Système immunitaire
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IRON: relations métabolisme du fer et inflammation
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Privées de fer par leur alimentation pendant quinze jours, ou au contraire supplémentées par injection dans l'abdomen, des souris génétiquement modifiées reçoivent ensuite un stimulant de la réponse immunitaire. Elles sont observées toutes les heures pendant les quatre heures suivantes, le porteur attendant une immobilité et un pelage hérissé chez les lignées déficientes. Leur sang est prélevé dans le sinus situé derrière l'œil, ce qui peut provoquer saignement et hématome. 7 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes sont tuées pour que leurs organes soient prélevés.
Objectifs
Le fer est un métal essentiel chez les mammifères, pour le transport de l'oxygène par les globules rouges et pour de nombreuses fonctions cellulaires. Chez les mammifères, un équilibre de la quantité de fer circulant et stocké dans les différents tissus est finement régulé par plusieurs mécanismes intracellulaires et systémiques. Cet équilibre est altéré dans de nombreuses situations pathologiques. En particulier, la distribution du fer dans l’organisme est largement perturbée lors d'une réaction inflammatoire entrainant une diminution du fer circulant qui peut limiter la production de globules rouges et conduire à une forme d'anémie. Ce projet est la continuité d'un précédent projet qui a permis de révéler l’influence du statut en fer de l’organisme sur l’efficacité de la réponse immunitaire. Ce projet vise maintenant, d'une part à identifier les mécanismes liés à la réponse immunitaire qui influencent la distribution du fer; et d'autre part, à définir l'influence des changements d'apport en fer sur la réponse immunitaire. Afin de répondre à nos questions, le projet prévoit l’utilisation de différentes lignées de souris génétiquement modifiées déficientes pour des voies de signalisation inflammatoires afin de démontrer leur implication dans la modulation de la distribution du fer associée à la stimulation de la réponse immunitaire. L’intérêt à terme est d’apporter des éléments d’amélioration dans le traitement des pathologies inflammatoires et la thérapie contre les agents pathogènes.
Bénéfices attendus
Nos précédentes études ont montré des perturbations dans l’équilibre de la distribution et du métabolisme du fer qui apparaissent lors des processus inflammatoires, inversement le statut en fer influence la réponse inflammatoire. Les signaux impliqués dans ces réponses sont largement incompris. Le projet s’attache à comprendre les processus liés au métabolisme du fer qui influencent la réponse immunitaire et inversement les voies de réponse du système immunitaire qui influencent la distribution du fer. L'utilisation de modèles de souris déficientes pour certains gènes permettra de valider la contribution des voies de signalisation du système immunitaire impliquées dans l'homéostasie du fer. L'influence du fer sur la réponse immunitaire sera aussi précisée et apportera des éléments prédictifs sur l'efficacité de la réponse immunitaire et ouvrira de nouvelles pistes d'exploration de voies thérapeutiques des pathologies inflammatoires. Les résultats feront l’objet de publications scientifiques et les donnée obtenues pourront être utilisées ultérieurement par la communauté scientifique pour des applications en santé humaine.
Procédures
Pour certains animaux avant entrée en procédure, un prélèvement sanguin sera effectué sur animaux vigiles (30 secondes/prélèvement). Pour l'ensemble des animaux un prélèvement sanguin sous ansthésie sera effectué (30 secondes/prélèvement).
Impact sur les animaux
L'ensemble des lignées génétiquement modifiées présentent un phénotype dommageable (déficience de réponse immune) qui ne s'exprime pas dans les conditions d'hébergement de haute qualité sanitaire de notre Etablissement Utilisateur. Les souris génétiquement modifiées auront été génotypés (selon projet autorisé) par l'établissement fournisseur avant d'arriver dans notre Etablissement Utilisateur. La contention de l’animal et la piqure d’aiguille pour injection de traitement ou prélèvement entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Le prélèvement sanguin au niveau du sinus rétro-orbitaire, peut conduire à des effets indésirables au niveau de l'oeil : saignement, hématome. Dans la partie 1 du projet, les protocoles d’apport/déficience en fer alimentaire, et d’apport de fer par voie intrapéritonéale, sont utilisés depuis plusieurs années au laboratoire. Aucune nuisance n’a été constatée sur les périodes expérimentales utilisées dans le projet. La déficience en fer alimentaire est mise en place sur une courte période de 15 jours maximum, ce qui n’est pas suffisant pour affecter l’érythropoïèse car la durée de vies des globules rouges chez la souris est d’environ 60 jours. Dans la partie 2 du projet, les souris génétiquement modifiées utilisées sont déficientes pour des voies de signalisation inflammatoires. Elles pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée aux stimulations de réponse immunitaire. Dans notre projet précédent, nous avons pu observer une immobilité légère à modérée et/ou un pelage légèrement à modérément hérissé sur .
Devenir
Le projet nécessite le prélèvements d'organes pour analyse, tous les animaux du projet sont donc mis à mort.
Remplacement
La distribution du fer dans les organes et la réponse inflammatoire mettent en jeu un dialogue complexe entre différents types cellulaires d'organes divers, et le recrutement de cellules de l'immunité depuis la circulation sanguine. Le modèle animal est fondamental dans notre cas, l’étude de l’inflammation et des effets pathologiques ne peut se faire de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes. A ce jour, l’animal de laboratoire reste le seul recours fiable et pertinent permettant d’étudier les mécanismes d’inflammation et de régulation qui nécessitent plusieurs niveaux d’interactions entre système immunitaire et métabolisme du fer, qui ne peuvent être reproduits in vitro ou in silico. Le projet nécessite de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des phénomènes biologiques examinés. Nous utiliserons lorsque cela est possible, les cultures de cellules pour tester et valider certaines hypothèses (traffic du fer dans les macrophages). Le modèle cellulaire ne peut remplacer que de façon limitée l’analyse in vivo pour l’acquisition de données, mais permettra une réduction de l’utilisation d'animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe sera réduit au minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, sur les paramètres étudiés. Nous utiliserons jusqu'à 5 animaux/groupe x 3 études indépendantes soit 15 animaux maximum pour les groupes contrôles et 12 animaux/groupe x 3 études indépendantes soit 36 animaux maximum pour les groupes sous traitement. Ces nombres tiennent compte de la réalisation d’expérimentations indépendantes nécessaires pour la validation de nos résultats et de nos tests statistiques qui sont réalisés sur de petits effectifs. Les tests statistiques de variabilité avec correction post-test pour effectifs réduits seront réalisés systématiquement pour valider nos résultats.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotodienne de l'état clinique des animaux utilisés sera assurée. Les administrations par voies intranasales ou intratrachéales, et le prélèvement de sang en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de réduire à un strict minimum le stress et la souffrance de l'animal. Pour les animaux ayant subi une injection de stimulant inflammatoire dans la procédure 2, l’expression de douleur (immobilité, un pelage hérissé, ou comportement anormal) peut apparaître au cours des 4h suivant l’injection, une surveillance chaque heure au cours de ces 4 heures sera mise en place afin de quantifier l’expression de douleur, des aliments humides pourront être fournis pour favoriser la prise alimentaire, une prise de température pourra être réalisée, et le cas échéant d’appliquer les points limites du projet. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites (grille de scoring) suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. La stimulation réalisée n’induit aucun dommage chez la souris de type sauvage à la dose et au temps de stimulation utilisés, d’après notre expérience et la littérature. Selon les résultats de notre précédente étude, certaines lignées de souris utilisées présentent une réduction de leur réponse immune et peuvent exprimer une sensibilité accrue à ces stimulants de réponse immunitaire, qui s'observe par une immobilité et/ou un pelage hérissé. Des mesures particulières de suivi seront mises en place : les animaux seront observés toutes les heures pendant les 4 premières heures après injection du stimulant, puis quotidiennement, afin de quantifier les phénomènes douloureux et de mettre en place l’analgésie ou la mise à mort si les animaux atteignent le point limite défini dans les procédures.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Les mécanismes de régulation de métabolisme du fer sont identiques chez la souris et l'homme. - L'espèce murine est le modèle pour lequel nous disposons de lignées génétiquement déficientes pour les voies de l'inflammation 'intérêt dans notre projet. - La souris est le mammifère de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études de pathologies, notamment dans les modèles de réponse immunitaire. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à l’âge de 2 à 15 mois à l’arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé, et dont le système immunitaire est mature. L’âge minimal de 2 mois permet de garantir un système immunitaire mature et un processus de développement corporel terminé. La quantité de fer et sa distribution dans les tissus évoluent avec l’âge chez les mammifères. En effet en cas de défaut de régulation d'entrée du fer, une accumulation progressive du fer se développe. L’utilisation d’animaux âgés jusqu'à 15 mois permet de pouvoir analyser l’établissement de la répartition du fer chez les animaux génétiquement modifiés au cours de la vie. Chaque lot d'animaux utilisés sera d'âge homogène. Des lots de différents âges pourront être utilisés.
