Système immunitaire

310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et sous la peau tous les trois à quatre jours pendant cinq semaines, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie tous les quinze jours pendant trois mois, le temps qu'une arthrite se développe dans leurs articulations. Le bénéfice annoncé reste un modèle murin destiné à évaluer plus tard des traitements ciblés, aucun essai clinique n'étant en vue. Sur le remplacement, le porteur décrit des tests sur cellules isolées suivis d'un passage chez l'animal, et présente la souris comme le modèle approprié pour observer la coopération cellulaire dans un "organisme entier".

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation au niveau des articulations aboutissant à la déformation des articulations et, à terme, une perte de qualité de vie des patients. Certaines personnes sont plus à risque de développer cette maladie, notamment celles qui possèdent un certain type d’anticorps. Ces anticorps apparaissent parfois avant les premiers symptômes et sont liés aux formes les plus sévères de la maladie. Les traitements actuels sont basés sur l’immunosuppression : ils freinent l’ensemble du système immunitaire pour limiter l’inflammation. Mais cela peut aussi affaiblir les défenses naturelles du corps, augmentant le risque d’infections graves. Notre équipe développe une nouvelle approche : cibler uniquement les cellules immunitaires responsables de la production de ces anticorps particuliers, sans toucher aux autres cellules immunitaires. Pour cela, il est essentiel de tester ces thérapies sur des modèles expérimentaux fiables. Notre projet consiste à développer un nouveau modèle murin reproduisant les caractéristiques de la PR, notamment la présence de ces anticorps. Ce modèle unique nous permettra ensuite de tester avec une plus grande fiabilité des traitements innovants qui ciblent uniquement les cellules malades, pour une approche plus précise, plus efficace et avec moins d’effets indésirables.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mettre en place un nouveau modèle murin d’arthrite, reproduisant la pathologie humaine, avec la présence des anticorps spécifiques à cette maladie. Ce modèle unique permettra d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules pathogènes spécifiquement pour limiter les effets secondaires des traitement actuels.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Douleur légère due aux injections intrapéritonéales et sous-cutanées. Douleur modérée due au développement de l’arthrite ou à une réaction immunitaire exacerbée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour analyser les cellules immunitaires présentes et l’impact des molécules testées sur les cellules exprimant/sécrétant les anticorps spécifiques de la pathologie.

Remplacement

Nos recherches visent à trouver de nouveaux traitements pour la polyarthrite rhumatoïde, une maladie où le système immunitaire attaque les articulations. Nous cherchons à développer des thérapies capables de cibler et détruire uniquement les cellules du système immunitaire qui fabriquent les anticorps responsables de ces attaques. D’abord, nous testons ces approches en laboratoire sur des cellules isolées (in vitro). Les plus prometteuses seront ensuite testées sur des modèles vivants (in vivo) pour vérifier leur efficacité avant d’envisager des essais sur l’humain. Pour cela, nous devons créer des modèles expérimentaux qui reproduisent le système immunitaire humain, y compris les cellules qui provoquent la maladie. Ces modèles permettront ensuite d’évaluer concrètement les nouvelles molécules thérapeutiques que nous aurons sélectionnées.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec un logiciel adapté pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Seules les molécules ayant démontré une activité in vitro seront évaluées in vivo, afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les animaux seront observés régulièrement selon de nombreux critères : paramètres comportementaux et perte de poids. Le développement de l’arthrite sera suivi 3 fois par semaine pour évaluer le bien-être animal et adopter les mesures de raffinement appropriées. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des copeaux de litière et des igloos, et de la nourriture humidifiée dans la cage.

Choix des espèces

La souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Ces modèles permettent d’évaluer l’effet des molécules développées, leur efficacité sur les pathologies mais également l’identification d’effets secondaires potentiels. Les souris doivent être utilisées à l’âge adulte pour avoir un système immunitaire mature.

