une micro-injection dans l’embryon au stade 1-4 cellules. Nous suivons les animaux aux stades larvaires, juvéniles et adultes sur plusieurs générations (sur 5 ans : 3 générations) pour détecter toute anomalie potentiellement nuisible dans les poissons injectés ou porteurs d’une mutation. Quand cela est nécessaire nous génotyperons (génotyper signifie analyser l'ADN) les poissons adultes de nos lignées par prélèvement d’un fragment de nageoire. En effet, il n’est pas toujours possible de réaliser le génotypage aux stades précoces c’est à dire avant 5 jours (incompatibilité avec le calendrier et/ou les expériences) et nous devons dans ce cas effectuer le génotypage à partir de 3 mois. Les prélèvements de sperme et d’ovocytes se font à l’âge adulte. Les tests comportementaux consistant à exposer les poissons à des odeurs puis analyser leur nage seront réalisés aux stades juvénile et adulte. En effet, c’est à partir du stade larvaire que le système olfactif commence à être fonctionnel et en état de répondre aux odeurs. L’analyse de l’activité des neurones par imagerie sera réalisée au stade larvaire. C’est à partir de ce stade que le système olfactif commence à être fonctionnel. Nous exposerons des poissons juvénile et adulte à des stimuli odorants puis nous les euthanasierons par choc thermique avant de réaliser des analyses sur leurs cerveaux fixés.
Rôle de l’activateur tissulaire du plasminogène au cours de l’allaitement et son importance au cours du développement post-natal.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
3 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance sévère. 720 souriceaux subissent une chirurgie de 45 minutes destinée à poser des prothèses de contention qui immobiliseront leur tête pendant l'imagerie, puis jusqu'à 50 minutes d'IRM et une heure d'échographie fonctionnelle. Pour injecter l'agent de contraste, 600 d'entre eux reçoivent une piqûre intracardiaque sous anesthésie, 960 autres souriceaux étant utilisés uniquement pour des prélèvements de tissus entre le 7e et le 60e jour de vie. Les 750 femelles allaitantes comptées dans le projet ne subissent aucune intervention, le porteur ne retenant pour elles que le stress de la séparation répétée d'avec leurs petits. Le bénéfice annoncé reste d'acquérir des données fondamentales sur l'influence du lait maternel sur le développement du cerveau.
Objectifs
Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (tel que l’activateur tissulaire du plasminogène) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central et peuvent jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, elles peuvent jouer un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral. Notamment, l'absence de l'activateur tissulaire du plasminogène au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline qui entoure les neurones, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette protéine présente dans le lait maternel, au cours de l’allaitement, sur le développement cérébral post natal. Pour ce faire, des souriceaux déficients en activateur tissulaire du plasminogèneseront adoptés et élevés dès leur naissance (jour post natal 0 ; P0) par une mère ayant conservé le gène codant la protéine. De la même façon, nous utiliserons également des souriceaux nés d’une mère exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène, élevés par une mère déficiente en cette protéine. Deux groupes de souriceaux contrôles seront également utilisés : un groupe de souriceaux exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène et un groupe ne l'exprimant pas resteront avec leur mère biologique respectives. Des analyses comportementales, en imagerie par résonnance magnétique anatomique ainsi qu’en imagerie fonctionnelle échographique seront réalisées à plusieurs stades de développement post-natal, jusqu’à l’âge adulte. Des études transcriptomiques et protéiques seront également conduites à partir de prélèvements de tissus.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude du rôle des protéines du système d’activation du plasminogène doit se faire au cours de la phase d’allaitement sur des souriceaux in vivo, afin d’observer leur trajectoire neurodéveloppementale, d’un point de vue fonctionnel et morphologique.
Procédures
L’anatomie du système nerveux central sera observée en imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 720) et en imagerie fonctionnelle échograpghique (1 heure maximum, n = 720) aux jours post-nataux (P) 7, 10, 15, 21, 30 et 60. Cette dernière technique nécessitera l’administration d’un agent de contraste par voie intra veineuse. La méthode la plus efficiente pour cette administration jusqu’à P30 est en intracardiaque, sous anesthésie (n=600), et par pose d’un cathéter sur la veine caudale de la queue à P60 (n=120). Une procédures chirurgicale d’une durée de 45 minutes sera réalisée afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie (n = 720). Le développement des capacités sensorimotrices, cognitives et émotionnelles sera également évalué, de manière longitudinale à P7, P10, P15, P21, P30 et P60 (n = 600). 960 souriceaux serviront uniquement à prélever des tissus à P7, P10, P15, P21, P30 et P60. Les 750 gestantes ne subiront aucune intervention et la seule nuisance qu'elle pourraient recevoir serait liée à un éventuel stress lors de la séparation avec leur souriceaux lors des évaluations comportementale de ces derniers.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. De plus, nous disposons au laboratoire d’une souche de souris très bien caractérisée, qui sont déficientes en activateur tissualire du plasminogène, ce qui en fait le modèle le plus adapté à ce projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies neurodéveloppementales humaines.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, afin de ne pas biaiser les résultats, les analyses comportementales ne seront pas suivi d’analyses morphologiques afin d’éviter les effets de la récupération fonctionnelle en réponse à la plasticité cérébrale. Dans la même idée, aucune évaluation comportementale ou histolgique ne sera réalisé consécutivement aux imageries qui nécessitent une anesthésie générale. En effet, des travaux récents mettent en évidence que l’anesthésie agit sur l’intégrité cérébrale, surtout lorsqu’elle est pratiquée précocement au cours du développement. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches génétiquement modifiées disponibles au laboratoire comme celles déficientes en activateur tissulaire du plasminogène. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur l’étude du neurodéveloppement post-natal, il est donc nécessaire de se procurer des femelles allaitantes avec leurs souriceaux. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques, comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (P7 / P10 / P15 / P21 / P30 / P60) est nécessaire afin d’identifier des différences significatives dans la trajectoire développementale des différents groupes.