Système urogénital

Relever la température hivernale des bassins piscicoles pour réduire la facture de refroidissement, voilà le débouché annoncé à court terme. 225 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 165 d'entre elles étant ensuite réutilisées dans une autre expérience ou versées comme géniteurs dans une pisciculture, les autres tuées pour le prélèvement des ovaires. Chaque poisson est sorti de l'eau, anesthésié, sexé par échographie et pucé sous la peau, et 90 femelles subissent en plus l'introduction d'une canule dans l'orifice génital. La récupération des pontes et du sperme, elle, se fait sans anesthésie, par pression sur l'abdomen, pour ne pas altérer la qualité des gamètes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux entiers, les cultures de gonades ne permettant pas le développement complet des cellules reproductrices.

Objectifs

Les poissons des régions tempérées sont souvent sensibles aux variations de stimuli environnementaux présentant une saisonnalité. Tout écart important de ces stimuli par rapport à une situation normale, à laquelle est adaptée l’espèce cible, pourrait compromettre leur reproduction. Ainsi, le succès de reproduction d’une espèce dépend de sa capacité de résilience face aux écarts de ces stimuli par rapport à une référence. Le contrôle des étapes de production des cellules reproductrices femelles (l’ovogenèse) dépend notamment de variations de température chez la perche commune (Perca fluviatilis). Cette espèce, d’intérêt aquacole, peut être élevée avec succès dans des conditions captives dans lesquelles les variations thermiques saisonnières sont mimées. Il a été montré, dans ces conditions, qu’une exposition prolongée à une température de 6°C (vernalisation) durant l’ovogenèse garantissait l’obtention d’ovules de bonne qualité (avec cependant une très grande variation). En revanche, si la température de vernalisation ne descendait qu’à 14°C, l’ovogenèse s’arrêtait. Nous n’avons aucune donnée pour des températures intermédiaires. Or, dans les conditions environnementales actuelles, des écarts de cette température de vernalisation pourraient apparaitre plus fréquemment. Dans la cascade d’évènements qui lient la température au contrôle de la reproduction, on cite des modifications moléculaires sur l’ADN qui n’induisent pas de mutation. Toutefois la régulation des gènes est modifiée, conduisant potentiellement à des variations du contenu cellulaire. En effet, ces transformations chimiques sont effectuées par des protéines sensibles aux variations thermiques. Ainsi les œufs des poissons pourraient avoir une composition différente qui pourraient influencer leur qualité et la santé de la descendance. Ce projet porte sur la perche commune, un poisson d’eau tempérée dont les conditions de reproduction normales sont connues et reproductibles en bassins. Il est prévu d’étudier le succès de la reproduction lorsque les animaux sont soumis à des températures de vernalisation de 6, 8 et 10°C. En parallèle, les modifications du génome seront étudiées au cours de l’ovogenèse pour comprendre le lien potentiel entre des changements environnementaux et le succès de reproduction chez cette espèce.

Bénéfices attendus

La perche est une espèce d’intérêt aquacole et de haute valeur commerciale dans plusieurs pays européens. Son élevage peut être fait soit dans des étangs où elle est soumise aux variations climatiques conduisant régulièrement à des écarts thermiques en hiver, soit dans des bassins en circuit fermé pour lesquels les variations de température et photopériode (durée du jour et de l’obscurité au cours d’une journée) naturelles sont mimées artificiellement. Dans ce dernier cas, la température hivernale pour la perche commune est réglée à 6°C conformément aux résultats scientifiques obtenus chez cette espèce. L’augmentation du coût de l’énergie conduit les fermes aquacoles à revoir leurs pratiques et il devient souhaitable de déterminer s’il serait possible d’augmenter la température hivernale ce qui permettrait de réduire les besoins liés au refroidissement de l’eau. A court terme, cette information sur la qualité des gamètes mâles (analyse en microscopie) et femelles (analyse du succès de reproduction) en fonction de la température permettra de déterminer s’il est possible de changer la température hivernale. A moyen terme, ces données pourraient être partagées avec d’autres scientifiques pour intégrer des modèles prédictifs de l’effet d’un réchauffement de la température hivernale de 2 ou 4°C par rapport aux conditions normales dans le milieu sauvage ce qui aurait des répercussions tant pour l’élevage en étang que pour la survie de cette espèce en milieu sauvage. Enfin à moyen et plus long terme, ce travail favorisera une meilleure compréhension des interactions entre les variations de température, la qualité des gamètes femelles à l’échelle cellulaire et moléculaire. En effet, il sera intéressant d’étudier simultanément les données sur les régulations moléculaires dans les ovocytes qui pourraient avoir pour conséquence de modifier la composition des œufs et ainsi influencer le succès de développement chez une espèce sensible aux variations de température d’eau douce tempérée.

Procédures

Les poissons du projet seront soumis à une échographie sous anesthésie générale pour déterminer leur sexe (il n’y a pas de dimorphisme sexuel chez la perche). Lors de cette anesthésie, une puce électronique est injectée sous la peau à l’aide d’une aiguille pour pouvoir ensuite identifier chaque individu (sexe et numéro) : 150 femelles et 75 mâles seront ainsi retenus pour le projet. L’ensemble des deux procédures dure 2 à 3 minutes pour chaque individu. Avant la saison de ponte, le stade de maturation ovocytaire des femelles sera déterminé pour évaluer le moment de la ponte des différents individus : pour cela, une canule sera introduite dans l’orifice génital sous anesthésie générale pour prélever quelques ovocytes. Cette procédure dure 1 à 2 minutes et concernera 90 femelles. A la fin du projet, une fécondation artificielle devra être réalisée pour étudier la qualité des pontes. Pour cela, les pontes et le sperme sont récupérés en une minute en exerçant une légère pression sur l’abdomen des individus. Cette procédure est pratiquée sans anesthésie pour ne pas compromettre la qualité des gamètes, et concernera 90 femelles et 37 mâles. Toutes ces procédures sont pratiquées couramment dans les fermes piscicoles.

Impact sur les animaux

Les manipulations de poissons nécessitent de sortir les animaux de l’eau ce qui pourrait engendrer un stress chez les animaux. De plus, l’injection d’une puce électronique et la canulation impliquent des nuisances liées à la l’introduction d’une aiguille ou d’une canule. Cela pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections quelques jours après l’intervention même si ces dernières sont rares.

