Système immunitaire
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Étudier les cellules immunitaires infiltrant le Glioblastome après chirurgie
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Injection de cellules tumorales dans le cerveau, puis résection chirurgicale de la tumeur trois semaines plus tard, avant des prélèvements sanguins jusqu'à trois fois par semaine: 425 souris subissent ce protocole reproduisant la prise en charge du glioblastome. Le RNT classe 423 d'entre elles en souffrance sévère et prévoit leur mise à mort pour analyses. L'étude vise une sous-population de cellules immunitaires supposée favoriser la récidive après chirurgie. Le choix se porte sur des souris immunodéficientes, qui acceptent les cellules humaines sans rejet.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives chez l’adulte. Malgré une prise en charge lourde associant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, la survie moyenne des patients n’excède pas huit mois, en raison de l’apparition quasi systématique de récidives. Le principal facteur supposé responsable de ces récidives est la repousse de cellules hautement invasives se propageant à partir de la masse tumorale initiale. L’environnement protecteur de ces cellules empêche leur élimination par les traitements conventionnels, rendant la récidive le plus souvent létale. Certaines populations de cellules immunitaires ont déjà été identifiées comme jouant un rôle pro-tumoral, notamment en réduisant l’efficacité de la chimiothérapie. Cette étude vise à étudier l’effet supposé délétère d’une sous-population particulière de cellules immunitaires, particulièrement abondante dans le glioblastome après la chirurgie. L’objectif est de montrer que l’inhibition ou la suppression de cette population améliore la réponse au traitement. Une telle découverte permettrait d’affiner notre compréhension des mécanismes de résistance thérapeutique et d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de prise en charge des glioblastomes chez les patients.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs cérébrales malignes chez l’adulte. Malgré un protocole thérapeutique complet mêlant chirurgie, chimio- et radio- thérapie, le pronostic reste très défavorable avec une survie médiane de 8 mois. Ce mauvais pronostic est en grande partie dû au très haut taux de récidive de la maladie qui apparait dans 80% des cas au même endroit que la tumeur initiale. Cette résistance au traitement fait du glioblastome un véritable défi médical et scientifique, nécessitant le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à mieux comprendre et à prévenir la repousse des cellules tumorales résiduelle après une chirurgie du glioblastome. Les connaissances obtenues pourraient permettre de limiter la récidive de la maladie, qui constitue aujourd’hui l’un des principaux obstacles au succès des traitements. À court terme, ce travail apportera des informations précieuses sur les mécanismes qui permettent à certaines cellules de survivre aux thérapies actuelles et de reformer une tumeur. Ces découvertes pourront orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces, ciblant spécifiquement les cellules immunitaires. À long terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer à améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de glioblastome, en rendant les traitements plus durables. Les bénéfices dépasseront le cadre de cette maladie : les connaissances acquises pourraient également être utilisées pour d’autres types de cancers dont le protocole de soin inclut une résection chirurgicale.
Procédures
Dans cette étude, les animaux subiront plusieurs interventions Tout d’abord, une première intervention consistera en l’injection de cellules tumorales directement dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale. Cette procédure, réalisée une seule fois par animal, durera environ 10 à 15 minutes. Un premier lot d’animaux ne subira que cette intervention. Les autres lots subiront une résection chirurgicale, environ trois semaines après l’injection des cellules tumorales, sous anesthésie générale. Cette intervention, qui vise à mimer la prise en charge clinique du glioblastome chez l’humain, durera environ 30 à 45 minutes. Un lot d’animaux ne subira que cette résection. Les autres lots subiront en plus de la chirurgie un traitement, dont l’administration est effectuée sur animaux non anesthésiées (=vigiles) (geste inférieur à 10 sec). Ces traitements seront administrés avant, pendant et un jour après chirurgie pour un lot, ou un jour et deux jours après chirurgie dans un autre lot. Parallèlement, des prélèvements sanguins seront effectués une à trois fois par semaine afin de mesurer l’évolution de la tumeur sur tous les lots de souris vigiles. Chaque prélèvement, réalisé en quelques secondes sur une veine de la queue, permettra de limiter le stress des animaux. Enfin les animaux seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection des cellules tumorales : Les animaux greffés avec les cellules tumorales vont développer une tumeur cérébrale qui peux entrainer une perte de poids et de coordination. Lors la résection : L’os du crane étant peu innervé, la craniotomie est à l’origine d’une douleur mesurée. La résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses. Cependant, la craniotomie peut engendrer un changement de pression intracrânienne et la résection en elle-même peut être à l’origine de petites hémorragies. Suite à cette intervention, une réduction des mouvements et de la mobilité de l’animal, une perte de coordination peuvent subvenir dans les heures qui suivent la chirurgie. Dans les jours suivant, une perte de poids peut également être observée. Lors de l’injection des thérapies ciblée : Les nuisances attendues suite à l’injection des traitements seront celles liées à l’injection (stress et douleur légers, de courte durée). D’après la littérature disponible, aucun effet secondaire n’est décrit pour les drogues envisagées. De fait, aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ces traitements. Lors du suivi de la croissance tumorale : Les prélèvements sanguins réalisés au niveau de la queue de l’animal provoqueront une douleur légère et un stress de courte durée chez la souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
En amont de ce projet, notre laboratoire a réalisé un travail bioinformatique (in silico) d’analyse des données générées par d’anciens projets afin d’identifier des cibles / vulnérabilités potentielles post-chirurgie. Ces cibles ont ensuite été testées dans un modèle in vitro développé par notre laboratoire pour mimer de manière réductionniste les effets de la chirurgie sur les cellules immunitaire de type macrophage. Seuls les meilleurs candidats ayant démontré des résultats convainquant in silico et in vitro et susceptibles d’apporter des améliorations considérables dans le traitement du glioblastome ont été retenus. Le microenvironnement tumoral est complexe et les effets de la chirurgie sur ce dernier sont multiples et peu compris. Dans ce contexte, seule la validation en modèle souris peut permettre de valider nos découvertes en prouvant leur réalité biologique et leur potentiel translationnel.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons effectué un travail de recherche bibliographique rigoureux. De plus, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d’animaux. En effet: ⁃Dans un précédent projet, nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur qui sera résécable environ un mois après l’injection. Nous ne testerons donc pas différentes concentrations de cellule. ⁃Nous maitrisons la résection de la tumeur ⁃Nos connaissances des changements biologiques induits par la chirurgie et de leur temporalité nous permet de rationaliser le choix des points temporel d’injection des divers traitements, limitant ainsi les injections et les tests préalables. ⁃Protocole expérimental basé sur des expériences pilotes qui permettent de décider de continuer ou non les expériences, et de diminuer le nombre de groupe d’animaux à tester ⁃Les analyses requièrent une faible quantité de matériel et permettent donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. ⁃Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux reçoivent systématiquement des traitements analgésiques appropriés pendant et après les opérations. Les interventions chirurgicales sont réalisées dans des conditions de stérilité maximale par un personnel spécialement formé. Les animaux bénéficient d'une prise en charge standardisée de la douleur et sont régulièrement suivis après l'opération grâce à une évaluation objective à l’aide d’une grille de cotation. Après injection des cellules tumorales, les animaux seront suivis 2 à 3 fois par semaine pendant les deux premières semaines, puis une surveillance quotidienne sera mise en place dès le développement de la tumeur. L’objectif est de détecter précocement toute perte de poids ou signe de souffrance. Le développement de la tumeur est suivis de manière précise et peu invasive via l’utilisation d’un marquage sanguin fiable. Si nécessaire, des soins supplémentaires, tels que des analgésiques ou réhydratation, compléments alimentaires seront apportés. Si aucun soulagement n’est possible, les animaux seront mis à mort. Certains traitements envisagés par cette étude sont à administrer par voie orale. Nous utiliserons la méthode MDA (administration de traitements guidée par micropipette) comme alternative au gavage classique. Cette méthode consiste à proposer aux souris une solution diluée de lait concentré sucré à l'aide d'une micropipette classique, après une courte période d'habituation et un temps d'entraînement minimal, elles la boivent volontairement. En permettant l'administration orale de substances en toute sécurité et sans stress, la MDA représente un raffinement conséquent pour les animaux. Cette méthode a également le potentiel d'augmenter la robustesse scientifique et la reproductibilité en étant plus précise et répétable et en supprimant les biais importants introduits par le stress, la douleur ou l'inflammation.
Choix des espèces
Nous mènerons nos expériences en utilisant des souris, espèce de choix pour les études de cancérogenèse et les expériences menées en thérapeutique du cancer. Elles ont depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que leur physiologie est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes, qui permettent l'implantation de cellules humaines sans rejet et offrent un modèle pertinent pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements anticancéreux in vivo. Adultes de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale. De plus, les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie.
Le nerf vague comme modulateur de l’arthrose : effets de son activation ou de son absence chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Section du nerf vague dans l'abdomen, pose d'une électrode autour de ce nerf dans le cou, puis injection ou section d'un ligament du genou pour provoquer une arthrose: 1758 souris enchaînent ces interventions sur sept à huit semaines. Le RNT classe 576 d'entre elles en souffrance sévère et les 1182 autres en souffrance modérée. Les opérations sur le nerf vague sont décrites comme pouvant entraîner une douleur modérée à importante, et l'induction de l'arthrose une douleur au genou avec gonflement et démarche modifiée. Toutes seront tuées à la fin du protocole, sans réutilisation.