Pour savoir si une alimentation maternelle riche en cholestérol ou de type fast-food modifie le système immunitaire du fœtus, 820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 676 d'entre elles et modéré pour 144. Les femelles suivent un régime gras qui augmente leur poids de 20 à 50 % et provoque une hypercholestérolémie modérée à sévère, avec une ponction sanguine sous la mâchoire, un gavage gastrique et, pour 144 souris, une infection à Citrobacter. Les souriceaux naissent par césarienne après la mise à mort de leur mère, puis sont confiés à des femelles adoptantes. Ceux qu'aucune femelle n'adopte sont tués, ce que le porteur justifie par la limitation du stress du reste de la portée.

Objectifs

Les cellules immunitaires appelées ILC3 jouent un rôle essentiel dans la formation du système de défense de l’intestin dès le développement du fœtus. En plus de protéger contre les infections, ces cellules participent aussi à la croissance des tissus intestinaux, à la protection des cellules souches et à l’équilibre du métabolisme. Nos premières recherches, réalisées en laboratoire et chez la souris, montrent que le cholestérol pourrait modifier profondément le fonctionnement de ces cellules. En apportant du cholestérol en plus, on observe des changements dans l’activité de certains gènes, une baisse de la production de cellules immunitaires clés, et une perturbation globale de leur bon fonctionnement. Ce projet cherche donc à comprendre comment l’alimentation de la mère pendant la grossesse — en particulier une alimentation riche en cholestérol ou de type “fast-food” (grasse et sucrée) — peut influencer le développement du système immunitaire de son futur bébé. Nous allons : 1. Étudier si un excès de cholestérol modifie la formation des cellules immunitaires chez l’embryon. 2. Observer si une alimentation de type “fast-food” perturbe les défenses intestinales du bébé. 3. Évaluer si ces perturbations précoces ont un impact durable sur l’immunité de l’enfant plus tard.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intéresse à l’influence de l’alimentation de la mère pendant la grossesse sur le développement du système immunitaire du bébé à naître. Il cherche à mieux comprendre comment des apports en graisses, notamment en cholestérol, peuvent modifier la formation des défenses immunitaires dès la vie embryonnaire. Pourquoi c’est important : Mieux comprendre : Le projet permettra de découvrir comment une alimentation riche en cholestérol ou de type fast-food peut perturber la formation des cellules immunitaires et des organes essentiels du système de défense. Innover : Ces recherches pourraient mener à de nouvelles approches pour protéger la santé des bébés dès la grossesse, en agissant par exemple sur l’alimentation des futures mères. Agir pour la santé publique : Les résultats pourraient aider à mieux prévenir certaines maladies immunitaires ou métaboliques en comprenant leurs origines dès la vie fœtale, et ainsi affiner les conseils nutritionnels pour les femmes enceintes. Porté par une équipe experte en immunité et développement, ce projet a le potentiel de mieux anticiper les effets à long terme d’une alimentation déséquilibrée pendant la grossesse sur la santé des enfants.

Procédures

Une seule prise de sang dépassant le seuil minimal réglementaire sera réalisée au début du régime, par une ponction submandibulaire d’une durée inférieure à 1 minute, afin d’analyser le métabolisme des femelles. L’alimentation modifiée (enrichie en cholestérol ou de type “fast-food”) sera administrée à partir de deux semaines avant ou dès le début de la grossesse.

Impact sur les animaux

Régimes alimentaires spécifiques : Les femelles recevront un régime riche en graisses et cholestérol, ce qui entraînera une augmentation de leur poids corporel (environ +20 à +50 % du poids initial) et une hypercholestérolémie modérée à sévère. Prélèvements sanguins : Une seule ponction sous la mâchoire sera réalisée, pouvant provoquer une douleur brève, un léger stress, un saignement transitoire ou une petite irritation locale. Naissance et adoption des souriceaux : Les souriceaux naîtront par césarienne après euthanasie de la mère. Ils seront confiés à des femelles adoptantes préparées à cet effet. Les nouveau-nés non adoptés seront euthanasiés afin de limiter le stress du reste de la litière. Infection expérimentale (Citrobacter) : Elle pourra entraîner une perte de poids, des changements dans la consistance des selles ou le comportement. Les animaux seront surveillés quotidiennement et toute détérioration importante donnera lieu à des mesures adaptées. Gavage gastrique : Cette manipulation peut provoquer un stress transitoire et comporte de faibles risques mécaniques (lésion œsophagienne, fausse route).