Devenir

A la fin de l’expérience, hormis les femelles utilisées pour les prélèvements d’ovaires, l’ensemble des perches communes (Perca fluviatilis) seront gardées en vie. Les géniteurs (75 mâles et 90 femelles restantes) seront alors, selon les besoins expérimentaux au laboratoire à la fin de l’expérience soit réutilisés dans une nouvelle expérimentation, soit réhabilités comme géniteurs dans une pisciculture.

Remplacement

L’étude de l’effet de la température sur le contrôle de la production des ovules et spermatozoïdes implique des liens physiologiques entre différents organes parmi lesquels le cerveau, les gonades ou le foie. Ces organes diffusent par voie sanguine des hormones dont la concentration peut varier entre les conditions de vie des poissons (bassins à des températures différentes). Même si plusieurs hormones potentiellement impliquées sont connues, nous ne pouvons pas contrôler l’ensemble de ces signaux extracellulaires. Aussi, il est indispensable de nous assurer une réponse physiologique complète des individus qui permettront des régulations fines de la progression de l’ovogénèse au niveau cellulaire et moléculaire. Cette expérience implique donc de devoir travailler sur animaux entiers. Si les cultures de gonades se sont développées ces dernières années, elles ne permettent pas de réaliser un développement complet des cellules reproductrices.

Réduction

La perche commune vit en bancs dans le milieu sauvage. Pour son bien-être en conditions captives, il est nécessaire de reproduire ce mode de vie tout au long du cycle de reproduction. De plus, il est possible que des interactions comportementales ou à l’aide de phéromones puissent influencer la progression du cycle de reproduction. Nous souhaitons minimiser les différences entre les groupes et avons décidé d’établir des groupes homogènes entre les 3 conditions avec 50 femelles et 25 mâles dans chaque bassin. Une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet de focaliser nos études sur un nombre de femelles et mâles adapté à nos besoins au départ. Le nombre de 50 femelles par condition a été établi en tenant compte des prélèvements tout au long du cycles (20 femelles par bassin pour l’expérience entière), de la mortalité éventuelle observée en conditions d’élevage et du fait que nous voulons mettre en évidence la diversité de qualité des ovules (étude de 15 pontes par condition pour effectuer une analyse statistique fiable). En effet, certaines femelles peuvent ne pas engager d’ovogenèse conduisant à l’absence de ponte. Concernant les mâles, 25 seront placés dans chaque bassin, leur présence est nécessaire pour le bon déroulement du cycle de reproduction. Ce nombre nous permettra de garantir l’obtention de sperme frais pour féconder toutes les pontes étudiées même à partir d’une condition même si les mâles des autres conditions ne sont pas spermiants.

Raffinement

Les procédures de puçage, de sexage ou de canulation peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (canulation ou sexage) ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage). De ce fait, les animaux seront préalablement anesthésiés pour limiter le stress et éviter la douleur. Même si les infections sont rares, les animaux seront surveillés de façon accrue la semaine suivant l’implantation de la puce ou la canulation. Le matériel utilisé est stérile ou désinfecté. Si nécessaire, un protocole de traitement mis en place au laboratoire sera utilisé. Les étapes de prélèvement de sperme ou des pontes chez les femelles sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulé seront stimulés. Ces critères sont visibles dès les premiers instants de manipulation des poissons. L’absence de sperme chez les mâles, ou d’une cloque sur l’orifice génital chez les femelles nous conduira à replacer immédiatement l’animal dans le bassin. La stimulation des individus correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale quelques jours avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin sur quelques jours (6-7 j/par bassin) et nous disposerons de 3 bassins. Cette organisation diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en favorisant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés également.

Choix des espèces

La perche commune (Perca fluviatilis) est une espèce d’intérêt aquacole pour laquelle l’amélioration du contrôle de la reproduction peut avoir des retombées économiques importantes. De plus, contrairement à de nombreux autres modèles, il s’agit d’une espèce à ovogénèse synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément selon un cycle contrôlé par des changements de photopériode et de température. Il est donc possible de comparer l’effet de variations de ces conditions à l’échelle moléculaire et cellulaire ainsi que leurs conséquences sur la génération suivante. Théoriquement, l’ensemble des ovocytes se développent de la même manière mais ce résultat n’a pas encore été démontré au niveau des régulations moléculaires. Les connaissances actuelles sur la progression de l’ovogenèse chez cette espèce sont assez fines pour garantir une comparaison rigoureuse avec la progression de l’ovogenèse en comparant le contenu moléculaire de cellules individuelles lorsque la température varie. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares (qui ne se sont pas encore reproduits). Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondu pourraient provenir de lots différents, et la qualité des pontes est connue pour être affectée par les pontes précédentes. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever organes et échantillons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux à quatre immunisations par voie nasale ou intramusculaire sous anesthésie, jusqu'à cinq prélèvements sanguins, des lavages vaginaux, des lavages nasaux et un prélèvement de salive obtenu grâce à un médicament qui force la salivation, les femelles voyant leur cycle hormonal synchronisé avant inoculation du virus. Le projet teste des formulations d'ARN encapsulé censées déclencher une réponse immunitaire dans les muqueuses génitales contre le VIH. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont mises à mort, et le porteur précise qu'aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne sera administré, ces produits risquant d'interférer avec la réponse immunitaire mesurée.

