Biologie du développement

Une injection unique de marqueur dans l'abdomen, puis l'anesthésie et la mise à mort pour prélever les embryons : 45 souris gestantes génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des nouveau-nés sont également tués quatre jours après leur naissance pour analyse histologique du cortex, et chaque future femelle reproductrice subit une biopsie de queue entre le septième et le dixième jour de vie pour génotypage. L'objet du travail est de préciser le rôle d'un gène dans la production des neurones du cortex embryonnaire, sur deux années de prolongation d'un projet arrivé à échéance. Le gène en question n'est jamais nommé, et les 45 femelles forment le seul effectif annoncé, les embryons et les souriceaux tués n'étant comptés nulle part.

Objectifs

Notre projet vise à mieux comprendre le rôle d'un gène dans le contrôle de la neurogenèse dans le cortex cérébral chez l’embryon. Le développement du cortex est un processus complexe encore très mal compris dont les dérèglements sont à l’origine de pathologies graves chez l’humain (épilepsie, retards mentaux, troubles comportementaux et cognitifs). Il implique de nombreux partenaires moléculaires dont beaucoup restent à découvrir. Nous disposons d’un modèle de souris génétiquement modifiée dans lequel notre gène d’intérêt est inactivé spécifiquement dans les cellules à l’origine des neurones du système nerveux central. Des résultats préliminaires nous ont montré que l’inactivation de ce gène modifiait le nombre de neurones produits dans le cortex de l’embryon à des stades précoces. Afin de préciser ces défauts de neurogenèse, nous souhaitons pouvoir analyser les conséquences de l’inactivation de ce gène à plus long terme, à différents stades embryonnaires et après la naissance, sur l’organisation anatomique du cortex cérébral et le nombre de neurones générés. Pour cela nous effectuerons une injection intrapéritonéale unique à des souris génétiquement modifiées gestantes à un stade donné d’une solution d’une molécule qui permet de repérer les neurones en cours de génération. Un à sept jours embryonnaires plus tard, la mère gestante sera anesthésiée et euthanasiée selon les procédures réglementaires pour prélever les embryons pour des analyses histologiques. Des nouveaux-nés seront aussi euthanasiés 4 jours après leur naissance pour des analyses histologiques. La présente DAP est une demande de prolongation de 2 ans d'une DAP arrivant à échéance fin 2024.

Bénéfices attendus

La prolongation de ce projet permettra de finaliser l'étude visant à comprendre le rôle de notre gène d'intérêt dans le développement du cortex cérébral. Chez l'homme, des formes mutées de ce gène conduisent à plusieurs pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, dépression et schizophrénie) chez l'adulte et des retards mentaux chez l'enfant. Cette étude permettra de proposer de nouvelles hypothèses sur les processus physiopathologies générés par ces mutations.

Procédures

Les 45 femelles gestantes vigiles sont soumises à une seule injection intrapéritonéale durant 2 secondes d'un composé de marquage non douloureux. Elles sont anesthésiées avant euthanasie. Chaque animal voué à devenir une femelle transgénique gestante fait par ailleurs l’objet d’une biopsie de queue entre J+7 et J+10 pour génotypage.

Impact sur les animaux

La présente demande est de classe légère. L’injection intrapéritonéale du composé en solution physiologique provoque une douleur légère et de courte durée. Le produit injecté n’a pas de conséquence délétère sur la santé de la mère et des embryons ou jeunes souriceaux. Le phénotype des embryons et des jeunes souriceaux génétiquement modifiés « mutants » n’est pas dommageable. Le phénotype des individus génétiquement modifiés contrôles n’est pas dommageable. Cette étude nécessite le maintien d’une lignée transgénique pour générer les parents impliqués dans l’étude. Le phénotype des parents n’est pas dommageable.

Devenir

Les souris gestantes ayant subi l'injection intrapéritonéale du composé de marquage, seront anesthésiées et euthanasiées pour le prélèvement des embryons. Elles ne peuvent être réintroduites en animalerie, ni réutilisée du fait de la présence du composé de marquage dans les tissus. Les embryons et nouveaux-nés sont euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Le cortex cérébral étant caractéristique des mammifères et les protocoles de culture in vitro ne permettant pas de reconstruire un cortex typique, nous sommes contraints de travailler sur des souris à différents stades embryonnaires et post-natals. Compte-tenu des similitudes entre les processus de développement du cortex chez les primates et la souris, le modèle souris permettra d'obtenir des résultats vraisemblablement utiles à la connaissance des processus humains.

