Système immunitaire

484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 84 un niveau léger. Elles reçoivent des injections dans la veine et dans le ventre, une irradiation de dix minutes au maximum sous anesthésie profonde, une greffe de moelle osseuse et des prélèvements de sang. Le porteur signale une immunodéficience transitoire et une dépigmentation après l'irradiation, cette dernière étant qualifiée de sans conséquence sur le bien-être de l'animal. Il conclut que la maturation du système immunitaire ne peut s'étudier que sur un "organisme entier".

Objectifs

Les cellules immunitaires nous protègent des infections et de l'émergence de tumeurs. Cependant, pour être pleinement efficace, elles doivent se maturer progressivement durant les périodes d'homéostasie, c'est-à-dire lorsque l'organisme est en équilibre, en l'absence d'infections ou de pathologies. Notre objectif est de définir les mécanismes qui favorisent un développement optimal des cellules immunitaires pendant ces périodes d'homéostasie où tout va bien.

Bénéfices attendus

En identifiant les facteurs contribuant au développement correct des cellules immunitaires en l’absence de pathologie, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies préventives contre diverses infections. Il pourrait aussi permettre d’augmenter les réponses immunitaires chez des populations à risque.

Procédures

- Injection dans la veine dans des souris sous anesthésie gazeuse (1 fois 2min/souris) - Injections dans le ventre (1 fois 20s/souris) - Injection dans le ventre (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie et application d'analgésie locale ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections ; ii) le stress généré par l’anesthésie et les contentions lors des prises de poids; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. Légère perte de poids transitoire suite à l’irradiation. - Immunodéficience transitoire due à l’irradiation. Dépigmentation du fait de l’irradiation sans conséquence sur le bien-être de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. Nous préléverons alors différents tissus pour établir différentes analyses.

Remplacement

La maturation du système immunitaire est un processus complexe qui implique l'interaction de divers acteurs, tels que le microbiote (la flore microbienne), le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif, et ne peut actuellement être étudiée qu'à l'échelle de l'organisme entier. Par ailleurs, nous avons renforcé nos hypothèses et éliminé un grand nombre de pistes en effectuant une recherche bibliographique exhaustive et en réalisant divers tests in vitro, réduisant ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet.

Réduction

Nous avons toute l’expertise technique. Ainsi, il n’y a pas de mises au point nécessaires. Le nombre de souris proposées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Ce nombre a été calculé à partir d’outil statistique. Ce nombre peut encore être réduit si les tests de prises de décisions (préliminaires) ne valident pas nos hypothèses avancées. Utilisation de technologie de pointe nous permettant de faire certaines analyses de façon combinée réduisant significativement le nombre d’animaux utilisés. Nous utilisons également à la fois les souris mâles et femelles.

Raffinement

En complément des suivis réglementaires quotidiens des zootechniciens, un suivi 5 fois par semaine sera fait par les expérimentateurs permettant un repérage rapide des premiers signes de mal-être. – Des points limites définis et précoces nous permettant d’agir rapidement ont été mis en place. – Hébergement et manipulation des souris dans un environnement stérile - Anesthésie des animaux lors de manipulations invasives comme l’injection dans la veine et ainsi réduire le stress de l’animal et éviter des mouvements de l’animal pouvant le blesser. – Pour favoriser le bien-être des animaux, leur environnement sera enrichi de nids en cartons pour se cacher et de bâtonnets en coton pour créer un nid. - Après l'irradiation, une alimentation plus souple, comprenant des croquettes humidifiées et du gel hydratant, sera mise à disposition dans les cages pendant quelques jours pour faciliter la récupération des animaux. - Une anesthésie locale sera administrée pour réduire la douleur résultant de l’injection ou de la prise de sang. - Pas d’isolement des souris pour respecter au tant que faire ce peu le comportement social des souris.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle souris se justifie car nous disposons de toute l’expertise scientifique et technique. Les souris sont un modèle très utilisé en recherche pour adresser les différentes branches du système immunitaire et ainsi la communauté scientifique dispose de divers modèles génétiques et outils scientifiques nous permettant d’adresser ce projet le plus efficacement possible. Le stade adulte (souris 2 mois) est choisi de façon à avoir un système immunitaire mature.