Objectifs

L'objectif est de développer un vaccin intranasal à ARN contre le VIH. Le VIH est un virus ciblant le système immunitaire, rendant les patients plus vulnérables à d’autres infections et maladies. Le virus se propage pendant les rapports sexuels non protégés (sans préservatif ou sans médicament spécifiques), ou lors du partage d’équipement d’injection de drogues. Si non traité, le VIH peut mener au SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquis). Malgré de nombreuses années de recherche, le développement d’un vaccin efficace contre le VIH reste un défi. Le point critique est d'induire une réponse immunitaire efficace et durable aux sites de l'infection. Notre but est de tester l’efficacité de formulations vaccinales administrées par voie intranasale afin d'induire une réponse génitale étant donné que les sites muqueux communiquent entre eux. De nouvelles technologies vaccinales comme celles de l’ARN (utilisé avec succès contre le COVID-19) est une solution prometteuse. Cependant, administrés par des méthodes traditionnelles comme une injection, ces vaccins ne déclenchent pas une forte réponse au niveau génital. Dans cette étude, nous utiliserons des vaccins ARN encapsulés dans des lipides qui permettront le passage muqueux et amélioreront la réponse immunitaire. Nous testerons différentes formulations vaccinales contenant des ARN. Nous testerons différentes voies d'administration. Nous mesurerons les réponses immunitaires dans le sang et dans les parties génitales, en s’intéressant notamment à la durabilité de la réponses immunitaire. Enfin, nous étudierons l'efficacité de notre stratégie vaccinale en infectant les souris. Le VIH n’infecte pas naturellement la souris, donc nous utiliserons un virus non pathogène qui a certaines caractéristiques du VIH et qui sera administré par voie génitale.

Bénéfices attendus

Le développement de vaccins ciblant les antigènes du VIH reste compliqué et a échoué dans la plupart des essais cliniques. Le problème principal est la difficulté d'induire des anticorps neutralisants à large spectre et la haute variabilité génétique du virus. Il est donc nécessaire de développer une stratégie efficace et robuste contre le VIH. Ce projet a pour objectif de développer de nouvelles formulations vaccinales, administrées par voie intranasale qui induisent une forte réponse immunitaire dans les muqueuse vaginales, rectales et orales. Nous évaluerons la réponse anticorps, qui se développe dans la muqueuse et au niveau systémique. Les données générées dans ce projet seront essentielles pour tester par la suite la protection induite par la formulation la plus prometteuse. De plus, ce projet apportera de nouvelles connaissances dans le développement des réponses immunitaires durables dans le contexte du VIH. Ce projet permettra de déterminer la meilleure stratégie pour améliorer la réponse immunitaire au niveau génital. La voie intranasale qui est sans aiguille permettrait aussi de rendre la vaccination plus accessible et confortable.

Procédures

1) Les souris seront identifiées à leur arrivée 2) Vaccination par voie nasale ou dans le muscle sous anesthésie. Il y aura entre 2 et 4 immunisations par souris. Les prélèvements suivants seront effectués avant chaque immunisation et avant la mise à mort (5 fois maximum) 3) prélèvement d'un petit volume de sang: c’est un geste qui dure 30 secondes. 4) Lavages vaginaux avec une solution saline : geste qui dure 5 minutes. 5) Prélévement des fèces: les souris selon isolées dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à la collecte d’un nombre suffisant de fèces (20 minutes). 6) Lavage nasal (sous anesthésie) : En utilisant une pipette, un petit volume de solution saline sera doucement déposée au goutte à goutte sur une narine, permettant au fluide de sortir par l’autre narine pour le prélèvement. 7) Prélevement de la salive : Ce prélèvement sera fait lors de la même anesthésie que pour le lavage nasal (4) ). La sécrétion de salive sera stimulée avec un médicament qui fait saliver utilisé chez l'humain pour collecter une quantité suffisante de salive pour les analyses. La procédure sera réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle des souris. 8) pour les souris femelles, le cycle hormonal sera synchronisé avant l'infection virale pour faciliter l’accès du virus au tissu génital. 1 seule fois, pour les expériences d'infection. 9) Administration virale sous anesthésie: une seule fois pour les expériences d'infection 10) un anticorps sera injecté en intra-veineux quelques minutes avant la mise à mort. Ce geste sera fait une seule fois avant la mise à mort. 94% des souris (n=620) subiront ces gestes sur un intervalle de 9 semaines. Seulement 40 souris (6%) participeront à l’étude longitudinale pour évaluer la durabilité de l'immunité et subiront ces techniques sur une durée de 18 mois.

Impact sur les animaux

Un inconfort léger et transitoire peut arriver pendant l’administration du vaccin, en particulier lors de l’injection intramusculaire qui peut causer une douleur ou une inflammation locale au site d’injection. L’administration intranasale peut induire une légère irritation. Certains animaux peuvent avoir un comportement modifié pendant un petit moment. Des réactions physiologiques peuvent survenir comme une augmentation de la température corporelle ou une perte de poids temporaire, ceci rentre dans l'ordre dans les 24-48 heures. Une manipulation répétée pour les rappels vaccinaux peuvent induire un stress léger, cependant toutes les procédures seront faites par des personnes qualifiées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour préléver des échantillons et des organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser les réponses immunitaires pour établir l’immunogénicité des formulations vaccinales testées

Remplacement

Avant de tester les formulations chez les souris, nous étudierons in vitro la passage des ARN dans les capsules lipidiques sur des modèles cellulaires. Cependant, aucun modèle animal ne permet de tester la réponse vaccinale, en particulier la durabilité des réponses immunitaires. Cela peut seulement être étudié dans un animal vivant récapitulant tous les systèmes biologiques.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous inclurons autant de groupes test que possible pour un groupe contrôle, tout en gardant les expériences réalisables et les données robustes. Nous utiliserons des tests statistiques standards pour s’assurer de la validité des résultats. Si un ou plusieurs groupes démontrent une réponse immunitaire plus forte que les souris contrôles, nous répèteront l’expérience trois fois pour confirmer les résultats.

Raffinement

Après chaque vaccination et anesthésie, les souris seront surveillées pendant 30 à 60 minutes, puis 3, 24, 48 et 72 heures après vaccination. Nous surveillerons l’apparition de douleur ou d'inconfort comme une difficulté à bouger, une boîterie ou une sensibilité accrue au site d’injection. Pour la vaccination intranasale, nous vérifierons l’absence d'une forte irritation nasale ou de problèmes respiratoires. La température corporelle et le poids seront vérifiés aux temps mentionnés. Si une souris présente un signe de souffrance comme une extrême fatigue, absence de mouvement, un gonflement, des problèmes de respiration ou perd plus de 20% de son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Étant donné que nous étudions une réponse immunitaires après une vaccination, nous ne pouvons pas donner d’analgésiques ou d’anti-inflammatoires car ils pourraient interférer avec les réponses immunitaires.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus adapté pour étudier les réponses immunitaires spécifiques à un vaccin. La plupart des expériences d’immunogénicité seront réalisées avec des souris âgées de 7 semaines à 6 mois car avant 7 semaines les souris n’ont pas un système immunitaire mature et après 6 mois la réponse immunitaire peut être altérée. Étant donné qu’il a été démontré que l’âge peut modifier les réponses vaccinales, certaines expériences avec la formulation vaccinale la plus prometteuse chez les souris jeunes seront répétées chez des souris âgées de plus de un an.