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon les procédures réglementaires. 676 animaux ayant participé à l’étude (régimes alimentaires spécifiques, gestation, prélèvements sanguins, phénotype intestinal inflammatoire, etc.) seront également euthanasiés à la fin de leur suivi. 144 animaux auront reçu une infection contrôlée par une bactérie dans le cadre de l’étude. Ils seront aussi euthanasiés en fin d’expérience.

Remplacement

Des premières expériences ont été menées sur des cellules en laboratoire, ce qui a permis de montrer que le cholestérol influence bien le développement des cellules immunitaires. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’une grossesse, avec ses nombreuses interactions entre la mère et l’embryon. Pour comprendre comment l’alimentation de la mère agit sur le système immunitaire du fœtus, l’utilisation de souris gestantes est indispensable, car il n’existe pas d’alternative permettant de recréer fidèlement ces conditions.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au strict nécessaire, calculé à partir de données préliminaires pour garantir des résultats fiables, ainsi que grâce à des approches statistiques. Les croisements seront organisés pour obtenir le plus d’embryons possibles par portée. L’utilisation de lignées transgéniques déjà existantes évite de créer de nouvelles souches, ce qui limite le nombre total d’animaux. Enfin, loger les mâles seuls entre les accouplements améliore les chances de réussite tout en réduisant le stress et le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Tout sera mis en œuvre pour garantir le bien-être des animaux. Les souris seront logées en groupes, dans des cages spacieuses et enrichies avec du coton ou du matériau pour faire des nids, ce qui encourage leurs comportements naturels et limite le stress. La température, l’humidité, la lumière et le bruit seront contrôlés pour créer un environnement stable et calme. Les manipulations seront effectuées uniquement par du personnel expérimenté. Les régimes alimentaires choisis ont été testés pour ne pas nuire au bien-être ou au comportement des animaux. Tous les animaux seront surveillés chaque jour, et en cas de signe de souffrance ou de perte de poids (décrits rigoureusement dans un tableau de score), une prise en charge rapide sera assurée selon des règles strictes.

Choix des espèces

Les souris sont le modèle idéal pour étudier comment l’alimentation de la mère influence le développement du système immunitaire chez le bébé. Elles sont utilisées pour plusieurs raisons : Leur génome est très proche de celui de l’humain (environ 85 % identique), ce qui rend les résultats pertinents pour mieux comprendre ce qui pourrait se passer chez l’être humain. Elles se reproduisent rapidement (grossesse de 3 semaines) et donnent naissance à plusieurs petits à la fois, ce qui permet d’étudier facilement l’effet de l’alimentation sur plusieurs générations. Certaines lignées de souris ont été génétiquement modifiées, ce qui permet de suivre précisément le développement de certaines cellules immunitaires ou de mimer des maladies humaines comme l’excès de cholestérol. Les animaux seront étudiés à différents moments de leur développement : les embryons et les fœtus avant la naissance, et les jeunes et adultes après la naissance, pour observer comment se forment et mûrissent les ganglions lymphatiques et comment l’alimentation de la mère peut influencer l’immunité intestinale à long terme. Leur environnement est entièrement contrôlé, ce qui garantit des conditions stables et des résultats fiables. Leur placenta fonctionne de manière similaire à celui des humains, ce qui renforce la pertinence de ce modèle pour comprendre les effets de la nutrition pendant la grossesse. En résumé, utiliser des souris permet d’obtenir rapidement des informations précieuses, dans un cadre bien contrôlé, et avec des outils très précis pour mieux comprendre le lien entre alimentation maternelle et santé future de l’enfant.

