Système immunitaire
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Etude des mécanismes des réponses immunitaires spécifiques du poisson-zèbre contre des agents infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont anesthésiés puis injectés, ou plongés deux à quatre heures dans un bain contenant l'agent infectieux, certains subissant ensuite une épreuve virulente destinée à mesurer si le vaccin protège. L'infection peut provoquer une nécrose au point d'injection, une perte d'appétit, une nage erratique et la mort, et les résultats intéressent autant la recherche sur les maladies humaines que les industriels de l'aquaculture, avec une mise sur le marché en perspective. Le porteur formule le tout ainsi : "pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre", il sera nul chez les témoins et sévère chez les infectés.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses repose sur la caractérisation de l’agent pathogène (nature, propriétés de virulence…) et de la réponse de l’animal infecté, par une combinaison d’approches expérimentales menées in vitro en culture cellulaire et in vivo chez l’animal. La complexité des mécanismes engagés nécessite la reproduction expérimentale des maladies étudiées. Cela nous permet d’aborder des études de virulence des agents pathogènes causant les infections. Ces études sont effectuées dans une perspective de comparaison entre les agents émergents qui affectent les élevages et ceux qui causent des maladies chez l’Homme. Nous disposons de multiples modèles d’infections du poisson zèbre par des agents pathogènes de poissons ou de mammifères. Les infections par injection permettent de contrôler finement la dose de pathogène administrée à chaque poisson et constituent donc un modèle d’infection reproductible. Les infections par balnéation restent une alternative importante pour reproduire la voie naturelle d’infection des poissons. Les protocoles engagés peuvent être associés à des vaccins et à des prélèvements de matériel biologique après euthanasie des animaux pour caractérisation de la réponse immunitaire induite par les infections. Les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes quand il n’existe pas de vaccin efficace. Pour limiter leur utilisation et les risques associés, la mise au point de stratégies alternatives de lutte faisant appel à des immunostimulants est une solution possible pour améliorer les performances de l’aquaculture. Les objectifs de ce projet sont donc, en utilisant le poisson zèbre (1) de caractériser les mécanismes des réponses immunitaires des poissons lors d’infections par des virus ou des bactéries, (2) d’évaluer les effets protecteurs des vaccins et de comprendre les réponses immunitaires qu’ils induisent chez ces espèces, et (3) d’évaluer la capacité de nouvelles stratégies d’immunostimulations à augmenter la résistance à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique (Flavobactérie, virus responsable de la septicémie hémorragique virale (SHV), virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI), …).
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension des mécanismes de réponses à l’immunisation - Compréhension des mécanismes de la pathogenèse associée aux infections - Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus chez le poisson zèbre - Evaluation des effets immunostimulants et/ou protecteur des différentes conditions pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour valider les modèles d’étude des maladies infectieuses, des mécanismes de réponses associés, et des stratégies de prévention ou de lutte contre ces maladies. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères et qui peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une injection est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. L’immunisation des poissons par injection implique une ou deux injections (si rappel nécessaire) effectuées sous anesthésie. Le cas échéant, les prélèvements de mucus sous anesthésie seront effectués une ou deux fois, à un intervalle de temps d’au moins 3 jours. L’anesthésie associée est courte (de l’ordre de la minute) comme pour les injections. L’immunisation des poissons par balnéation implique une séance de 2 à 4 heures éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire, l’injection nécessite une anesthésie de 1-2 minutes. Les infections par injection ou par bain correspondent à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène. Dans le cas d’épreuve virulente post immunisation, pour tester l’efficacité d’un vaccin, l’infection correspond à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène.
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre, il sera nul chez les contrôles non infectés, très modéré chez les animaux immunisés et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. Le niveau de douleur sera modéré chez les animaux vaccinés/immunostimulés et protégés, même après infection. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension de la pathogenèse liée à l’infection, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des lymphocytes B ou T responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par les lymphocytes B ou T, ou l’efficacité d’un vaccin/immunostimulant lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
Les infections par balnéation ou par injection, et les expériences de vaccination/immunostimulation permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différents génotypes, différents agents infectieux, différents protocoles d’immunisation/immunostimulation, etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie et de réponses entre les conditions dépendent de l’homogénéité des réponses et de la mortalité, et sont calibrés sur la base de notre connaissance de la sensibilité du poisson zèbre à chaque virus, chaque fois que cela est possible. Les groupes peuvent être de 10 à 15 individus, selon les informations disponibles. Les effectifs sont fixés pour l’obtention de résultats statistiquement représentatifs permettant d’apporter des résultats interprétables dans nos études. Des tests statistiques sont utilisés La taille des groupes (10-15 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus. Un effectif minimal de 15 poissons permet de mettre en évidence une protection qui doit assurer 90 à 100% de survie pour une vaccination efficace. Par ailleurs, les groupes de 15 poissons permettent d’évaluer la mortalité induite par un agent pathogène chez des poissons non vaccinés ou stimulés, en utilisant un minimum d’animaux et en gardant des conditions d’effectif standardisées. Cet effectif permet de réaliser des prélèvements en nombre suffisants pour étudier la réponse immunitaire induite par une immunisation, une infection, ou une vaccination/stimulation chez les survivants. Un effectif de 10 à 15 permet en effet, pour un même groupe de poissons, de consacrer 3 à 5 poissons entiers à des expériences d’histologie et 7 à 10 à des prélèvements de tissus pour des études d’expression ; il doit être noté que la taille du poisson zèbre peut imposer pour certains tissus, de réaliser des pools de prélèvements de 2 individus. Des groupes de 10-15 individus permettent donc de travailler dans des conditions reproductibles (même taille de groupe, mêmes conditions expérimentales par exemple, même taille d’aquarium), et correspondent à des effectifs minimums, des groupes plus petits ne permettraient pas de fournir, de manière systématique et standardisée, les échantillons et informations requises pour nos projets de recherche. Ainsi ces effectifs permettent une utilisation optimale des animaux.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. L’enrichissement mécanique dans ce type d’expérimentation n'est sera pas sans impact sur les résultats (blessure avec voie d’entrée du pathogène, difficulté d’observation des poissons situés dans les caches, développement de biofilm, …). Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La transparence des premiers stades de développement de cette espèce facilite la mise en œuvre des techniques d’imagerie in vivo. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires contre des agents infectieux, dans ce modèle. Pour l’étude des réponses immunitaires spécifiques et de la protection vaccinale/immunostimulant, le système immunitaire des poissons doit être mature, et ils sont donc utilisés au stade adulte, à 4-6 mois. L’étude des réponses immunitaires innées et de la pathogenèse sera effectuée à différents stades, chez les juvéniles (3 à 8 semaines) et chez l’adulte (4-6 mois)
Développement et évaluation de vaccins à ARNm contre les agents pathogènes mycobactériens