Opérées une heure sous anesthésie générale pour recevoir des implants de télémétrie qui enregistrent les contractions de l'utérus, des brebis reçoivent ensuite six injections intramusculaires en trois jours pour les soins post-opératoires. 8 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes replacées en élevage à l'issue et réutilisables dans "d'autres protocoles expérimentaux". L'équipe les suit plusieurs mois au fil de leur cycle, pour tester à terme sur des brebis des contraceptifs non hormonaux destinés aux femmes, et le porteur ajoute que le projet "pourrait permettre d'améliorer les pratiques d'élevage" des brebis inséminées pour la production de fromage. Le résumé ne dit pas si les implants sont retirés avant le retour en élevage, et cite des traitements de synchronisation de l'œstrus parmi les sources de stress sans les inscrire dans la liste des procédures.

Objectifs

Le développement de méthodes de contraception non hormonale chez la femme pour s’affranchir des risques associés aux traitements hormonaux est un sujet central de la recherche reproductive actuelle. L’évaluation de potentiels contraceptifs s’appuie sur des tests pré-cliniques sur modèles animaux de laboratoire de type rongeur. Toutefois le modèle rongeur ne permet pas de réaliser toutes les analyses nécessaires. Des modèles animaux de plus grande taille, comme la brebis, permettent par exemple de quantifier la distribution des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle par une méthode d’imagerie endoscopique. Un contraceptif de type gel vaginal, qui bloque le passage des spermatozoïdes au niveau du col de l’utérus, a été validé chez la brebis par cette méthode d’imagerie en 2023. Les grands animaux peuvent également être équipés d’implants de télémétrie permettant des mesures d’activité physiologique en continu et sans intervention humaine. Afin de valider le modèle brebis comme modèle animal de test de contraceptif, nous devons caractériser un élément important de la reproduction : la physiologie de l’utérus et plus précisément les contractions utérines. En effet, si les spermatozoïdes se déplacent dans le tractus génital par leur mobilité propre, ce sont les contractions utérines qui sont en grande partie responsables de leur remontée vers l’ovaire. Il existe désormais des implants sous cutanés télémétriques qui permettent de mesurer une activité myoélectrique d’un tissu. Des études récentes ont initié la caractérisation par télémétrie de l’activité utérine chez la brebis et la truie. Dans notre projet, nous souhaitons équiper des brebis avec des implants de télémétrie pour quantifier les contractions utérines (fréquence et intensité des contractions) dans diverses conditions physiologiques (stade du cycle) et comparer les résultats aux données existant chez l’humain. Une fois équipées, ces brebis pourront ensuite permettre le test de contraceptifs potentiels à visée utérine.

Bénéfices attendus

1. Biologie fondamentale : Données non biaisées : la télémétrie va permettre d’obtenir des données non biaisées de caractérisation de l’activité utérine chez la brebis car il est attendu que l’interaction de l’animal avec l’humain peut perturber l’activité utérine. Relation statut hormonal / activité utérine : Les mesures d’activité seront réalisées au cours du cycle oestral et permettront de relier le statut hormonal (oestrogènes / progestérone) et l’activité utérine. Nous pourrons également mesurer pour la première fois l’activité de chaque corne utérine en simultané et étudier d’éventuels mécanismes de synchronisation / désynchronisation des cornes utérines. Modèle alternatif à l’éxpérimentation animale : A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificiel (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel. 2. Biologie appliquée : Etude pré-clinique de contraceptifs humains non hormonaux : Dans le cadre d’un large projet de recherche international, des contraceptifs non hormonaux sont recherchés. Le contrôle des contractions utérines par un dispositif non hormonal comme moyen de contraception est une méthode envisagée et pourra s’appuyer sur notre modèle. Amélioration de la fertilité après insémination : La production de fromages de brebis s’appuie presque essentiellement sur l’utilisation de l’insémination animale après synchronisation de l’oestrus. Cette insémination nécessite la manipulation des brebis qui peut altérer l’activité utérine et limiter l’efficacité de l’insémination. Une étude de 2002 a déjà montré que la contention, même limitée, perturbe les contractions utérines et donc potentiellement le transport des spermatozoïdes, facteur clé de la réussite de fécondation. Ce projet pourrait permettre d’améliorer les pratiques d’élevage et l’efficacité de l’insémination.

Procédures

Chaque brebis subira une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’une heure, une injection par voie intraveineuse pour l’induction de l’anesthésie (30 secondes avec contention), et 6 injections par voie intramusculaire pour les traitements post-opératoires (2 injections par jour pendant 3 jours, 1 minute à chaque fois avec contention). Les animaux vivront quelques moments de stress de 5 à 10 minutes lors des déplacements, manipulations et contentions.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une chirurgie qui peut entrainer des douleurs post opératoires. La mise en place des implants va perturber de manière transitoire l’activité utérine. Les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour l’induction de l’anesthésie, puis l’administration des traitements post-opératoires et des synchronisations de l'oestrus. Ces injections par voie intra veineuse et intra musculaire peuvent induire une douleur ainsi qu’un hématome.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont replacés en élevage et pourront être utilisés pour d’autres protocoles expérimentaux ou des phases d'élevage.

Remplacement

La mesure de l’activité utérine de la brebis nécessite la réalisation de mesures chez l’animal vivant. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale. A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificielle (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel.