Réduction

Pour limiter le nombre de souris gestantes, tous les individus de la portée qu’ils soient mutés ou non mutés seront utilisés pour les analyses, les animaux non mutés servant de contrôles. De plus, nous combinerons plusieurs types de marquages histologiques sur les mêmes individus. Nous prélèverons et archiverons un maximum de tissus à partir d’un même individu, et ce, en prévision de futures expériences.

Raffinement

Pour raffiner les conditions d’utilisation des animaux, les souris gestantes sont élevées dans un environnement enrichi. Préalablement à l’injection, les souris gestantes seront habituées à une contention manuelle. L’injection sera effectuée en respectant la stérilité et les volumes autorisés. Une surveillance journalière des souris gestantes sera effectuée pour vérifier le non dépassement des points limites adaptés et précoces jugés à travers le comportement, l’absence de souffrance, d’hémorragie ou d’infections.

Choix des espèces

Le cortex cérébral étant une structure très complexe, il n’est pas possible de le reconstruire en culture in vitro pour l’étudier. De plus, le cortex cérébral est une structure typique des mammifères. Le recours à des souris est donc nécessaire. De plus, l’invalidation d’un gène est nécessaire pour en comprendre le rôle chez le modèle souris. Nous avons choisi une stratégie invalidant de manière conditionnelle notre gène d’intérêt de manière restreinte dans le système nerveux central pour éviter une atteinte d’autres organes et ainsi avoir un phénotype le moins dommageable possible.

Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale est immédiatement mise à mort, comme tout animal dont le score de bien-être ne s'améliore pas après 48 heures ou qui perd plus de 20 % de son poids. 476 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. 120 femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales espacées de 48 heures pour déclencher une sur-ovulation, puis sont mises à mort entre 12 heures et 4 jours plus tard, dans une étude sur des variantes d'histones propres aux cellules reproductrices. Les autres sont tuées au titre de l'entretien de la colonie, parce que leur génotype ne sert pas au projet ou qu'elles ont dépassé douze mois, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de leur éviter les complications de santé liées à l'âge.

Objectifs

L’information génétique transmise par les gamètes est compactée en fibre de chromatine dont l’unité de base se compose de protéines appelées histones. Les cellules reproductrices présentent la particularité́ d’utiliser des variantes d’histones qui ne sont pas trouvées dans les tissus somatiques et sont uniques à chaque espèce. Ces variantes sont parfois induites de manière aberrante dans des cancers humains. Que ce soit au cours de la reproduction ou dans un contexte pathologique, les fonctions de ces histones restent, à ce jour, peu connues. Ces histones se trouvant exclusivement sur le chromosome X des mammifères, l’étude de leurs fonctions in vivo nécessite une approche en modèles murins. Il existe des modèles de souris mutantes déficitaires pour ces histones et des travaux antérieurs ont montré que les mâles mutants présentaient une sous-fertilité et que 10 % des embryons succombaient in utero post-implantation. Ce projet, a pour but d’identifier les conséquences de la perte de ces histones sur la structure de la chromatine des cellules reproductrices ainsi que leurs rôles au cours du développement embryonnaire précoce. Enfin, il n’existe pas d’anticorps permettant de purifier ces histones dans leurs contextes natifs, et ce projet propose de produire de nouveaux modèles de souris permettant de les identifier in vivo. Dans son ensemble, ce projet permettra de comprendre de nouveaux mécanismes mis en jeu lors de la reproduction. L’identification des fonctions de ces variantes d’histones ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques aussi bien ciblant certains cancers que combattant des infertilités.

Bénéfices attendus

Les modèles murins de ce projet ont pour but d’identifier de nouveaux processus contribuant à l’hérédité durant la reproduction. Ils présentent donc un bénéfice pour la compréhension fondamentale de ce processus. Les histones étudiées étant aussi présentes chez l’homme, ce projet contribuera à notre compréhension de la fertilité humaine. Enfin, ces variantes étaient induites de manière ectopique dans de nombreux cancers, leur caractérisation fonctionnelle ouvrira la voie vers de nouvelles routes thérapeutiques.

Procédures

Un groupe d’animaux est soumis à deux injections intra-péritonéales durant chacune moins de 5 secondes et espacées de 48h afin de stimuler l’ovulation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont : du stress et de l’angoisse de courte durée (moins de 2 minutes), et une douleur légère et transitoire, de quelques secondes, lors des injections intrapéritonéales. Bien qu'aucun phénotype dommageable n’ait été observé sur les lignées existantes, l'établissement des nouvelles lignées pourrait entrainer une baisse transitoire des performances reproductives chez les mâles.