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 823 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie après avoir été infectée. 2 571 relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole commence par une encoche dans l'oreille, se poursuit par deux ou trois injections de vaccin à ARN espacées de quatorze jours et des prises de sang, puis par l'inoculation d'une mycobactérie dans la queue, qui provoque une inflammation locale. Le porteur annonce "peu d'effets indésirables" et un "inconfort léger de courte durée", et justifie l'effectif par une "vaste expérience" d'études in vivo validée par des biostatisticiens, sans donner le calcul.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester et de développer de nouveaux vaccins contre des mycobactéries. Ces agents pathogènes constituent une préoccupation croissante pour la santé mondiale en raison de leur résistance aux antibiotiques et de leur propagation continue. L'infection par ces agents pathogènes entraîne une morbidité à vie chez les personnes immunodéprimées, et leur traitement est extrêmement coûteux, long et complexe. Il est urgent de mettre en place de nouvelles stratégies pour prévenir l'infection et réduire l'impact de ces agents pathogènes sur la population mondiale, comme la vaccination. Le besoin de vaccins contre ces agents pathogènes reste non satisfait à ce jour, et il est urgent de mieux comprendre les corrélats immunologiques de protection contre chacune de ces infections. Cette demande concerne l'analyse fonctionnelle de la réponse immunitaire induite par la vaccination et la détermination de l'efficacité des vaccins à ARN contre le développement des infections mycobactériennes. Le projet a pour objectif de développer de nouveau vaccins en utilisant certains progrès technologiques permettant la découverte et la caractérisation non ciblée de nouveaux antigènes bactériens très certainement reconnus par le système immunitaire lui permettant de contrôler l’infection, et d’inclure ces antigènes dans des vaccins à base d’ARN. Le projet est donc de produire des vaccins ARN permettant l’expression des antigènes de ces mycobactéries et de tester l’efficacité de ces vaccins dans des modèles animaux. Les bénéfices du projet seront la production de vaccins protecteurs efficaces contre ces mycobactéries. Une fois défini, ces vaccins pourront être testés dans des essais cliniques chez l’Homme. Il est prévu dans le projet de tester une vingtaine de candidats vaccins pour chacun des pathogènes dans des expériences de protection chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des bénéfices de santé publique à court et long terme grâce au développement de nouveaux vaccins à ARN ciblant trois importantes mycobactéries non tuberculeuses (MNT). Ces agents pathogènes sont responsables d'infections graves, en particulier chez les personnes immunodéprimées ne disposant actuellement pas de traitement efficace. Bénéfices à court terme : 1. Avancement scientifique dans le développement de vaccins Le projet permettra l'identification et les tests précliniques de nouvelles cibles antigéniques pour le développement de vaccins à ARN. Il favorisera également le développement d'un nouveau processus de développement de vaccins contre les agents pathogènes mycobactériens, et pourrait être appliqué à divers agents pathogènes bactériens. 2. Évaluation des réponses immunitaires et de la protection En évaluant systématiquement les réponses immunitaires et l'efficacité protectrice dans un modèle murin, le projet identifiera les antigènes des agents pathogènes mycobactériens conduisant à une immunité protectrice. Ces connaissances amélioreront également notre compréhension des interactions hôte-pathogène pour les infections étudiées. De plus, l'étude des réponses immunitaires permettra de mieux comprendre les corrélats immunitaires de la protection contre ces pathogènes. 3. Innovation collaborative L'implication de laboratoires européens de premier plan, dotés d'expertises complémentaires, garantit un échange rigoureux de méthodologies et de connaissances. Bénéfices à long terme : 1. Développement de nouveaux vaccins contre les maladies négligées L'objectif ultime d'identifier les candidats vaccins les plus performants pourrait conduire à de futurs essais cliniques et, à terme, à la mise au point de vaccins humains efficaces. 2. Impact sur la santé publique La réduction de l'incidence et de la gravité des infections à MNT grâce à la vaccination pourrait réduire le recours à des traitements antibiotiques de longue durée, souvent mal tolérés et favorisant l'apparition de résistances aux antibiotiques.
Procédures
Toutes les souris utilisées dans ce protocole seront marquées par encoche à l’oreille prenant quelques secondes. Pour les animaux vaccinés, 2 à 3 injections de vaccins prenant une dizaine de secondes par animal. Les injections sont espacées de 14 jours. Si 2 à 4 prélèvements sanguins s’avéraient nécessaires pour nos analyses à deux semaines d’intervalle, ils prendront quelques secondes par animal. Pour certains animaux vaccinés, une injection sera réalisée prenant une dizaine de seconde par animal. L’injection pour l’infection sera réalisée à l’aide d’un dispositif de contention prenant une trentaine de seconde par animal. L’imagerie sera réalisée une fois par semaine après l’infection sous anesthésie et durera une quinzaine de minutes (8 séances d’imagerie au maximum sont prévues). Une autre infection sera réalisée sous anesthésie et ne prendra que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Pour ces études, nous prévoyons peu d'effets indésirables chez les souris. Les animaux reçoivent deux ou trois doses de vaccin, ou une dose de BCG (le vaccin antituberculeux Bacille Calmette Guérin). Il est maintenant reconnu que les vaccins à base d’ARN ou l’injection du BCG n’entrainent qu’un inconfort léger de courte durée sur le site d’injection lié à l’introduction de l’aiguille lors de la vaccination. Dans certains cas rares, les souris présentent une légère réaction inflammatoire localisée au site d’injection suite à la vaccination par les vaccins ARN. Un petit volume de sang sera prélevé une semaine après chaque vaccination et une semaine après l’infection. Les processus de prélèvement sont courts et n’engendreront qu’un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille. Ces prélèvements seront espacés de deux semaines pour faciliter leur récupération. L’infection des souris par des mycobactéries par voie sous-cutanée engendrera lui aussi un inconfort léger de courte durée lié à l’introduction de l’aiguille au niveau de la queue. Une inflammation pourra être observée au niveau du site d’injection. L’infection des souris sous anesthésie n’engendrera qu’un inconfort léger de courte durée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux. Ces organes ne pourront être prélevés qu’après mise à mort de l’animal.
Remplacement
Ce projet vise à tester l'immunogénicité et l'efficacité protectrice de différentes formulations de vaccins contre divers agents pathogènes. Toutes les hypothèses pouvant être testées in vitro, telles que l'activation des cellules immunitaires ou l'expression de molécules vaccinales, seront d'abord vérifiées à l'aide de lignées cellulaires ou de cellules sanguines. En effet, ces tests invitro permettent d'analyser certaines composantes de la réponse immunitaire à la vaccination. Cependant, aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement le développement de l'infection ou sa physiopathologie associée car il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. Les bénéfices potentiels des vaccins dans la prévention et le contrôle de l'infection, notamment leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice, ne peuvent être évalués de manière fiable que dans un organisme vivant, rendant ainsi l'utilisation d'un modèle animal indispensable pour leur analyse et leur validation.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est basé sur une vaste expérience d’études in vivo pour des modèles d’infection et a été validé par des biostatisticiens. Le nombre d’animaux par groupe a ainsi été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs par l’utilisation de tests statistiques adaptés en fonction des expériences et des groupes analysés en prenant en compte la variabilité attendue de chaque paramètre et des expériences pilotes qui nous permettront d’évaluer la dispersion des valeurs individuelles au sein des groupes. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, 6 souris par groupe seront utilisées et deux expériences indépendantes, l’une avec des souris femelles et l’autre avec des souris mâles, seront réalisées. Si des différences entre les sexes est observée, une expérience supplémentaire comprenant des femelles et des mâles sera réalisée sur les vaccins les plus efficaces. Par ailleurs, nos protocoles visent à extraire un maximum d'informations de chaque animal en utilisant plusieurs techniques. Nous prélèverons tous les organes d’intérêt et un important volume de sang de tous les animaux de l’étude pour tirer parti de toutes les informations que peuvent nous apporter les animaux utilisés. Nous utiliserons des techniques expérimentales novatrices qui nous permettront d’analyser sur un seul individu de multiples facteurs d’intérêt pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé maximisant ainsi les données tout en minimisant le recours aux animaux. Les études approfondies d'immunogénicité ne seront menées que sur les candidats vaccins les plus prometteurs afin de réduire davantage le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer le bien-être animal : - Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur nouvel environnement de deux semaines - Pour les souris vaccinées, après la vaccination, un léger massage est réalisé pour permettre la dispersion du vaccin. En cas de réaction inflammatoire au niveau du site d’injection, un traitement local sera réalisé. - Pour les souris infectées, l’infection va engendrer une inflammation localisée sur la queue au niveau du site d’injection. La zone inflammée sera massée avec de l’eau tiède pour soulager l’inflammation. Une litière plus douce à base de cellulose pourra être utilisée. -Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront réhydratés avec une solution de sérum physiologique pour faciliter leur récupération. - Nous avons choisi les temps d’expérience suite à l’infection pour que les animaux ne développent pas la pathologie associée et qu’ils ne soient pas susceptibles de développer des signes d’inconfort et de souffrance. Néanmoins, les animaux seront évalués une à deux fois par semaine. En cas d’apparition de signes d’inconfort des croquettes humides et du gel hydrique seront ajoutés et la surveillance renforcée à trois visites par semaine. Si des signes de souffrance sont détectés, l’animal sera réhydraté avec du sérum physiologique par voie sous-cutané et surveillé une fois par jour. Si les signes persistent pendant plus de 24h, l’animal sera mis à mort. - Si nécessaire, d’autres moyens de raffinement pourront être utilisés pour améliorer le bien-être des animaux comme une augmentation de l’enrichissement et le chauffage des cages.