Objectifs
L’arthrose est une maladie très fréquente qui provoque des douleurs articulaires chroniques et une perte progressive de mobilité. Elle résulte d’un déséquilibre entre les processus de dégradation et de réparation des tissus articulaires, souvent associé à une inflammation locale et générale. Ce projet vise à mieux comprendre comment le système nerveux peut influencer l’inflammation et la douleur dans l’arthrose, en particulier à travers le nerf vague, qui relie le cerveau à plusieurs organes et joue un rôle important dans la régulation des réponses inflammatoires. Pour cela, plusieurs modèles expérimentaux d’arthrose seront utilisés chez la souris. Dans certains cas, le nerf vague sera interrompu chirurgicalement pour étudier les conséquences de sa suppression. Dans d’autres, une stimulation électrique contrôlée sera appliquée sur ce même nerf pour observer ses effets sur la douleur et l’évolution de la maladie. À plus long terme, ce travail pourrait contribuer au développement de stratégies innovantes visant à améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de douleurs articulaires chroniques, en limitant le recours aux anti-inflammatoires classiques et leurs effets secondaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent plusieurs aspects : – une meilleure compréhension du rôle du système nerveux dans la régulation de l’inflammation et de la douleur ; – la mise en évidence de mécanismes biologiques pouvant être ciblés pour ralentir ou limiter la dégradation du cartilage ; – l’évaluation d’une technique de stimulation électrique pouvant, à terme, être adaptée pour des applications cliniques chez l’humain. À moyen terme, les résultats obtenus pourraient ouvrir la voie à des traitements complémentaires ou alternatifs aux anti-inflammatoires classiques, mieux tolérés et sans effet secondaire systémique.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions visant à étudier le rôle du nerf vague dans la régulation de la douleur et de l’inflammation au cours de l’arthrose. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et feront l’objet d’un suivi rigoureux pour assurer le bien-être des animaux. – section du nerf vague pratiquée au niveau de l’abdomen. Durée: environ 25 minutes et est suivie d’une période de récupération de 7 jours, avec une double analgésie systématique et une surveillance quotidienne. – implantation d’une électrode autour du nerf vague dans le cou. Durée environ 20 minutes, également sous anesthésie générale, et est suivie d’une semaine de récupération avant le début des stimulations. – dans certains groupes, une injection au niveau du genou sera réalisée sous anesthésie, pour reproduire une inflammation articulaire ou une dégradation du cartilage, selon différents modèles expérimentaux d’arthrose. Ce geste est très rapide (environ 2 minutes) et provoque une gêne légère et transitoire. Pour d'autres groupes, l'induction de l'arthrose se fera par la section d'un ligament du genou sous anesthésie (durée : environ 15 minutes).– Évaluations comportementales : des tests non invasifs (mesure de la sensibilité mécanique et de l’activité motrice) permettront d’évaluer la douleur et la mobilité. Pour la sensibilité mécanique (tests sur la voûte plantaire), l'évaluation consiste en une moyenne de 5 mesures successives par animal, répétée 4 ou 5 fois selon le modèle d’arthrose. Pour l’activité motrice (locomotion), le test dure 5 minutes (1 fois 5 min) par animal, répété également 4 ou 5 fois selon le modèle. Ils sont réalisés dans un environnement calme afin de limiter le stress. Chaque animal participe à une seule séquence expérimentale. La durée totale, incluant chirurgie, récupération et suivi, varie de 7 à 8 semaines selon les groupes.
Impact sur les animaux
Effets liés aux chirurgies : Les opérations réalisées (section du nerf vague ou pose d’une petite électrode autour de ce nerf) sont invasives et peuvent entraîner une douleur modérée à importante après l’intervention. Les animaux peuvent également présenter une activité réduite, une légère perte de poids, ainsi que de petits troubles digestifs passagers (appétit diminué, transit ralenti). Durant les premiers jours, un inconfort au niveau de la zone opérée est possible, lié à la cicatrisation (tiraillements, démangeaisons). Effets liés à l’arthrose expérimentale : Les différentes méthodes utilisées pour provoquer une arthrose entraînent toutes une douleur au niveau du genou, un gonflement et une démarche modifiée.
Devenir
À la fin de chaque procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort. Aucun animal ne sera réutilisé ni maintenu au-delà de la durée prévue pour chaque protocole. La mise à mort sera toujours effectuée sous anesthésie générale profonde, suivie d’une injection intrapéritonéale d’un agent euthanasique . Cette méthode garantit une perte de conscience rapide et irréversible, sans douleur ni stress. Le décès sera confirmé par l’absence de respiration et de battement cardiaque avant tout prélèvement.
Remplacement
Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, toutes les alternatives possibles ont été envisagées. Des modèles informatiques et des cultures cellulaires permettent d’étudier certains aspects de la biologie du cartilage et de l’inflammation. Cependant, ils ne reproduisent pas l’ensemble des interactions entre les systèmes nerveux, immunitaire et musculo-squelettique impliqués dans l’arthrose. L’objectif de ce projet étant de comprendre comment la stimulation du nerf vague influence la douleur et l’inflammation au niveau de l’articulation, il est indispensable d’utiliser un organisme vivant. Seul le modèle animal permet d’évaluer ces phénomènes dans leur complexité, en tenant compte de la circulation sanguine, de la transmission nerveuse et des réponses physiologiques globales. Le choix de la souris repose sur plusieurs critères : la connaissance approfondie de son système immunitaire et nerveux, la disponibilité de modèles d’arthrose bien caractérisés et reproductibles, et la possibilité d’appliquer des procédures chirurgicales miniaturisées avec un impact limité sur l’animal. Ce projet ne sera donc mené sur des animaux que dans la mesure où il n’existe pas de méthode alternative permettant d’obtenir des informations équivalentes. Les résultats obtenus pourront toutefois servir, à terme, à réduire l’expérimentation animale en orientant plus précisément les futures études vers des mécanismes identifiés comme pertinents. Ainsi, l’expérimentation animale n’est utilisée ici qu’en dernier recours, lorsque l’étude de phénomènes complexes tels que la communication entre nerfs et organes ou la régulation de l’inflammation ne peut être reproduite autrement.
Réduction
Le projet a été conçu de manière à limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la fiabilité scientifique des résultats. Les effectifs ont été calculés à partir d’analyses statistiques préalables, afin de détecter des effets réels sans multiplier inutilement le nombre d’animaux. Chaque expérience sera réalisée en deux séries indépendantes pour assurer la reproductibilité des observations. Si les résultats de la première série sont jugés concluants, la seconde pourra être interrompue, conformément au principe de réduction. Les protocoles ont été harmonisés pour permettre de recueillir plusieurs types de données (comportementales, histologiques, immunologiques et biochimiques) à partir du même animal. Cette approche intégrée maximise la quantité d’informations obtenues par individu et évite de reproduire plusieurs études séparées. Les groupes expérimentaux ont été limités aux comparaisons indispensables : animaux soumis à la stimulation vagale ou non, avec ou sans induction d’arthrose, et distinction entre mâles et femelles pour identifier d’éventuelles différences biologiques. L’ensemble des procédures suit une planification rigoureuse : chaque manipulation, chaque point temporel et chaque prélèvement ont été définis pour répondre à une question précise, évitant toute répétition ou surconsommation d’animaux. Enfin, les connaissances acquises à partir de ce projet permettront d’affiner les futurs protocoles expérimentaux, contribuant ainsi à une utilisation plus raisonnée et plus parcimonieuse des animaux dans la recherche biomédicale.
Raffinement
Toutes les mesures ont été prévues pour réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du projet. Les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale , avec une analgésie préventive administrée avant l’opération et un traitement antalgique prolongé après celle-ci. Les doses et les durées d’administration ont été définies pour assurer un confort optimal tout en évitant toute interférence avec les paramètres étudiés. Les soins post-opératoires incluent une surveillance rapprochée, une hydratation sous-cutanée, une alimentation enrichie et un hébergement dans des cages propres et chauffées jusqu’à récupération complète. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour pendant les premiers jours, puis quotidiennement. Une grille de suivi précise permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de perte de poids ou d’altération du comportement. Les procédures chirurgicales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, utilisant du matériel microchirurgical stérilisé, des incisions limitées et des sutures fines pour réduire les traumatismes tissulaires. La durée des anesthésies et des manipulations sera strictement contrôlée pour limiter les risques. Les conditions d’hébergement (température, humidité, rythme jour/nuit) seront maintenues stables. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu (matériaux de nidification, abris) et d’un environnement calme afin de réduire le stress. Les points limites sont clairement définis : tout animal présentant des signes persistants de douleur ou de souffrance non soulagée sera immédiatement euthanasié sous anesthésie profonde. Enfin, les protocoles seront régulièrement réévalués au sein de la structure en charge du bien-être animal afin d’ajuster les pratiques et d’intégrer toute amélioration permettant de réduire encore la contrainte imposée aux animaux. Ce dispositif complet garantit que chaque étape du projet est menée dans le respect le plus strict du bien-être animal et des principes éthiques européens.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce expérimentale repose sur plusieurs critères scientifiques, éthiques et pratiques. La souris est largement utilisée dans les recherches biomédicales car son système immunitaire, nerveux et musculo-squelettique est bien connu et partage de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Cela permet de modéliser avec fiabilité des maladies complexes telles que l’arthrose et d’évaluer de manière pertinente les effets de nouvelles approches thérapeutiques. Les modèles d’arthrose développés chez la souris sont bien établis, reproductibles et validés à l’échelle internationale. Ils permettent de reproduire les principaux mécanismes impliqués dans la douleur et la dégradation du cartilage tout en limitant la durée et la gravité des symptômes. L’utilisation de cette espèce garantit ainsi une obtention de données fiables avec un minimum d’animaux, conformément au principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les animaux seront utilisés à un stade adulte jeune, entre 10 et 12 semaines d’âge, correspondant à une maturité physiologique complète et à une bonne tolérance aux interventions chirurgicales. Ce stade permet également d’éviter toute variabilité liée à la croissance ou au vieillissement des tissus articulaires. L’emploi d’animaux plus jeunes ou plus âgés n’est pas approprié : les sujets immatures présentent une croissance active du cartilage rendant les résultats non comparables, tandis que les animaux plus âgés présentent des troubles métaboliques ou des altérations spontanées du cartilage. La souris représente donc le compromis le plus adapté entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal. Ce choix permet de limiter au strict nécessaire l’utilisation d’animaux plus grands ou plus sensibles, tout en obtenant des informations essentielles sur les mécanismes de la douleur et de l’inflammation articulaire.
Étude du rôle de la lamine A dans le vieillissement des cellules immunitaires[V
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des injections de toxine botulique dans l'oreille, de la vitamine D et un traceur fluorescent sur la peau: 5424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole prévoit cinq jours d'injections quotidiennes par lot, puis des traitements locaux répétés pour suivre le vieillissement des cellules immunitaires. Le porteur qualifie les effets cutanés, rougeurs, épaississement et démangeaisons, de mineurs et temporaires. L'effectif de plus de cinq mille animaux tranche avec une étude présentée comme portant sur des atteintes bénignes.