Devenir

Pour la collecte de tissus, les procédures s’effectuent post-mortem. Pour le maintien de la colonie, le sort prévu est l'euthanasie pour les génotypes non-utilisés ainsi que pour les animaux au-delà de 12 mois. Ceci permet de minimiser le stress dû à l'élevage et d'éviter les complications de santé pouvant apparaître avec l’âge. Les 120 femelles soumises à la sur-ovulation sont euthanasiées entre 12h et 4 jours suivant les injections.

Remplacement

L’expression des gènes étudiés est limitée aux cellules reproductrices, y compris chez l’Homme. Actuellement, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire de remplacement. Les effets de ces gènes sont mesurables sur l’embryon avant l’implantation, le recours à un mammifère placentaire est donc nécessaire. La souris présente une bonne traçabilité génétique et il existe des approches génétiques déjà établies. Date de recherche de méthodes de remplacement sur base de données : 01/01/2024.

Réduction

La stratégie expérimentale choisie afin de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet est la suivante : 1) Minimisation de l’élevage par des schémas de croisements qui permettent de générer une partie des animaux contrôles et tests dans la même portée. Les estimations du nombre de cages de croisement prennent aussi en compte une portée moyenne de 8 animaux tous les mois 2) La stratégie expérimentale de collecte de tissus post-mortem permet de prélever plusieurs tissus sur un même individu. Les estimations prennent aussi en compte le fait que plusieurs types de mesures (protéines, ARN, ADN…) peuvent être effectués sur 3 à 5 échantillons de tissus (testicules, épididymes, foie…), ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.

Raffinement

La stratégie mise en œuvre pour réduire l’angoisse et la douleur induite est la suivante : 1) Utilisation du fond génétique qui présente peu de maladies spontanées et est bien adapté à l’élevage en laboratoire dans un contexte de recherche scientifique. Toutes les souris (maintenance et groupes expérimentaux) seront maintenues dans des cages avec milieu enrichi (matériel de nidification et tunnel de carton). Les lignées mutantes pour les histones étudiées présentent une légère diminution de fertilité, mais pas d’autres phénotypes dommageables à la survie et au confort des animaux en laboratoire. Ces animaux sont suivis de manière journalière. Les phénotypes des animaux produits dans ce projet n’ont pas encore été caractérisés et leur bien-être suivra une procédure d’évaluation accrue (grille d’évaluation sur deux générations) afin de déterminer s’ils présentent un phénotype dommageable. 2) Tous les tests s’effectuent post-mortem sur tissus, cellules ou embryons pré-implantatoires. 3) Afin de minimiser l’angoisse, l’ensemble de nos animaux sera surveillé chaque jour pour détecter tout signe de mal-être. Quatre indicateurs sont utilisés : - Posture et activité exploratoire dans la cage - Comportement naturel - Réponse à des stimuli extérieurs - Anomalie liée à la mise-bas chez les femelles gestantes. Tout individu présentant un signe de mal-être lors de ces surveillances fera l’objet d’une surveillance renforcée pendant 48h (voir point suivant). 4) La surveillance renforcée consiste en un suivi par grille d’évaluation du bien-être pendant 48h. Pour chacun de ces indicateurs, un score est déterminé par vérification visuelle et par manipulation. Un animal présentant un score entre 5 et 9 sera pesé. L’animal sera euthanasié si aucune amélioration du score n’est observée ou s’il présente une perte de poids supérieure à 20 % après 48h. Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale sera immédiatement euthanasiée.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser la souris répond aux critères de fertilité́ et de temps de génération requis pour une étude expérimentale en laboratoire. De plus, ces études nécessitent un modèle placentaire possédant tout le complément de gènes présents chez l’homme. Enfin, nous disposons d’outils génétiques chez la souris qui ne sont pas disponibles pour d’autres organismes modèles Pour les croisements ainsi que la collecte de tissus reproductifs matures post-mortem des animaux à maturité sexuelle sont utilisés – c’est à dire après leur sevrage et jusqu'à un an d’âge. Pour les études préimplantatoires, des stades de développement précédant et suivant l’activation du génome zygotique de 0,5 à 4,5 jours post-fécondation sont étudiés.

Reproducteurs d'au moins 90 jours, mis en croisement pour fournir les embryons et les larves d'autres projets, 5 280 poissons zèbres vont être utilisés dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun perd 20 % de sa nageoire caudale, coupée sous anesthésie à la tricaïne, avec de la lidocaïne ajoutée à l'eau contre la douleur. Le porteur indique que la nageoire repousse en sept à dix jours et que le poisson nage correctement entre-temps. Le prélèvement sert à trier les individus, 2 400 porteurs de la mutation recherchée partant vers des projets ultérieurs, les 2 880 autres étant tués.

Objectifs

Permettre de déterminer le statut génétique des poissons adultes âgés d'au moins 90 jours de vie.