Choix des espèces
Le modèle murin représente le meilleur compromis éthique parmi les modèles mammifères, avec des résultats proches de ceux de l'homme. Le système immunitaire de la souris est bien caractérisé et largement comparable à ceux de l'homme. De plus, le modèle murin a été largement utilisé pour la recherche sur les réponses immunitaires aux mycobactéries et sur les vaccins. Chacun de ces modèles d'infection a été précédemment publié dans d'autres laboratoires. Par conséquent, les résultats obtenus peuvent être facilement mis en contexte avec la littérature existante et avec nos connaissances préalables sur ces agents pathogènes. Le modèle murin, largement utilisé dans la recherche sur les maladies infectieuses, présente également l'avantage de disposer d'un large éventail de techniques adaptées et de réactifs. Cela nous permet de réaliser des analyses sur un plus large éventail de facteurs, avec un faible échantillonnage de souris. Des souris adultes âgées de 2 mois seront utilisées. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé et nous permet d'évaluer la réponse vaccinale.
Mécanismes contrôlant l’ontogenèse et les fonctions des cellules de la microglie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Toute souris qui perd du poids ou montre un signe de maladie est soignée ou mise à mort sur décision du vétérinaire. 1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre, cinq ou neuf injections dans l'abdomen, dont un agent inflammatoire pour certaines, et passent une batterie de huit épreuves : locomotion en milieu nouveau pendant quarante minutes, reconnaissance d'objets, coordination motrice, trente-deux heures d'enregistrement de l'activité nuit et jour, six minutes de nage, une semaine de test de préférence pour une boisson sucrée. Le porteur écrit que "les expériences menées ici sont indolores" et qualifie les tests de non aversifs, sur un projet déclaré en souffrance modérée pour la totalité des animaux.
Objectifs
La vitamine A est une molécule très importante impliquée dans diverses fonctions vitales chez les vertébrés, notamment le développement, la croissance et l'homéostasie. La perturbation de la signalisation de la vitamine A chez l’humain ou dans les modèles murins entraîne un comportement de type dépressif et pourrait être associée à la neurodégénérescence. Bien que plusieurs études montrent que les cellules microgliales (MGC), cellules immunitaires résidentes du cerveau, sont impliquées dans les comportements dépressifs et les troubles neurologiques qui y sont associés, aucune étude n'a établi le lien entre la signalisation par la vitamine A et les MGC. Afin de combler cette lacune, nous avons développé des lignées de souris génétiquement modifiées qui nous permettent de perturber la signalisation de la vitamine A spécifiquement dans les MGC. Ce projet vise à comprendre l'importance de la signalisation de la vitamine A dans le développement des MGC et ses fonctions dans le cerveau de la souris adulte. Les résultats du projet ouvriront de nouvelles voies en matière de thérapeutique pour différents troubles neurodégénératifs en ciblant spécifiquement les MGC et leur capacité à sauver les fonctions cérébrales.
Bénéfices attendus
Les données de la recherche ont montré que certains récepteurs de la vitamine A se trouvent dans des types spécifiques de cellules microgliales - des cellules immunitaires qui vivent dans le cerveau - à différents stades du développement. D'autres études ont suggéré que les cellules microgliales sont impliquées dans les comportements liés à la dépression, et nous avons constaté que lorsque certains récepteurs des rétinoïdes sont inactivés chez les souris, les animaux présentent des comportements similaires à la dépression ou des signes de neurodégénérescence. S'il est prouvé que ces récepteurs jouent un rôle important dans d'autres cellules immunitaires (comme les macrophages), peu de recherches ont été menées sur la façon dont ils affectent directement les cellules microgliales, qui sont essentielles à la santé du cerveau. Au début de la vie, les cellules microgliales contribuent au développement du cerveau et à la formation de différents types de cellules cérébrales, tandis qu'à l'âge adulte, elles protègent le cerveau et aident à maintenir l'équilibre des fonctions cérébrales. Ce projet vise à explorer le rôle et la chronologie de ces récepteurs dans le développement et la fonction microgliale, à la fois pendant la croissance du cerveau et dans le cerveau adulte. Les résultats pourraient nous aider à mieux comprendre comment la vitamine A pourrait être utilisée dans le traitement des maladies neurodégénératives, où les cellules microgliales jouent un rôle clé dans la réponse aux lésions cérébrales et à l’évolution de la maladie.
Procédures
Injections intra-péritonéales : selon le groupe expérimental, 4 injections ou 5 injections (1 injection par jour successif). L'injection ne dure qu'une dizaine de secondes entre le moment où l'animal est saisi et le moment où le produit est injecté. Seul un sous-groupe d’animaux recevra en tout 9 injections (4 injections successives à 8 semaines d’âge, 5 injections successives à 12 semaines d’âge). Tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 : 40 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 : 2 x 20 minutes, reconnaissance d’objets nouveaux, test 3 : 5 minutes, évaluation de la capacité d’exploration, test 4 : 3 x 5 minutes, coordination motrice, test 5 : 32 heures, mesure de l’activité spontanée nuit/jour, test 6 : 6 minutes, activité natatoire, test 7 : 1 semaine, évaluation de la préférence à une boisson sucrée, test 8 : 5 minutes, activité de toilettage.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux à effectuer ne sont pas susceptibles de causer des souffrances mais certains peuvent occasionnellement causer du stress. Dans ce but, l’ordre des tests est établi du moins stressant au plus stressant et certains tests nécessitant une isolation temporelle ou du contact avec de l’eau seront effectués à la fin de la batterie de tests comportementaux. Les effets stressants de l’isolation seront négligeables grâce à la réduction de temps d’isolation à la nuit, et le temps limité de durée du test de préférence à la boisson sucrée. Les injections peuvent provoquer une légère douleur et un stress chez l'animal et seront minimisées par utilisation d’aiguille très fines. Dans les cas d’injection d'agent inflammatoire, un état d'inflammation légère et transitoire sera provoqué.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de collecter du matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui complèteront les résultats obtenus à partir du comportement.
Remplacement
Le modèle murin ne peut être remplacé, et reste indispensable pour évaluer l'impact des mécanismes biologiques sur les cellules microgliales, et pour étudier leurs effets sur le cerveau dans son ensemble. La complexité biologique du cerveau et de son environnement ne permet pas de le remplacer par des modèles mathématiques ou in vitro, car ils ne reflètent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, la taille des groupes expérimentaux (n=6/condition) correspond au nombre minimum d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les exigences de réduction. De plus, nous utilisons les deux sexes pour éviter de produire inutilement des femelles. En l'absence de différences, nous regrouperons les données des deux sexes pour une même condition expérimentale. Ces effectifs ont été déterminés en fonction des données de la littérature et des procédures en vigueur dans l'animalerie.