Réduction

Le projet vise à obtenir des informations provenant de deux types d’implants donc deux lots d’animaux sont nécessaires. Le nombre de 4 animaux par lot a été calculé pour avoir un nombre minimal de 3 animaux par lot en tenant compte d’un éventuel défaut expérimental (chirurgie ou équipement de télémétrie) pour 1 animal sur 4. Les animaux seront analysés pendant plusieurs mois, ce qui permettra d’obtenir des réplicats biologiques sur chaque animal. Les tests statistiques réalisés seront des tests non paramétriques en données répétées car chaque animal sera son propre témoin. Par exemple, au cours du cycle oestral, les paramètres de contraction utérine seront comparés, pour plusieurs cycles successifs, entre le moment de l’oestrus et la phase lutéale au sein de chaque cycle oestral de chaque animal.

Raffinement

Les brebis sont logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée, en groupe social stable. Les brebis proviennent d’un EU fournisseur très proche de notre plateforme ce qui limitera le stress du déplacement. Pour un transit digestif optimal, du foin de qualité sera distribué matin et soir. La douleur est traitée préventivement avant l'acte chirurgical dès induction de l'anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu'à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l'état normal est estimé à 3 à 4 jours post-opératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. De plus, les implants utérins permettront de mesurer en continu la température interne et l’activité locomotrice. Une éventuelle augmentation de la température, signe d’une infection, pourra être détectée et conduire à un traitement antibiotique adapté. L’activité locomotrice sera mesurée comme paramètre de bien être animal. Deux caméras vidéo, présentes dans le logement et couplées aux implants par télémétrie, permettront de suivre les animaux en temps réel dans leur logement et de détecter tout signe de douleur ou mal être. La douleur est également prévenue par l’administration de sérum physiologique stérile et tiédi dans la cavité abdominale : ce geste prévient la formation des adhérences qui peuvent être très douloureuses. Du fait des visites régulières, les animaux seront socialisés et familiarisés à l’humain. Des récompenses après les contentions et manipulations renforceront cette socialisation. Un animal anorexique, prostré, en décubitus latéral prolongé recevra l'administration d'analgésique. Sans réponse physiologique satisfaisante rapide, il sera fait appel au vétérinaire agréé. La décision d’euthanasie par voie médicamenteuse et sous anesthésie sera prise en concertation avec les différents acteurs du projet.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi comme modèle expérimental par ses points communs avec l’anatomie humaine concernant la morphologie du tractus génital femelle et la physiologie utérine. Chez ces deux espèces, les contractions utérines sont sous contrôle nerveux et hormonal (l’oestrogène stimule et la progestérone inhibe les contractions utérines). Les brebis seront des femelles multipares et cycliques pour exprimer une activité utérine d’un adulte capable de reproduction.

Sept jours enfermées seules dans une cage calorimétrique, sans congénères et sans enrichissement : 2 160 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant hormonal sous la peau lors d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, puis des injections deux fois par semaine, une partie recevant en plus un régime gras pendant près de trois mois. Le déséquilibre hormonal ainsi provoqué doit reproduire un syndrome ovarien chronique et entraîne, selon le texte, prise de poids, résistance à l'insuline, anxiété accrue et agressivité perturbant la cohabitation. Les femelles utilisées ont 5 à 7 semaines, un stade prépubère retenu pour observer l'effet d'une perturbation hormonale prolongée sur le développement ovarien.

Objectifs

Certaines maladies chroniques touchant les ovaires peuvent entraîner des troubles hormonaux importants chez les femmes. Ces affections apparaissent souvent dès l’adolescence et peuvent évoluer au cours de la vie. Elles se manifestent notamment par des irrégularités menstruelles, une production excessive d’hormones masculines, une difficulté à ovuler ou à concevoir un enfant, ainsi que par la formation de petits kystes dans les ovaires. Ces troubles sont parfois associés à une prise de poids, à des problèmes de peau (acné), à une pilosité excessive ou à une chute de cheveux. Ils peuvent également augmenter le risque de développer d'autres maladies comme le diabète, l’hypertension ou certains troubles cardiovasculaires. L’origine de ces pathologies reste encore mal comprise, bien que des facteurs génétiques et liés au mode de vie soient probablement impliqués. Ces maladies peuvent aussi avoir un impact psychologique important, notamment en raison de l’infertilité ou de la modification de l’apparence physique. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contribuent à l’apparition et au maintien de ces troubles, afin d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, qui présente des caractéristiques proches de celles observées dans ces maladies. Nous testerons si l’activation ou la régulation de certains processus biologiques naturels permet de limiter les manifestations les plus marquantes de la maladie. L’objectif est d’identifier de nouvelles stratégies pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes concernées, en agissant à la source des déséquilibres hormonaux et métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider, au sein de plusieurs modèles expérimentaux, une nouvelle approche thérapeutique ciblant les déséquilibres biologiques impliqués dans une maladie hormonale chronique des ovaires. Cette affection fréquente chez les femmes en âge de procréer est souvent sous-diagnostiquée. Elle constitue l’une des principales causes de troubles de la fertilité, et elle s’accompagne fréquemment de complications métaboliques, cardiovasculaires et psychologiques, ayant un impact significatif sur la santé globale et la qualité de vie des personnes concernées. Le développement d’un traitement capable de corriger les dérèglements hormonaux et métaboliques associés à cette pathologie pourrait contribuer à améliorer la fonction reproductive, à prévenir les complications à long terme, et à limiter l’apparition de maladies associées. En améliorant la prise en charge globale, cette approche permettrait aussi de réduire les coûts médicaux et sociaux liés à ces troubles. À terme, cette stratégie pourrait déboucher sur des solutions thérapeutiques innovantes et mieux tolérées, destinées à améliorer durablement la santé des patientes.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (environ 30 minutes), précédée et suivie d’une analgésie. Certaines souris recevront un régime alimentaire riche en graisses jusqu’à la fin de la procédure (durée du régime : 80 et 87 jours). Elles recevront des injections sur animaux vigiles, deux fois par semaine (quelques secondes). Certaines souris recevront également 4 à 5 injections d’une molécule supplémentaire (quelques secondes) sur animaux vigiles en 1 semaines ou en 4 semaines. La composition corporelle sera mesurée deux fois par une méthode non invasive, sans anesthésie (durée inférieure à 2 minutes). Elles seront également hébergées individuellement en cage (durée 7 jours) pour permettre de mesurer en continu des paramètres physiologiques tels que la consommation d’oxygène, la production de dioxyde de carbone, l’activité locomotrice.

