Système urogénital

Des femelles gestantes reçoivent une dose unique de tamoxifène par pipette, sous contention de vingt à trente secondes, pour désactiver trois gènes chez leurs embryons. 214 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à comprendre comment ces gènes commandent la formation du rein fœtal, sans perspective thérapeutique annoncée au-delà de la connaissance elle-même. Le porteur écrit que le tamoxifène "ne cause aucun effet secondaire" et fonde ses calculs sur 20 embryons, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 214 souris déclarées.

Objectifs

Certaines malformations du rein et de l’appareil urinaire font partie des anomalies les plus graves que l’on peut détecter à la naissance. Dans les cas les plus sévères, elles peuvent entraîner la mort du nouveau-né. Dans d’autres cas, ces malformations peuvent causer des maladies rénales chroniques qui apparaissent plus tard, à l’adolescence ou à l’âge adulte. Ces maladies sont souvent liées à d’autres problèmes de santé, comme le diabète ou l’hypertension (pression artérielle trop élevée), qui sont les principales causes de mortalité chez les personnes atteintes. Depuis 1990, le nombre de cas de maladies rénales chroniques a augmenté de 29 %. Malgré l’ampleur du problème, il n’existe aujourd’hui aucun traitement permettant de guérir ces maladies. Dans notre laboratoire, nous cherchons à mieux comprendre comment se forment les reins. Pour cela, nous étudions un groupe de gènes qui pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Nous étudions les embryons parce que les reins se forment pendant la grossesse. Pour comprendre l’origine des malformations, il faut observer le développement dès le début, pas une fois que l’organe est déjà formé. Le tamoxifène est un médicament que l’on utilise comme un “interrupteur” pour activer un changement dans les gènes, de manière très ciblée, chez les souris de laboratoire. Dans notre modèle, certaines souris ont été génétiquement modifiées pour posséder un gène qui peut être désactivé (ou "supprimé") à un moment précis de leur vie. Mais ce gène ne se désactive pas tout seul : il faut un signal pour déclencher cette suppression. Ce signal, c’est le tamoxifène. Quand on administre le tamoxifène à ces souris, il agit comme une clé qui active une enzyme spéciale déjà présente dans leur organisme (appelée Cre recombinase, une sorte de petit outil moléculaire). Cette enzyme est inactive tant que le tamoxifène n’est pas là. Une fois activée, cette enzyme va repérer des "balises" spéciales placées autour du gène ciblé et va alors le couper ou le désactiver, comme si on retirait une pièce d’un circuit électrique. Ce mécanisme permet aux chercheurs d’étudier l’effet de la disparition de ce gène, à un moment précis et dans un tissu particulier, sans affecter tout l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement d'un groupe de 3 gènes altère la formation du rein fœtal. Ces malformations peuvent aboutir à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours. Les éléments de réponse à cette question permettront d’approfondir notre connaissance dans ce domaine.

Procédures

Chaque animal sera nourri par une dose unique de tamoxifène. Temps de contention de l’animal : 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation, nous envisageons une seule procédure qui consiste à administrer à des femelles gestantes du tamoxifène par voie orale, il ne s’agit pas de gavage mais par la méthode pipet feeding (alimentation par pipette) qui est moins invasive. Le tamoxifène ne cause aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon la réglementation, car il n’est pas possible de les maintenir en vie après l’expérimentation en raisons de contraintes éthiques et sanitaires.

Remplacement

Une des étapes de ce projet nécessite une quantité très importante des cellules progénitrices du rein. Afin de remplacer l’animal nous avons mis au point, dans notre laboratoire, un protocole qui nous nous permet d’obtenir des cellules progénitrices du rein en quantité suffisante sans avoir recours à l’animal. Afin d’étudier d'autres aspects du fonctionnement de ces gènes, nous aurons besoin d'invalider les trois gènes à la fois, ce qui n'est possible que sur le rein des embryons mutants.

Réduction

Selon nos calculs basés sur des tests statistiques, nous nous basons sur 20 embryons mais si nous constatons des variations moins grandes que prévues, nous reverrons le nombre d’embryons à la baisse.

Raffinement

Des points limites seront appliqués : perte de poids >15 %, signes de suffocation, altération persistante de l’état général (prostration, perte de mobilité, difficulté d’alimentation/hydratation), ou douleur manifeste non contrôlée. Tout animal présentant un de ces critères sera immédiatement retiré de l’étude et mis à mort (décrit selon 3.3.3) Une surveillance régulière, adaptée aux périodes critiques, sera appliquée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris comme modèle de recherche, car elle partage de nombreuses ressemblances génétiques et biologiques avec l’être humain. De plus, son patrimoine génétique peut être facilement modifié et étudié en laboratoire. Cela nous permet de créer des souris porteuses de maladies rénales semblables à celles que l’on observe chez l’humain. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines, car c’est à cet âge qu’elles sont le plus fertiles.