Objectifs
Le noyau des cellules joue un rôle clé : il protège le génome, c’est-à-dire l’ensemble du matériel génétique, et assure la stabilité de la cellule. Des protéines maintiennent la structure du noyau et protègent ainsi l’ADN. Avec l’âge, cette fonction de protection semble s’affaiblir, mais ses conséquences sur le vieillissement et sur l’immunité restent encore mal comprises. Dans une maladie génétique rare appelée progéria, une mutation bien identifiée produit une protéine défectueuse, qui déforme le noyau, provoque des dommages à l’ADN et entraîne un vieillissement accéléré des cellules. Cette maladie reproduit de façon exacerbée certains mécanismes naturels du vieillissement normal. L’étude de cette mutation permet ainsi d’explorer le rôle du gène sain — c’est-à-dire non muté — dans le vieillissement physiologique. Notre projet vise à comprendre comment les altérations du noyau influencent le vieillissement des cellules de Langerhans, des cellules immunitaires de la peau qui agissent comme des sentinelles. Elles détectent les microbes et préviennent le reste du système immunitaire. Avec l’âge, leur nombre et leur efficacité diminuent, ce qui contribue à la fragilité accrue de la peau et à la baisse des défenses contre les infections. Ce projet contribuera à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du vieillissement et à identifier de nouvelles stratégies pour préserver la santé immunitaire de la peau. À long terme, ces découvertes pourraient également éclairer la compréhension de la progéria et inspirer de nouvelles pistes pour un vieillissement en meilleure santé.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment le vieillissement altère le fonctionnement du système immunitaire et, plus largement, la santé des cellules au cours du temps. Le noyau protège le matériel génétique et contribue à la stabilité de l’ensemble de l’organisme. Avec l’âge, ce rôle protecteur semble s’affaiblir. Une forme anormale de protéine nucléaire, appelée progérine, est produite en excès dans la progéria, une maladie génétique rare où les enfants présentent un vieillissement très rapide, qui amplifie les mécanismes du vieillissement normal. Le projet vise à mieux comprendre comment des défauts du noyau fragilisent les cellules immunitaires et contribuent à l’affaiblissement progressif des défenses de l’organisme. Pour cela, des souris génétiquement modifiées sont utilisées. Certaines produisent de la progérine et présentent un vieillissement accéléré ; d’autres sont dépourvues de certains types de cellules immunitaires. Nous observerons comment les cellules du système immunitaire se répartissent dans le corps, en particulier dans la moelle osseuse, et comment elles réagissent à la présence de progérine. Ces expériences détermineront si certaines cellules aggravent ou limitent les effets du vieillissement pathologique. Dans un second volet, le projet s’intéresse plus spécifiquement à un type de cellules immunitaires, les cellules de Langerhans, qui sont les sentinelles de la peau. Avec l’âge, leur nombre et leur efficacité diminuent, ce qui contribue à rendre la peau plus vulnérable aux infections et à ralentir la cicatrisation. En utilisant des modèles de souris dans lesquels le noyau de ces cellules est altéré, le projet cherche à comprendre comment ces modifications affectent leur survie et leur fonctionnement. En combinant l’étude de la progérine et celle des cellules de Langerhans, ce projet fait le lien entre des mécanismes de vieillissement accéléré et le vieillissement naturel du système immunitaire. À long terme, ces recherches pourraient aider à trouver de nouvelles façons de renforcer les défenses immunitaires, de réduire certaines inflammations chroniques et d’améliorer la santé des personnes âgées, tout en apportant des pistes pour une meilleure prise en charge des enfants atteints de progéria.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, les souris vigiles recevront un traitement, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours (durée du geste < 3 min par jour). Dans un second lot d’animaux, les souris vigiles recevront un traitement, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours (durée du geste < 3 min par jour). Une semaine après, les souris anesthésiées (environ 5 min) recevront une injection locale de botox dans l'oreille (durée < 2 min). Dans un troisième lot d’animaux, les souris vigiles recevront un traitement, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours (durée du geste < 3 min par jour). Une semaine après, les souris seront anesthésiées (environ 5 min) pour recevoir un traitement par application cutanée tous les deux jours pendant 14 jours (1 min/jour). Dans un quatrième lot d’animaux, une peinture cutanée sera appliquée aux souris anesthésiées (environ 5 min), 1 fois au cours de l'expérience, (durée < 1 min).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, certaines souris recevront des traitements localisés sur la peau, comprenant de la toxine botulique, de la vitamine D et un traceur fluorescent qui permet de suivre les cellules immunitaires. Ces produits sont appliqués à faibles doses et de manière contrôlée. Les effets pouvant être observés sont mineurs et temporaires. La toxine botulique peut provoquer une légère sensibilité ou une petite baisse de mobilité au niveau de la zone traitée, qui disparaît en moins d’une semaine. L’application de vitamine D ou du traceur fluorescent peut entraîner une irritation modérée de la peau – un léger épaississement, une rougeur ou des démangeaisons – mais ces signes restent réversibles une fois le traitement arrêté. Dans certains cas, les animaux peuvent montrer un peu d’inactivité ou une courte perte de poids, selon leur sensibilité individuelle. Les souris progéria utilisées dans ce projet porteront uniquement une copie de la mutation, ce qui retarde l’apparition des signes de Progéria et en réduit la sévérité. Dans ce contexte, le phénotype de vieillissement accéléré ne se manifeste généralement qu’à partir de 8 à 9 mois, et non en début de vie. Les nuisances attendues sont principalement liées à ce vieillissement prématuré tardif : amaigrissement progressif, diminution de l’activité, altération de la qualité du pelage et éventuellement troubles locomoteurs modérés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Dans le domaine de la recherche sur le système immunitaire, il existe aujourd’hui plusieurs méthodes alternatives à l’expérimentation animale, comme les cultures de cellules, les mini-organes cultivés en laboratoire (organoïdes) ou les simulations informatiques. Cependant, ces approches ne permettent pas encore d’étudier correctement les cellules de Langerhans, car ces cellules dépendent étroitement de leur environnement naturel dans la peau et ne peuvent pas être reproduites fidèlement en culture. Pour comprendre comment elles fonctionnent dans un organisme vivant et comment elles interagissent avec les autres cellules du système immunitaire, l’étude sur l’animal reste donc indispensable. Seule l’observation in vivo, c’est-à-dire dans un organisme complet, permet d’appréhender la complexité du système immunitaire et d’obtenir des résultats fiables et pertinents pour la santé humaine.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, le projet a été conçu avec une planification rigoureuse et progressive. Des tests préliminaires sur de petits groupes permettront d’ajuster les conditions expérimentales, afin d’obtenir des résultats fiables sans multiplier inutilement les animaux. Des outils de simulation informatique aideront aussi à prévoir certains effets et à mieux cibler les expériences à réaliser. Par ailleurs, la sélection équilibrée des animaux selon leur sexe et leurs caractéristiques génétiques permettra d’obtenir des groupes comparables et statistiquement représentatifs, tout en réduisant les effectifs nécessaires. Les analyses reposeront sur des techniques modernes d’imagerie et de mesure très précises, qui nécessitent peu de matériel biologique. Cela permet de recueillir de nombreuses informations à partir d’un même échantillon et d’éviter de répéter inutilement les expériences. De plus, certaines conditions expérimentales peuvent être testées sur le même animal, ce qui réduit encore les besoins. Enfin, les protocoles suivront des méthodes déjà bien établies dans la littérature scientifique. Le nombre d’animaux sera défini à partir des données connues et ajusté en fonction des résultats des premiers essais.
Raffinement
Tout au long de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux et limiter au maximum toute gêne ou souffrance. L’état de santé de chaque animal sera suivi attentivement grâce à une grille d’observation permettant de repérer rapidement tout signe de douleur ou de stress et d’intervenir sans délai si nécessaire. Lors des interventions, les animaux seront anesthésiés et installés sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle stable. Les procédures seront adaptées et réalisées avec le plus grand soin : utilisation d’anesthésiques quand cela est utile, manipulation douce, habituation progressive pour réduire le stress. Les souris progéria seront suivies régulièrement (poids, aspect général, comportement) afin d’identifier précocement l’apparition des signes de vieillissement, et ne seront incluses dans les expériences qu’à un stade où les analyses sont informatives sans que l’état général soit trop altéré. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire. Des critères d’arrêt clairs seront définis afin de mettre fin à l’expérience pour un animal dès que son bien‑être est compromis, en privilégiant toujours la méthode d’euthanasie la plus rapide et la moins douloureuse reconnue par les recommandations en vigueur. Les personnels formés appliqueront les pratiques les plus respectueuses et surveilleront en permanence le confort des animaux. L’objectif est de concilier exigence scientifique et respect absolu du bien-être animal, conformément au principe de raffinement des expérimentations.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est l’animal le plus utilisé pour étudier le fonctionnement du système immunitaire. Chez elle, il est possible d’observer en détail comment les cellules réagissent face à une infection ou à une stimulation. Sa particularité est qu’on peut modifier certains de ses gènes pour comprendre précisément le rôle qu’ils jouent dans la défense de l’organisme. Grâce à ces atouts, la souris est devenue un modèle de référence pour la recherche sur l’immunité, et il n’existe aujourd’hui aucune alternative qui permette d’obtenir des résultats aussi complets. Les souris progeria offrent un levier translationnel puissant pour comprendre et traiter le vieillissement pathologique. Elles développent ainsi, en quelques mois, des signes rappelant ceux des patients : retard de croissance, fragilité des os, problèmes cardiovasculaires. Cela permet aux chercheurs d’observer de près comment la maladie évolue dans l’organisme et de tester de nouveaux traitements dans des conditions contrôlées, avant d’envisager des essais chez l’être humain. Les expériences seront réalisées chez la souris à des étapes bien précises de la vie, afin de garantir un système immunitaire pleinement fonctionnel. Chez les souris dites « jeunes adultes » (environ deux à trois mois), la peau est mature et fonctionne de manière stable. Cela permet d’étudier le comportement des cellules de Langerhans dans un tissu déjà formé. Les modèles génétiques permettent de reproduire des effets du vieillissement uniquement dans le système immunitaire, alors que le reste de l’organisme reste jeune, ce qui aide à mieux identifier les causes du vieillissement immunitaire. Pour le modèle progéria, les animaux seront étudiés lorsque leur système immunitaire est mature, mais avant que la maladie ne provoque des atteintes trop sévères. Les premières manifestations de vieillissement apparaissant à l’âge adulte, les souris seront suivies à partir de 6–7 mois, puis incluses dans les expériences lorsque ces signes sont visibles sans que l’organisme ne soit trop affaibli.