Impact sur les animaux

Les souris recevront un implant hormonal sous-cutané destiné à reproduire les déséquilibres endocriniens caractéristiques de certaines maladies chroniques des ovaires. Cette intervention chirurgicale peut entraîner une réaction inflammatoire locale et un inconfort transitoire au site d’implantation. L’anesthésie générale utilisée peut provoquer une hypothermie, une dépression respiratoire, voire des troubles du réveil. Une mauvaise cicatrisation de la plaie, une dessiccation des tissus ou une gêne post-opératoire peuvent également survenir. Le déséquilibre hormonal induit peut entraîner une prise de poids, une résistance à l’insuline, des troubles glycémiques, une baisse de l’activité physique, une sécheresse cutanée, une modification du pelage, une anxiété accrue, ainsi qu’une augmentation de l’agressivité pouvant perturber la cohabitation des animaux. Une altération du comportement exploratoire est également observée dans certains cas. Certaines souris recevront des injections intrapéritonéales répétées, ce qui peut générer un stress lié à la contention, une douleur transitoire au point d’injection, ainsi qu’un risque d’irritation locale ou d’adhérences. Des infections, bien que rares, peuvent survenir aux sites d’injection ou de prélèvement. Les animaux seront également placés, pendant une semaine, en hébergement individuel dans des cages calorimétriques. Ce dispositif, indispensable à la mesure de paramètres métaboliques individuels, impose l’absence temporaire de cohabitation et d’enrichissement, ce qui peut induire un stress social et sensoriel. Le passage en cage calorimétrique ainsi que la manipulation répétée des animaux au cours du protocole peuvent également constituer des facteurs de stress supplémentaires.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Le laboratoire réalise un grand nombre d’expérimentations pour lesquelles les animaux ont été remplacés par des méthodes alternatives. Ces approches incluent notamment l’utilisation de modèles in vitro et d’outils in silico, utilisés dans les phases exploratoires pour limiter le recours aux animaux. Cependant, l’avancée du projet nécessite la mise en place d’expériences, justifiées, qui impliquent de l’expérimentation animale. L’étude des déséquilibres hormonaux et métaboliques liés aux maladies chroniques des ovaires implique des interactions complexes entre systèmes endocrinien, ovarien, nerveux et immunitaire, qui ne peuvent être fidèlement reproduites dans des systèmes alternatifs. Aucun modèle in vitro ou in silico ne permet actuellement d’évaluer l’impact d’une modulation hormonale prolongée sur l’ensemble des fonctions métaboliques, comportementales et reproductives. Le modèle animal reste donc indispensable pour valider les effets des interventions thérapeutiques dans un organisme entier, dans des conditions mimant au plus près la physiopathologie humaine.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2160 souris. Afin de limiter le nombre d’animaux témoins, les expérimentations seront regroupées autant que possible. Plusieurs tissus seront prélevés et analysés par différentes approches biologiques afin d’exploiter pleinement les données obtenues. Ces échantillons seront également partagés avec des collaborateurs, ce qui contribuera à réduire le nombre total d’animaux nécessaires. La taille des effectifs a été déterminée à l’aide d’un calcul de puissance, permettant d’utiliser le nombre minimal d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Des analyses statistiques seront effectuées pour interpréter correctement les effets observés et garantir la robustesse des conclusions.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur et seront optimisées en collaboration avec le personnel de l’animalerie afin d’assurer le bien-être des animaux. Les souris auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum, et leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification pour favoriser leur confort et leur comportement naturel. Une surveillance rigoureuse et régulière sera mise en place pour identifier rapidement tout signe de mal-être, tel que des yeux mi-clos, une réduction de l’activité ou des comportements anormaux, permettant ainsi une intervention précoce si nécessaire. Des points limites spécifiques à chaque type d’expérience seront définis afin de minimiser toute douleur ou souffrance. Une perte de poids significative, une altération marquée de l’état général ou l’apparition de signes cliniques sévères (difficultés respiratoires, prostration) entraîneront une évaluation immédiate et, si nécessaire, l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. Les réactions au site d’implantation et aux injections seront surveillées régulièrement afin de détecter précocement toute inflammation, infection ou complication locale. Des interventions seront prévues en cas de nécessité, incluant l’application d’antiseptiques ou l’administration d’analgésiques adaptés aux animaux présentant des signes de douleur. En cas de difficulté d’alimentation, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage pour garantir un apport nutritionnel suffisant. L’ensemble du personnel impliqué dans ce projet est spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale et suit une formation continue afin d’assurer des manipulations sécurisées et respectueuses du bien-être animal. Toutes les interventions seront réalisées dans le strict souci de réduire l’inconfort des animaux, notamment grâce à l’utilisation d’anesthésie et d’analgésie adaptées ainsi que de lampes chauffantes pour limiter l’hypothermie post-anesthésique. Les femelles présentant des signes d’agressivité liés à l’hyperandrogénie seront placées en hébergement individuel pour éviter les blessures et le stress liés aux interactions sociales conflictuelles. Si nécessaire, des ajustements en temps réel seront apportés aux conditions d’hébergement et aux protocoles expérimentaux afin d’améliorer le bien-être des animaux tout en garantissant la rigueur scientifique du projet.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur des considérations scientifiques et méthodologiques. La souris est un modèle bien établi, bénéficiant d’une expertise approfondie en élevage, en techniques expérimentales et en suivi vétérinaire. Le choix de la souris repose sur des critères scientifiques et pratiques. Il s’agit d’un modèle largement utilisé, pour lequel les connaissances en matière de manipulation, d’élevage et de suivi vétérinaire sont bien établies. Ce modèle permet de reproduire de manière fiable les manifestations cliniques observées dans certaines pathologies humaines, notamment en ce qui concerne les déséquilibres hormonaux, les troubles métaboliques et comportementaux. Les animaux utilisés dans ce projet présentent des caractéristiques compatibles avec l’étude des effets d’un déséquilibre hormonal prolongé. Ils sont viables, fertiles et ne présentent pas d’anomalies phénotypiques connues. Les expérimentations seront réalisées chez des femelles âgées de 5 à 7 semaines, correspondant à une période prépubère. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour étudier l’impact des perturbations hormonales sur le développement ovarien et les fonctions métaboliques à long terme.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer 48 heures seule en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent quinze jours d'un médicament qui reproduit les symptômes du syndrome de Gitelman, jusqu'à quinze jours de gavages deux fois par jour avec un risque de fausse route, deux prélèvements sanguins sous anesthésie, ou une chirurgie sans réveil pour prélever leurs reins. Le porteur écrit qu'aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure, et qu'une souris dont l'état se dégrade en cage à métabolisme est ramenée en hébergement classique avant le franchissement des points limites, sa mise à mort pouvant ensuite être envisagée.