Étude des interactions entre système nerveux et système immunitaire dans les troubles du comportement
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour relier la dépression humaine à l'inflammation chronique, des souris sont rendues durablement inflammatoires puis soumises à des tests censés mesurer un phénotype dépressif. 8 799 souris vont être utilisées, dont 4 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever tissus et organes vitaux. Elles reçoivent des composés jusqu'à trois fois par semaine pendant cinq à quatorze semaines, subissent des chirurgies pouvant atteindre deux heures, des poses d'implants, jusqu'à quatre ponctions sanguines et un hébergement individuel de un à sept jours après chirurgie. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans dire lesquels, et signale que certains imposent une privation de nourriture ou de boisson pouvant aller jusqu'à seize heures.
Objectifs
Nous étudierons comment les signaux pro-inflammatoires, notamment certaines molécules, affectent le cerveau et le comportement. Des valeurs sanguines élevées de molécules pro-inflammatoires sont associées à la dépression chez l’être humain. De plus, il existe un groupe de maladies rares caractérisées par la production incontrôlée de molécules pro-inflammatoires, à l’origine d’un état inflammatoire chronique pouvant être associé à des troubles psychiatriques. Par conséquent, notre projet permettra de découvrir les mécanismes responsables qui relient la perturbation de l’humeur à un contexte inflammatoire chronique. Nous poursuivrons trois objectifs principaux qui structurent l’ensemble du projet : 1. Objectif 1 : Étudier les effets sur le comportement, le tissu cérébral et le système immunitaire, de l'administration ponctuelle, ou répétée, de molécules pro-inflammatoires. 2. Objectif 2 : Examiner le rôle des principales voies de communication entre périphérie et cerveau dans l’expression des phénotypes identifiés dans l’objectif 1. En particulier, nous étudierons les composants du système immunitaire, les nerfs périphériques et les barrières immunitaires du cerveau. 3. Objectif 3 : Tester l’efficacité de différentes approches pharmacologiques pour contrecarrer les effets des molécules étudiées sur le comportement, en ciblant les relais périphériques déterminés avec l’objectif 2. En particulier, nous évaluerons des antidépresseurs standard et alternatifs, et également des stratégies novatrices visant à réactiver le système immunitaire et réduire l’infiltration des cellules immunitaires dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les approches conventionnelles pour l’étude des troubles de l’humeur et du comportement se focalisent sur des facteurs internes au cerveau, comme les niveaux des neurotransmetteurs, ou des facteurs externes, comme le stress. De manière innovante, notre projet propose d’examiner des facteurs présents à la périphérie du cerveau, en tant que déclencheurs de la dépression. Les expériences proposées permettront une avancée significative dans les connaissances scientifiques concernant la communication bidirectionnelle entre périphérie et cerveau, en général, et plus particulièrement ceux impliqués dans les troubles de l’humeur. À court et moyen terme, les données collectées permettront de découvrir des nouveaux mécanismes pathologiques et marqueurs diagnostiques ou pronostiques de la dépression dans un contexte inflammatoire. Il s’avère que cette forme de dépression est résistante aux traitements de première ligne et constitue ainsi un besoin médical non satisfait à ce jour. À long terme, nos recherches poseront les bases pour le développement de nouvelles thérapies et contribueront à atténuer la stigmatisation qui accompagne les maladies mentales.
Procédures
Dans ce projet, les souris seront soumises à différents types d’interventions, séparément ou parfois en combinaison : 1. Administration répétée de composés, au maximum trois fois par semaine, pour une durée de 5 à 14 semaines selon le traitement. 2. Procédures chirurgicales sous analgésie/anesthésie. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris. 3. Tests comportementaux non-invasifs pour évaluer le phénotype dit dépressif. Les tests seront effectués à raison de 2 tests par jour, chaque test ayant une durée limitée entre 5 minutes et 4 heures. Ces tests seront effectués sur une durée maximale de 2 semaines (5 jours, pause de 2 jours puis 5 jours). Les tests pourront être répétés pour évaluer la progression du phénotype et minimiser le nombre d’animaux nécessaires. 4. Ponction sanguine, environ 1 min par souris. Les prélèvements pourront être répétés au maximum 4 fois par individu, avec un intervalle d’au moins une semaine entre chaque prélèvement. 5. Hébergement individuel. Un hébergement individuel pourra faire suite aux procédures chirurgicales, pour un maximum de 1 à 7 jours en fonction des procédures.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place de modèles de dépression chez l’animal, soit par administration de composés pharmacologiques, soit par l’application de facteurs environnementaux stressants, et ceci durant plusieurs semaines. Ces conditions sont source d’angoisse pouvant nuire au bien-être et à l’état général des animaux. Cette nuisance est considérée comme sévère. Les procédures chirurgicales prévues ont une sévérité globale qualifiée de modérée. Certaines peuvent entraîner une période de récupération jusqu’à deux semaines. Après chaque chirurgie, les souris recevront les soins post-opératoires appropriés (thérapie antalgique, désinfection de la plaie) et seront surveillées pour la manifestation des points limites spécifiques. D’autre part, les animaux pourront être soumis à des gestes pouvant causer une détresse ou une douleur légère : 1. Administration des traitements pharmacologiques, y compris les anesthésiques/antalgiques et les solutions physiologiques. La piqûre d’aiguille pour les injections provoque une douleur légère de courte durée. Le gavage provoque un inconfort léger de courte durée. Selon le traitement, les injections pourraient être répétées plusieurs fois par semaine, pour une durée maximale d’environ quatre mois. 2. Implants. La présence des implants pourrait créer de l’inconfort. La durée maximale de l’expérience sera d’environ quatre mois. 3. Tests comportementaux. La manipulation des souris pourrait causer un stress léger. Pour le minimiser, les souris seront habituées à l’expérimentateur et à la pièce où les tests seront conduits. La durée maximale des tests sera d’environ deux semaines. Certains tests comportementaux prévoient une privation de nourriture ou de boisson jusqu’à 16 h avant la réalimentation. Cela induit un stress physique et une détresse modérée. 4. Prélèvement sanguin au niveau de la joue. La piqûre comporte une douleur légère de courte durée. Le prélèvement sanguin peut entrainer un stress physique léger ou modéré temporaire. 5. Anesthésie gazeuse. Elle peut provoquer un inconfort de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour évaluer les phénotypes histologiques et moléculaires, ce qui nécessite le prélèvement de tissus et organes vitaux.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de stratégies alternatives aux études in vivo pour l’étude du système immunitaire, du fonctionnement du cerveau et du comportement, ainsi que pour évaluer la complexité des interactions entre périphérie et cerveau. Les approches in vitro comme les cultures cellulaires ne reproduisent que des aspects particuliers du phénomène en question et peuvent manquer des connections anatomiques et fonctionnelles qui jouent un rôle clé dans ce projet ancré sur le thème des interactions cerveau-corps. Les modèles in silico que nous envisageons à moyen terme, nécessitent d’abord une validation expérimentale pour optimiser leur valeur prédictive.
Réduction
Les expériences ont été conçues pour comprendre un nombre d’animaux minimal mais suffisant pour évaluer les différences de comportement entre les divers groupes expérimentaux (avec la prise en compte de paramètres statistiques nécessaires pour estimer la taille de l’échantillon comme la puissance, le niveau de significativité, la taille de l’effet et de variations dans la population). Étant donné que le comportement animal est susceptible de variations inter-individuelles, et que nous souhaitons tester plusieurs paramètres à partir des mêmes animaux en utilisant une batterie de tests comportementaux choisis sur la base de la littérature et de notre expérience, nous avons estimé un nombre minimum de souris de 10 individus par sexe par groupe expérimental. Pour minimiser le nombre de souris, les tests pourront être répétés sur les mêmes individus après un intervalle de deux à quatre semaines. Le nombre de souris par groupe s’élève jusqu’à 15 pour les procédures qui peuvent entraîner l’exclusion d’individus pour des raisons techniques (par exemple, implants mal positionnés, expression hors cible ou sous-optimale d’un transgène). Les échantillons biologiques prélevés provenant des mêmes souris post-mortem fourniront des données anatomiques, physiologiques et/ou moléculaires qui pourront être corrélées à la performance comportementale mesurée.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été conçues afin de minimiser tout inconfort, douleur ou souffrance prolongée de l’animal. Dans ce but, nous utiliserons des points limites précoces et spécifiques prédéfinis. Pour les tests de comportement, les souris seront habituées à l’expérimentateur et, si possible, à la pièce expérimentale avant les tests. Pour les procédures qui comprennent une chirurgie, les souris seront surveillées attentivement en post-opératoire pour la fermeture des plaies, les signes d’inconfort, douleur ou souffrance prolongée et leur bien-être général. Les interventions incluent la désinfection des plaies, la thérapie antalgique, l’administration de solution saline pour réhydratation, le renforcement de l’enrichissement des cages et/ou chauffage (dôme en papier, morceaux de coton ou papier), la séparation des souris agressives des souris blessés en cas d'agressivité répétée.