Etude des populations immunitaires présentes chez des souris humanisées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 20 souris dites humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales d'une molécule censée faire mûrir un système immunitaire humain greffé, puis un prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse. Leur mise à mort tient à l'objet même de l'étude, vérifier après leur mort si ces cellules humaines se comportent comme chez l'humain. Le porteur affirme que ce dispositif remplace des études cliniques sur l'être humain.
Objectifs
Les modèles animaux classiques sont d’une grande utilité dans les études précliniques car ils permettent de tester des hypothèses et des traitements de manière robuste. Malheureusement, le système immunitaire de la souris reste différent de celui de l’Homme et ne peut parfaitement mimer les réponses qui se développeront chez l’Homme. A mi-chemin entre souris et Homme ont été développées des souris humanisées, c’est-à-dire qui possèdent des cellules du système immunitaire humain. L’objectif de ce projet est de tester si les cellules immunitaires présentes chez des souris humanisées possèdent les même caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques que les cellules humaines.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote permettra de mieux caractériser le système immunitaire humain présents dans les souris humanisées. Les bénéfices attendus de ce projet doivent être considérés à l’aune de son caractère exploratoire. Sur le plan scientifique, cette étude permettra d’évaluer la transposabilité des données issues d’expériences réalisées chez les souris humanisées et ainsi de les utiliser au mieux de leur capacité. D’un point de vue translationnel, l’identification d’un modèle murin récapitulant les caractéristiques du système immunitaire humain permettra la mise en place d’études précliniques dont les résultats mimeront avec une grande fidélité ceux attendus chez l’Homme.
Procédures
Les souris vigiles recevront 4 administrations d’une molécule permettant la maturation du système immunitaire en IP (30 secondes par geste). Les souris endormies se verront prélever du sang au niveau de la mandibule une fois pendant une minute.
Impact sur les animaux
Les 4 injections de la molécule permettant la maturation du système immunitaire humain se feront en intra péritonéale. Ces injections sont susceptibles de générer un stress lié à la contention pendant l’injection. L’injection en elle-même n’est pas douloureuse. Le prélèvement de sang se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane et ne devrait pas susciter de douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin d’étudier le système immunitaire humain qui s’est développé dans différents organes.
Remplacement
Des expériences in vitro ont été réalisées en amont grâce à l’utilisation de poches de sang. Cependant le système immunitaire humain est complexe et dépendant de son microenvironnement, absent lors des études in vitro. L’utilisation de souris possédant un système immunitaire humanisé permet le remplacement d’étude clinique sur l’homme.
Réduction
Le principe de réduction est au cœur de la conception de cette étude pilote. En menant d’abord une étude préliminaire, nous pourrons déterminer si ces souris humanisées possèdent un système immunitaire humain dont les fonctionnalités sont proches de celle d’un être humain. Cette étape exploratoire permettra d’évaluer la pertinence et la faisabilité d’une étude plus vaste, évitant ainsi l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux sans justification scientifique préalable. De plus, notre équipe a déjà généré un volume important de données in vitro en utilisant des poches de sang. En combinant ces deux éléments — étude pilote préalable et exploitation des données expérimentales existantes — nous respectons pleinement le principe de réduction, en utilisant le minimum d’animaux nécessaires pour répondre à la question scientifique tout en assurant la robustesse et la pertinence des conclusions.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit). L’hébergement se fera classiquement en cagepouvant accueillir 10 animaux. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers, permettant de réduire l‘ennui, diminuer le stress en stimulant l‘activité et procure un sentiment de sécurité à l‘animal dans la cage. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane) suivi de la mise à mort par dislocation cervicale avant le réveil.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car le processus d’humanisation de leur système immunitaire est maitrisé en routine par la société les mettant en œuvre. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal qui a pu reconstituer un système immunitaire humain complet.
Asthme allergique dans le modèle souris : Etude des mécanismes d’activation et évaluation de molécules à visée thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
13 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains animaux recevant jusqu'à cinquante administrations d'allergène ou de composés. Les produits sont instillés dans le nez ou la trachée pour déclencher un asthme allergique, avec inflammation des voies respiratoires, gêne à respirer et perte de poids. Toutes sont mises à mort pour analyser leurs poumons et leur réponse immunitaire. Le porteur situe l'effectif à dix animaux par groupe et rappelle que le précédent projet a donné lieu à quatre publications, la finalité restant l'accumulation de données sur les mécanismes de la maladie.
Objectifs
Ce projet est la suite d’un précédent projet qui vise à étudier les mécanismes qui participent à la mise en place de la réponse immunitaire pulmonaire en réponse à des allergènes et causant l'asthme allergique sur des modèles murins. L’objectif est d’étudier le rôle des acteurs immunologiques qui participent à la réponse inflammatoire pulmonaire suite à une exposition à un allergène et qui peuvent conduire au développement de pathologies irréversibles comme l'asthme allergique et la difficulté respiratoire et de tester des composés à visée thérapeutique. L'asthme allergique est une maladie complexe caractérisée par une inflammation des voies respiratoires, une obstruction variable du flux d'air et une hyperréactivité bronchique, souvent influencée par des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Il se manifeste à travers des crises durant lesquelles il existe une gêne respiratoire (dyspnée) et des sifflements liés à une inflammation chronique associée à des perturbations locales du tissu respiratoire. Selon l’OMS, d’ici 2050, une personne sur deux dans le monde sera allergique, contre trois sur dix aujourd’hui. L’asthme allergique touche environ 300 millions d’individus dans le monde dont 4 millions de personnes en France et est associé à plus de 60 000 hospitalisations et près de 900 décès par an. A ce jour, aucun médicament ne permet d’en guérir d’où la nécessité de continuer à étudier les mécanismes moléculaires impliqués. L’objectif est d’étudier le rôle des cellules, cytokines, récepteurs ou voies de signalisation impliqués dans la réponse immunitaire de l'hôte afin de participer à l’amélioration de nos connaissances et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans un second temps, une fois que des cibles thérapeutiques auront été identifiées, nous testerons ces composés à visée thérapeutique pour voir l’évolution sur la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un précédent projet autorisé dont les résultats ont donné lieu à 4 publications scientifiques. Nous avons pu montrer l’implication de certaines voies de signalisation dans la réponse inflammatoire pulmonaire suite à l’exposition aux allergènes. Nous avons également pu montrer le rôle des voies d’activation des récepteurs d’acides nucléiques cGAS-STING suggérant une nouvelle approche pour identifier des cibles thérapeutiques. L’utilisation des souris déficientes en certains gènes a permis de valider la contribution des gènes correspondants et donc des voies de signalisation ou cytokines impliquées dans ces mécanismes pathologiques. Nous poursuivons nos investigations pour tester l’implication de ces voies en utilisant des agonistes et inhibiteurs de ces voies de signalisation et des voies annexes qui ont pu être identifiées grâce à nos travaux. Une fois validées, ces molécules représentent des cibles thérapeutiques potentielles dont la pertinence sera vérifiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Ces travaux feront l’objet de publications scientifiques.
Procédures
Un prélèvement sanguin unique sous anesthésie gazeuse sur tous les animaux utilisés dans la partie A et B du projet pourra être effectué. Les administrations d’allergène se feront par voie intranasale, intratrachéale, sous anesthésie ou par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. 3 administrations maximales/semaine espacées de 24 h pour les procédures 4 à 6 auront lieu. Les administrations de « candidat médicament » pourront se faire par voie intranasale/intratrachéale, intrapéritonéale, sous-cutanée, sublinguale ou intragastrique. Le traitement pourra commencer jusqu’à 1 semaine avant l’administration d'allergènes ou au moins 1h après induction et se prolonger pendant toute la durée de l’expérience pour assurer un effet optimal. A noter que certains traitements (notamment ceux administrés par voie intragastrique) pourront être réalisés 2x par jour durant toute la période d’expérimentation, soit au maximum 50 administrations par animal. Les administrations sont de courte durée maximum 2min/souris.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires chez l'animal liées au développement de la pathologie. La douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqûre de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et du stress. Pour les traitements en intragastrique, aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Les effets secondaires liés aux molécules à visée thérapeutique ne sont pas attendus. Certaines lignées utilisées sont immunodéficientes, cependant, les phénotypes ne s’expriment pas dans nos conditions d’élevage en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à l'évaluation des mécanismes de l'asthme allergique et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.
Remplacement
Nous menons des études in vitro sur des cellules épithéliales et immunitaires murines qui nous permettent d’évaluer la toxicité des molécules utilisées. Nous évaluons l’efficacité potentielle de ces molécules en mesurant la sécrétion de molécules de l’inflammation (cytokine pro-inflammatoire par exemple). Bien que nous conduisons en parallèle ces études in vitro, l’inflammation et l’asthme allergique sont des pathologies globales qui ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes. Le modèle animal reste indispensable afin d’examiner la réponse de l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et les inter-relations entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires innées et acquises. C’est le seul moyen d’analyser les interactions entre les différents types cellulaires au niveau du poumon et d’examiner la pathologie au niveau histologique, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, sur les paramètres étudiés. Il ressort ainsi que 10 animaux maximum /groupe seront nécessaires. Ce nombre d'animaux par groupe permet de réduire la répétition des expériences car les résultats sont moins variables. Nous optimisons chaque expérience en termes de prélèvements effectués et de paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un tapis chauffant.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie scientifiquement : -La souris est un mammifère qui présente une architecture anatomique et fonctionnelle comparable à l’espèce humaine. -La souris est l’un des seuls modèles de mammifères permettant de telles modifications génétiques de précision cellulaire. -La souris reste l’animal modèle de référence dans la communauté scientifique pour étudier expérimentalement les mécanismes immunitaires pulmonaires. En particulier, des modèles de maladies pulmonaires chez la souris ont été développés dans différents laboratoires dont le nôtre depuis plusieurs années, ce qui nous permet de maitriser ces modèles.