Raffinement
Les injections seront réalisées par un manipulateur expérimenté et avec une aiguille fine. Les expériences menées ici sont indolores et réalisées par un personnel compétent et qualifié. Elles consistent uniquement en des études comportementales qui servent à mettre en évidence des dysfonctionnements d’origine neurologique. Les animaux seront méticuleusement surveillés quotidiennement, et leur poids sera vérifié une fois par semaine ou sur une base quotidienne si un signe de mal-être était detecté. Tout animal présentant une perte de poids ou des signes de pathologie ou de lésion sera traité selon décision du vétérinaire, ou mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la signalisation de la vitamine A dans les cellules microgliales et ses implications neurologiques, la souris est un modèle optimal en raison de la similitude des génomes de la souris et de l'homme et de la disponibilité de différentes lignées de souris portant des mutations génétiques ciblées qui couvrent tous les processus physiologiques, en particulier le développement neurologique et la neurodégénérescence. De plus, les mécanismes d'action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et divers traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d'action. Afin d'obtenir des résultats comparables et fiables, nous utiliserons des animaux d'âge similaire au moment des tests, à savoir 12 semaines d’âge post-natal, âge minimal reconnu par la communauté scientifique comme un stade « adulte » permettant d’obtenir des résultats fiables dans les études comportementales.
Identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les différences liées au sexe dans l’immunité
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Ovaires ou testicules retirés sous anesthésie, implant hormonal glissé sous la peau, injections jusqu'à trois fois par semaine, deux séances d'irradiation : 4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 2 620 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 1 480 d'un niveau modéré. Elles portent des modèles de sclérose en plaques avec paralysie de la queue et des pattes, d'asthme et de lupus avec inflammation de la peau et des reins, l'objet étant de comprendre pourquoi les maladies auto-immunes touchent davantage les femmes. Le porteur écrit que les animaux "récupèrent parfaitement" des castrations et annonce des douleurs abdominales modérées, sur un projet où plus de la moitié des souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Les objectifs de notre projet seront d'identifier ll'origine des différences liées au sexe dans l'immunité et les maladies associées. Les études porteront sur des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, une pathologie respiratoire (asthme) et les réponses immunitaires lors d’une infection virale. Dans chacune de ces conditions, des différences de susceptibilité entre sexes ont été démontrées. Nous étudierons notamment le rôle des hormones sexuelles (œstrogènes et androgènes) ainsi que celui des gènes portés sur les chromosomes sexuels.
Bénéfices attendus
Les maladies auto-immunes, mais aussi les allergies, sont plus fréquentes chez les femmes comparées aux hommes. Ce projet permettra de comprendre comment les hormones sexuelles et les gènes portés sur les chromosomes sexuels, influencent ces maladies. Une meilleure connaissance de ces maladies permettra ainsi d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques les exploitant.
Procédures
Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris mâle ou femelle - Implant sous la peau réalisée sous anesthésie générale ( 30 sec), dure moins de 5 min - - des injections (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine - - des prélèvements de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure - deux irradiations de moins de 4 minutes chacune
Impact sur les animaux
Une partie des animaux sera opéré pour retirer les ovaires ou les testicules. Les animaux récupèrent parfaitement de ces opérations. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. Certaines de nos modèles de souris développent spontanément une inflammation au niveau de la peau et des reins. Certains de nos modèles de souris miment une sclérose en plaques et ses caractéristiques telles qu'une paralysie de la queue et des pattes. Pour les animaux irradiés, nous surveillerons particulièrement les lésions cutanées (croûtes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. En effet, les animaux que nous utilisons vont subir des protocoles pour mimer les maladies humaines : sclérose en plaques et asthme par exemples. Pour étudier ces maladies, nous avons besoin non seulement d'évaluer l'état physique des animaux mais aussi d'analyser leur réponse immunitaire dans les organes malades (rein, peau, cerveau, poumon) et les organes de l'immunité (rate, ganglions) que nous prélèverons donc après leur mise à mort.
Remplacement
Les maladies que nous étudiont (ex: sclérose en plaques, asthme) ne peuvent pas être étudiées dans des modèles cellulaires in vitro et nécessitent l'utilisation d'animaux. En effet, ils impliquent plusieurs organes, par exemple dans la sclérose en plaques, à la fois le cerveau et la moelle épinière sont malades. De plus, nous étudions les réponses immunitaires de ces maladies. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (à des temps précis) et dans différentes parties du corps (organe malades, rate). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées in vitro.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles murins les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Notre expérience de ces modèles, que nous maitrisons au laboratoire depuis plusieurs années, nous a permis de conclure que le nombre minimal d’animaux est de 5 par groupe. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal.
Raffinement
Le change de la litière des souris est réalisé tous les 15 jours. Les cages seront systématiquement enrichies (coton, igloo, tunnel) pour leur permettre de faire un nid et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids. L'angoisse des animaux sera réduite par une période d'acclimatation à l'hébergement mais également par une habituation à la manipulation. Un protocole est mis en place avec la structure du bien-être animal (SBEA) de notre centre pour prévenir toute douleur, souffrance ou angoisse de l'animal. De plus, les procédures et le suivi de l'animal seront réalisés par des personnes compétentes, formées à l'expérimentation animale et maitrisant parfaitement les procédures ici décrites. Les animaux sont surveillés tous les jours par les zootechniciens du service, en accord avec la réglementation. A cela s'ajoutent des points limites qui ont été mis en place et qui seront appliqués pour éviter toute souffrance aux animaux. Les opérations chirurgicales des animaux seront réalisées selon des protocoles que nous maîtrisons et sous anesthésie générale. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie (qui dure moins de 5 min), les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 24 heures. Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Dans le modèle de sclérose en plaques, une modification de l’hébergement sera réalisée pour éviter l’inconfort des animaux qui commencent à être paralysés.
Choix des espèces
Les acteurs de la réponse immunitaire chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. De plus, nous utilisons des modèles de pathologie dont les signes cliniques sont très proches entre l'espèce humaine et la souris : lupus, sclérose en plaque, asthme... Les groupes expérimentaux seront analysés à l’âge de 8 semaines à 4-5 mois maximum. Les animaux sont de jeunes adultes mâles et femelles utilisés entre 8 et 16 semaines. Quand nécessaire, les souris subissent une castration (retrait ovaires ou testicules) à 4 semaines de vie avant maturité sexuelle, sinon les animaux sont utilisés entre 8 et 16 semaines, une fois la maturité de leur système immunitaire atteinte.
Révéler le rôle des cellules myéloïdes dans le développement du crâne et la protection immunitaire du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Injections intrapéritonéales et sous-cutanées à deux, quatre, six et neuf jours de vie, souriceaux sortis du nid et frottés à la sciure maternelle avant d'y être replacés sous lampe chauffante, puis prélèvements échelonnés de J9 à J60 : 2 400 souris vont être utilisées, dont 2 304 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un virus neurotrope qui déclenche une infection du système nerveux central, les animaux étant tués avant qu'elle ne devienne systémique. Le projet porte sur des canaux osseux du crâne par lesquels des cellules immunitaires rejoignent les méninges, et sur les conséquences d'une modulation de leur taille et de leur nombre. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever les tissus du crâne, des méninges et du cerveau, dont l'organisation entre eux est l'objet même de l'étude.
Objectifs
Les méninges, situées entre le cerveau et le crâne, constituent une plateforme de recrutement pour les cellules immunitaires et protègent le cerveau des infections. Notamment, après une infection par un virus neurotrope, nous avons observé que des cellules immunitaires se regroupent dans les méninges, sous les canaux osseux reliant le crâne à la moelle osseuse. Ceci suggère que des cellules de la moelle osseuse voyagent à travers ces canaux osseux vers les méninges pendant l'infection. Récemment décrits, ces canaux osseux sont depuis intensément étudiés, et il a été rapporté qu'ils sont cruciaux pour la communication entre le cerveau et la moelle du crâne que ce soit dans une situation physiologique mais aussi lors d'une inflammation comme lors d’un accident vasculaire cérébral, un cancer, ou une infection et qu’ils sont utilisés par certaines cellules immunitaires pour migrer de la moelle du crâne vers le cerveau. Il a notamment été décrit qu’augmenter cette migration immunitaire était protectrice dans le cas d’un cancer de type glioblastome, une tumeur primitive du cerveau la plus fréquente et la plus agressive. Les objectifs de ce projet sont 1/ d’étudier le développement de ces canaux osseux, 2/ de moduler leur formation, et 3/ d’évaluer les conséquences d’une modulation de ces canaux (en taille et/ou en nombre) sur la protection immunitaire du cerveau en cas d’infection. Ce travail vise donc à explorer les interactions entre le cerveau, les méninges et le crâne, ainsi que la migration des cellules immunitaires entre ces trois compartiments.