Bénéfices attendus

Le projet nous permet de conserver uniquement les individus de génotypes désirés et s'intègre dans la Réduction du nombre d'animaux dans les projets de recherche.

Procédures

Prélèvement de 20% de la nageoire caudale sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

La procédure est de classe légère. L'eau des poissons sera supplémentée de lidocaine, antalgique, pour diminuer la douleur et le stress de la procédure. Pendant 7-10 jours, le poisson nagera avec une nageoire caudale plus petite le temps que celle-ci régénère mais cela ne l'empêche pas de nager correctement ou de chercher sa nourriture.

Devenir

Les animaux porteurs de la mutation seront utilisés ultérieurement dans des projets scientifiques (n=2400), les animaux non porteurs de la mutation d'intérêt seront euthanasiés (n=2880).

Remplacement

Le poisson zèbre est un modèle de choix pour l'analyse du développement précoce du système nerveux central et entérique car il permet une visualisation de ces organes au cours du développement embryonnaire et larvaire grâce à la transparence des embryons et larves et à la rapidité de son développement précoce. Le développement des organes et leurs fonctions sont assez similaires avec les organes humains, ce qui fait du poisson zèbre un organisme de choix. Nous travaillons sur la meilleure compréhension du développement d'organes qui communiquent entre eux (cerveau et intestin), il n'est donc pas possible de réaliser nos projets de recherche en utilisant des lignées cellulaires in vitro.

Réduction

Les animaux utilisés dans ce projet sont les reproducteurs qui seront mis en croisement pour obtenir les embryons et larves pour les études scientifiques. Le nombre d'animaux est maintenu le plus bas possible tout en maintenant un nombre d'individus suffisants (40 couples d'adultes par lignée) pour éviter une dérive génétique. Les larves et embryons issus des croisements peuvent être analysés au niveau de plusieurs organes (cerveau, intestin, nageoires, cartilage de la face) en même temps ce qui limite le nombre de reproducteurs nécessaires et donc le nombre de poissons à génotyper.

Raffinement

La dose de tricaine, anesthésique, a été validée par notre vétérinaire. La gestion de la douleur est également pris en charge par l'ajout de lidocaine, antalgique, dans la solution d'anesthésique avant la procédure, pendant la procédure de biopsie et ensuite pendant la phase de convalescence du poisson. Des publications récentes nous ont permis de choisir le meilleur antalgique et la dose à utiliser pour notre procédure. Au cours du projet, une veille bibliographique nous permettra de connaitre d'autres signes possibles de douleur ou d'angoisse chez le poisson et nous pourrons prendre des mesures de raffinement appropriées.

Choix des espèces

Pour réaliser des études de gènes impliqués dans les maladies développementales de l'enfant, il faut pouvoir suivre l'effet des mutations d'un gène donné sur le développement de l'organe atteint (dans notre cas le cerveau et l'intestin) et ce, dans sa globalité et dans son contexte d'interaction moléculaire avec les autres organes environnants. Ce type d'études ne peut donc se réaliser sur des lignées cellulaires in vitro. Le poisson zèbre est un modèle approprié pour nos études sur la fonction des gènes responsables de troubles du neurodéveloppement. Le poisson zèbre est un vertébré et possède des régions cérébrales identiques à celles de l'être humain. Il a un développement ex-utero, ce qui nous permet de réaliser l'ensemble de nos études sur des embryons et des larves âgées de moins de 5 jours de développement. Pour obtenir ces embryons et larves, nous avons besoin de reproducteurs, mâles et femelles, pour produire des oeufs fécondés. Ces reproducteurs sont des poissons adultes âgés de 90 jours. A ce stade, les nageoires caudales sont assez grandes pour procéder à une biopsie de 20% sans altérer le comportement du poisson adulte. Les 20% de cette nageoire caudale repousse en 7-10 jours.

Tués dès qu'ils ne portent pas la modification génétique attendue, pour ne pas garder d'animaux jugés "non nécessaires" au projet, la grande majorité des 4 040 poissons zèbres déclarés ne passent pas l'étape de la sélection. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans qu'aucune intervention ne soit déclarée sur eux, la protéine fluorescente s'observant sur l'animal vivant. Les lignées sont créées pour rendre visibles des protéines du cytosquelette des neurones, et le porteur annonce que ces poissons se comporteront comme des animaux sauvages, tout en reconnaissant que la modification touche une protéine du système nerveux et pourrait entraîner une nage anormale ou une prostration. Une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an, gardés jusqu'à dix-huit mois, suffit à maintenir ces lignées, sans que l'écart avec l'effectif déclaré soit expliqué.