530 poissons produits par lignée étudiée, sur trois générations de croisements, pour n'analyser au bout du compte que les ovaires des femelles homozygotes. 2 650 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson subit sous anesthésie le prélèvement d'un fragment de nageoire caudale de moins de 2 mm² pour génotypage, puis reste isolé jusqu'à 24 heures dans l'attente du résultat. Les femelles retenues sont tuées par surdosage d'anesthésiant et leurs ovaires prélevés, l'écart entre les 2 650 individus élevés et le petit nombre réellement analysé restant sans chiffrage.

Objectifs

L’insuffisance ovarienne prématurée (IOP) touche jusqu’à 4 % des femmes et constitue une cause majeure d’infertilité féminine. Bien que l’IOP ait souvent une origine génétique, la cause sous-jacente demeure inconnue dans 70 % des cas, soulignant ainsi la nécessité urgente d’un diagnostic clinique plus efficace pour une meilleure prise en charge de l’infertilité. L’identification des causes génétiques de l’IOP est un défi en raison du grand nombre de gènes impliqués dans le développement et le fonctionnement normal des ovaires, ainsi que de la difficulté à établir un lien de causalité entre les mutations identifiées chez les patientes et le diagnostic clinique. Ce projet vise à relever ces défis en exploitant un modèle de poisson vertébré pour démontrer la relation causale entre des gènes candidats spécifiques et l’IOP. Notre hypothèse est que l’analyse fonctionnelle de ces gènes dans notre modèle permettra vérifier si une mutation est responsable d’un dysfonctionnement de l’ovaire, contribuant ainsi à améliorer le diagnostic clinique. De plus, nous réaliserons une caractérisation approfondie de la folliculogenèse à l’aide d’imageries 3D de pointe et en analysant quels gènes sont exprimés dans chaque cellule, afin d’éclairer les voies moléculaires impliquées dans l’IOP et d’identifier d’éventuelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo combinée à des approches de phénotypage avancées, à la fois macroscopiques (phénotypage reproductif et analyse 3D des ovaires) et transcriptomiques, représente une avancée méthodologique majeure. En effet, à ce jour, aucun modèle animal n’existe pour l’étude de ces gènes dans la fonction ovarienne. Cette approche innovante pourrait donc combler un vide important dans le domaine de la recherche sur l’IOP et offrir un modèle fiable et reproductible pour étudier l'impact de ces mutations sur la fonction ovarienne. Enfin, ce projet s’appuie sur des données de séquençage issues d’une cohorte de patientes IOP et bénéficie d’une reconnaissance institutionnelle, notamment par l’Agence de Biomédecine. Son impact dépasse ainsi le cadre fondamental, avec des perspectives d’applications biomédicales concrètes pour le diagnostic et la prise en charge de l’IOP.

Procédures

Les animaux subiront dans un premier temps un prélèvement de morceaux de nageoire caudale pour génotypage afin d'établir une lignée mutante. Les femelles mutantes seront prélevées pour leurs ovaires post-mortem. Le prélèvement des œufs ne nécessite pas d’anesthésie, les œufs sont prélevés à la main après capture de la femelle. Les œufs une fois pondus restent accrochés à l’abdomen de la femelle ce qui facilite leur collecte. Les animaux subiront, sous anesthésie, un prélèvement d’un petit fragment de nageoire caudale (moins de 2 mm²) afin de permettre leur génotypage et l’établissement des lignées mutantes. L’anesthésie est réalisée par balnéation en anesthésiant assurant l’absence de réflexes et de douleur pendant la procédure qui ne dure que quelques minutes (moins de 3 minutes/poisson). L’isolement temporaire des poissons est inférieur à 24h, le temps d'obtenir le résultats de génotypage. Après identification des femelles mutantes, celles-ci seront prélevées à des stades spécifiques du protocole. Elles seront euthanasiées par surdosage de d'anesthésiant, et la mort sera confirmée par l’arrêt des mouvements respiratoires et l’absence de réflexes. Les ovaires seront ensuite prélevés post-mortem pour les analyses prévues. »

Impact sur les animaux

Les gènes ciblés dans ce projet jouent un rôle crucial dans le développement et la fonction ovarienne, notamment dans la maturation folliculaire, la régulation de la division cellulaire, la stabilité génétique et la transcription. Leur invalidation est susceptible d’entraîner des altérations de la fertilité, de la croissance folliculaire ou de la qualité des ovocytes. Cependant, l’inactivation génique peut également provoquer des effets hors cible, c’est-à-dire des mutations involontaires en dehors des gènes ciblés. Ces effets sont difficilement prédictibles et peuvent avoir des conséquences variables sur d'autres fonctions physiologiques, allant d’effets bénins à des perturbations plus significatives. Bien que des stratégies de validation et de sélection des lignées soient mises en place pour limiter ces risques, il n’est pas possible de les exclure totalement. Par ailleurs, la procédure de génotypage nécessite une biopsie de la nageoire caudale pratiquée sous anesthésie. Cette intervention peut entraîner une douleur légère et transitoire, bien que des mesures de raffinement soient mises en œuvre pour en limiter l’impact (anesthésie, taille réduite du prélèvement

Devenir

les animaux sont euthanasiés après 3 générations pour l’analyse de leurs organes.(ovaires)