Etude du rôle d’un facteur de transcription dans la fonction anti-tumorale des lymphocytes T chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour mesurer le rôle d'un facteur de transcription dans les lymphocytes T, 131 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement des tumeurs, de la rate et des ganglions. Les animaux reçoivent une greffe de cellules de mélanome ou de cancer du côlon sur le flanc, puis des injections de médicaments et de lymphocytes, la tumeur pouvant provoquer une douleur modérée et parfois nécroser. Les retombées décrites relèvent de l'espoir, le porteur indiquant qu'il "pourrait" mettre en évidence un biomarqueur de réponse aux immunothérapies. Les procédures suivantes ne seront menées que si la première donne des résultats significatifs.
Objectifs
Malgré l’avancée révolutionnaire que constituent les immunothérapies du cancer, seule une partie des patients en bénéficie de façon durable. Notre projet vise à comprendre le rôle d’une protéine exprimée par les cellules immunitaires, dans la progression du cancer et la réponse aux immunothérapies. L’objectif principal est de décrire l’impact et les mécanismes de l’inhibition de cette protéine dans des modèles de mélanome et de cancer du colon chez la souris. Nous testerons aussi l’amélioration de la réponse aux immunothérapies induite par la sur-expression de notre protéine d’intérêt.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, nous pourrions mettre en évidence une protéine régulant l’activité des globules blancs dans la tumeur. Au point de vue translationnel, nous espérons mettre en évidence notre protéine comme un biomarqueur de réponse aux immunothérapies et comme une cible potentielle d’immunothérapie.
Procédures
- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Injections intrapéritonéales de médicaments (2 ou 3x 5 secondes/souris) – Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris)- Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)
Impact sur les animaux
L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.
Devenir
Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle de notre protéine d’intérêt dans la réponse immunitaire contre la tumeur, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Les procédures 2, 4 et 5 ne seront effectuées que si la procédure 1 donne des résultats significatifs.
Raffinement
Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées et intra-veineuses seront faites sous anesthésie gazeuse. Un anesthésique local sera appliqué avant les injections intra-veineuses. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 10 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, sauf dans une procédure où seules des femelles seront utilisées. L’âge sera homogène dans chaque procédure.
Création et maintien de lignées permettant l’étude des réponses immunes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
23 648 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour créer et entretenir des lignées destinées à l'étude des réponses immunitaires. Les souriceaux sont tatoués aux coussinets et subissent une biopsie de la queue vers 7 à 10 jours, certains une prise de sang sans analgésie dès quatre semaines. La grande majorité, environ 19 720, est transférée vers d'autres projets, tandis que les animaux au mauvais génotype et les anciens reproducteurs sont mis à mort. Le porteur justifie l'effectif par des stratégies d'accouplement conçues pour produire un nombre selon lui restreint mais suffisant.
Objectifs
Les objectifs du projet sont la création et le maintien des lignées permettant d'étudier les mécanismes des maladies chroniques inflammatoires, en particulier l’interaction entre les cellules immunitaires et les cellules résidentes des tissus cibles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est d'avoir les animaux nécessaires pour augmenter la connaissance scientifique sur les réponses immunes, et l’interaction des cellules du système immunitaire avec les cellules résidentes des tissus.
Procédures
Les souriceaux subiront une contention d'environ une minute pendant laquelle un ou deux coussinets des pattes seront tatoués. Une biopsie de queue sera prélevée en même temps que l'identification. Pour certaines souris, un prélèvement sanguin sera effectué à partir de l’âge de 4 semaines sans analgésie.
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal. La piqure du coussinet lors du tatouage peut provoquer une légère douleur. Le prélèvement sanguin peut induire une légère douleur de manière transitoire.
Devenir
Les animaux d'intérêt seront utilisés dans des projets scientifiques ou pour renouveler les accouplements. Les animaux n'ayant pas le bon génotype et anciens reproducteurs seront mis à mort.
Remplacement
Les questions scientifiques posées sur l’initiation et la modulation des réponses immunes par l’environnement ne peuvent être étudiées que directement dans l'animal, car la complexité et la richesse des interactions entre les nombreux et divers types cellulaires en présence ne peuvent, à ce jour, être reproduites dans aucun modèle de remplacement.
Réduction
Les stratégies d’accouplement ont été élaborées selon nos expériences antérieures pour générer un nombre restreint mais suffisant d’animaux pour réaliser au mieux ces expériences.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) et en groupe social. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum puis sont surveillés pour vérifier qu’ils sont bien réacceptés par leur mère. Des points limites stricts et spécifiques ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de référence pour mener les études sur le système immunitaire, principalement en raison des nombreux modèles génétiquement modifiés qu’elle permet de générer et aux nombreux outils à disposition, tels que des anticorps pour les immunomarquages, par exemple. Les souriceaux sont identifiés entre 7 et 10 jours après la naissance, âge auquel on peut tatouer les coussinets des pattes et/ou biopsier (queue). Le prélèvement caudal permet un génotypage avant le sevrage. Le prélèvement de sang permet un phénotypage indiquant le génotype des souris. Pour l'une des lignées, un prélèvement s’effectue à partir de l’âge de 4 semaines via une prise de sang sans analgésie. Le geste sera effectué par le personnel de l’animalerie formé au bien-être animal. Un prélèvement unique de faible volume (< 50 microlitres) est suffisant pour effectuer le phénotypage indiquant le génotype de la souris.
Étude de l’intérêt d’inhibiteurs du métabolisme du lactate dans la formation et le développement des métastases osseuses des cancers pulmonaires et combinaison avec les immunothérapies.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Une injection de cellules tumorales dans le tibia ou dans une artère, puis une séance d'imagerie sous anesthésie tous les cinq jours : 484 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Une partie est immunodéprimée par construction pour accueillir des tumeurs humaines. Le porteur décrit des douleurs osseuses, des boiteries, des difficultés respiratoires et des atteintes neurologiques selon le site des métastases. Les retombées cliniques espérées contre les métastases osseuses du cancer du poumon restent hypothétiques et lointaines, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre si le blocage de deux transporteurs du lactate, à l’aide de molécules spécialement conçues pour les inhiber, permet de ralentir ou de réduire le développement de métastases pulmonaires chez la souris. Le lactate est une substance produite par les cellules tumorales, et certains transporteurs permettent sa sortie de la cellule, facilitant ainsi la progression du cancer. En empêchant leur fonctionnement, nous cherchons à savoir si la croissance tumorale peut être limitée. Si ces inhibiteurs montrent une efficacité, nous évaluerons ensuite si leur utilisation conjointe avec des traitements d’immunothérapie peut renforcer la diminution du développement métastatique. L’objectif est de déterminer si cette approche combinée offre une meilleure réponse que chaque traitement pris séparément. Enfin, pour mieux comprendre les mécanismes en jeu, des analyses complémentaires seront réalisées sur les tissus et les cellules. Elles permettront d’identifier les processus cellulaires et moléculaires responsables des effets observés, afin de mieux expliquer comment ces inhibitions influencent l’évolution des métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inhibition de transporteurs du lactate influence la progression des métastases du cancer du poumon et la réponse à l’immunothérapie. L’étude précisera les mécanismes cellulaires et moléculaires associés aux phénomènes de résistance ou de sensibilité aux traitements. Même en l’absence d’effet majeur sur les métastases osseuses, les données obtenues apporteront des informations utiles sur l’impact de ces inhibiteurs dans d’autres sites métastatiques (poumon, foie, cerveau, glandes surrénales), contribuant ainsi à clarifier leur rôle dans différents microenvironnements tumoraux. Ces résultats enrichiront la littérature existante et aideront à identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse aux approches ciblant le métabolisme lactique. Sur le plan clinique, le projet pourrait ouvrir la voie à une stratégie innovante pour traiter les métastases osseuses du cancer du poumon, pour lesquelles les options actuelles sont très limitées. En montrant que l’inhibition de transporteurs du lactate peut renforcer l’efficacité de l’immunothérapie, il pourrait soutenir le développement de nouvelles combinaisons thérapeutiques. Si une activité est également observée sur d’autres métastases, ces agents pourraient être envisagés pour des patients atteints de formes avancées et de mauvais pronostic. À terme, ce travail contribuera à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à la conception d’essais cliniques dédiés.
Procédures
Les animaux seront injectés avec des cellules tumorale soit en intra-tibiale ou en intra-artérielle, sous anesthésie générale avec analgésie préalable, pour chaque procédure d’injection, 5 min seront nécessaire. Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier par imagerie. La colonisation tumorale sera évaluée par bioluminescence, une méthode non invasive consistant à anesthésier les souris, à les placer dans l’appareil pour capturer les images, puis à les retirer. Dans un second temps, les animaux seront maintenus sous anesthésie afin de réaliser une analyse complémentaire par scanner, permettant d’évaluer l’état des structures osseuses. Ainsi, chaque séance d’imagerie représentera une procédure d’une dizaine de minutes, répétée tous les cinq jours. En parallèle, un suivi quotidien sera assuré, comprenant l’observation clinique et la pesée de chaque animal.
Impact sur les animaux
Les modèles expérimentaux peuvent générer différents niveaux de nuisances, suivies de près afin d’éviter douleur ou détresse. • Injection intra-tibiale : le développement tumoral dans l’os de la patte arrière peut provoquer une douleur locale, se traduisant par une moindre utilisation du membre, des troubles de la marche ou une boiterie. Cela est identifié lors de l’examen quotidien des souris, lorsqu’elles sont placées en une cage individuelle quelques instant avant la pesée et les traitements, une douleur est repérée lorsque la souris utilise moins sa patte colonisée par la tumeur lorsqu’elle se lève ainsi qu’une boiterie lorsqu’elle se déplace. • Injection intra-artérielle : les cellules tumorales diffusent par la circulation sanguine et peuvent former des métastases dans le squelette, les poumons, le système digestif, le cerveau ou d’autres organes. Leur localisation sera suivie par imagerie bioluminescente. Cela peut engendrer des douleurs osseuses, des difficultés respiratoires, des atteintes neurologiques, une perte de poids, des lésions cutanées, et est identifiable lorsque les souris présentent des signes d’isolement, de prostration, d’hyperactivité ou d’agressivité envers le soigneur ou les congénères). • Les traitements par gavages et ou par intra péritonéale peuvent induire une inflammation dans les voies digestives supérieures ou une inflammation cutanée au site d’injection intrapéritonéale. • Les animaux traités avec les inhibiteurs du lactate devraient subir des dommages moindres que les animaux témoins, compte tenu des effets antitumoraux présumés.