Objectifs

Le cytosquelette, une structure fibreuse présente dans nos cellules, joue un rôle crucial en agissant comme des piliers de soutien. Son bon fonctionnement est essentiel pour les neurones, mais des anomalies dans ces structures sont associées à diverses maladies neurologiques. Pour mieux comprendre ces structures et leurs rôles, nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire au nôtre et sont transparents à un stade précoce de leur développement. Dans notre projet, nous allons introduire des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine fluorescente. Cela nous permet d’observer précisément où se trouvent les protéines du cytosquelette à l'intérieur du poisson et des suivre leur comportement alors que le poisson grandit et dans un contexte de maladie. L'objectif principal est de comprendre comment ces structures fonctionnent normalement lors du développement des cellules nerveuses, sans perturber le processus naturel. Cette compréhension pourrait éclairer les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques associées au cytosquelette.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les fonctions des protéines du cytosquelette au cours du développement. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes physiologiques impliquant les protéines du cytosquelette dans un contexte pathologique, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

Aucun

Impact sur les animaux

D'après les connaissances, la modification de notre protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente n'affecte pas la fonction de cette protéine. Par conséquent, nous nous attendons à ce que les poissons se comportent comme des animaux sauvages et nous ne prévoyons pas de nuisances indésirables pour les poissons génétiquement modifiés. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement d’effets indésirables Comme nous apportons une modification d'une protéine du système nerveux, les effets indésirables pourraient être liées à un système nerveux défectueux, avec des anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) ou une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité).

Devenir

Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre comment les protéines du cytosquelette fonctionnent dans les cellules nerveuses. Ces fonctions dépendent de processus comme la présence de certaines cellules qui protègent les nerfs. Les méthodes actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Pour surmonter ces limitations, nous nous tournons vers des modèles de laboratoire appelés organoïdes, qui sont des petites structures cellulaires qui imitent certaines caractéristiques des tissus réels. Cependant, ces organoïdes sont difficiles à imaginer en direct, ce qui est important pour notre recherche. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec toutes les cellules nécessaires, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.

Réduction

Nous avons utilisé une technique qui nous permet de sélectionner et d’élever uniquement les poissons dont la modification génétique a réussi, et éviter d'élever ceux qui n'ont pas le modification de notre intérêt. Le nombre d'animaux nécessaires est strictement déterminé en fonction de la fréquence à laquelle la modification génétique est transmise à la prochaine génération, ainsi que du nombre de couples de poissons reproducteurs requis. Pour maintenir ces lignées génétiquement modifiées, nous conservons seulement un nombre limité de poissons, environ une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an.

Raffinement

Étant donné que la protéine fluorescente est observée sur l’animal vivant, cela nous permet d’éviter d'avoir à effectuer des prélèvements invasifs sur le poisson. Comme la modification génétique ne devrait pas altérer la manière dont les gènes sont exprimés ni les fonctions de la protéine, nous prévoyons que ces animaux se comporteront de la même manière que les animaux sauvages et qu'ils ne présenteront aucun changement dans leur apparence ou leur comportement. Cependant, une surveillance hebdomadaire sera effectuée. De plus, une évaluation sera réalisée lorsque les poissons seront autonomes pour se nourrir (après 5-6 jours) et lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle (environ 12 semaines), en utilisant une grille de score pour détecter toute anomalie éventuelle. Nous avons mis en place des points limites prédictifs et précoces pour identifier les signes de mal être chez le poisson. Les poissons atteignant l’un de ces points limites seront immédiatement mis à mort pour abréger toute souffrance.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.

Évaluer comment des embryons et alevins de poissons encaissent une hausse de température doublée d'une irradiation gamma : 1 475 truites communes et ombles chevaliers vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Les actes déclarés se limitent à des photographies pour la morphologie et à des vidéos pour le comportement, avec un changement de bac. Le porteur attend pourtant une mortalité de 30 % due au stress thermique, et retient des débits de dose allant jusqu'à la valeur maximale mesurée à proximité de Tchernobyl. Les survivants, qui mesurent au plus un centimètre et demi, sont tués par surdose d'anesthésiant pour prélever foie et reins, un seuil de 30 % de perte de poids, estimé à l'œil, déclenchant une mise à mort anticipée.