Bénéfices attendus
Cette étude apportera une compréhension approfondie des canaux osseux du crâne, de leur rôle dans la protection immunitaire du système nerveux central (SNC) et dans le développement de pathologies inflammatoires ou post infection. Elle examinera le rôle des ostéoblastes (cellules sécrétant la matrice osseuse) dans la structuration des canaux osseux, révélant ainsi des mécanismes fondamentaux de la formation osseuse en lien avec les méninges. D’autre part, elle permettra d’identifier comment certaines cellules influencent la formation de ces canaux osseux durant la période périnatale. Nous étudierons également si la modulation des canaux osseux en taille et/ou en nombre impacte l’infiltration immunitaire vers le cerveau, en cas d’infection virale. Ces résultats pourraient avoir des implications majeures sur la connaissance du système immunitaire des méninges, et la protection du SNC. En définitive, ce travail ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires du SNC, notamment les méningites.
Procédures
Injections intrapéritonéales (15s), 2 par souriceau + 1 au stade de développement souriceau ou souris Injections sous cutanées (15s), 1 à 4 par souriceau
Impact sur les animaux
Stress et douleur modérés pour les injections intrapéritonéales et sous cutanées. Les molécules injectées sont non toxiques pour les volumes et les doses utilisées. Le virus injecté déclenche une infection du système nerveux central de bas grade et les souris seront mises à mort à des temps ne permettant pas le développement d’une infection systémique. Les souriceaux seront manipulés et donc sortis du nid, manipulation pouvant entrainer une hypothermie.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les tissus pour analyse.
Remplacement
L’objectif de ce travail est de comprendre les interactions entre le cerveau, les méninges et le crâne ; et la migration de cellules immunitaires entre ces 3 compartiments dans différents contextes. Du fait de la complexité anatomique de notre objet d’étude, et du fait qu’il soit à l’interface entre plusieurs tissus (méninges, os, cerveau), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre le système dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux a été estimé à l’aide d’un outil informatique et les effectifs réduits au minimum tout en permettant d’obtenir un effet statistique significatif.
Raffinement
S’agissant d’études réalisées en partie sur des souriceaux, des précautions supplémentaires seront prises pour leur manipulation : avant manipulation l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera les dépôts d’odeur et favorisera la réintégration au sein du nid. Les souriceaux seront réchauffés grâce à une lampe à infra-rouge, avant d’être replacés. Les souriceaux et les souris seront suivis régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance avérée de prendre des mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure SBEA (analgésie, surveillance renforcée).
Choix des espèces
De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’Homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. Le vaste développement de modèles transgéniques rapporteurs permettant de visualiser certains types cellulaires nous donnera la possibilité de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. En effet, la disponibilité de ces modèles rapporteurs uniques permet pour la première fois la visualisation de l’organisation complexe entre le crâne, les méninges et le cerveau ; et des communications entre ces systèmes. Ce n'est qu'en utilisant ces lignées de souris transgéniques que nous pouvons clairement distinguer les différents compartiments du système nerveux central et ses interactions avec le crâne. Étant donné cette organisation anatomiquement complexe, le modèle murin reste indispensable pour effectuer cette étude. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ne pas avoir de biais dans les résultats. Nos études commencent tôt après la naissance à des moments où nous pouvons agir sur la maturation ou l’ossification du crâne en développement ( J2-J4-J6-J9). Les prélèvements seront réalisés à différents temps selon les procédures (J9, J11, J13, J15, J17, J30, J60) afin d’obtenir une cinétique des effets de nos traitements à court terme sur des souriceaux ou à plus long terme sur des souris adultes.
Evaluation de la protection induite par des formulations vaccinales contre des pathogènes respiratoires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Quatorze séries de prélèvements par animal en six mois, sang à la joue, fèces, salive provoquée, prélèvements vaginaux : 747 souris vont être utilisées, dont 432 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont vaccinées jusqu'à quatre fois, puis infectées par voie nasale avec la grippe, le virus respiratoire syncytial ou le métapneumovirus, et peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids dans les sept jours qui suivent. Une injection intraveineuse d'anticorps marqué précède immédiatement la mise à mort, et toutes sont tuées pour prélever les tissus respiratoires. Le bénéfice annoncé, une protection durable des muqueuses que les vaccins actuels n'obtiennent pas, reste à démontrer, quand la perte de poids et l'infection, elles, sont attendues.
Objectifs
Les virus respiratoires, comme ceux causant la grippe ou la bronchiolite, provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’humain. Très contagieux, ces pathogènes sont responsables d’épidémies saisonnières ou de pandémies, et ils continuent à etre une cause majeure de mortalité notamment chez les jeunes enfants et les personnes agées. Différents candidats vaccins contre les pathogènes respiratoires sont en cours de développement dans le laboratoire pour une administration par voie injectable, par voie nasale ou orale. En continuité avec un projet précédent visant à déterminer les formulations vaccinales qui induisent les plus fortes réponses immunitaires, le but de ce projet est d’étudier la protection conférée par ces candidats vaccins dans un modèle d’infection de souris jusqu’à 6 mois après la vaccination initiale. Ainsi, après la vaccination, les souris seront infectées avec une des souches de virus respiratoires comme Influenza, le virus respiratoire syncytial ou metapneumovirus afin de déterminer la protection conférée par les candidats vaccins.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre les virus respiratoires permettent de réduire la sévérité de la maladie mais ils sont actuellement peu efficaces pour induire une réponse immunitaire dans les tissus respiratoires eux-memes permettant une protection à long-terme contre les infections et la transmission. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales contre ces virus. Ce projet permettra de déterminer si nos formulations vaccinales administrées par voie intranasale, orale ou intramusculaire induisent de fortes réponses immunitaires protectrices. De plus, ce projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur le développement des réponses durables au niveau des tissus nasaux et pulmonaires.
Procédures
- Le marquage des souris sera réalisé à leur arrivée. Ce geste dure quelques secondes. - Les souris seront vaccinées au maximum 4 fois. La durée maximum de la vaccination est de 3 mois. - Les prélèvements de sang au niveau de la joue est un geste qui dure 30 secondes quand il est réalisé par une personne expérimentée. - Les souris isolées pour le prélèvement des fèces seront maintenues dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à récupérer suffisamment de fèces, et ne seront pas gardées au-delà de 20 minutes dans ces boîtes. - Des prélèvements vaginaux seront réalisés. Ils durent environ 5 min. - Des prélèvements de salive seront effectués après injection d’une solution qui fait saliver la souris. Tous ces gestes seront réalisés avant chaque immunisation, 2 fois par mois jusqu’au 6ème mois et avant la mise à mort (14 fois dans la procédure durant 6 mois au maximum). - Les souris seront infectées avec un virus respiratoire par voie nasale. - Des lavages nasaux seront réalisés deux fois après l'infection . - Une injection intraveineuse avec un anticorps marqué sera réalisée juste avant la mise à mort. Cet anticorps permettra de marquer des cellules d’intérêt circulant dans le sang.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité ainsi que du poids. Après infection, les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoire : une perte de poids jusqu'à 20% dans les premiers 7 jours après administration nasale de virus, une accélération du rythme respiratoire, une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration nasale de virus.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour préléver des tissus afin d'analyser les réponses immunitaires et la protection.