Devenir
La mise à mort sans douleur des animaux sera réalisée pour tous les animaux. Elle est requise pour une analyse plus approfondie de la colonisation des organes par les cellules cancéreuses réalisées via des analyses de biologie cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer l’effet de traitements ciblant le métabolisme tumoral dans le cadre des métastases osseuses, en reproduisant au mieux la situation observée chez les patients. Actuellement, aucune méthode alternative (cultures cellulaires, modèles informatiques, systèmes ex vivo) ne permet de recréer l’ensemble du processus métastatique dans un os vivant, avec sa vascularisation, ses interactions cellulaires et sa réponse immunitaire. Avant de recourir à l’animal, différentes approches ont été utilisées : cultures de cellules tumorales, cocultures avec des cellules osseuses, os en culture et modèles informatiques. Ces techniques sont utiles pour explorer certains mécanismes, mais elles ne reflètent pas la complexité d’un organisme entier. L’utilisation de la souris reste donc nécessaire pour modéliser la dissémination tumorale par la circulation sanguine, observer l’évolution de la tumeur dans l’os, évaluer l’efficacité des traitements sur l’ensemble du corps et analyser leurs effets secondaires. Aucune autre méthode ne permet actuellement d’atteindre ces objectifs avec la même pertinence scientifique.
Réduction
Nous appliquons le principe des 3R en cherchant à limiter autant que possible le nombre d’animaux. Le plan expérimental est conçu de façon à inclure seulement le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ainsi, même si un petit surplus d’animaux est prévu pour anticiper d’éventuelles exclusions, nous évitons de répéter inutilement les expériences. Le suivi de l’évolution des tumeurs est réalisé grâce à des techniques d’imagerie, ce qui permet d’observer les mêmes animaux au fil du temps sans avoir besoin de procéder à des mises à mort à chaque étape. De plus, nous utilisons certains animaux provenant d’autres projets de recherche : ces animaux, qui auraient été euthanasiés car non conformes aux besoins initiaux, trouvent une utilité scientifique dans nos travaux. Enfin, lorsqu’un animal ne peut pas être inclus dans le groupe principal en raison d’une réponse expérimentale trop faible ou trop forte, il n’est pas perdu : il contribue à des analyses complémentaires (histologie, étude du système immunitaire, etc.). Cette approche maximise les informations obtenues tout en réduisant les effectifs globaux. Le projet est construit avec différentes étapes, dont deux de mise au point ; les résultats obtenus à chaque étape sont analysés et l’étape suivante n’est entreprise que si les résultats précédents ont été concluants.
Raffinement
Afin de limiter au maximum la douleur et le stress des animaux, plusieurs précautions sont mises en place. Les interventions douloureuses sont systématiquement réalisées sous anesthésie et un traitement antidouleur est administré au réveil et par la suite si nécessaire sont réalisées sous anesthésie et un traitement antidouleur est administré si nécessaire. Les animaux sont observés chaque jour pour détecter rapidement tout signe de souffrance, avec une prise en charge immédiate si besoin. Ils sont hébergés en groupes, dans des cages enrichies favorisant leur confort et leurs comportements naturels. Un temps d’acclimatation et une accommodation progressive aux manipulations permettent aussi de réduire leur stress. Nous privilégions des méthodes non invasives, comme l’imagerie, pour suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les interventions. Enfin, les animaux qui ne peuvent pas être inclus dans l’expérience sont utilisés pour d’autres analyses afin de réduire leur nombre global. L’ensemble du protocole est régulièrement ajusté avec le vétérinaire et l’équipe est formée en continu aux bonnes pratiques de bien-être animal. Notre projet utilise des animaux immunodéprimés maintenues sous barrières et les manipulations en conditions stériles pour limiter le risque infectieux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés pour le projet sont des souris normales immunocompétentes et des souris mutantes immunodéprimées. Les souris normales immunocompétentes disposent d’un système immunitaire bien caractérisé, indispensable pour évaluer l’efficacité de traitements métaboliques et immun thérapeutiques. Les souris mutantes immunodéprimées présentent une déficience en lymphocytes T. Cette immunodépression rend possible l’implantation et la croissance de lignées tumorales humaines (xénogreffes), indispensables pour étudier la biologie des tumeurs humaines et la formation de métastases en contexte in vivo. Dans le contexte de notre étude, les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.
Etude du r?le de m?tabolites de la flore microbienne intestinale dans le traitement de l’ob?sit? du diab?te et de l’asthme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.
Objectifs
Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.
Procédures
Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.
Devenir
Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.
Remplacement
Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.
Réduction
Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.
Raffinement
Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.
Choix des espèces
Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.
Phénotypage de la résilience des réserves corporelles chez des agnelles en croissance
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour repérer les individus les plus 'résilients' en vue de la sélection, 100 agnelles vont être soumises à des restrictions alimentaires de 30 à 50 % pendant plusieurs jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Quatre prises de sang, neuf échographies et une tonte dorsale s'y ajoutent, la faim et la perte d'état corporel étant décrites comme intrinsèques au protocole. Aucune n'est tuée dans ce projet, toutes poursuivant leur élevage et étant déjà prévues pour une autre étude quelques mois plus tard. Le porteur présente cette privation contrôlée comme un moyen d'améliorer à terme le bien-être des animaux non-humains d'élevage.
Objectifs
Le projet vise à caractériser chez des ovins en croissance la résilience à des challenges alimentaires contrôlés et relativement courts. L’objectif est d’explorer différentes modalités de restriction alimentaire, en variant leur intensité et leur durée, afin de déterminer dans quelle mesure ces perturbations permettent de révéler des différences de dynamique de réserves corporelles au cours de la croissance. Cette approche permettra d’établir la faisabilité d’un protocole de phénotypage précoce et non-invasif de la résilience. La validité de cette mesure de résilience chez le jeune reposera sur deux critères complémentaires : (1) la mise en évidence d’une variabilité intra‑ et inter‑individuelle dans les réponses aux challenges alimentaires évaluées à l’aide d’un indicateur non-invasif des réserves corporelles (épaisseur de gras dorsal mesuré par échograhie), et (2) la cohérence entre la dynamique des réserves corporelles évaluée via cet indicateur non-invasif et les indicateurs métaboliques du déficit énergétique qui nécessitent des prises de sang. L’objectif est de vérifier que les réponses physiologiques observées reflètent l’état énergétique réel de l'animal en croissance avant d’envisager un phénotypage à plus grande échelle uniquement sur l’indicateur non-invasif des réserves corporelles. Si la mesure de résilience est validée à ce stade précoce, une seconde phase du programme sera envisagée, afin d' appliquer un protocole similaire aux mêmes individus une fois adultes et en période reproductive. Cette étape (qui ne fait pas partie du projet présenté ici) permettra de confirmer la pertinence de la mesure chez la brebis adulte, de comparer les modalités de challenge les plus discriminantes entre les deux stades de vie, et d’étudier la relation entre résilience précoce et résilience adulte. In fine, le projet permettra d’explorer les liens entre résilience énergétique et d’autres caractères d’intérêt zootechnique ou adaptatif.En utilisant des challenges en milieux contrôlés et à partir d’un indicateur non-invasif des réserves corporelles, il sera possible d’identifier les individus les plus résilients et de les séléctionner visant à renforcer l’adaptation et la performance des troupeaux face à des conditions d’élevage contrastées.
Bénéfices attendus
Le projet apportera des avancées majeures dans la compréhension de la résilience énergétique chez les petits ruminants. La dynamique des réserves corporelles constitue un indicateur prometteur, mais elle est aujourd’hui principalement mesurée en milieu extensif, sans possibilité de caractériser précisément les challenges auxquels les animaux sont exposés. De plus, cet indicateur est le plus souvent évalué tardivement, chez la brebis reproductrice. Enfin les indicateurs les plus communs des réserves corporelles sont souvent soit peu précis (ex : note d’état corporel), soit nécessitant une méthode invasive (ex : métabolites sanguins), ce qui limite les possibilités de phénotypage de la résilience. Le protocole proposé permettra de tester la validité d’un phénotypage précoce de la résilience à l’aide d’un indicateur quantitatif et non invasif : l’épaisseur de gras dorsale mesurée par échographie. Si la résilience mesurée chez le jeune s’avère cohérente avec celle observée à l’âge adulte et dans des environnements variés, cela ouvrira la voie à des travaux de génétique visant à sélectionner des animaux plus robustes. Une telle amélioration de la résilience contribuerait également à renforcer le bien‑être animal, en réduisant la sensibilité aux variations alimentaires et aux situations de déficit énergétique
Procédures
Sur l’ensemble de la période expérimentale de 8 semaines, chaque animal aura 4 prélèvements de sang (temps de prélèvement : moins d’une minute). Chaque animal aura 9 échographies (8 minutes chacune) . Les 25 animaux suivant la procédure 2 auront une restriction de 50% de leur alimentation relativement à leur niveau non restreint pendant 4 jours et une restriction intermédiaire pendant 3 jours, les 25 animaux de la procédure 3 auront une restriction de 30% relativement à leur niveau non restreint pendant 4 jours et une restriction intermédiaire pendant 3 jours, les animaux de la procédure 4 auront une restriction de 50% de l’alimentation relativement à leur niveau non restreint pendant 8 jours et une restriction intermédiaire pendant 3 jours.