Objectifs

Le réchauffement climatique à l’échelle de la planète sera compris entre 1,5 et 4,5°C avec des valeurs extrêmes allant jusqu’à 6°C d’ici 2100. Par conséquent, l’écotoxicité de substances chimiques classiques retrouvées dans les écosystèmes aquatiques doit être réévaluée en prenant en compte les effets du stress thermique. Peu de données concernent l’étude combinée des effets de l’augmentation de la T°C et de l’irradiation gamma. Ce type d’irradiation se rencontre suite à un défaut de central nucléaire et pénètre davantage dans l'organisme que les rayonnements alpha et bêta, mais il modifie moins les particules qu'il rencontre. Un précédent projet dans les même conditions d’irradiation et sur les mêmes espèces de poisson avait montré seulement une préciosité de la date d’éclosion. Ce projet permettra d’évaluer le stress lié à une irradiation gamma couplé d’une hausse de température à travers des expérimentations menées en conditions contrôlées de laboratoire, la réponse phénotypique (mortalité/développement/comportement/croissance) et moléculaire de plusieurs espèces de poisson sauvage exposées à différents stress de température (aigue pour mimer les rejets thermiques des centrales nucléaires et chronique pour mimer l’augmentation des températures en amont des centrales nucléaires en lien avec le réchauffement climatique) et à différents niveaux de débits de dose (valeur seuil de protection des écosystèmes aquatiques, valeur maximale mesurée à proximité de Tchernobyl.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait servir à terme à mieux évaluer les capacités de résilience des stades précoces de poissons sauvages face au stress thermique couplé à des effets de rayons ionisants.

Procédures

Les procédures de ce projet (prise de photo pour mesurer la morphologie, vidéo pour le comportement ) n'impliquent qu'un leger stress dû à la manipulation des animaux. Nous nous attendons à ce que ce stress se dissipe rapidement après avoir remis les individus dans leur aquarium.

Impact sur les animaux

Compte tenu des connaissances acquises lors d’études précédentes sur les radiations ionisantes sur l’omble chevalier au stade embryo-larvaires nous nous attendons à ne pas avoir impact sur leur survie. Pour les variations de températures, nous prévoyons une mortalité au cours de l’expérimentation de 30% en raison du stress induit par la température pour les alevins . En outre, les procédures de ce projet (vidéo pour le comportement) n’impliquent qu'un léger stress du au changement de bac. Les animaux seront ensuite mis à mort par surdose d’anesthésie pour les mesures morphologiques et les prélèvements d’organes.

Devenir

A la fin de l'expérimentation les animaux seront mis à mort pour le prélévément des organes (fois et reins) pour le dosages des biomarqueurs de stress (stress oxydatif: catalase, super oxyde dismutase ). La mise à mort sera réalisée par surdose d’anesthésiant (balnéation > 250 ppm de benzocaine ou > 400 ppm de tricaine). L’objectif est d’atteindre une anesthésie de stade 4 (paralysie médulllaire) , caractérisée par une perte totale d’équilibre, une réactivité nulle, un arrêt de la fréquence operculaire et une perte totale de tonus. La mort sera confirmée par une vérification à la loupe binoculaire de l'arrêt permanent de la circulation. Les animaux en fin d’expérimentation mesurant au maximum 1.5 cm.

Remplacement

Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré ( différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...), de plus les stades embryo-larvaire sont pollu-sensibles. De plus, l’omble chevalier est une espèce patrimoniale et sentinelle des lacs alpins. Ainsi, aucune expérience in vitro ne permettrait de répondre à cette question scientifique qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier.

Réduction

L’effectif totale est de 30 individus parconditions thermique et par traitements afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). L’effectif totale est de 30 individus afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction).

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous- alimentation). De plus, dans chaque bassin, des tubes cérémiques seront installées pour permettre aux truites de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience. On considère qu'il y a un effet grave lorsque l'organisme perd 30 % de son poids. On considère qu'il y a un effet grave lorsque l'organisme qu’une perte de poids est estimé par contrôle visuel journalier des individus. Dans ce cas, l'individu sera immédiatement euthanasié par surdose d'anesthésie afin d'éviter toute souffrance à l'animal.

Choix des espèces

La truite commune (Salmo trutta) apparait comme un bon candidat modèle pour plusieurs raisons : i) est une espèce de relevance grâce à sa présence a niveaux mondial, ii) possède un fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et iii) a un intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial . L’omble chevalier est une espèce patrimoniale et sentinelle des lacs alpins. Ainsi, aucune expérience in vitro ne permettrait de répondre à cette question scientifique qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier. Enfin, ces deux espèces présentent des thermo tolérance faible ce qui en font un bon modèle pour cette étude. Les stades embryo-larvaires ont été ciblés pour cette étude car le test sur les embryons de poisson a été validé compte tenu de son excellente corrélation avec le test de sensibilité aiguë sur les poissons basé sur des poissons juvéniles et adopté comme méthode d'essai standard pour les tests de libération sur les poissons.