Choix des espèces
Le recours à la souris en tant que modèle animal est justifié par leur proximité génétique, physiologique, anatomique et bio/neurochimique par rapport à l’être humain. L’incomparable quantité de données présente dans la littérature scientifique sur ce modèle permet la comparaison, l’intégration et la validation des connaissances de notre projet, ainsi que l’optimisation des expériences prévues pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires et maximiser leur bien-être. Sur un plan neuroanatomique, le modèle murin permet l'étude des circuits neuronaux et des modifications synaptiques associées aux comportements, ce qui est essentiel pour comprendre les bases biologiques de la dépression humaine. Enfin, au niveau comportemental, il existe plusieurs tests bien établis pour évaluer des comportements analogues à la dépression chez la souris. Collectivement, ces tests aident à identifier les comportements dépressifs et à évaluer l'efficacité des antidépresseurs. Nous utiliserons des souris adultes, à partir de 6 semaines après la naissance, car nous étudions l’impact des dysfonctions du système immunitaire sur le comportement et l’humeur à l’âge adulte.
Etude de l’effet de l’exposition à la silice sur le développement d’arthrites dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Toutes tuées à l'issue pour prélever poumons, rate, ganglions, sang et articulations, 1 770 souris vont être utilisées, dont 1 510 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 260 un niveau léger. Elles reçoivent deux injections dans la queue sur animal vigile pour déclencher une arthrite au collagène, une instillation nasale de silice sous anesthésie deux fois par semaine pendant dix semaines, deux prélèvements sanguins et une chirurgie. Le porteur indique que la silice peut entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une surmortalité, et que les pattes gonflent au point de gêner les souris pour se nourrir. Il affirme que les expériences in vitro ne démontreraient pas de façon "irréfutable" l'effet de la silice sur une pathologie systémique, et conclut que les deux approches sont "toutes les deux nécessaires".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie au cours de laquelle les patients développent des arthrites (inflammation des articulations). Elle entraine des douleurs et la destruction progressive des articulations et peut être responsable d’un handicap majeur chez les patients. Il s’agit d’une maladie auto-immune, c’est-à-dire faisant intervenir la production anormale par l’organisme d’anticorps dirigés contre lui-même. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la survenue de la PR, notamment des facteurs génétiques et des facteurs environnementaux. Les mécanismes à l’origine de sa survenue ne sont pas bien connus. Des expositions pulmonaires comme l’exposition à la fumée de cigarette ou à la silice (contenue par exemple dans la poussière) sont associées au diagnostic de PR. L’exposition professionnelle à la silice est un facteur de risque reconnu dans le développement de maladies auto-immunes. Au cours de la PR, des anomalies pulmonaires peuvent être observée chez 25 à 50 pourcent des patients. Afin de clarifier les processus mis en jeu, il est essentiel de comprendre les mécanismes impliqués localement. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes impliqués dans la survenue de la PR à la fois au niveau pulmonaire et articulaire. Dans ce contexte, nous étudierons l’effet de la préexposition à la silice sur l’incidence et la sévérité des arthrites et de la réponse immunitaire dans un modèle murin d’arthrite au collagène.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité de travaux menés sur la polyarthrite rhumatoïde (PR) ayant montré l’association entre exposition environnementale à la silice et PR. Les mécanismes expliquant ce lien ne sont actuellement pas connus. Ainsi, cette étude a pour objectif d’étudier l’effet d’une pré-exposition à la silice sur la survenue et la sévérité d’arthrites. L’objectif est d’analyser les mécanismes immunologiques impliqués dans les différents compartiments : pulmonaire, sanguin, lymphoïdes secondaires et articulaires. Ceci permettra de mieux comprendre le processus de développement de l’auto-immunité et de l’inflammation qui favorise ensuite le développement d’arthrites et induit la destruction articulaire. Ce projet peut avoir un impact important en rhumatologie. Il permettrait en effet de mieux comprendre le lien entre exposition environnementale et développement de la PR. Elucider les phases d’initiation de la PR est en effet fondamental pour développer des stratégies thérapeutiques précoces et efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections répétées sur animal vigile (2 fois par animal sur 3 semaines, moins de 1 minute par acte). Ils seront également exposés à la silice sous anesthésie (2 fois par semaine pendant 10 semaines, moins de 1 minute par acte). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animal vigile (2 fois pendant le projet, moins d’une minute par acte). Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections répétées dans la queue des souris peuvent entrainer des blessures à la queue, des irritations ou des saignements minimes. Le développement de l'arthrite chez les souris peut être responsable d'une limitation de leur mobilité. L’exposition à la silice peut générer un stress lié à la manipulation chez la souris. Elle peut entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité plus importante. L’anesthésie peut entrainer une détresse respiratoire ou une surmortalité. Deux prélèvements de sang sont prévus ce qui pourrait entrainer des douleurs légères et un risque d’hématome.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer des prélèvements d'organes (poumons, rate, ganglions, sang et articulations) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’exposition à la silice présente dans l’environnement sur le système immunitaire et articulaire. A l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire la complexité d’un système impliquant des interactions entre poumon, cellules et organes du système immunitaire et des articulations. Par ailleurs, les expériences in vitro permettraient de démontrer l’activation potentielle de certaines cellules par la silice mais ne mais ne permettraient pas de démontrer de façon irréfutable l’effet clinique de cette molécule sur une pathologie systémique telle que la polyarthrite rhumatoïde. Les approches in vitro et in vivo sont donc complémentaires et toutes les deux nécessaires.
Réduction
Cette étude utilisera un total de 1770 animaux. Le nombre de souris nécessaire pour cette étude est défini sur la base des études précédemment réalisées sur le modèle d’arthrite au collagène. Le nombre d’animaux par groupe a été determiné pour obtenir un effet statistiquement significatif. Sur les animaux seront prélevés les poumons, le sang, la rate, les ganglions et les pattes afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation en vigueur pour l’espèce concernée . Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Dès les premiers signes cliniques (gonflement de la patte injectée), des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des souris. Les injections seront réalisées après anesthésie locale par cryoanesthésie. Concernant l'instillation nasale de silice, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale, ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'à leur réveil complet. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédant l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiée via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme.
Choix des espèces
Nous avons décidé d’utiliser l’arthrite expérimentale au collagène de la souris qui est le modèle animal le plus utilisé pour établir un effet thérapeutique dans la polyarthrite rhumatoïde. L’induction des arthrites se fera sur des animaux de 11semaines après une préexposition à la silice. Les scores cliniques d'arthrite seront évalués pendant 3 à 8 semaines après l'induction. Le stade de développement des animaux est déterminé par la maturation du système immunitaire. Avant 8 semaines, le système immunitaire n'est pas assez mature pour répondre correctement à l'immunisation. A partir de 12 semaines, la capacité des souris à développer des arthrites décroit avec l'âge.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de méningites bactériennes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Âgées de trois semaines, les souris utilisées servent à reproduire la méningite de l'enfant, et certaines lignées génétiquement déficientes portent un risque accru d'infection. 3 700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit une injection bactérienne sous anesthésie générale d'environ trois minutes, puis jusqu'à deux injections supplémentaires de trente secondes, le porteur indiquant que l'infection peut provoquer douleur, prostration et retrait du groupe social pendant seize heures au plus. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et analyser la réponse inflammatoire, seul moyen selon le porteur d'identifier les molécules qui abîment le cerveau au cours de l'infection.
Objectifs
La méningite est une infection du cerveau qui est associée à un taux de mortalité élevé ou laisse chez 30 à 50 % des survivants, des séquelles neurologiques. Lorsqu'un microorganisme envahit le cerveau, une réponse immunitaire est déclenchée afin de combattre l’infection. Cependant,cette réponse peut aussi causer des dommages au cerveau responsable en partie des séquelles neurologiques. Notre objectif est de caractériser la réponse immunitaire du cerveau lors de l’infection et d’identifier des molécules inflammatoires qui pourraient jouer un rôle néfaste sur le cerveau.
Bénéfices attendus
L'identification de ces molécules inflammatoires impliquées dans les dommages au cerveau lors de la méningite accélérera le développement de thérapies visant à réduire les séquelles neurologiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront infectés par injection sous anesthésie générale (1 injection pour une durée totale d'environ 3 min). Des injections supplémentaires permettant l'administration de traitement ou d'anesthésie seront réalisées (jusqu'à 2 injections/animaux durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections causent un stress de courte durée (quelques secondes). L'infection est susceptible de générer douleur, prostration, et une mise en retrait du groupe social (16h maximum). Certaines souris génétiquement déficientes qui seront élévées présentent un risque accru de développer une infection.