Impact sur les animaux
es potentielles nuisances dans ce projet sont principalement liées aux restrictions alimentaires temporaires et aux manipulations nécessaires au suivi des animaux. Les périodes de rationnement peuvent entraîner une sensation de faim transitoire, une légère perte d’état corporel, un ralentissement temporaire de la croissance et un stress métabolique modéré. Cependant les modifications de l’état corporel attendues lors des phases de restriction ne constituent pas une nuisance imprévue : elles sont intrinsèques au protocole, contrôlées et nécessaires pour mesurer la résilience énergétique. Ces variations sont limitées dans le temps, réversibles et correspondent à la réponse physiologique recherchée pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les manipulations associées aux mesures d’échographie dorsale et aux prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress ponctuel ou un inconfort bref lié à la contention. Une perturbation comportementale peut également survenir lors de l’adaptation initiale aux dispositifs automatisés ou lors des interventions humaines. La réalisation de la tonte dorsale et de l’échographie dorsale nécessite le passage des animaux dans un couloir de contention et l’immobilisation des animaux pendant 8 minutes maximum, pouvant provoquer un stress ponctuel ou un inconfort bref. Outre ce stress de contention, la tonte et l’échographie ne provoquent pas de douleur particulière. Ce stress, dû à la contention, diminue rapidement à mesure que les agnelles s’habituent à cette contention. Une poignée de concentrée distribuée en sortie de contention permet d’accélérer cette habituation et à réduire le stress des animaux. La prise de sang, nécessite le passage des animaux dans un couloir de contention pendant 1 minute maximum, pouvant provoquer un stress ponctuel ou un inconfort bref. La prise de sang génère une douleur brève et modérée en raison de la piqure de l’aiguille et peut potentiellement générer un hématome. Un baume (vétébiol) sera appliqué en cas d’apparition.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les agnelles poursuivront leur phase d’élevage.
Remplacement
Il n’est pas possible d’appliquer le principe de remplacement dans ce projet. À notre connaissance, aucun modèle in vitro, ex vivo ou in silico ne permet de reproduire l’ensemble des processus physiologiques impliqués dans la dynamique des réserves corporelles face à une challenge nutritionnel. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet, et aucune alternative ne permettrait d’obtenir des données équivalentes.
Réduction
Notre projet repose sur le phénotypage de 100 agnelles. À notre connaissance, il s’agit du premier essai visant à caractériser un caractère de résilience face à un challenge alimentaire contrôlé chez des petits ruminants en croissance. Sur la base de la littérature disponible et de nos données préliminaires, nous estimons qu’un minimum de 20 animaux par traitement est nécessaire pour détecter des différences de trajectoires des réserves corporelles avec une puissance statistique suffisante. Toutefois, compte tenu de l’incertitude sur la sensibilité de l’indicateur non-invasif utilisé pour les réserves corporelles (épaisseur de gras dorsal), et des aléas possibles en cours d’expérimentation, nous prévoyons une marge de sécurité de 25 %. Cette augmentation vise à garantir la robustesse des analyses tout en évitant d’avoir à mobiliser ultérieurement des animaux supplémentaires. Le nombre de prélèvements sanguins est limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, en l’occurrence la description de la dynamique des indicateurs métaboliques du déficit énergétique induit par la restriction alimentaire. Par ailleurs, les 100 agnelles utilisées dans cette expérimentation sont déjà prévues d’être utilisées quelques mois plus tard dans un autre projet. Pour ce projet, ces agnelles devaient au préalable être adaptées au dispostif automatiques en vue d’un passage au cours de l’été 2026. Elles le seront donc grâce à la phase d’adaptation prévue dans ce projet. Par ailleurs, la phase expérimentale prévue ici ne devrait pas interférer avec le projet suivant car les challenges alimentaires sont relativement courts et suivies d’une phase d’alimentation à volonté qui permettra de récupérer rapidement les trajectoires normales de croissance. Par ailleurs, le projet suivant se focalise sur le suivi des animaux pendant une phase d’alimentation à base de fourrage, il n’inclue pas de traitement expérimental et contient procédures légères. Ainsi la mutualisation d’animaux déjà engagés dans une autre étude permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Avant leur entrée dans la halle, les agnelles seront pré-habituées directement dans leurs lots d’élevage. En effet, une porte mimant celle des distributeurs automatiques de concentré a été reproduite dans les lots d’élevage, avec mise à disposition de foin ou de concentré pour inciter les animaux à passer la tête afin de s’habituer à ce dispositif pour accéder au concentré. En amont de l’expérience, des claies sont placées de part et d’autre des abreuvoirs dans les lots d’élevage des animaux, de façon à habituer les animaux à accéder aux couloirs d’accès aux distributeurs (eau et concentré) de la halle. Les agnelles sont hébergées sur une litière paillée et en lots de manière à pouvoir exprimer leurs comportements sociaux. Elles sont habituées à être manipulées. Les prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire alternativement gauche et droite. La prise de sang peut potentiellement engendrer un hématome. Un baume (vétébiol) sera appliqué en cas d’apparition. Différents enrichisssements seront proposés en alternance au cours de l’expérimentation : bascule (planche fixée à un cylindre), cône de signalisation, et brosse. Une surveillance visuelle est effectuée au quotidien par les agents formés. En cas de signes de maladie (fièvre > 40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé) ou d’impact sur l’état général des animaux (prostration, cachexie, alopécie…), l’animal est immédiatement sorti de l’expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce ovine est l’espèce cible du projet. Les ovins sont directement concernés par les variations d’apport alimentaire rencontrées en élevage, notamment en systèmes extensifs où les animaux sont fréquemment exposés à des périodes de sous‑alimentation. Les mécanismes de mobilisation des réserves corporelles et de résilience énergétique étudiés sont donc particulièrement pertinents chez l’ovin. L’utilisation d’agnelles permet en outre d’envisager un protocole de phénotypage précoce transférable aux programmes de sélection ovine. Les animaux sont âgés de 100 jours environ. A cet âge les animaux sont sevrés et en pleine croissance. Ainsi lors des phases d’alimentation au concentré à volonté on observe généralement une augmentation rapide du poids et de l’état corporel. Nous prévoyons à l’entrée dans la halle en moyenne un poids d’environ 30 kg, une épaisseur de gras dorsal (EGD) de 2,8 mm. A partir des données historiques dans les mêmes conditions, on peut s’attendre après 6 semaines à un poids moyen de 38 kg et une EGD de 3,9 mm chez les animaux alimentés à volonté avec du concentrés. L’âge auquel les animaux seront utilisés permettra donc d’étudier l’effet d’une restriction alimentaire sur la résilience par rapport à une trajectoire de référence chez des animaux en croissance.
Rôle des contacts microglie-synapses dans les mécanismes de consolidation de la mémoire chez la souris (EU 2/3)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une chirurgie du crâne de quatre heures, une contention de la tête portée jusqu'à trois heures par séance et une restriction d'eau de douze heures répétée six fois : 3 480 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Pour les motiver à une tâche tactile, un souffle d'air leur est envoyé en cas de mauvaise réponse. Le projet veut comprendre pourquoi une anesthésie prolongée peut laisser des troubles de mémoire, en observant les cellules immunitaires du cerveau. Au-delà des organes étudiés, d'autres sont prélevés pour constituer une banque de tissus mise à disposition d'autres laboratoires.
Objectifs
L’anesthésie générale est utilisée tous les jours à l’hôpital, notamment lors d’opérations chirurgicales ou pour maintenir un patient endormi en soins intensifs. Dans certains cas, notamment lorsqu’elle dure longtemps, elle peut être suivie de troubles de la mémoire ou de la concentration. Ce phénomène a été observé chez plusieurs patients après leur séjours en réanimation, notamment pendant la pandémie de COVID-19, mais les causes exactes de ces effets restent encore mal connues. Le sommeil et l’anesthésie peuvent sembler similaires (on ne bouge plus, on ne sent plus les choses, l’activité du cerveau ralentit), mais ils ne reposent pas sur les mêmes mécanismes. De plus, le sommeil est réparateur pour le cerveau, alors que l’anesthésie prolongée pourrait avoir des effets plus néfastes sur son fonctionnement. Chez la souris, il a été montré que rester longtemps sous anesthésie modifie certaines connexions dans le cerveau. Jusqu’à présent, les chercheurs ont surtout étudié les neurones, les cellules qui permettent la communication dans le cerveau. Mais les cellules immunitaires du cerveau, les microglies, pourraient aussi jouer un rôle important. Ces cellules aident normalement à entretenir et à remodeler les connexions dans le cerveau, surtout pendant l’apprentissage ou lorsqu’on forme des souvenirs. Ce projet multi-établissement (3 établissements utilisateurs), vise à mieux comprendre comment l’anesthésie prolongée pourrait perturber les interactions entre neurones et microglies chez la souris, à différents moments de la mémoire : quand on apprend, quand on consolide l’information, et quand on se souvient. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre pourquoi certaines personnes ont des troubles de la mémoire après une anesthésie, et à trouver des solutions pour mieux les prévenir.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’approfondir notre compréhension des effets à long terme de l’anesthésie générale prolongée sur le cerveau, notamment sur la mémoire et les capacités cognitives. En explorant pour la première fois le rôle potentiel des microglies dans ces effets, il pourrait: 1) Améliorer la compréhension des troubles cognitifs post-anesthésie, en identifiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, au-delà des seuls neurones. 2) Contribuer à la recherche médicale humaine, en proposant des pistes pour prévenir ou limiter les séquelles cognitives chez les patients ayant subi une anesthésie prolongée (par exemple après chirurgie lourde ou séjour en réanimation). 3) Orienter de futures stratégies thérapeutiques ciblant la plasticité cérébrale et les cellules gliales pour favoriser une meilleure récupération cognitive. 4) Fournir un nouveau modèle préclinique expérimental pour étudier les effets de l’anesthésie sur la mémoire, intégrant non seulement l’activité neuronale mais aussi les interactions cellules gliales-neurones. 5) Réduire les impacts socio-économiques des déficits cognitifs post-opératoires, en apportant des solutions de prévention ou d’accompagnement adaptées à ces patients.