Remplacement
La caractérisation des nouveaux candidats vaccins est réalisée dans un premier temps dans des modèles in vitro de cellules épitheliales humaines ou animales. Cependant, il n’existe pas de méthode in vitro pour tester l’efficacité des formulations vaccinales à induire une protection après infection. L’interaction entre le virus et l’intégralité du système immunitaire d’un organisme est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal pour évaluer la protection générée par des candidats vaccins.
Réduction
La réduction des animaux se fera principalement sur la mise en place des expériences qui seront optimisées afin d’inclure le maximum de groupes expérimentaux dans une seule expérience. Le design de ces expériences est basé sur des données préliminaires établies par nos collaborateurs en 2020 puis 2025.
Raffinement
Après une anesthésie chimique, un suivi accru sera fait jusqu’au réveil et la reprise d’activité de chaque animal. De plus, les souris seront observées dans les heures suivant la vaccination. La température corporelle et le poids des souris seront suivis après chaque vaccination. De plus, ce même suivi se fera pendant 14 jours après l’infection avec le virus au rythme de 1 fois par jour et pourra être augmenté à 2 fois par jour si besoin. Des points limites ont été définis selon différents critères biologiques et si ceux-ci sont atteints lors de la surveillance, l’animal sera mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle le mieux adapté pour évaluer les réponses immunitaires et la protection induites par un candidat vaccin car la souris a une génétique proche de l’humain et c’est un modèle relativement aisé à mettre en place. Les expériences d’infection avec un virus seront réalisées sur des souris de plus de 7 semaines au début de l’expérience car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complétement développé.
Optimisation d’immunothérapie par un agent pharmacologique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et vingt-cinq injections par animal : 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les analyses post-mortem. La douleur attendue vient de la croissance des tumeurs et de la manipulation hebdomadaire. Le projet doit confirmer chez l'animal un résultat déjà obtenu en culture, un agent pharmacologique qui renforce l'activité antitumorale des lymphocytes T. Le porteur situe le bénéfice dans l'élaboration de futures procédures d'immunothérapie, un horizon indéterminé face aux tumeurs et aux injections répétées inscrites dès maintenant au protocole de chaque souris.
Objectifs
Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes 25 injections sous anesthésie locale, la durée de ce geste est évaluée à moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale. Cette douleur sera modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses post-mortem nécessaires à l'étude
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux est indispensable pour valider le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant entier.
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps, afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les interventions seront précédées d'une anesthésie locale pour les injections et générale pour les prélèvements, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basées sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
Cibler les mégacaryocytes hébergeant des virus pour une restauration immunologique efficace dans les syndromes post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 553 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 367 d'un niveau léger. Les unes reçoivent le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie et perdent environ 12 % de leur poids en quatre jours, une sur dix mourant de l'infection à la dose retenue. Les autres reçoivent les virus Mayaro ou Chikungunya en sous-cutané et développent un gonflement de la patte injectée. Le prélèvement de sang se fait par voie rétro-orbitale et chaque animal est tué immédiatement après, le porteur indiquant que les organes recherchés ne peuvent pas être obtenus autrement.
Objectifs
Les syndromes infectieux post-aigus (PAIS) sont des maladies qui apparaissent après une infection, quand la phase la plus forte de la maladie est terminée. Ces maladies peuvent durer longtemps et rendre la vie difficile à ceux qui en souffrent. Même si on connaît ces syndromes depuis longtemps, on ne comprend pas encore bien comment ils fonctionnent ni comment les soigner. Un exemple connu est le COVID long, qui touche certaines personnes après une infection au coronavirus. Le virus SARS-CoV-2, responsable du COVID-19, provoque d’abord des problèmes respiratoires, mais chez certains, il reste présent dans le corps et cause des symptômes qui durent plusieurs mois. D’autres virus, comme le Mayaro et le Chikungunya, présents surtout dans les régions tropicales, peuvent aussi provoquer ce genre de maladies chroniques. Ils pourraient même arriver en Europe. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces virus restent dans le corps, en particulier dans certaines cellules. Nous nous intéressons notamment aux mégacaryocytes, des cellules surtout connues pour produire des plaquettes sanguines, mais qui pourraient aussi jouer un rôle dans la défense contre les infections. Mieux comprendre ces mécanismes pourrait aider à trouver des solutions pour améliorer la vie des personnes touchées par ces maladies.
Bénéfices attendus
Certaines cellules du sang, comme les plaquettes et les mégacaryocytes, peuvent servir de cachette à des virus. Notre équipe va donc étudier le rôle de ces cellules dans des modèles de souris atteintes de COVID long et lors d’infections par les virus Mayaro et Chikungunya (en collaboration avec l’Université Fédérale de Rio de Janeiro, au Brésil). Nous pensons qu’en ciblant ces cellules, il serait possible de renforcer le système immunitaire et d’améliorer la santé des personnes qui souffrent de symptômes persistants après une infection virale. Pour l’instant, il n’existe pas de modèles en laboratoire alternatifs à l’experimentation animale qui permettent de reproduire exactement ce qui se passe dans le corps humain à long term, après une infection. C’est pourquoi nous utilisons des souris pour mieux comprendre comment ces virus agissent et comment ils provoquent des maladies chroniques. Ces modèles sont essentiels pour tester de nouvelles idées et développer des traitements efficaces contre ces syndromes post-infectieux.
Procédures
(1) Infection du virus du COVID-19 (SARS2) par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. La durée totale de la procédure, comprenant l’anesthésie, est d’environ 2 à 3 minutes. (2) Infection de MAYV/CHIKV par voie sous-cutanée. Cette procédure, effectuée sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, dure environ 2 minutes, incluant l’installation, l’anesthésie et l’injection sous-cutanée. (3) Prélèvement sanguin par voie rétro‑orbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépôt d’une goutte de collyre à base de tétracaïne. Une anesthésie générale sera obtenue par inhalation d’isoflurane. L’ensemble de la procédure dure environ 3 minutes. Les animaux seront euthanasiés immédiatement après ce prélèvement.
Impact sur les animaux
Lorsqu’on infecte les souris avec le SARS2, elles perdent du poids (environ 12 % en quatre jours) et environ 1 souris sur 10 peut mourir à cette dose. Ce modèle permet d’étudier comment le virus provoque des maladies graves, comme des atteintes aux poumons, chez l’humain. Pour les virus Mayaro et Chikungunya, lorsqu’on les injecte à des souris, celles-ci présentent un gonflement de la patte (là où le virus est injecté) et perdent aussi du poids dans les jours qui suivent. Cependant, le risque de décès avec ces virus est très faible. Ces modèles animaux sont donc utiles pour comprendre comment ces virus agissent sur le corps et pour tester de futurs traitements
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans chaque procédure sera euthanasié à terme, y compris ceux affectés aux groupes contrôles. Cette étape est indispensable car l’étude nécessite le prélèvement de tissus et d’organes spécifiques, afin d’analyser la réponse immunitaire, la persistance virale et les mécanismes pathologiques induits par l’infection. Les échantillons d’organes ne peuvent être obtenus autrement. La durée maximale de maintien en vie des animaux après le début des expériences sera d’un (1) mois.
Remplacement
Pour étudier ces maladies, il existe des modèles en laboratoire comme les organoïdes (mini-organes créés à partir de cellules). Cependant, ces modèles ne sont pas encore assez avancés ou adaptés pour notre recherche, car les syndromes post-infectieux touchent plusieurs organes à la fois. C’est pourquoi nous avons besoin d’étudier l’effet des virus sur des animaux entiers, pour mieux comprendre ce qui se passe dans tout le corps.