Objectifs

Le syndrome de Gitelman est une maladie génétique rare conduisant à une perte rénale de sel qui s’accompagne d’une déshydratation modérée, d’une perte rénale de potassium et de magnésium ce qui provoque une baisse de leur concentration plasmatique (hypokaliémie et hypomagnésémie). La prévalence de cette maladie est de 1 sur 40000. Ce syndrome est dû à des mutations inactivatrices d’un gène codant pour un co-transporteur sodium et chlorure. A noter, qu’il existe un inhibiteur pharmacologique (la famille des thiazides) utilisé dans le traitement de l’hypertension qui reproduit les effets de ces mutations. L’hypokaliémie chronique entraine souvent de la fatigue et des troubles du rythme cardiaque. Des protéines participent à la conservation du potassium et ce projet vise à étudier si deux d’entre elles pourraient être mises en jeu dans le syndrome de Gitelman pour limiter la perte de potassium et l’hypokaliémie.

Bénéfices attendus

La découverte récente d’un lien entre un facteur de croissance, un transporteur rénal de potassium et la capacité du rein à retenir le potassium, nous a amené à envisager que cette voie pourrait être mis en œuvre dans le contexte du syndrome de Gitelman. Notre projet, qui utilisera 624 souris mâles et femelle invalidées ou non pour les gènes codant soit pour facteur de croissance soit pour transporteur de potassium permettra d’évaluer le rôlr de cette voie dans ce contexte pathologique ce qui pourrait permettre d’envisager d’agir dessus pharmacologiquement au bénéfice des malades. Par ailleurs, la mesure de du facteur de croissance dans le plasma ou l’urine des patients, pourrait devenir un outil diagnostique pour évaluer l’état de déplétion potassique de la personne considérée.

Procédures

Certains animaux seront traités avec un agent pharmacologique pendant 15 jour afin de mimer les symptômes du syndrome de Gitelman selon différentes méthodes : par injection 1 fois par jour sur animal vigile (quelques secondes par animal), ou via l’alimentation ou l’eau de boisson en prise spontanée.. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Pour une autre partie des animaux et afin de mesurer l’effet du traitement pharmacologique, deux recueils urinaires sur animal vigile seront réalisés ce qui nécessitera de les placer 48 heures en cage à métabolisme (24h d’habituation et 24h pour le recueil). Toujours pour évaluer l’effet du traitement, nous effectuerons, également, 2 prélèvements sanguins à 9 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal). Afin de documenter la voie de signalisation impliquée dans les effets du traitement pharmacologique, une partie des animaux sera soumise à 6 ou 15 jours de gavages deux fois par jour (30 secondes par animal) avec l’inhibiteur d’une protéine et subira un prélèvement sanguin unique sous anesthésie (1 minute par animal) pour analyser si l’inhibition de cette protéine affecte l’effet du traitement. Toutes les souris sont euthanasiées en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions prévues chez la souris sont connus car celles-ci ont été et sont utilisées en routine dans d’autres projets. Une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (risque d’arrêt cardio-respiratoire) pouvant entrainer une hémorragie (stress hémodynamique). Pour le prélèvement de leurs reins, certains animaux seront également sujet à une chirurgie sans réveil sous anesthésie et antalgie susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire (risque d’arrêt cardio-respiratoire). En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement (stress social) et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite (inconfort). Des animaux subiront également un gavage qui pourrait conduire à une fausse route (étouffement).

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure. A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences physiopathologiques sur l’équilibre de la balance potassique induit par un syndrome de Gitelman. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 624 souris. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous l’avons calculé au plus faible à l’aide de tests statistiques et sur la base de notre expérience. Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et qui pourraient impacter négativement certains résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles ou si nous constatons que certaines de nos hypothèses concernant l’implication de nos protéines d’intérêt ne sont pas validées.

Raffinement

Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre sur cette grille ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier en n’étant plus en contact permanent avec la grille, ce dispositif n’altérant pas le recueil d’urine. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation classique avant que son état ne se détériore si ces points devaient être franchis. Le suivi de ces points limite continuera afin de vérifier s’ils reviennent à la normal. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagé. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil. L’ensemble des expériences sera mené dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur, par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associés à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles, jeunes adultes matures sexuellement (âgées de 8 à 15 semaines), afin d’étudier le syndrome de Gitelman car c’est souvent dans cette période de la vie que les symptômes de cette maladie se manifestent chez l’Homme.

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

Mutées pour le récepteur des œstrogènes, une partie des 120 souris de ce projet présente déjà un excès d'androgènes et une fonction ovarienne perturbée, à l'image du syndrome des ovaires polykystiques humain. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leurs ovaires sont échangés par chirurgie avec ceux de souris témoins, en cinq minutes par animal, puis un accouplement est imposé un mois après la greffe pour voir si un ovaire devenu non fonctionnel peut mener une gestation. Le porteur décrit une douleur prise en charge par un analgésique morphinique local et n'annonce aucun autre effet indésirable, les femelles étant tuées en fin de procédure pour prélèvement de l'utérus et des ovaires.