Immunisées à trois reprises par voie sous-cutanée, nasale ou orale, puis infectées par Clostridioides difficile après un gavage antibiotique qui détruit leur flore intestinale, 432 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue en raison de leur infection. Les diarrhées attendues durent deux à trois jours, avec des pertes de poids de 5 à 15 %, et les selles sont recueillies tous les deux jours pendant tout l'essai. L'enjeu est de tester des candidats vaccins déjà évalués in vitro et in silico, dont un essai préliminaire chez la souris n'avait montré qu'une efficacité partielle. Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire sont annoncés au nombre de cinq pour quatre dates listées, et de quatre dans la rubrique des atteintes, sans que le texte lève la différence.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser une évaluation préclinique de leur efficacité in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire suite aux vaccinations. Des essais préliminaires in vivo en modèle murin ont montré qu’administré seul par voie parentérale les antigènes étaient capables d’induire une efficacité vaccinale partielle. L'objectif de ce projet est d’améliorer cette efficacité vaccinale in vivo par une vectorisation des candidats vaccins dans des vecteurs viraux, de les combiner et de tester plusieurs schémas vaccinaux (voie parentérale et/ou voie muqueuse). Les animaux seront immunisés à trois reprises. Le statut immunitaire des animaux sera vérifié avant et après immunisation afin d'évaluer l'efficacité des différents candidats vaccinaux testés. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la colonisation intestinale par C. difficile (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux) une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire spécifique analysée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ces essais sont d’un intérêt majeur. C. difficile a été classée comme «menace urgente» dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. En effet, le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Notre approche vaccinale permettrait à moyen terme de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire est induite lors de ces essais de vaccination, la bactérie sera limitée dans son développement et les symptômes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles. L’analyse de la réponse immunitaire suite à des immunisations est réalisable uniquement in vivo, aucun système in vitro ne permet d’évaluer cette stimulation par un antigene du système immunitaire dans sa globalité. Le développement à moyen terme d’un vaccin ciblant les infections à C. difficile permettrait de reduite l’incidence des infections, leur cout mais également de réduire le risque majeur de développement d’antibio-resistance grâce à une reduction notable du recours aux antibiotiques.

Procédures

Le modèle nécessite différents types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée (anesthésie locale), nasale (qui dure moins de 10 secondes par animal),ou orale, immunisation ou administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale. De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours après infection, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement, 5 prélèvements à J-3, J13, J28 et J45. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.

Impact sur les animaux

Le modèle nécessite plusieurs types d’actes expérimentaux réalisés sur animaux vigiles à savoir 3 immunisations : injections par voie parentérale (sous-cutanée) ou administration par voie muqueuse (nasale ou orale), 1 injection intrapéritonéale d’un antibiotique pour l’induction d’une dysbiose, l’administration par voie orale de C. difficile et 4 prélèvements sanguins par voie submandibulaire. Les injections entrainent une douleur légère. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poids initial est généralement observé 4 jours après l'infection. La procédure d’immunisation, d’induction de la dysbiose et la procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.

Devenir

En raison de leur infection par une bactérie pathogène, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Plusieurs tests in silico, in vitro et in vivo ont permis d'évaluer l'intérêt des antigènes vaccinaux sélectionnés. La méthode de vectorisation dans des vecteurs viraux a déjà démontré son efficacité dans d’autres modèles de vaccination. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. Les interactions entre l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de les reproduire dans leur intégralité.