Les souris dont l'état se dégrade nettement sont tuées immédiatement, puis analysées. 405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 pour l'élevage, mises à mort à un an. Chacune subit un prélèvement de 2 mm au bout de la queue, quatre injections abdominales consécutives, puis deux injections sous la peau et dans l'abdomen d'un mélange qui déclenche une inflammation du système nerveux reproduisant la sclérose en plaques. Le porteur affirme avoir choisi des conditions d'induction produisant des symptômes "modérés", sans douleur ni perte de poids significative, et annonce que les retombées "devraient sans nul doute" ouvrir des pistes thérapeutiques chez l'humain.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du cerveau et de la moelle épinière qui conduit à une destruction progressive de la gaine de protéines qui entoure les neurones. Elle est dévastatrice et conduit à la paralysie du patient. Une partie des cellules immunitaires, les macrophages du cerveau appelés microglies (MG), protègent normalement le système nerveux central du développement de la SEP. Il a été récemment découvert que les MG contiennent une substance nommée la protéine P, qui contrôle la fonction des MG et leur capacité de protection contre les maladies du cerveau. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo le rôle de la protéine P dans la progression de la SEP chez des souris transgéniques, en induisant la maladie par un traitement chimique. Nous étudierons également comment la protéine P modifie l'activité des MG. Nous espérons que notre projet permettra d'identifier de nouveaux outils diagnostics et thérapeutiques dans le contexte de la SEP.

Bénéfices attendus

Le rôle de la protéine P dans un modèle murin de SEP n'a jamais été testé et permettra de confirmer des résultats préliminaires in vitro sur son rôle dans la progression de la SEP. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics, et peut-être thérapeutiques, en découvrant les gènes contrôlés par la protéine P dans les MG, qui seront des cibles thérapeutiques potentielles. Les retombées de ce travail seront utiles pour la compréhension des mécanismes pathologiques de la SEP et devraient sans nul doute faire découvrir de nouveaux outils de prévention et des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.

Procédures

Les souris auront une biopsie de la queue, qui consiste à prélever 2 mm de l'extrémité de la queue. Elles recevront pendant quatre jours consécutifs une injection dans le ventre d'un produit permettant de supprimer la protéine P chez les souris ayant une modification génétique spécifique. Cette injection dure moins de deux minutes. Quatorze jours plus tard, les souris recevront deux injections sous la peau et dans le ventre d'une combinaison de substances produisant le modèle de sclérose plaques chez l'animal. Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour éviter tout stress chez l'animal. Toutes les souris seront observées quotidiennement pour évaluer l'évolution de la pathologie. Celles présentant une dégradation importante de leur état seront immédiatement euthanasiées et analysées.

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue peut causer une brève douleur et un léger saignement qui seront arrêtés par une légère pression exercée localement.Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Clorhexidine). Des injections répétées pendant quatre jours consécutifs peuvent être une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les 45 souris utilisées pour l’élevage seront euthanasiées à l’âge d’un an. Les 360 souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude (10 à 15 semaines pour les souris euthanasiées au pic de la maladie et 12 à 17 semaines pour les souris euthanasiées 30 jours après induction de la maladie). Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées dans le cerveau de ces souris.

Remplacement

Toutes les données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages (MG) du cerveau et contrôle leur fonction. La lignée de souris qui n’exprime plus P dans les MG nous permettra de mimer au mieux la sclérose en plaques, une maladie très sévère qui conduit à la paralysie des patients et à leur mort. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues par d’autres méthodes, étant donné la complexité physiologique du développement de la sclérose en plaques. Nous sommes donc obligés de travailler à l'échelle de l'organisme. L'inactivation de la protéine P ne peut être réalisée que sur l'animal et la complexité du cerveau ainsi que les interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués dans la maladie ne peuvent pas être reproduites in vitro par des cultures cellulaires.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir des résultats robustes qui pourront ensuite être transposés chez l’homme. L’induction de la maladie sera réalisée en trois séries d'expériences : 1). - pour suivre l’état clinique des animaux pendant un mois ; 2) - pour isoler les macrophages du cerveau (MG) au pic de la maladie et les analyser ; 3)- pour isoler les macrophages du cerveau des souris avec ou sans la protéine P, en absence de la maladie. Cette dernière étape nous indiquera des marqueurs qui pourront être utilisés pour prédire la progression de la maladie. Le nombre total de souris est de 360. 45 souris seront utilisées comme géniteurs dans l'élevage. Pour réduire le nombre total de croisements et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, parce que la maladie SEP ne montre pas de différence due au genre.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées par groupe de cinq dans des cages ventilées. La température, l'humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec un bâtonnet en bois, des cotons et du kraft, pour permettre aux souris de jouer et avoir une activité diversifiée. Avant les injections sous-cutanées, les souris seront anesthésiées pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. D’ailleurs, nous avons choisi des conditions d’induction de la maladie qui permettent un développement modéré des symptômes de la maladie sans induction de douleur et sans perte significative de poids des aliments spécifiques qui permettront aux souris de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Le suivi des souris malades deux fois par jour permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance. Enfin, nous nous attendons à ce que le blocage de la protéine Pax6 induise la maladie plus tôt et avec un phénotype plus marqué. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris, car c'est le meilleur modèle pour créer des animaux transgéniques et comparer le développment des maladies chez ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des maladies humaines. Toutes nos données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages du cerveau et régule l'état inflammatoire de ces cellules. La lignée de souris qui permet d'inactiver la protéine P chez l’animal adulte, exclusivement dans les microglies (les macrophages du cerveau), est un modèle idéal pour étudier le rôle de la protéine P dans le développement de la sclérose en plaques (SEP). Ce modèle de SEP chez la souris est de loin le meilleur moyen de mimer la SEP humaine, l'une des maladies les plus sévères et dévastatrices, liée à une activation aberrante des microglies, qui sont les macrophages du cerveau, et qui jouent un rôle protecteur contre l'inflammation du cerveau. Toutes les souris devront être adultes, âgées de 6 à 8 semaines, parce que la maladie SEP se développe chez l'être humain adulte.