Procédures
Une chirurgie sous anesthésie pour placer implant et des électrodes d'enregistement sur le crane (4h00) au sein de l'EU1/3. Habituation à la contention longue de la tête au sein de l'EU2/3 (10 jours par session quotidienne allant progressivement de 5 minutes à 3h00). Comportement (tâche de discrimination tactile par les vibrisses) et imagerie, 2 sessions de 3h maximum/jour pendant 3 jours avec des pauses de 3 heures minimum au sein de l'EU2/3. Restriction hydrique pendant 12 heures répétées 6 fois maximum. Mise à mort sous anesthésie générale (animaux inconscients) au sein de l'EU3/3.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une chirurgie afin de coller un implant sur le crâne de la souris, implantons des électrodes sur le crane et dans les muscles de la nuque pour évaluer leur activité et déterminer si la souris est endormie ou éveillée, et amincissons le crâne sans corrompre l'intégrité du système nerveux central sous anesthésie. Cette chirurgie peu invasive réalisée sous analgésie et anesthésie entraine des douleurs post opératoire pendant 48h00. Les complications au stade de la chirurgie sont extrêmement rares. Nous réalisons ensuite une habituation progressive des souris par renforcement positif pour qu'elles restent en condition tête restreinte pendant les sessions d'apprentissage et de rappel et pendant la phase de sommeil (séances allant de 5 minutes à 3 heures progressivement sur 7 jours). Il arrive rarement que certaines souris présentes des difficultés à s'habituer. Cette contention entraine certainement un stress léger, difficile à évaluer car nous n'observons pas de manifestations physiques (grattage, vocalisations, mictions/défécations, posture ou comportements compulsifs), le stress potentiel, est atténué par le renforcement positif (récompense avec des friandises). Afin de motiver les souris à s'engager dans la tâche d'apprentissage une restriction hydrique est réalisée pendant 12 h max sur 24h, cette restriction d'accès à l'eau peut être reproduite pendant 3 jours, elle entraine un inconfort transitoire de la souris (sensation de soif). Un stimulus aversif, puff d'air (durée 1s) en cas de mauvaises réponses est utilisé dans la phase initiale de l'apprentissage pour aider les souris à comprendre la tâche à réaliser, le puff d'air est utilisé uniquement si elle ne répondent pas aux pénalités de temps. Ces puffs d'air utilisé en dernier recours et potentiellement répétés peuvent engendrer un stress, difficile à quantifier en absence de signes cliniques. 2 séances de comportement et d'imagerie en tête restreinte de 3 heures maximum chacune ont lieu chaque jour et sont répétées au maximum pendant trois jours, ses séances peuvent occasionner un stress identique voir plus faible que lors de l'habituation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Les organes d'intérêt pour l'étude sont alors prélevés et d'autres organes sont collectés pour constituer un banque de tissus à disposition d'autres équipes et laboratoires (muscles ou rétine).
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’à présent inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées par informatique. Nous utilisons généralement des cultures cellulaires ou des explants de cerveaux mais modifier l’environnement des microglies entraine un changement morphologique et fonctionnel. Afin de comprendre le rôle des microglies dasn le cerveau sain, il faut donc les étudier in vivo. Les données obtenues seront partagées avec des mathématiciens afin de modéliser la morphodynamique microgliale.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés sur la base de notre connaissance de la littérature. Les comparaisons seront faites en utilisant des statistiques non paramétriques ne nécessitant pas de distribution normale et compatible avec nos effectifs réduits pour la partie in vivo. D'autre part, dans certaines expériences ex vivo et in vivo, chaque souris est son propre contrôle ce qui permet de réduire drastiquement le nombre d'expériences et d'animaux requis.
Raffinement
Notre expérience du modèle nous permet d’affirmer que la morbidité due à l’implantation de la fenêtre est quasi nulle. Après plus de 10 ans d'expérimentation avec ce modèle, nous n'avons observé qu'une désimplantation et aucun signe de souffrance ou de stress. Nous veillerons à limiter le mal être des animaux en réalisant des habituations progressives de nos souris à la manipulation. La gestion de la douleur et de l'inflammation sera réalisée de la façon suivante : injection d'anesthésique local avant la chirurgie, injection d'anti inflammatoire non stéroidiens en s.c en début de chirurgie, puis 24 et 48h après. En complément le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Ils seront observés dans leur cage pendant plusieurs minutes puis pesés. L’évaluation se fera selon un scorage établi tenant compte de différents paramètres classiquement utilisés (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (nid et roue d'activité), tout au cours de l'expérience. Une partie des expérimentations seront réalisées ex vivo. Les expérimentations ex vivo sur tissus post-mortem ont été pensé pour compléter l'approche in vivo sur animal vigile tout en réduisant la nécessité de prélèvements impliquant des gestes invasifs ou la durée d'inconfort des animaux. Le transport des souris d'une UE à l'autre (5 minutes de transport) se fait dans des cages opaques et en triple emballage pour limiter le stress lié au transport.
Choix des espèces
Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Enfin l'architecture corticale est proche de celle de l'homme et il s'agit donc d'un des meilleurs modèles non primate pour étudier la plasticité synaptique. Les souris seront des souris jeunes adultes utilisées entre 6 et 10 semaines car la taille du crâne n'évolue plus dans le temps.
Protocole d’immunisation dans le modèle murin et suivi par prélèvements sanguins et nécropsie afin de démontrer l’efficacité d’un prototype vaccinal.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Développés par un collaborateur industriel, des candidats vaccins contre les poxvirus sont testés sur 2 800 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit deux injections puis cinq prélèvements sanguins avant la mise à mort, qui sert à mesurer la réponse immunitaire par nécropsie. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives non-animales" et qu'un "organisme entier" au système immunitaire développé est requis. L'objectif reste de comparer jusqu'à quinze molécules antigéniques aux antigènes déjà présents dans les vaccins de Moderna et BioNtech.
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés par un collaborateur. Les capacités de stimulation du système immunitaire seront aussi évaluées dans des modèles de souris afin de transposer l’efficacité potentielles en clinique. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins contre un pathogène donné. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre des maladies infectieuses transmissibles, à risque pandémique, d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer des molécules immunogènes à inclure dans de nouveaux vaccins contre les poxvirus. Actuellement, deux vaccins à sous-unités sont en cours d'essais cliniques, l'un développé par Moderna et l'autre par BioNtech. Les deux vaccins sont basés sur une combinaison de quatre antigènes dont un ne génère pas une réponse neutralisante optimale. Un composant important de ces mélanges, bien que l'antigène génère une forte réponse neutralisante contre le virus modèle des poxvirus, la réponse immunitaire ne semble pas neutraliser le virus de la variole du singe . En nous basant sur des études de la réponse humorale chez des patients vaccinés contre la variole, nous avons identifié des régions de ce composant qui génèrent des anticorps neutralisants contre virus de la variole du singe . Nous avons utilisé ces données structurelles pour concevoir des nouveaux antigènes basés sur ce composant et des nouveaux types d’antigènes qui, nous l'espérons, généreront une réponse cross-neutralisante contre les poxvirus. Nous cherchons à tester jusqu’à 15 molécules antigéniques pour développer de nouveaux vaccins contre des poxvirus pathogènes. Bien sûr, nous allons comparer l'efficacité de ces nouveaux antigènes par rapport aux cinq antigènes présents dans les vaccins développés par Moderna et BioNtech. Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. L’immuno-monitoring par les prélèvements sanguins et après la mise à mort lors des prélèvements de la nécropsie permettront d'établir si le prototype vaccinal permet une réponse anticorps et cellulaires à un pathogène donné. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs ou thérapeutiques contre les poxvirus pour lesquelles le besoin médical est avéré.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections à 3-4 semaines d’intervalles et de 5 prélèvements sanguins effectués à une semaine d’intervalle. Les injections come les prélèvements dureront quelques secondes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables potentiels liés à l’administration de produits vaccinaux prophylactiques chez la souris : -Stress, douleur et inconfort légers de courte durée au moment des gestes d’injection et prélèvements -douleurs musculaires systémiques liées à l’inflammation de courte durée Les adjuvants utilisés sont des produits classiques connus et utilisés chez la souris couramment. Ils vont être appliqués avec de doses couramment utilisées. Le but est d’induire une réponse immunitaire au vaccin.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de candidats vaccins et ne peuvent donc pas être réutilisés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Sur la base sur nos expériences antérieures, nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique de nos résultats. 1. Optimisation de la taille des cohortes : Nos calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont par une analyse biostatistique afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs avec une puissance de 80% tout en évitant une surutilisation. 2. Maximisation des données obtenues par animal : nous utilisons des approches multimodales sur un même animal (humorale et cellulaire), ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. 3. La standardisation de nos protocoles expérimentaux permet de minimiser la variabilité et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. En combinant ces stratégies, nous nous engageons à minimiser le recours au modèle murin tout en garantissant la pertinence scientifique de nos travaux sur les vaccins.
Raffinement
Les manipulations telles que les injections ou les prélèvements sanguins entraînent une douleur passagère et légère, ne justifiant pas l’usage d’anesthésie ou d’analgésie. Après chaque prélèvement sanguin, nous injectons du sérum physiologique aux souris afin d'éviter toute déshydratation. Mais il est possible que les souris puissent mal supporter les substances injectées et elles peuvent montrer une réaction inflammatoire (gonflement présent après quelques jours, rougeur). Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse, comme les yeux mi- fermés, le poil hérissé, le dos vouté ou une absence de réaction à la manipulation, l'absence de toilettage ou elles se tiennent à l'écart du groupe. Dès que nous observons une de ces signes nous allons intervenir afin de limiter la souffrance : - éviter une inflammation locale à l’aide des massages et application de l’eau tiède régulièrement après l’injection - faciliter la consommation alimentaire dès l’apparition de signes d’affaiblissement en ajoutant un gel nutritif dans la cage - chauffés les animaux en cas d’hypothermie à l’aide de chaufferettes installés sous la cage - suivi de poids d’animaux Les protocoles seront régulièrement réévalués afin d’intégrer les améliorations possibles en matière de bien-être animal.
Choix des espèces
L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins car les réponses humorales et cellulaires chez le rongeur de petite taille comme la souris sont souvent de même nature et de même amplitude que les réponses humaines. Ainsi, en vaccinologie et immunothérapie préclinique, il est recommandé de commencer par un modèle préclinique murin, puis de valider l’immunogénicité chez les primates non humain, d’évaluer la toxicité chez d’autres modèles précliniques plus gros (rat, lapin, autres modèles de toxicité), avant de proposer une étude clinique chez l’homme. Les animaux doivent être adultes et matures au plan immunologique (au moins 6 semaines). Nous allons utiliser des souris âgées entre 8-12 semaines.