Devenir
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire la complexicité du cerveau et du système immunitaire in vitro. L'analyse de la réponse inflammatoire du cerveau nécessite le prélevement des organes justifiant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la réponse inflammatoire du cerveau qui peut mettre en jeux de nombreux types de cellules. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet qui permettra d'identifier l'ensemble des cellules et molécules inflammatoires impliquées dans ce processus et également d'analyser l'impact de l'inflammation systémique sur le déclanchement de la neuroinflammation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum mais suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. Chaque expérience indépendante comportera au moins un groupe témoin d'animaux et un groupe test et les différences entre les souris test et les témoins seront analysées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L’infection se fera sous anesthésie générale. Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté et d'un milieu enrichi. Nous avons optimisé les inocula bactériens et les temps d’étude de manière à minimiser les effets de l’infection sur les animaux. Ce protocole inclut des points limites spécifiques au projet qui permettront d'évaluer les animaux, à l'aide d'une grille de score. En cas de point limite atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée. Dans le cas où certains animaux peuvent être malades, des croquettes imbibées d’eau sont systématiquement introduites directement dans la cage pour favoriser la prise alimentaire. Pour les souris immunodéprimées, un hébergement sans orgganismes pathogène sera mis en place;
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la physiopathologie de l'infection tels qu’ils peuvent se développer chez l'enfant. Nous utiliserons des souris juvénile de 3 semaines qui constituent notre modèle d'étude de méningite. D’autre part, les modèles animaux comme la souris offrent la possibilité d’investiguer des cibles spécifiques in vivo à l’aide d’animaux génétiquement modifiés, ce qui permet d'approcher ou d'élucider de plus près les mécanismes impliqués
Pharmacocinétique : Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à 365 administrations de composés et 52 prélèvements de sang par animal : 900 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués pour analyses immunologiques et histologiques. La plupart des gestes se font sur animaux vigiles, sous contention, le porteur décrivant des hématomes aux points de piqûre et une douleur brève à chaque injection. Ces études de pharmacocinétique servent à mesurer où va une molécule dans le corps et à quelle vitesse elle en sort, étape que les autorités de santé exigent avant tout essai chez l'être humain. Le projet pourra comporter dix études, et le bénéfice annoncé pour les patients reste renvoyé à d'éventuels essais cliniques ultérieurs.
Objectifs
La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur sain est une étape essentielle dans le développement de médicaments et de vaccins. Ce projet a pour but de vérifier l'innocuité (absence de toxicité) et de déterminer la biodisponibilité de nouvelles molécules thérapeutique. La pharmacocinétique a pour but d'étudier le devenir d'une substance, contenue dans un médicament, dans l'organisme après son administration selon différentes voies d'administration. Ce projet a pour but d’étudier le devenir des agents pharmacologiques in vivo chez le rat sain qui est une étape essentielle dans le développement d’un candidat médicament afin d'étudier sa bio-distribution et biodisponibilité dans un organisme vivant. La pharmacocinétique est le devenir du médicament, depuis son entrée jusqu'à sa sortie de l'organisme, l'évolution en fonction du temps de son absorption, sa biodisponibilité, sa distribution, son métabolisme, et son excrétion. En effet pour développer un composé, il est indispensable d’étudier sa pharmacocinétique et de vérifier l’absence de toxicité sur un modèle animal. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Cette caractérisation des paramètres pharmacocinétiques permet par la suite de déterminer entre autres les voies d’administration et la posologie.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique (PK) chez l'animal sont nécessaires et demandées par les autorités de santé afin de pouvoir réaliser des études cliniques avec un maximum de sécurité. Elles permettent de déterminer les doses, la fréquence des administrations et de calculer la marge de sécurité. Ce projet pourra comporter 10 études et permettra de générer des données scientifiques robustes chez l’animal afin de pouvoir passer ultérieurement aux essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 52 prélèvements (30 secondes/rat) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/rat). Administrations de composés : maximum 365 administrations, durée : 30 secondes/injection.
Impact sur les animaux
Les contentions des animaux vigiles pour administrer les molécules thérapeutiques peuvent engendrer un stress mineur à l’animal. L’administration de molécules par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des molécules entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort se traduisant par une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun problème de toxicité n’a été relevé sur les composés testés lors du précédent projet.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet d’étudier la bio- distribution, biodisponibilité de nouvelle molécules thérapeutiques et vérifier l’innocuité de nouvelles thérapies in vivo chez le rat. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale (culture cellulaire, modélisation informatique) ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. Ces tests sont nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle substitutif n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement (pour les études de plus de 24h) pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages et le vétérinaire en sera informé. Certains types de traitements seront effectués sous anesthésie ainsi que les prélèvements de sang. Un suivi et scoring quotidien seront effectués. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Pour les projets longs, au cours des précédents projet nous avons varié les enrichissements au cours de l’étude (tunnel, dômes, frisures de carton, cylindre de coton, morceau de bois à ronger) afin d’améliorer le bien-être des animaux (curiosité, diminuer l'ennui). Nous allons continuer de procéder ainsi dans ce projet.
Choix des espèces
Le choix du rat pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développé sur des fonds génétique de rat dont les génomes possèdent 90% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendu. - De nombreux outils génétiques, anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire chez le rat. - Le rat est l’autre espèce de rongeur utilisée en recherche biomédicale (en plus de la souris), même si son importance numérique est moindre que celle de la souris. C’est aussi une espèce de petite taille qui présente l’avantage, par rapport à la souris, d’être plus proche physiologiquement de l’homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure comparaison inter-espèces. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Etablissement d’une lignée zébrafish mutante pour l’étude du rôle des immunoglobulines de type D dans la réponse immunitaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privés du gène de l'immunoglobuline D par ciseaux moléculaires, les poissons zèbres créés dans ce projet perdent une partie de leurs défenses et deviennent plus sensibles aux infections. 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit un génotypage par section d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, geste de moins de deux minutes qui peut réduire son activité de nage et modifier sa prise alimentaire dans la journée. Seuls 50 hétérozygotes de la première descendance sont maintenus pour produire la génération suivante, dont les œufs partiront vers un autre laboratoire pour y être infectés par des virus, les 850 autres étant tués.
Objectifs
Malgré la conservation évolutive dans le système immunitaire de l'immunoglobuline D (IgD), les fonctions spécifiques de cette Immunoglobuline restent une énigme. Le rôle précis de l'IgD lorsqu'elle est exprimée avec d'autres immunoglobulines à la surface des cellules immunitaire (cellules B) n'a été clarifié ni chez les poissons ni chez les mammifères. On pense que l’IgD joue un rôle important dans les muqueuses mais son rôle exact n’est pas encore bien compris. Pour mieux comprendre la fonction de l’IgD nous allons utiliser le modèle poisson zébrafish qui produit aussi ces immunoglobulines D au niveau des cellules immunitaires B. Pour cela, nous créerons deux lignées de poissons-zèbres dont le gène de l’IgD aura été inactivé grâce à la technique des ciseaux moléculaires : les Crispr/Cas9. Dans un deuxième temps et dans un autre laboratoire (nouvelle demande d'autorisation de projet), les poissons mutants seront soumis à des infections virales afin d’étudier les effets de l’absence d’IgD sur leur système immunitaire.
Bénéfices attendus
Malgré la conservation évolutive de l'IgD, les fonctions spécifiques de cette immunoglobuline restent une énigme. C'est pourquoi la génération de mutants de poisson zèbre dépourvus de l'expression de l'IgD serait un outil extrêmement précieux pour comprendre le rôle de l'IgD à la fois lorsqu'elle est sécrétée et lorsqu'elle est co-exprimée avec l'IgM à la surface des cellules. Plus précisément, cela nous permettrait de déterminer comment l'absence d'IgD affecte la réponse immunitaire aux agents pathogènes qui pénètrent dans l'hôte par les voies muqueuses et comment elle conditionne la réponse IgM. Le fait de disposer de ces poissons sera déterminant pour clarifier le rôle immunitaire de cette immunoglobuline énigmatique.