Objectifs

La prévalence des problèmes d'infertilité féminine et du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez les femmes en âge de procréer varie entre 6 et 20 %, selon les critères de diagnostic utilisés. Plusieurs facteurs interdépendants, tels que l'excès d'androgènes, l'hypersécrétion de l'hormone lutéinisante (LH), des anomalies dans la sécrétion de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) et la résistance à l'insuline, contribuent à la variabilité des manifestations cliniques du SOPK. Ces caractéristiques sont observées chez des souris mutées pour le récepteur des œstrogènes. Le projet vise principalement à étudier le rôle des mutations du récepteur des œstrogènes dans le contrôle de la fertilité. Dans ce but, nous remplacerons les ovaires des souris contrôles par les ovaires de souris mutés pour le récepteur des oestrogènes, et vice versa. Un mois après la greffe, nous analyserons i) les taux hormonauxcirculants dans le sérum de ces souris et ii) la fonction ovarienne par une analyse anatomopathologique. Enfin, après avoir réalisé des accouplements contrôlés de ces souris greffées, nous déterminerons si ces ovaires greffées non fonctionnels retrouvent leur fonction et permettent de mener à bien une gestation. Nous suivrons ainsi la prise de poids de ces souris et analyserons la gestation en observant le nombre de bébés nés et éventuellement le nombre de fœtus implantés et les résorptions. Des souris intactes serviront de contrôles pour ces expériences.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d'étudier l'impact des mutations du récepteur des oestrogènes dans le syndrome des ovaires polykystiques et de différentier les actions respectives des oestrogènes dans l'ovaire et dans l'hypothalamus. A terme, ceci permettra de mieux comprendre la physiopathologie des troubles de la fonction ovarienne conduisant à l'infertilité dans le syndrome des ovaires polykystiques,

Procédures

Les greffe d'ovaires sont réalisées pendant 5minutes par souris avec observation quotidienne pendant 1 semaine. Un accouplement contrôlé des souris est réalisé après un mois de greffe.

Impact sur les animaux

Les greffes d'ovaires peuvent générer une douleur dûe à la chirurgie mais qui sera traitée par un analgésique injecté en sous-cutané avant et après la chirurgie, un analgésique local et pris en compte par une surveillance accrue de l'animal par le zootechnicien, avec enrichissement du milieu et chirurgie sur plaque chauffante.

Devenir

Tous les animaux sont à mis mort en fin de procédure afin de prélever les différents tissus : utérus, ovaires pour études biomoléculaires et analyses histologiques.

Remplacement

Les effets des œstrogènes, principalement synthétisés par les ovaires, impliquent de nombreuses fonctions dans l’organisme. Ces effets complexes ne peuvent être modélisés par des approches in vitro. De plus, l'étude de la fertilité, y compris la gestation et la lactation, nécessite l'observation sur animaux vivants. C'est pourquoi le recours à l'expérimentation animale est indispensable dans ce contexte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous utiliserons principalement les femelles, étant donné que cette recherche concerne la fertilité. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum nécessaire, sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé pour assurer des résultats statistiquement significatifs, permettant de distinguer les effets du génotype, du temps et/ou du traitement. Le nombre de souris a été déterminé en utilisant généralement un test statistique, afin de préciser l'effet des variables étudiées.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris adulte car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation.

Pour étudier le rôle du cil primaire des cellules rénales dans les maladies rénales chroniques, 17 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson pendant vingt-quatre heures ou deux semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein ou son obstruction permanente sous anesthésie, parfois suivie d'une réversion chirurgicale quatre jours plus tard, et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que la maladie peut entraîner à un stade avancé une baisse de l'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité, et que les souris atteignant les points limites sans possibilité de soulagement sont tuées. Ce chiffre de 17 320 n'est adossé qu'à la mention d'un test statistique comparant les groupes deux à deux.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des pathologies génétiques ou acquises caractérisées par une détérioration de la fonction et de la structure du rein avec l’apparition de multiples kystes rénaux ou l’accumulation de cellules immunitaires et cicatricielles. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Ce projet a pour objectif d’étudier le rôle du cil primaire, une extension filiforme de la membrane des cellules rénales dans les maladies rénales. Le cil primaire joue un rôle important dans ces maladies en régulant la forme et les propriétés mécaniques du rein ainsi que le recrutement de cellules qui participent à la destruction du rein. En permettant une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de la destruction du rein, ce projet va servir de base à l’élaboration de nouveaux traitements à destination des patients atteints de maladies rénales chroniques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but une meilleure compréhension des maladies rénales chroniques kystique et fibrosante pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement actuellement, afin d’améliorer les traitements et la prise en charge des patients.

Procédures

-Induction d’une maladie rénale chronique par administration d’antibiotique dans l’eau de boisson en continu sur animaux vigiles. Cette intervention dure 24 heures ou 2 semaines et est réalisée une seule fois. -Ablation chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction permanente chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes) suivi d’une réversion chirurgicale de cette obstruction 4 jours plus tard également sous anesthésie générale et analgésie (20 minutes). Ces interventions sont réalisées une seule fois. - Injections intrapéritonéales de molécule induisant la perte des cellules mutantes dans le rein sur animal vigile : les injections durent 10 à 20 secondes. 1 à 5 injections sont réalisées à 24 heures d’intervalle. -Prélèvement de sang sous anesthésie générale. Cette intervention dure 2 minutes et est réalisée une seule fois.

Impact sur les animaux

La contention peut provoquer un stress chez l’animal. L’ajout d’antibiotique dans l’eau de boisson peut induire un goût amer. La maladie rénale chronique peut entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité́. La chirurgie induit une douleur modérée et passagère. Le prélèvement sanguin sous anesthésie peut occasionner une douleur passagère. Les injections intra-péritonéales induisent une douleur légère et passagère.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l'étude pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoïdes rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, et l’ensemble des populations cellulaires observées in vivo. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. De plus, lors des chirurgies, un seul rein sera manipulé, permettant de conserver le rein controlatéral comme contrôle interne.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Pour diminuer l’amertume liée à la prise d’antibiotique, du sucre est ajouté dans l’eau de boisson. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Dans l’attente de leur réveil, les souris opérées sont placées sur une table chauffante jusqu’aux premiers signes de réveil puis transférées dans une cage propre avec de la nourriture à disposition. Le prélèvement sanguin est réalisé à l’aide d’un mini-capillaire sous anesthésie générale. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin du développement rénal. Les maladies rénales chroniques étudiées dans ce projet affectent majoritairement les patients adultes. L’induction de la maladie sera effectuée sur des souris âgées de 4 semaines afin que la maladie se développe progressivement à l’âge adulte entre 12 et 18 semaines.