Réduction
Nous faisons très attention à utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. Pour chaque expérience, nous utiliserons seulement le nombre minimum de souris nécessaire pour que les résultats soient valides et puissent être analysés correctement. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique permettant de garantir la puissance nécessaire des expériences. Les expériences seront répétées trois fois, avec six souris par groupe. Au total, nous aurons besoin de 550 souris d’une première lignée de souris pour l’étude du SARS2, et 370 d’une autre lignée de souris pour l’étude du MAYV/CHIKV, y compris celles utilisées pour préparer les expériences et maintenir les lignées. Cela nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour garantir le bien-être des animaux. Cela passe par des procédures précises, une formation du personnel, un suivi quotidien de la santé des animaux, et l’utilisation de méthodes les moins douloureuses possible. Si un animal montre des signes de souffrance, il sera pris en charge rapidement, et une euthanasie pourra être pratiquée si nécessaire pour éviter toute douleur inutile. Chaque animal sera observé chaque jour, et son état de santé sera noté selon une grille précise pour s’assurer qu’il ne souffre pas.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé pour étudier comment notre corps réagit aux infections virales, car son système immunitaire ressemble beaucoup à celui de l’humain. De plus, il est très difficile d’obtenir certains tissus, comme la moelle osseuse, chez l’humain pendant une infection, alors que c’est possible chez la souris. Cela nous permet d’en apprendre plus sur les réactions du corps face à ces virus. Il existe aussi de nombreux outils scientifiques adaptés à la souris, ce qui rend l’analyse des réactions immunitaires plus facile et plus précise. Dans nos recherches, nous infecterons des souris femelles de la lignée Balb/c avec le virus du COVID-19 à l’âge de 8 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est complètement développé.Pour les virus Mayaro et Chikungunya, nous utiliserons des souris femelles de la lignée 129/sv âgées de 3 semaines, car elles présentent alors des symptômes similaires à ceux observés chez les humains malades. Cela nous aide à mieux comprendre comment ces maladies se développent et à chercher des solutions pour les traiter.
Réduire la production de peptides toxiques dans la maladie d’Alzheimer : une piste génétique prometteuse
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour savoir si une mutation repérée en culture cellulaire protège du dépôt de plaques amyloïdes, 96 souris conçues pour développer une maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent cinq prélèvements sanguins espacés d'au moins quatre semaines, à partir de l'âge de deux mois, sous contention d'une minute. Le porteur affirme que ces lignées ne présentent pas de phénotype dommageable connu, tout en les ayant retenues parce qu'elles accumulent la protéine amyloïde dans le cerveau. À quatre ou six mois selon les résultats sanguins, elles sont toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Elle touche aussi particulièrement les personnes atteintes du syndrome de Down (ou trisomie 21). Cette maladie se caractérise par deux éléments majeurs dans le cerveau : des amas de protéines anormales à l’intérieur des neurones, appelés enchevêtrements neurofibrillaires, formés par une version modifiée de la protéine Tau et des plaques formées à l’extérieur des cellules, composées d’une autre protéine appelée amyloïde-β (Aβ). Les fragments d’Aβ sont produits à partir d’une grosse protéine appelée APP, qui est plus abondante chez les personnes ayant le syndrome de Down. Dans nos travaux précédents, nous avons découvert qu’une petite modification (ou mutation) d’un seul acide aminé dans cette protéine APP permet de produire des formes plus courtes et non toxiques d’Aβ, du moins dans des cellules en laboratoire. Nous voulons maintenant voir si cette même mutation peut avoir un effet protecteur dans 2 modèles de souris conçus pour développer des symptômes proches de ceux de la maladie d’Alzheimer (les souris dites APP NL-G-F et APP Humanisé). Pour cela, nous avons créé deux nouveaux modèles de souris qui porte à la fois les caractéristiques d’Alzheimer et cette mutation protectrice. Notre objectif est de comparer ces 4 types de souris (avec et sans la mutation) en étudiant : Les signes de la maladie dans leur cerveau, Certains biomarqueurs mesurés dans le cerveau et dans le sang et La manière dont la protéine APP est découpée dans leur organisme.
Bénéfices attendus
Plusieurs médicaments ont été testés pour essayer de réduire la production des formes longues et toxiques de la protéine Aβ, qui sont liées à la maladie d'Alzheimer. Mais jusqu'à présent, aucun de ces traitements n’a réussi à produire surtout des formes plus courtes qui sont moins dangereuses. Dans notre étude, nous allons tester pour la première fois si une mutation particulière, (qui agit un peu comme un médicament modificateur), peut empêcher l'accumulation des formes longues d’Aβ. Nous utiliserons 2 modèles murins porteurs de mutations génétiques associées à la forme familiale de la maladie d’Alzheimer. On espère que ces mutations vont favoriser la production de formes plus courtes d’Aβ. Nous allons aussi vérifier si ces formes plus courtes ont des effets nocifs ou non sur le cerveau. Si les résultats sont positifs, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste pour traiter la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les souris seront suivies (longitudinal) au niveau sanguin, elles auront au total 5 prélèvements sanguins espacés de 4 semaines minimum. La prise de sang nécessite une contention préalable et n'excèdera pas 1 minute. Après 6 mois (ou à 4 mois en fonction des résultats sanguins) de suivi les souris sont mises à mort pour pouvoir prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Les lignées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotypes dommageables connus. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au point de piqure pour injection ou prélèvement. Le prélèvement de sang sera également associé à des risques d’hématome et de saignement persistant.
Devenir
Les souris utilisées seront euthanasiées afin de prélever puis analyser leur cerveau dans le but de répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Plusieurs études in vitro de notre équipe ont montré que la mutation K699A dans le gène codant l’APP conduisent à la production de formes courtes d’Aβ non toxique. Cependant, les modèles in vitro ne présentent pas la complexité physiologique complète d'un organisme vivant (c'est-à-dire qu'ils ne reproduisent pas les interactions systémiques). De plus, bien que les modèles in vitro montrent des effets moléculaires ou cellulaires, ils ne confirment pas si cette mutation produit des bénéfices thérapeutiques significatifs dans un organisme entier. Enfin, un modèle vivant fournit des données précliniques essentielles soutenant la transition de la recherche fondamentale vers les études humaines. A l’heure actuelle il n’existe donc pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour ces expériences.
Réduction
Nous utiliserons sur 2 ans un total de 96 souris. Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Cette étude longitudinale inclut un total de 96 souris, réparties en 4 groupes de 24 (12 mâles et 12 femelles par génotype et par lignée). Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédentes publiées, notamment des études de notre collaborateur. Des groupes de 24 souris par génotype (12 mâles et 12 femelles) assureront une robustesse des résultats (tests statistiques de type ANOVA) et une prise en compte de la variabilité biologique, spécialement liée au sexe. Nous produirons nos lots expérimentaux et maintiendrons les lignées de souris génétiquement modifiées sur les 2 années du projet. Nous piloterons de manière raisonnée notre élevage pour ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire.
Raffinement
Le bien-être des souris sera évalué de manière spécifique par notre équipe à l’aide d’une grille de score. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact potentiel des procédures expérimentales sur les animaux. L’euthanasie sera réalisée sur l’animal anesthésié permettant d’éviter tout stress ou douleur en lien avec l’injection létale
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à la Maladie d’Alzheimer requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. Étant donné que le développement cérébral des souris atteint sa maturité autour de 2 à 3 mois d'âge, et que le dépôt de plaque amyloïdes dans cerveau, chez les souris APP NL-G-F- hétérozygotes debute à 4 mois, nous commencerons le prélèvement sanguin à 2 mois. Les échantillons de sang seront collectés sur toute la durée de la procédure pour suivre l’évolution des différents paramètres d’intérêt. Nous allons sacrifier les souris au bout des 6 mois (ou à 4 mois si nécessaire en fonction des résultats sanguins) lorsqu’elles atteignent leur développement cérébral adulte complet, la pathologie amyloïde est clairement visible et leurs schémas cognitifs et comportementaux se stabilisent entre 4 et 6 mois.