Procédures
Ce projet concerne uniquement la création de 2 lignées mutantes n'exprimant pas le gène de l'immunoglobuline. Pour l'établissement de ces lignées, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudal) sera réalisé sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthie du poisson compris.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène codant l’IgD peut entraîner une altération des fonctions immunitaires. Ainsi: la reconnaissance des microbes et la régulation des cellules immunitaires sont altérées.Les animaux pourraient être un peu plus sensibles aux infections ou au stress environnemental. Cependant, d’autres anticorps (comme l’IgM) peuvent compenser partiellement cette absence, donc les effets ne sont pas toujours graves, mais ils peuvent apparaître dans certaines conditions (infection, changement d’environnement, etc.). Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. L’anesthésie pratiquée pour le prélèvement de fragment de nageoire peut aussi entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Devenir
Ce projet vise à créer 2 lignées mutantes pour étudier le fonctionnement du système immunitaire après l’inactivation de l’Immunoglobuline D. Seuls les 2 x 25 animaux hétérozygotes de la première descendance seront maintenus en vue de la production de la descendance suivante.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du fonctionnement du système immunitaire. Il n’existe donc pas d’alternative à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène IgD dans la fonction des cellules B du système immunitaire et les interactions avec les autres cellules immunitaires.
Réduction
In fine, il s’agit de créer 2 lignées pures (dans la descendance de 2ème génération) présentant une inactivation du gène de l'immunoglobuline D. Pour cela, par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus de la porteurs de mutations intéressantes (génération fondatrice). Au maximum 150 de ces individus atteindront le stade adulte selon les chiffres habituels. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygotes (possédant des copies de gènes différentes) en descendance de 1ère génération lorsque les animaux fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype naturel. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes de la génération de 1ère descendance produira une descendance de deuxième génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif obtenu). Après validation de chacune des lignées, nous produirons et conserverons un minimum de poissons respectant dans le même temps la demande en œufs de cette descendance pure contenant 100 homozygotes mutants complets.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce. Les différents paramètres de suivi sont relevés quotidiennement. Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en densité optimale . Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique de IgD) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien-être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la SBEA sera immédiatement avertie. La procédure de génotypage (permettant d'estimer le taux de mutants) qui consiste en un prélèvement de fragment de très petite taille durera moins de 2 minutes, temps d'anesthésie et réveil du poisson compris.
Choix des espèces
La demande concerne la fourniture de 2 lignées zébrafish présentant une inactivation de gène en vue de test infectieux. Le zébrafish est un poisson osseux qui possède un système immunitaire adaptatif fonctionnel. Le zébrafish exprime les immunoglobulines communes aux mammifères. Dans le cas de zébrafish présentant une mutation de gène, cela permet de réaliser des cribles en conditions infectieuses à grande échelle, ce qui est non réalisable chez les mammifères. De plus, le poisson zèbre est une espèce chez laquelle les outils d’édition de génome peuvent être appliqués de manière simple en raison du très fort taux de fécondité chez cette espèce et du développement rapide : 1 animal mature sexuellement peut être obtenu en 3 mois. Il est possible de produire beaucoup d’individus avec un gène inactivé plus rapidement que chez d’autres modèles vertébrés. Les animaux seront utilisés au stade adulte (pour la génération fondatrice et les animaux de 1ère génération) pour la création de lignée puis les œufs de la 2ème génération seront fournis au demandeur pour la suite des expérimentations (tests ultérieurs d’infection virale non réalisés par notre laboratoire). Au préalable, une vérification du taux de transmission de la mutation sera faite sur des alevins de la 2ème génération âgés de 1 mois. Cela permettra aussi de vérifier la qualité phénotypique et comportementale des individus cette 2ème génération.
Evaluation de stratégies thérapeutiques pour les tumeurs ténosynoviales à cellules géantes dans un modèle induit par l’injection intra-articulaire de cellules mutées de patient chez la souris NMRI Nude.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Dépourvues de défenses immunitaires, les souris de ce projet reçoivent dans l'articulation du genou des cellules tumorales prélevées sur des patients, sans risque de rejet. 267 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit ensuite jusqu'à quatre semaines d'injections hebdomadaires ou de gavage quotidien, avec un prélèvement de sang chaque semaine. Le porteur indique que la tumeur peut faire souffrir l'animal, restreindre l'amplitude de ses mouvements et parfois dégrader son os, et que toutes les souris seront tuées pour analyser les tissus.
Objectifs
Le projet a pour but de mettre au point un modèle fiable de tumeur ténosynoviale à cellules géantes (TGCT) par injection dans l’articulation du genou de souris de cellules de patients atteints de ces tumeurs. Dans un second temps, ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité de différents traitements. Ces différentes molécules sont, soit déjà utilisés pour le traitement des TGCTs chez l’homme, soit pertinentes dans d’autres pathologies proches et ont donc un potentiel pour être utilisées dans le traitement des TGCTs. Dans le cas de molécules déjà validées, ce modèle nous permettra d’évaluer l’efficacité de leur administration locale (intra-articulaire). Cette voie est peu utilisée pour l’instant dans le traitement des TGCTs mais pourrait permettre de grandement réduire les effets secondaires de ces traitements qui sont le frein majeur à leur utilisation.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints de TGCT est insuffisante avec de nombreux patients souffrants d’effets secondaires ou non répondeurs aux thérapeutiques actuelles. Ce projet permettra de mettre en évidence l’efficacité de nouveaux traitements dans un modèle adapté et de valider que l’administration locale (intra-articulaire) permet une efficacité au moins équivalente en réduisant les effets secondaires pour les molécules déjà utilisées. Ces nouveaux traitements et modes d’administration pourront ensuite être proposés pour des essais cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection intra-articulaire sous anesthésie (induction + geste + réveil = 5 min) dans le cadre de la mise en place du modèle. Pour tester les traitements, ils subiront en plus des injections hebdomadaires (intra-articulaire ou intra-veineuse) ou un gavage quotidien ainsi qu’un prélèvement sanguin hebdomadaire. Les injections intra-articulaires et leurs contrôles en intra-veineuses seront également réalisées sous anesthésie (induction + geste + réveil = 5 min). Les autres interventions seront réalisées sur les animaux vigiles, avec environ 30 secondes de manipulation par animal comprenant une dizaine de secondes de contention pour réaliser le geste. Le temps de traitement total reste à définir mais ne devrait pas excéder 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les molécules à tester sont connues pour induire comme effets secondaires potentiels les plus graves une baisse du nombre de neutrophiles dans la circulation sanguine et une atteinte du foie. Les différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement) seront attentivement surveillés, particulièrement dans les heures et jours suivants les injections. Une induction efficace de la tumeur pourrait amener l’animal à ressentir la douleur associée à son développement. Ces tumeurs, d’évolution généralement lente, entrainent surtout une restriction de l’amplitude de mouvement mais peuvent dans certains cas induire de la dégradation osseuse. Le suivi de la mobilité des animaux sera un point de vigilance particulier pour s’assurer que l’accès à la nourriture ou la capacité à interagir ne sont pas affectés.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter et analyser les tissus.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus qui jouent tous un rôle important dans son fonctionnement et peuvent aussi participer au développement de maladies comme les TGCTs. Le test de molécules d’intérêts thérapeutiques, en particulier avec l’analyse de la voie d’administration la plus adaptée pour réduire des effets secondaires, ne peut pas être pleinement réalisé sur des modèles in vitro et ex vivo. Le recours aux souris ayant une immunité réduite, est un modèle de choix pour l’injection de cellules humaines sans souci de rejet.
Réduction
La réalisation d’un étude pilote permettra de définir la faisabilité et les meilleures conditions de réalisation du projet. Le nombre d’animaux est réduit au minimum suffisant (8 animaux par groupe) pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes en utilisant les tests statistiques adaptés. Ensuite, le nombre de molécules se limitera aux plus pertinentes pour l’application chez l’homme (molécules déjà validées à tester en injection intra-articulaire et nouvelles molécules pouvant offrir un bénéfice thérapeutique).
Raffinement
Les souris seront hébergées par cage de 5 maximum avec l’enrichissement nécessaire à la nidification. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour les injections intra-articulaires, une injection d’analgésique est réalisée pour prévenir la douleur. Les souris sont ensuite anesthésiées par la méthode permettant l’induction et le réveil le plus rapide, et maintenus sur un tapis chauffant pendant la durée de la procédure. Des points limites adaptés ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles pour analyser les cellules dans la tumeur qui viendront de l’animal. Elle permet la constitution de groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Les souris utilisées permettent la greffe de tissus et de cellules humaines en évitant les phénomènes de rejet et constituent en cela un modèle reconnu. Des souris adultes de 9 semaines seront utilisées pour modéliser les TGCTs qui affectent principalement des adultes.
Étude du rôle des cellules immunitaires innées dans la progression de la drépanocytose chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à quatre-vingt-dix gavages quotidiens, quinze injections, deux séjours de huit à vingt-quatre heures en cage métabolique et jusqu'à vingt-quatre heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène : 1 825 souris vont subir ce protocole, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que les crises vaso-occlusives provoquées chez ces souris entraînent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes que vivent les personnes drépanocytaires. L'objet du projet est d'identifier des cellules immunitaires comme cibles thérapeutiques dans les complications rénales et cardiaques de la maladie. Le choix de souris de quatre semaines à six mois est justifié par l'absence de fibrose liée à l'âge, qui assurerait "une variabilité minimale des résultats expérimentaux".