Le xénope et le poisson zèbre sont retenus parce qu'ils régénèrent naturellement leur rétine, capacité que les mammifères ont perdue. 600 xénopes et 260 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les poissons reçoivent une injection dans l'œil sous anesthésie générale, 560 têtards sont maintenus dans le noir de sept à trente-cinq jours dans des bains de solution, dont 240 pendant vingt-cinq jours de plus dans une seconde solution, et 40 xénopes adultes reçoivent une injection d'hormones pour déclencher la ponte. Tous les poissons et tous les têtards sont tués pour examiner leur rétine, les 40 adultes restant en élevage et recevant de nouvelles injections hormonales tous les quatre mois, sur une période reproductive que le porteur évalue à quinze ans au moins.

Objectifs

Les maladies dégénératives de la rétine sont dues à la perte progressive et irréversible des cellules de la rétine. Dans le cas de la rétinite pigmentaire ou de la DMLA (Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age), ce sont les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine qui sont affectées, et leur disparition entraine une perte de la vision. Comme ces maladies restent pour la majorité incurable, il est essentiel d’approfondir nos connaissances en recherche fondamentale afin de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. Le xénope et le poisson-zèbre, contrairement aux mammifères, ont la capacité de régénérer leur rétine grâce à leurs cellules gliales de Müller qui se comportent comme des cellules souches en cas de dégénérescence. Chez l’homme, ces cellules ont perdu la capacité de réparer la rétine suite à une lésion. De récents travaux ont néanmoins montré, via l’ajout de facteurs de croissance ou la surexpression de facteurs de transcription, que ces cellules de Müller chez les mammifères ont gardé un potentiel régénératif. Cependant, ce potentiel reste très limité et les cellules de Müller réactivées régénèrent très peu, voire pas du tout, les photorécepteurs, le sous-type même de cellules rétiniennes qui doivent être remplacées chez les patients. Il est donc essentiel de trouver des molécules capables de stimuler la régénération des photorécepteurs, et en particulier des cônes, responsables de notre vision diurne. Nous avons développé récemment un modèle de dégénérescence des cônes chez le xénope) et avons montré que bien que cet amphibien possède la capacité de régénérer les photorécepteurs à bâtonnets, il ne régénère que très peu les cônes dans ce modèle lésionnel, contrairement au poisson-zèbre. Bien que ne représentant que 5% des photorécepteurs chez l’homme, les cônes sont essentiels pour la vision des couleurs. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes responsables de cette différence entre xénope et poisson zèbre afin d'identifier des facteurs capables de promouvoir la régénération des cônes chez les mammifères.

Bénéfices attendus

Ce travail préliminaire a pour but de tester la pertinence du projet visant à comparer les caractéristiques distinctes des cellules de Müller à régénérer les cônes, entre le poisson-zèbre et le xénope. Selon les résultats obtenus, il permettra de décider ou non de poursuivre l’étude. Celle-ci a pour objectif d’identifier les voies de signalisation contrôlant les processus régénératifs à partir des cellules de Müller et ainsi fournir des informations essentielles qui permettraient de stimuler la régénération des photorécepteurs chez les personnes atteintes de pathologies dégénératives de la rétine.

Procédures

- 260 poissons zèbre adultes recevront, sous anesthésie générale, une injection intra vitréenne. La procédure s’effectuera en 30 secondes environ le temps de placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. L’injection en elle même ne prendra que quelques secondes. - 560 xénopes au stade têtard seront placés en bain dans une solution dans le noir entre 7 et 35 jours. - 240 d’entre eux seront ensuite placés dans une autre solution pendant 25 jours. Les solutions seront changées tous les 2 à 3 jours. - 40 xénopes adultes recevront une injection sous cutanée. La procédure s’effectuera en 30 secondes environ le temps de placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. L’injection en elle-même ne prendra que quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’injection intra vitréenne est un acte de chirurgie légère. Chez l’homme, les effets indésirables décrits sont une irritation de l’œil (ce qui peut se traduire par une sensation de brulure, de grains de sable ou de picotements), un saignement de la conjonctive, la sensation d’un corps étranger ou l’apparition de tâches dans le champ visuel. Cela reste des symptômes bénins qui se résorbent en quelques jours. Afin de maintenir les poissons immobiles pendant la procédure, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Les effets indésirables potentiels sont la désorientation passagère lors du réveil et le risque d’asphyxie entrainant la mort de l’animal si l’anesthésie est trop longue en raison de l’arrêt de l’irrigation des branchies. À la dose utilisée, les traitements sont considérés comme étant non toxiques. Les effets indésirables possibles restent l’apparition d’œdèmes. De plus, le fait que les animaux seront conservés dans le noir pendant la durée de certains traitements est susceptible de leur causer du stress (de 7 à 35 jours) ou de la dépigmentation. L’administration d’hormones par injection sous cutanée chez le xénope adulte pour déclencher les pontes n’est pas connue comme entrainant des effets secondaires indésirables. Un court stress est généré le temps de la contention.