Interaction d’une bactérie pathogène avec l’intestin chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des souriceaux de quatorze jours reçoivent par gavage une bactérie responsable de sepsis et de méningites chez les nouveau-nés. 157 souris vont être utilisées, dont 141 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue, les mères après leurs petits parce que l'exposition à la bactérie interdit de les réutiliser. Les mères gestantes passent en outre environ sept jours en hébergement individuel. Pour 141 animaux classés en souffrance sévère, le porteur ne décrit les atteintes attendues qu'en une phrase, un stress et une douleur dans les 24 heures suivant l'inoculation, sans dire quels signes cliniques l'infection provoque ni à quel stade elle est arrêtée.
Objectifs
Certaines bactéries pathogènes peuvent être présentes dans les voies vaginales et digestives des individus. Alors que le portage est asymptomatique chez l’adulte, elles peuvent causer des infections graves chez les nouveau-nés (sepsis, méningite). L’infection peut survenir au cours de la première semaine de vie (syndrome précoce) ou plus tardivement (syndrome tardif, 7 à 89 jours de vie). Au cours des syndromes tardifs, l’infection survient après le franchissement de la barrière intestinale par les bactéries, et plus précisément après la traversée de cellules spécialisées. Le but de ce projet est d'identifier et d'analyser à l'aide d'un modèle murin d’infection néonatale tardive, i) les cellules immunitaires recrutées après l'infection et ii) la réponse des différentes cellules de l'intestin à l’infection.
Bénéfices attendus
Nos résultats fourniront des informations précieuses sur les cellules et les gènes impliqués dans le franchissement de la barrière intestinale par les bactéries pathogènes, ainsi que la réponse immunitaire intestinale à l'infection. À terme, le projet permettra d’identifier de nouvelles cibles pour le développement de stratégies préventives et thérapeutiques contre les infections néonatales bactériennes.
Procédures
Toutes les souris gestantes adultes seront en hébergement individuel pour une durée d'environ 7 jours. Tous les souriceaux seront soumis à un gavage oral d'une durée de 5 à 10 secondes réalisé sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L'hébergement individuel est susceptible d'entraîner un léger stress et des modification du comportement. Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress et de la douleur chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements post-mortem seront effectués chez les souriceaux pour analyse. Les mères ayant été exposées à une bactérie pathogène (niveau A2) ne pourront pas être réutilisées et seront mises à mort après mise à mort de l'ensemble de leurs souriceaux.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de récapituler la complexité de la barrière intestinale ni d'étudier l'ensemble des types cellulaires présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utiliserons des animaux obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l’infection néonatale bactérienne, du franchissement de la barrière intestinale jusqu’à la dissémination par voie sanguine et la méningite. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris adultes gestantes car c'est une étude sur leur progéniture avant sevrage. Nous utiliserons des souriceaux de 14 jours à un stade de développement équivalent à celui de nouveau-nés humains âgés de 7 à 89 jours de vie.
Etude de l’interaction entre le dysfonctionnement métabolique et l’inflammation chronique dans un modèle murin de la dégénérescence maculaire liée à l’âge
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
6 500 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six électrorétinogrammes de 30 à 45 minutes et six imageries de la rétine sous anesthésie générale, 500 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 750 modéré et 4 250 léger. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes entiers. Un lot est hébergé jusqu'à quatre mois sous lumière intense, cotons de nidification retirés de la cage pour les empêcher de se cacher de la lumière, un autre subit l'ablation du nerf vague combinée ou non à celle de la rate, un autre des injections dans l'œil au risque d'inflammation et de micro-saignements. Le porteur écrit avoir limité les effectifs au maximum et fixe cinq animaux par groupe comme minimum statistique, sans expliquer par quel enchaînement de groupes on parvient à 6 500 souris.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de 65 ans. En France, environ 1,5 million de personnes seraient atteintes de DMLA. Dans cette pathologie, un processus inflammatoire caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires et un processus de dysfonctionnement métabolique participent de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Ce projet permettra de comprendre comment ces processus essentiels interagissent, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA. De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge). De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Procédures
Un lot d’animaux subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera hébergé sous une lumière intense (jusqu’à 4 mois maximum) et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux subira une chirurgie d’ablation du nerf vague combinée ou non à une ablation de la rate (durée de l’intervention 10 minutes) sous anesthésie générale et analgésiques administrés en préopératoire et postopératoire. Un lot d’animaux recevra des régimes alimentaires spécialement formulés pendant 4 semaines et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera soumis à une injection de molécules thérapeutiques par voie intraoculaire sous anesthésie générale avec analgésique (durée : moins de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Lors des anesthésies, il y a un risque de mauvaise réaction à l’anesthésiant (difficultés respiratoires, anxiété), un risque d’hypothermie ainsi qu’un risque d’arrêt cardiaque. Lors des injections intraoculaires, il y a un risque d’inflammation localisée (œil rouge) et de micro saignements visibles instantanément lors du geste. Lors de la procédure d’illumination, les animaux peuvent ressentir un stress lié à l’exposition à une lumière de (animaux agités pendant moins d’une heure), et leurs fonctions visuelles peuvent baisser au cours du temps. Lors des imageries de l’œil, les animaux peuvent également ressentir un stress lié à la préhension et contention lors de l’administration des collyres (durée de quelques secondes seulement). Lors du changement d’alimentation (mise à disposition des croquettes spécifiques à notre projet), les souris peuvent subir une perte de poids transitoire en réponse au changement de nourriture. Une hémorragie peut se produire au cours des chirurgies, ce qui peut entrainer le décès de l’animal. Après les chirurgies, les sutures pourraient s’irriter ou être retirées prématurément par l’animal. Après l’opération, il peut y avoir des douleurs postopératoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. Cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux, car nous avons besoin de prélever des organes entiers pour les analyser dans leur globalité.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cellules isolées.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser 6500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 5 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables, selon nos expériences antérieures. Pour les injections intraoculaires, nous prévoyons d’injecter le traitement dans un œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle ce qui permettra de limiter la variabilité entre animal et de réduire ainsi le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observent une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant d’entrer en expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation pour l’espèce concernée (cages ventilées standard avec enrichissement). Le nombre de souris par cage est limité à 5 individus adultes. Lors de la mise des animaux sous illumination, les animaux sont placés dans une pièce différente, mais restent dans leurs cages de stabulation normale, selon les mêmes conditions, hormis la luminosité et les cotons qui sont retirés pour éviter que les animaux ne se cachent de lumière. Ils auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par les membres de la structure bien-être de notre établissement utilisateur. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Le personnel assure le suivi du bien-être des animaux à l’aide d’un système d’étiquettes et de pastilles. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale de la cornée et l'humidité cornéenne sera maintenue à l'aide d'une goutte de gel ophtalmique. Après la chirurgie nous mettons à disposition une gelée post-opératoire nutritive avec des croquettes mouillées dans le fond de la cage pour aider à l’alimentation et à l’hydratation. En plus de l’analgésie préopératoire, des injections d’analgésiques postopératoires seront administrée après la chirurgie pour toute douleur postopératoire potentielle. Le poids corporel des animaux sera mesuré la veille, deux jours après et une semaine après la chirurgie. Une grille de scoring a été créée pour suivre les poids des animaux et les autres observations postopératoires. Le poids des animaux nourris avec des croquettes formulées avec un composé sera également surveillé chaque semaine pendant toute la durée de l’alimentation (mise en place d’une fiche de suivi pour vérifier ce paramètre).
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Nous utilisons des modèles génétiquement modifiés qui sont plus susceptibles à l’induction d’une inflammation pathogène, mimant la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les animaux sont âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie étudiée.
Caractérisation de l’effet prébiotique et nutrigénomique des produits alimentaires d’origine végétale
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.
Bénéfices attendus
Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.
Procédures
Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.
Devenir
A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.
Remplacement
Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.
Réduction
Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.