Objectifs
La drépanocytose est une maladie génétique récessive causée par une mutation d’un gène, qui provoque une déformation des globules rouges. Cette pathologie entraine des complications rénales et cardiaques. Malgré les traitements actuels, les complications multiorganiques persistent. Des recherches récentes soulignent le rôle clé de certaines cellules immunitaires dans l’amplification des réponses inflammatoires, aggravant les lésions tissulaires et les dysfonctionnements des organes. Ce projet vise à explorer l’implication de ces cellules dans les complications liées à la drépanocytose et à évaluer leur potentiel en tant que cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes inflammatoires impliqués dans les complications aiguës et chroniques rénales et cardiaques de la drépanocytose. En se concentrant sur la contribution des cellules immunitaires, l’objectif est d’identifier des marqueurs pronostiques validés ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques capables de dépasser les limites des traitements actuels, en s’attaquant directement aux causes sous-jacentes des atteintes organiques associées à la drépanocytose. À terme, cette recherche pourrait contribuer à améliorer de manière significative les résultats cliniques et le bien-être global des patients atteints de cette maladie.
Procédures
- Biopsie de la queue : une seule biopsie de moins de 2 mm (10 secondes) réalisée sur une souris. - Prélèvement sanguin : un prélèvement sur souris vigile (durée environ 30 secondes) et deux prélèvements sur souris anesthésiées (durée environ 1 minute). - Mesure de la pression artérielle : deux mesures non invasives de 20 minutes sur souris vigiles pendant deux jours consécutifs. - Injections : 15 injections (une par jour) sur souris vigiles (environ 20 secondes par jour). - Administration orale : entre 15 et 90 administrations orales (une par jour) sur souris (environ 20 secondes par jour). - Administration par mini-pompes osmotiques : implantation sous-cutanée de pompes pour la délivrance continue du traitement (durée de la chirurgie : environ 5 minutes). - Séjour individuel dans des dispositifs métaboliques d’une durée de 8 à 24 heures, réalisé une à deux fois selon le protocole. - Exposition à une atmosphère hypoxique contrôlée : une à deux expositions d’une durée de 3 à 24 heures dans un environnement à faible teneur en oxygène.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront des douleurs légères et de courte durée à la suite de la biopsie de la queue et de la mesure de la pression artérielle. - Elles subiront également le stress d’un confinement individuel dans des cages métaboliques pendant une durée de 8 à 24 heures. - L’administration par voie orale, le prélèvement sanguin et les injections leur causeront une douleur légère et de courte durée ou un inconfort minime au site d’injection. -Douleurs modérées et de courte durée après chirurgie pour la pose de la pompe osmotique. - Les crises vaso-occlusives, qui reproduisent les complications aiguës observées dans le contexte de la drépanocytose, provoquent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes douloureux sévères ressentis chez les patients drépanocytaires. - L’administration par voie orale quotidien entraînera un certain inconfort chez les souris, mais cette technique sera réalisée à l’aide de sondes d’alimentation en plastique polypropylène, afin de minimiser les risques de lésions œsophagiennes.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et d’analyser les reins, le cœur et le foie.
Remplacement
Le modèle animal permet d’étudier la physiopathologie rénale, cardiaque et hépatique en tenant compte de l’ensemble des paramètres physiologiques présents chez un organisme vivant. Les approches in vitro ou in silico ne peuvent pas reproduire cette complexité, notamment les interactions entre les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, ce qui les rend peu pertinentes pour comprendre ces mécanismes.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux requis est calculé sur la base d'un plan expérimental permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire pour obtenir des conclusions biologiquement pertinentes. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque animal, un maximum d’organes et d’échantillons biologiques sera prélevé afin d’éviter la répétition des expériences sur de nouveaux animaux. Ces tests statistiques sont adaptés à la taille de nos échantillons. Les accouplements sont optimisés pour obtenir les animaux d’intérêt avec le meilleur rendement possible.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour réduire le stress, l’anxiété et la souffrance des animaux : 1/ Des points limites clairs et stricts, spécifiques au projet, ainsi qu’un système de notation de la douleur ont été définis pour surveiller le bien-être des animaux et permettre une intervention si nécessaire. 2/ Pour limiter la douleurs, des prélèvements seront effectués sous anesthésie, des analgésies sont prévues pour traiter la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est essentiel pour étudier les pathologies rénales, cardiaques et hépatiques, car il reflète la complexité de l’organisme vivant que les modèles in vitro ou in silico analyses ne peuvent pas reproduire. Les souris âgées de 4 semaines à 6 mois sont idéales, car elles ont dépassé le sevrage physiologique et ne sont pas encore à un âge où une fibrose des organes (rein, cœur, foie, etc.) pourrait se développer en raison de facteurs liés à l'âge pendant la drépanocytose, ce qui permet d’assurer une variabilité minimale des résultats expérimentaux.
Étude et impact de la persistance du SARS-CoV-2 dans un modèle primate non humain
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour savoir où le SARS-CoV-2 se cache dans l'organisme après la guérison apparente, 12 macaques à longue queue vont être infectés puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit environ quarante-cinq anesthésies générales, quarante-cinq prélèvements de sang, trente écouvillonnages du nez et de la trachée, vingt lavages broncho-alvéolaires, dix ponctions de moelle osseuse et huit retraits de ganglions lymphatiques. Le porteur annonce aussi deux injections de molécules qui imitent une infection bactérienne, destinées à réveiller le virus "endormi", et décrit fièvre, douleurs musculaires, anémie et saignements de nez parmi les suites attendues. La surveillance repose sur une grille de score déjà employée dans le service, les animaux étant tués en fin de projet pour analyser moelle osseuse, ganglions, rate et intestin.
Objectifs
Le Covid long touche environ une personne sur dix après une infection par le virus responsable du Covid-19, le SARS-CoV-2. Il entraîne des symptômes qui persistent plusieurs mois après la guérison initiale, comme une grande fatigue, des troubles de la mémoire ou encore des douleurs multiples (thoraciques, musculaire ou articulaire, céphalées…etc). Les causes précises de ce syndrome restent encore mal comprises. Plusieurs pistes sont étudiées : une inflammation prolongée, un dérèglement du système immunitaire, des déséquilibres hormonaux ou encore la présence persistante du virus dans l’organisme. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous utilisons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus, dont les réponses à l’infection à SARS-Cov-2 sont proches de celles de l’humain. Ce modèle permet d’étudier en détail l’évolution de l’infection sur le long terme. Grâce à lui, il a été découvert que le virus, même s’il n’est plus détecté par les tests tels que les écouvillons nasaux, peut rester caché pendant 6 à 18 mois dans les poumons dans certaines cellules immunitaires, les macrophages. Nous avons aussi observé que certaines cellules du système immunitaire, les cellules NK (pour “natural killer”), peuvent s’adapter pour mieux combattre ce virus caché. Une sous-population particulière de ces cellules, les “NK adaptatives”, semble jouer un rôle clé dans le contrôle de l’infection persistante. Ce projet de recherche se poursuit aujourd’hui autour de trois grandes questions : 1/ Où le virus se cache-t-il à long terme ? Nous voulons savoir si les macrophages des poumons sont les seuls refuges du virus, ou si d’autres cellules, dans d’autres organes comme l’intestin, peuvent aussi l’héberger durablement. 2/ Quel est le rôle du système immunitaire ? Nous étudierons si l’état du système immunitaire au moment de l’infection influence la capacité à éliminer le virus. Nous chercherons aussi à comprendre comment les cellules NK adaptatives se développent et agissent. 3/Le virus peut-il se réveiller ? Enfin, nous testerons si ce virus "endormi" peut se réactiver plus tard, par exemple en cas d’infection bactérienne, et provoquer de nouveaux symptômes. Ces recherches visent à mieux diagnostiquer le Covid long et à poser les bases pour développer, à terme, un traitement curatif.