Réduction

Des tests in silico et in vitro ont présélectionné les antigènes candidats selon trois critères : conservation entre souches de C. difficile, pouvoir immunogène et présence membranaire, réduisant ainsi le nombre de tests in vivo. Critère de jugement principal et calcul d'effectif Le critère principal est le score clinique , couramment utilisé dans les modèles murins d'infection à C. difficile. Une différence de 3 points entre groupe vacciné et contrôle est cliniquement pertinente. Le calcul indique 12 animaux/groupe. Procédure 1 : 144 animaux (12 groupes × 12 animaux) Procédure 2 : 288 animaux maximum (24 groupes × 12 animaux). Cette planification garantit des résultats conclusifs en une seule expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement par examen clinique incluant : Évaluation du score clinique (posture, activité, aspect du pelage, diarrhée) selon une grille définie, pesée quotidienne, état d'hydratation (test du pli cutané). Concernant la traçabilité : Toutes les observations seront consignées individuellement dans des fiches de suivi quotidiennes. Dès l'apparition de diarrhée ou perte de poids, nous procèderons à l’administration de DietGel. Une euthanasie anticipée sera réalisée en cas d’atteinte des points limites.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile. Les animaux, âgés de 4 semaines, seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine.

Neuf mesures de pression artérielle et trois échocardiographies par animal, plus la pose sous la peau du dos d'une pompe osmotique : 5 148 souris mâles vont être utilisées, 3 822 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 326 d'un niveau modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la rate, du rein, du cœur, de la moelle osseuse et du sang. Des injections intrapéritonéales et sous-cutanées leur provoquent un sepsis, avec un état fébrile de plusieurs heures, une perte de poids et une baisse d'activité. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles étant selon lui relativement protégées du sepsis par les œstrogènes. Il affirme avoir réduit les effectifs "à son minimum" grâce à des analyses statistiques, sans donner ni calcul ni taille de groupe pour ces 5 148 souris.

Objectifs

Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le coeur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.

Bénéfices attendus

La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre, à court terme, un meilleur suivi de ces patients, et de dégager de nouvelles thérapeutiques à plus ou moins long terme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections (intra-péritonéales et sous-cutanées) pour générer l’état de sepsis et faire varier la réponse inflammatoire au cours des 14 premiers jours de la procédure. Ces injections sont peu douloureuses et sont réalisées en quelques minutes. Une chirurgie quelques jours plus tard permettra la pose sous cutanée d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie en début de procédure, avant la chirurgie et au moment de la mise à mort de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle non invasive sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant le début de la procédure pour habituer l’animal, puis au moment de la chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la chirurgie (9 fois 10 minutes). Pour les animaux élevés au sein de l'établissement, une biopsie de queue est réalisée dans les premiers jours de vie (10 à 15 jours) pour nous assurer de leur conformité génétique. Ces biopsies sont réalisées en moins d’une minute par un expérimentateur qualifié.

Impact sur les animaux

L’induction d’une infection septique induit un état fébrile qui perdure plusieurs heures. Un traitement antibiotique sera administré durant les premiers jours pour limiter la fièvre. La perte de poids et une diminution de l'activité sont des complications attendues, et reviennent à la normale en quelques jours. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress pour l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure. La pose de pompe sous la peau du dos est un acte chirurgical qui comporte peu de risques pour l’animal, mais peut occasionner une gêne pour celui-ci. Pour caractériser génétiquement les animaux du projet, une biopsie unique à la queue est effectuée 10 à 15 jours après la naissance. C’est un acte peu douloureux et qui ne met pas en jeu la survie de l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Afin de réduire les nuisances causées par l’induction du sepsis, une antibiothérapie sera mise en place les premiers jours. La chirurgie ser fera sur animal anesthésié et analgésié.

Choix des espèces

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.

Aucune connaissance ne sort de ce projet : 600 souris sont utilisées pour entraîner du personnel aux gestes d'injection, de prélèvement sanguin et d'administration par voie orale, nasale ou trachéale. 450 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et 150 un niveau modéré, chacune tuée dès le geste appris. Les prélèvements peuvent provoquer des hématomes, les injections une douleur locale que l'animal signale en se léchant ou en se mordant, et le porteur précise que les actes se font sous anesthésie générale sans analgésie prévue. Il affirme que les rongeurs en plastique existants ne suffisent pas, puisqu'il faut un animal vivant pour un prélèvement rétro-orbital et une souris qui respire pour qu'une instillation intra-nasale soit efficace.