Devenir

Tous les poissons seront euthanasiés afin d’étudier la régénération de la rétine. Tous les xénopes adultes utilisés seront maintenus en élevage. Tous les têtards de xénopes seront euthanasiés afin d’étudier la régénération de la rétine.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que les cellules de Müller n’ont pas le même comportement in vivo au sein de la rétine et en culture cellulaire. Elles sont en effet fortement influencées par le micro-environnement et en particulier le contexte inflammatoire, qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. Ainsi, il n’est pas possible de se passer de l’utilisation d’animaux et d’utiliser des méthodes alternatives au vu de la finalité de ce projet. L’induction de la ponte chez le xénope constitue la seule façon d’obtenir des ovocytes matures de manière non-invasive (sans chirurgie).

Réduction

L’objet de cette demande d'autorisation de projet est de réaliser des expériences préliminaires à un projet plus large afin de tester la pertinence du projet et minimiser le nombre d’animaux utilisés. - Le nombre d’animaux prévu pour cette DAP correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques individuelles et techniques, nous avons déterminé que chaque lot comprendra 10 animaux pour les lignées sauvgaes et 20 animaux pour les lignées transgéniques et nos expériences seront réalisées en tripliqua. - Nous utiliserons des poissons réformés (poisson de lignée sauvage trop âgés pour continuer à faire de l’élevage) et non utilisable pour d’autres projets. - Nous limiterons le nombre d’animaux adultes transgéniques au minimum requis afin de maintenir une lignée transgénique stable. - Le développement d’une lignée rapportrice fluorescente permettra l’observation des phénotypes de dégénérescence puis de régénération sur animaux vivants en continu et par conséquent permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires. - Les femelles xénopes adultes utilisées pour générer des embryons sont réutilisés tous les 4 mois. Ces animaux ayant une période reproductive longue (au moins 15 ans), ils peuvent être induits de nombreuses fois, ce qui permet de réduire le nombre d’individus utilisés. - Pour les animaux transgéniques, nous avons prévu de ne faire que des fécondations naturelles afin d’éviter de devoir sacrifier des mâles. Les mâles peuvent donc être utilisés plusieurs fois pour la reproduction donc là aussi cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le projet repose sur l’étude de processus de dégénérescence et régénération spécifiques à un organe non-vital et la dégénérescence cellulaire au niveau de la rétine, comme dans la DMLA, est un processus indolore. Les injections intravitréennes chez le poisson se font sous anesthésie générale. Les animaux sont ensuite surveillés jusqu’au réveil puis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience. L’utilisation des xénopes adultes par roulement (possiblement tous les 4 mois pour les femelles, et tous les mois pour les mâles) permet le renforcement positif lors des manipulations ce qui réduit leur stress. Tout au long des procédures, nous évaluerons en continue l’état des animaux à l’aide de fiches d’évaluation de points limites adaptés à l’espèce et à l’âge des animaux et procéderons à des soins ou à l’euthanasie des animaux si cela s’avère nécessaire. Le développement d’une lignée inductible et réversible permettra de cibler la dégénérescence à une sous population de cellules, et de limiter le traitement dans le temps.

Choix des espèces

L’objet de cette étude vise à étudier et comparer les mécanismes de régénération dans des espèces qui sont naturellement capables de régénérer leur rétine. A ce jour, cela n’a été décrit que chez le poisson, les amphibiens et l’embryon de poulet. Le poisson-zèbre et le xénope constituent des espèces faciles à manipuler et à maintenir en laboratoire et pour lesquels sont établis des protocoles d’élevage et d’utilisation à des fins scientifiques. Par ailleurs, nous disposons des génomes pour les deux espèces et leur analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain (plus de 70% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs équivalents chez le xénope et le poisson-zèbre). Les poissons-zèbre seront utilisés soit à l’âge adulte (4-6 mois, taille 3cm), soit au stade juvénile (1 mois, taille 1cm) afin de comparer les capacités de régénération de la rétine à ces deux stades. Les xénopes des lignées transgéniques seront utilisés au stade têtards car l’article de référence sur cette lignée indique qu’à ce stade le phénotype obtenu est plus homogène d’un individu à l’autre. Les xénopes adultes utilisés afin d’établir une nouvelle lignée transgénique seront utilisés à un stade mature sexuellement. Du fait de la longue durée de vie du xénope et de sa longue période de maturité sexuelle, les animaux peuvent avoir entre 2 et 20 ans.