Bénéfices attendus
Une des hypothèses avancées pour le Covid long est que le virus pourrait persister discrètement dans l’organisme, sans être complètement éliminé par le système immunitaire. Dans ce projet de recherche, l’objectif est de mieux comprendre où et comment le virus peut rester caché dans le corps. Les cellules et tissus jouant un rôle de “réservoirs” viraux – comme les poumons, l’intestin, les ganglions lymphatiques ou la moelle osseuse – seront identifiés et étudiés. Leur nombre, leur activité anti-virale et leur évolution dans le temps seront analysées. Une attention particulière sera portée aux macrophages des poumons et aux cellules NK, capables d’éliminer les cellules infectées. On s’intéressera aussi aux facteurs immunitaires (c’est-à-dire l’ensemble des réactions et des cellules de nos défenses naturelles qui permettent de combattre une infection) et aux facteurs épigénétiques (c’est-à-dire les mécanismes qui modifient l’activité de nos gènes sans changer l’ADN) qui peuvent influencer la capacité du corps à éliminer durablement le virus. Pour cela, nous utiliserons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus. Grâce à lui, après une infection par le SARS, la dynamique du virus peut être observée dans plusieurs organes et sur une longue période, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. Nous testerons une approche innovante qui consiste à injecter une molécule modulatrice de la réponse immunitaire qui imite une infection bactérienne. L’objectif est de vérifier si, dans ces conditions, le virus encore présent dans l’organisme mais « endormi » peut se réactiver, sans qu’il y ait réellement de nouvelle infection. Plusieurs avancées sont attendues grâce à ce projet : • Une meilleure compréhension de la persistance virale, des mécanismes d’échappement au système immunitaire, et des conditions de réactivation du virus. • La mise en évidence du rôle des cellules NK dites "adaptatives" dans le contrôle de l’infection à long terme. • L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des antiviraux ou des immunothérapies. • La détection de marqueurs sanguins utiles au diagnostic du Covid long et à la sélection des patients pour de futurs essais cliniques. Ce projet permettra une avancée majeure dans la compréhension et la prise en charge du Covid long, tout en enrichissant les connaissances scientifiques sur les infections chroniques et l’immunité.
Procédures
Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (45 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SARS-CoV-2 (une fois, 15 min, tous les animaux, - Injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire (deux fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (45 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (10 fois environ, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait de ganglions lymphatiques périphériques (8 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (30 fois environ, 2 minutes, tous les animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (20 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection : Symptômes respiratoires (pneumonie légère à modérée, difficultés respiratoires transitoires, toux légère), fièvre et comportement de fatigue, anorexie transitoire ou diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, déshydratation. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Nuisances suite à l’injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire : Fièvre et comportement de fatigue, douleurs musculaires (tremblements, difficultés locomotrices), anorexie transitoire ou diminution de l’appétit, déshydratation, activation de la réponse immunitaire. Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse, et anesthésies répétées : Diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite aux lavages bronchoalvéoaires: Toux, difficultés respiratoires légère juste après le geste. Nuisances suite aux écouvillons nasotracheaux: Saignement nasal (léger à modéré). Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Après infection et pendant environ 4 semaines, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales pour limiter la surinfection virale. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin de pouvoir analyser tous les organes où sont activées les NK et macrophages (moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, intestin…)
Remplacement
Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester présent dans l’organisme sur le long terme, il est essentiel d’étudier ce phénomène dans un organisme vivant. Les expériences faites uniquement sur des cellules isolées, ne permettent pas de reproduire la complexité d’un corps entier. Elles ne reflètent pas non plus le comportement réel des cellules dans leur environnement naturel. C’est pourquoi des études sont menées sur des modèles animaux. Le macaque est l’un des plus adaptés pour ce type de recherche, car il est très proche de l’humain sur le plan biologique. Il possède les mêmes récepteurs cellulaires d’entrée pour le virus), ce qui permet au SARS-CoV-2 d’infecter ses organes de manière similaire à ce qui est observé chez l’humain, qu’il s’agissent des poumons, des intestins, des ganglions lymphatiques ou encore de la moelle osseuse. Grâce à ce modèle, la persistance du virus, l’emplacement de ses réservoirs dans l’organisme et l’évolution des réponses immunitaires peuvent être étudiés dans la durée. De plus, des prélèvements peuvent être réalisés dans différents organes, ce qui n’est pas possible chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude est réalisée en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.
Raffinement
Anesthésies/ Toutes les interventions et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule et même anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée. Prélèvements / Ils consistent en des prélèvements de sang, de moelle osseuse et des exérèses de ganglions périphériques. Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si des réactions locales apparaissent, un traitement symptomatique pourra être instauré. Exposition au virus / Après exposition aux virus SARS-CoV2, une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Elles ont déjà été établies et utilisées au sein de notre département et assure un bon suivi de l’état de santé des animaux après infection et permet d’alerter les vétérinaires en cas de besoin. Administration des molécules modulatrices de la réponse immunitaire / Si des réactions locales apparaissent suite à l’administration des modulateur, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Hébergement individuel / Les animaux sains seront hébergés en groupe sauf avis contraire des vétérinaires ; les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour limiter la surexposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée (4 semaines maximum), ils seront remis en groupe sociaux. Observations Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.
Choix des espèces
Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester dans le corps après une infection, nous utilisons un modèle animal proche de l’humain : le macaque cynomolgus. Ce primate partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l’être humain, notamment les récepteurs que le virus utilise pour entrer dans les cellules. Cela signifie que l’infection se développe chez ce modèle animal de manière très similaire à ce qui est observé chez l’humain, en touchant notamment les poumons, les intestins, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse. Ce modèle permet de suivre l’infection sur le long terme, dans des conditions très contrôlées : nous pouvons choisir précisément la dose de virus administrée et simuler certaines maladies associées (comorbidités), par l’injection de molécules modulatrices de la reponse immunitaire, comme cela se produit chez certains patients humains. Des prélèvements réguliers dans différents organes (sang, ganglions, moelle osseuse) sont possibles sur plusieurs mois, ce qui permet d’observer l’évolution du virus, d’identifier ses "cachettes" dans le corps (appelées réservoirs) et de mieux comprendre les réactions du système immunitaire dans le temps. Ce modèle permet aussi d’étudier le sang pour y repérer des signes spécifiques (biomarqueurs) de la présence du virus dans les différents organes. Ces informations pourraient ensuite être utilisées pour améliorer le diagnostic du Covid long chez l’humain, sans devoir effectuer de prélèvements invasifs. Les recherches se concentrent uniquement sur des modèles animaux adultes. En effet, leur système immunitaire est déjà totalement développé, ce qui permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables à ceux d’adultes humains. Cela aide à mieux comprendre les mécanismes de défense qui fonctionnent — ou échouent — face au virus, et pourquoi il peut parfois persister longtemps dans l’organisme. En résumé, le modèle macaque cynomolgus adulte est aujourd’hui l’un des plus pertinents pour faire progresser la recherche sur la persistance du SARS-CoV-2 et mieux prendre en charge les personnes souffrant de Covid long.
Étude de la modulation du métabolisme des monocytes sur la récupération post-infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Ouvertes au niveau du thorax pour qu'un infarctus leur soit provoqué, jusqu'à 140 minutes sous anesthésie profonde, 356 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, huit autres d'un niveau léger. Le porteur reconnaît une douleur modérée à sévère pendant et après l'opération. Viennent ensuite une échographie de vingt à trente minutes et cinq prélèvements sanguins échelonnés, avant le développement attendu d'une insuffisance cardiaque, que le RNT décrit comme sans conséquence clinique visible en raison du court délai avant la mise à mort. Les 364 souris sont tuées pour prélever leur cœur et leurs poumons et y mesurer l'infiltration des cellules immunitaires.
Objectifs
Après une crise cardiaque, le corps réagit par une inflammation qui peut parfois persister et fragiliser davantage le cœur. Ce projet vise à mieux comprendre cette réaction inflammatoire pour la maîtriser, tout en préservant les défenses naturelles de l’organisme. Nous nous intéressons à des cellules immunitaires appelées monocytes, qui jouent un rôle central dans l’inflammation et la réparation du tissu cardiaque. En étudiant leur comportement chez l’humain et chez la souris, nous cherchons à repérer les signes précoces d’une inflammation excessive et à explorer de nouvelles pistes pour la réguler. Notre objectif : développer des traitements innovants pour mieux protéger le cœur après un infarctus, anticiper les complications, et améliorer le suivi des patients les plus à risque.
Bénéfices attendus
Nous pensons que ce projet introduira une nouvelle approche thérapeutique post-infarctus du myocarde en limitant l’inflammation, réduisant ainsi le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce projet pourra également ouvrir la voie à de nombreuses études d’intervention post-infarctus du myocarde à fort impact, notamment en collaboration les centres de recherche clinique proches. Il générera des connaissances nouvelles de haute qualité, disponibles en accès libre. De plus, les techniques et expertises développées dans le cadre de ce projet pourront être appliquées à d’autres pathologies cardiovasculaires impliquant une dérégulation de l’inflammation, comme la myocardite. À plus long terme, l’objectif est de transposer ces avancées en stratégies thérapeutiques disponibles en clinique. Impacts économiques et technologiques attendus : L’insuffisance cardiaque représente un coût économique considérable, lié aux traitements à vie et aux hospitalisations fréquentes (estimé à 991 millions d’euros par an en France). Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou ralentir la progression de cette maladie pourrait réduire significativement cette charge économique. À court terme, ce projet permettra d’explorer une nouvelle voie thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance cardiaque. À long terme, il pourrait ouvrir des perspectives vers le développement de solutions thérapeutiques ciblées. Au-delà de l’impact économique, l’insuffisance cardiaque altère fortement la qualité de vie des patients (environ 160 000 hospitalisations chaque année en France). En améliorant les approches thérapeutiques et les stratégies de prévention, notamment par la nutrition et l’exercice physique, nous pourrions atténuer les conséquences de l’infarctus du myocarde sur la vie des patients. L’impact à long terme de ce projet pourrait bénéficier à plusieurs milliers de patients chaque année
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale thoracique visant à induire un infarctus du myocarde, réalisée sous anesthésie générale profonde avec une couverture analgésique adaptée (140 minutes maximum). Le suivi des animaux implique un examen échographique (20 à 30 minutes) et cinq prélèvements sanguins par animal (moins d’1 minute chacun), réalisés sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation. .