Objectifs

L’objectif du projet est de former les personnes aux gestes techniques des différents types d’injections, de prélèvements et d’administration de substances par différentes voies afin d’assurer le bon déroulement des protocoles expérimentaux en termes scientifique et de bien-être animal. Il s’agit d’un renouvellement de projet. La formation sera dispensée par des personnels 'tuteurs' de l’unité bien formés à ces gestes et sensibilisés au bien-être animal.

Bénéfices attendus

La maîtrise des gestes est un prérequis pour le succès des futures procédures d’expérimentation animale du laboratoire, destinées à faire progresser les connaissances pour identifier des pistes thérapeutiques en santé humaine à moyen terme. La formation permettra aussi de faire en sorte que la manipulation des animaux soit effectuée selon les bonnes pratiques en termes de bien-être animal. Il s’agit du renouvellement d’un projet. Les bénéfices obtenus du précédent projet comprennent la formation de 3 nouveaux personnels sur contrat, 1 doctorant et de 2 personnels permanents.

Procédures

Il est prévu un prélèvement de sang (maximum 5 minutes/souris) ou une administration (maximum 5 minutes/souris) sur animaux anesthésiés ou vigiles selon le cas et les bonnes pratiques vétérinaires.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus concernent principalement les prélèvements sanguins pouvant générer des hématomes. Les injections peuvent occasionner une douleur localisée au point d’injection qui pourra être détectée si l'animal a tendance à se lécher ou se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les administrations, intra-nasale ou intratrachéales, réalisées sous anesthésie, et le gavage ne devraient causer qu’une gêne passagère. Si l’animal est en souffrance au cours de la procédure, il sera mis à mort. Il s’agit d’un projet renouvelé, sans nuisances relevées lors du précédent projet, la majorité des actes étant réalisés sous anesthésie et de gravité légère.

Devenir

Dans cette DAP ‘Formation aux gestes techniques spécifiques’ nous limitons le nombre de geste par animal, l’animal est donc mis à mort une fois la formation au geste réalisée.

Remplacement

Ce projet est à visée de formation du personnel aux bons gestes techniques expérimentaux sur la souris afin de réaliser les protocoles de recherche avec compétence. Même si des rongeurs en plastique ont été développés pour permettre certains aspects de la formation à l’expérimentation animale, leur utilisation est limitée pour apprendre la maîtrise des gestes techniques de prélèvements sanguins, d’injections ou d’administration par voie orale, intra-nasale ou intra-trachéale. En effet, l’utilisation de rongeurs en plastique n’est pas possible puisqu’il est nécessaire d’avoir un animal vivant pour réaliser un prélèvement sanguin rétro-orbital ou sub-mandibulaire, il faut que la souris respire pour que l’instillation intra-nasale soit efficace, et il faut ouvrir la bouche de la souris pour effectuer l’administration par gavage ou intra-trachéale. De plus il n’est pas possible de vérifier que le volume injecté est allé directement dans les poumons par coloration avec le bleu Evans sur un rongeur en plastique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour acquérir la maîtrise du geste. Ainsi il est estimé qu’une répétition, soit 2 fois 5 animaux par groupe, sera nécessaire. Les animaux utilisés seront issus de l’élevage ne pouvant pas être utilisés pour les projets de recherche.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être et suivis avant et pendant l’expérimentation afin d’éviter au maximum la douleur et le stress au moment de l’expérimentation. Les dommages attendus pour l’animal sont limités, les gestes se faisant sous anesthésie générale, sans analgésie prévue, et les animaux étant mis à mort juste après le geste technique ou dès l’atteinte des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris permettra l’apprentissage des gestes techniques - Les souris (consanguines ou génétiquement modifiées) âgées de 2 à 10 mois seront utilisées dans ces études. - L’établissement utilisateur où se situe notre laboratoire, utilise principalement des souris, ce qui nous donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 2 mois et 10 mois) qui correspond à l’âge des animaux étudiés dans les protocoles de recherche.