Des femelles gestantes reçoivent un complément alimentaire jusqu'au dix-neuvième jour de gestation, puis sont tuées pour une césarienne. Les nouveau-nés sont confiés à des femelles adoptantes dont la portée est tuée aussitôt le remplacement fait, et les adoptantes le sont à leur tour après le sevrage. La descendance reçoit deux injections d'allergène à vingt-huit et trente-huit jours, puis un gavage à quarante-cinq jours qui déclenche la réaction allergique, chute de température, irritation de la bouche et des oreilles, isolement, avant d'être tuée à son tour. 193 souris vont être utilisées au total, 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et aucun des trois groupes ne sort vivant du protocole.

Objectifs

La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.

Procédures

L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendants au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur la descendance. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.

Devenir

Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes seront mises à mort après le sexage et la fin du sevrage. La descendance seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.

Remplacement

Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.

Réduction

Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendants) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.

Choix des espèces

Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles et femelles seront séparés, afin de poursuivre le protococole.

Deux plaies sont taillées dans la peau du dos de souris rasées, puis maintenues ouvertes par des disques de silicone cousus, opération d'une vingtaine de minutes par animal. 740 souris vont être utilisées, 560 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 180 un niveau léger, toutes tuées à la fin pour prélever des organes. Les pansements sont changés chaque jour sous anesthésie, et des injections intrapéritonéales quotidiennes alternent d'un côté puis de l'autre, l'objectif déclaré étant de tester si un composé produit lors d'un régime cétogène accélère la cicatrisation chez la souris diabétique. Le porteur écrit que ce composé, produit naturellement par l'organisme, "ne présente donc pas d'effet nuisible", et ne dit rien des deux plaies chirurgicales.

Objectifs

Le composé X est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est altérée comme lors d’un diabète.

Bénéfices attendus

Au-delà des informations fondamentales les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. La cicatrisation de personnes atteintes de diabète est altérée, non seulement elle est plus lente mais les surinfections sont également plus fréquentes. Le composé X est produit naturallement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est diminuée comme lors d’un diabète.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime spécifique ou seront traités par des injections intrapéritonéales du composé X ou seront traités directement en topique avec le composé X. Les 3 traitements seront réalisés sur des souris ayant subi une chirurgie afin d’induire deux lésions cutanées sur le dos de l’animal (modèle de cicatrisation). Les injections intrapéritonéales sont rapides et n’excèdent pas quelques secondes de manipulation. Elles seront réalisées alternativement à droite et à gauche d’un jour à l’autre afin de réduire la douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et antidouleur local. Le temps de raser les animaux, de réaliser la plaie, d’appliquer et de fixer les disques de silicones avec des points de suture, une vingtaine de minutes sont nécessaires par souris. Les pansements des plaies des animaux seront changés chaque jour sous anesthésie. Le temps de changer les pansements, de faire l’acquisition d’images afin de suivre l’évolution de la cicatrisation et d’appliquer le composé X sur les plaies environ 5 minutes sont nécessaires par souris.

Impact sur les animaux

Le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et ne présente donc pas d’effet nuisible sur les animaux.

Devenir

La totalité des animaux (740) sera mis à mort à la fin des 2 procédures pour prélèvement d’organes post mortem.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en oeuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, les souris seront hébergées en cages collectives (3 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique d’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la relative facilitée d'hébergement et de soins, à la grande taille des portées et au temps de génération court. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car l’insulinémie augmente brusquement à partir du sevrage pour atteindre son maximum à l’âge de 2-3 mois puis elle chute.