Impact sur les animaux
La chirurgie thoracique provoque une douleur modérée à sévère, per- et post-opératoire, de durée moyenne. Aucune nuisance n’est attendue pendant les examens échographiques (non invasif). Les prélèvements sanguins engendrent une douleur légère de très courte durée. L’induction de l’anesthésie (ou la sédation selon l’examen) associée à ces interventions, de même que le réveil, induisent un léger stress ou inconfort de courte durée. Pour les groupes d’animaux ayant subi un infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu, mais sans conséquence clinique visible ou invalidante associée dans les conditions expérimentales prévues (délais court entre l’infarctus et l’euthanasie de l’animal).
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement de différents organes (cœur, poumons…), pour effectuer des analyses tissulaires et des analyses d’infiltration des cellules immunitaires.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données in vitro et in vivo déjà publiée montrant le rôle clef du métabolisme dans la réponse inflammatoire post infarctus. Dans le présent projet nous cherchons à identifier le rôle clefs de la réponse inflammatoire post infarctus, qui est un phénomène multi organe nécessitant une approche sur organisme vivant. En effet, les monocytes infiltrant le tissu myocardique sont produits à distance dans la moelle osseuse, puis circulent dans le sang et infiltrent le cœur.
Réduction
L’utilisation du même animal pour un prélèvement sanguin a différent temps permet d’augmenter la puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le calcul des nombres d’animaux nécessaires a été réalisé avec l’appui du biostatisticien.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie seront entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec une couverture analgésique adaptée. Grâce au recul de l’équipe sur ce modèle chirurgicale, nous appliquerons tous les raffinements mis en place jusqu’ici (abord chirurgical sans résection de côte, soin post-opératoire,…) Des points limites sont établis en conséquence, afin de permettre l’interruption de l’expérimentation en cas d’apparition de douleur, stress, angoisse ou dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou de soulager.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature pour les études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires. Malgré certaines différences physiologiques, telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris s’est révélée être un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de l’inflammation. La disponibilité de modèles génétiquement modifiés permet également une compréhension plus détaillée des mécanismes sous-jacents. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde, nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque, est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, ce qui nous permet de bénéficier d’un excellent retour d’expérience. Les animaux seront âgés de 10 à 16 semaines au début de chaque procédure. Ce stade de développement est le plus couramment utilisé, permettant une réalisation maîtrisée et homogène de la chirurgie. Il permet également de s’affranchir de la variabilité interindividuelle apparaissant avec le vieillissement des animaux.
Rôle des peptides antimicrobiens dans un modèle de maladie auto-immune chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris utilisées appartiennent à une lignée qui développe spontanément une maladie auto-immune détruisant les glandes salivaires et lacrymales, et sont réparties par âge, à 4, 12 et 20 semaines, pour couvrir les stades de la maladie. 960 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse. Chacune subit une biopsie du bout de la queue, un tatouage d'identification, un prélèvement de sang à la veine faciale que le porteur décrit lui-même comme modérément douloureux, et jusqu'à six injections. La contrepartie annoncée tient en une phrase, de nouveaux outils thérapeutiques pour une maladie sans remède, et le dimensionnement des groupes en une autre, une "étude statistique adaptée" dont rien n'est précisé.
Objectifs
Nous étudions une maladie auto-immune chronique caractérisée par la destruction des glandes exocrines. Environ 0,5% de la population totale est atteinte et souffre de sécheresse buccale et oculaire et jusqu'à présent, il n'y a pas de remède pour celle maladie. Cela amène à la nécessité d'explorer d'autres domaines dans la compréhension de la maladie. Le rôle des molécules antimicrobiennes émerge dans le domaine de l'auto-immunité. Ces molécules constituent un groupe de petites molécules largement exprimés pour la défense contre les micro-organismes. Des études récentes révèlent que ces molécules régulent également les réponses immunitaires. Les molécules anti-microbiennes sont très exprimées dans les glandes salivaires. Notre objectif général est de déterminer le rôle de molécules anti-microbiennes dans les glandes exocrines lors du développement de l'auto-immunité dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet fournira de nouveaux outils thérapeutiques pour prévenir ou guérir un syndrome auto-immun.
Procédures
* Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. * Prélèvement de sang : une fois par animal,, 2-3 secondes. * Injection : entre 1 et 6 injections, 2-3 secondes.
Impact sur les animaux
- Biopsie pointe de la queue (douleur légère de quelques secondes), -Tatouage d'identification (douleur légère de quelques secondes), -Injections (douleur légère de quelques secondes), Prélèvement sang à la veine faciale (douleur modérée de quelques secondes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse.
Remplacement
Pour étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de ces maladies et notamment les interactions entre le microbiote intestinal, le système immunitaire et le tissu cible. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.
Réduction
Les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : un nombre suffisant sera défini pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique.Tout animal qui aura une valeur totale comprise entre 1 et 3 dans les différents points limites recevra un analgésique (Ketoprofen, dose 5mg/kg, volume 0,012ml/g; SC).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. De plus il existe des modèles bien établis de maladies auto-immunes. Les souris NOR seront de 3 âges différents (4, 12, 20 semaines) correspondant aux différents stades de développement de la maladie. Les souris C57BL/6 Tcfcp2L1-Cre-ERT X Slpi-flox seront utilisées à l'âge adulte >8 semaines.
Pharmacocinétique : Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à 365 administrations de composés et 52 prélèvements de sang sur animal vigile, pour un même individu : 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Il s'agit de suivre le devenir de candidats médicaments dans le corps de souris saines, étape que les autorités de santé réclament avant tout essai chez l'être humain. Le porteur ramène les nuisances à un stress mineur, de petits hématomes au point de piqûre et une douleur légère de quelques secondes. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour des analyses immunologiques et histologiques.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le devenir des agents pharmacologiques in vivo chez la souris saine qui est une étape essentielle dans le développement d’un candidat médicament afin d'étudier sa bio-distribution et biodisponibilité dans un organisme vivant. En effet pour développer un composé, il est indispensable d’étudier sa pharmacocinétique et de vérifier l’absence de toxicité sur un modèle animal . Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Cette caractérisation des paramètres pharmacocinétiques permet par la suite de déterminer entre autres les voies d’administration et la posologie.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique (PK) chez l'animal sont nécessaires et demandées par les autorités de santé afin de pouvoir réaliser des études cliniques avec un maximum de sécurité. Elles permettent de déterminer les doses, la fréquence des administrations et de calculer la marge de sécurité. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l’animal afin de pouvoir passer ultérieurement aux essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 52 prélèvements (30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 365 administrations, durée : 30 secondes/injection.
Impact sur les animaux
Les contentions des animaux vigiles pour administrer les molécules thérapeutiques peuvent engendrer un stress mineur à l’animal. L’administration de molécules par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des molécules entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés (au maximum 3 micro-prélèvement en 24h ) ce qui peut générer du stress et de l’inconfort se traduisant par une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun problème de toxicité n’a été relevé sur les composés testés lors du précédent projet.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet d’étudier in vivo la bio-distribution et biodisponibilité des molécules thérapeutiques ainsi que vérifier l’innocuité de nouvelles thérapies chez la souris. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale (culture cellulaire, modélisation informatique) ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. Ces tests sont nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle substitutif n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement (pour les études de plus de 24h) pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages et le vétérinaire en sera informé. Certains types de traitements seront effectués sous anesthésie gazeuse. Un suivi et scoring quotidien seront effectués. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Pour les projets longs, au cours des précédents projets nous avons varié les enrichissements au cours de l’étude (tunnel, dômes, frisures de carton, cylindre de coton, morceau de bois à ronger) afin d’améliorer le bien-être des animaux (curiosité, diminuer l'ennui). Nous allons continuer de procéder ainsi dans ce projet.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développé sur des fonds génétique de souris dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendu. - La souris est un animal pour lesquel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. - Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).