Remplacement

Les cellules épithéliales ovariennes peuvent être étudiées dans des modèles in vitro de culture. Cependant, ces modèles ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de l’environnement ovarien in vivo, notamment la présence de cellules germinales à différents stades de la folliculogenèse. En outre, ils ne prennent pas en compte l’ensemble des autres types cellulaires qui composent l’ovaire et qui interagissent pour réguler son développement, telles que les cellules immunitaires, les cellules somatiques de soutien , et les cellules endothéliales, entre autres. Ces interactions cellulaires jouent un rôle crucial dans le bon fonctionnement de l'ovaire et dans la régulation des processus de folliculogenèse. De plus, il n'existe actuellement pas d’alternative viable pour étudier le rôle des gènes ciblés dans ce projet au sein d'un modèle expérimental qui reflète cette complexité biologique. L'expérimentation in vivo permet de comprendre de manière réaliste les interactions entre ces différents types cellulaires et leur impact sur le développement ovarien. Par conséquent, elle reste indispensable pour étudier le rôle des gènes ciblés et leurs effets sur la fonction ovarienne dans son ensemble.

Réduction

Dans ce projet, nous prévoyons de produire 530 poissons pour chaque lignée étudiée. Ces poissons proviennent d’un programme d’élevage en plusieurs étapes. D’abord, des poissons génétiquement modifiés (appelés F0) sont croisés avec des poissons "sauvages" (c’est-à-dire sans modification génétique). Cela donne une première génération (appelée F1) composée pour moitié d’individus porteurs d’une seule copie de la mutation étudiée (hétérozygotes). Ensuite, pour obtenir la génération F2, nous croisons ces F1 hétérozygotes avec d'autres poissons sauvages. Ce croisement permet d’obtenir, une moitié des animaux hétérozygotes, un quart d’animaux qui possèdent deux copies de la mutation (appelés homozygotes mutant) et un quart qui n’en portent aucune (animaux dits homozygotes "sauvages"). C’est parmi ces homozygotes que seront sélectionnés les poissons pour les expériences, car ils expriment pleinement les effets de la mutation. Une génération F3 sera produite à partir de poissons F2 porteurs d’une seule copie de la mutation (hétérozygotes), selon les mêmes principes de répartition génétique. Tout au long du processus, le nombre d’animaux produits sera limité au strict nécessaire pour garantir des résultats fiables dans les différentes analyses prévues (observation des effets visibles, étude de l’expression des gènes, et imagerie 3D des ovaires). Cela permet de respecter au mieux le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la qualité scientifique du projet.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums contenant 9,5 litres avec la densité de 25 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte, le prélèvement d’oeufs ou la mise en balnéation seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique des gènes cibles) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la structure bien être animal de notre établissement sera immédiatement avertie. . Pendant la procédure de biopsie pour le génotypage, les animaux sont anesthésiés par balnéation dans une solution de tricaïne. L'efficacité de l’anesthésie est confirmée par le ralentissement net des mouvements respiratoires et l’absence de réponse à un pincement de la nageoire caudale. Une biopsie d’environ 2 mm2 est prélevée à l’extrémité de la nageoire caudale à l’aide de ciseaux fins désinfectés. Cette procédure, brève et peu invasive, ne génère qu’un inconfort léger et transitoire. Afin de limiter la douleur potentielle, l’anesthésie est maintenue pendant toute la durée de la manipulation, et les animaux sont replacés en eau propre pour un réveil progressif. Après la biopsie, les animaux sont isolés individuellement pour une durée maximale de 24 heures, en attendant les résultats du génotypage. Bien qu’en aquarium individuel, le contact visuel avec leurs congénères est préservé afin de limiter le stress lié à l’isolement. Bien que cette méthode soit sans risque notable et maîtrisée, tout poisson montrant des signes de mal-être ou de comportement anormal dans les 24h suivant la biopsie est immédiatement retiré de l’expérimentation et euthanasié selon les procédures définies.

Choix des espèces

Les poissons téléostéens, tels que le medaka (Oryzias latipes), représentent une alternative plus efficace que les modèles de rongeurs pour l’étude de pathologies au diagnostic complexe. L'absence de placenta et le développement externe des œufs transparents, facilitent l’observation des premières étapes du développement. Le Medaka pond environ 20 œufs par jour, offrant ainsi un accès direct au développement embryonnaire et larvaire précoce — des informations souvent inaccessibles dans les modèles mammaliens. De plus, comme le génome du médaka est entièrement séquencés, l’étude des fonctions des gènes peut être réalisée efficacement grâce aux technologies de modification génétique, permettant de répliquer facilement des mutations génétiques observées chez des patientes. En outre, 66 % des gènes liés aux maladies humaines ont un équivalent clair chez le médaka, ce qui en fait un modèle excellent pour mieux comprendre les pathologies génétiques humaines, comme l’IOP. Les animaux F2 homozygotes sauvages et mutants seront utilisés à l'âge adulte, soit à partir de 3 mois, au moment de leur maturité sexuelle, afin d'analyser leur capacité de reproduction pendant une période minimale de 70 jours. Concernant les analyses d’imagerie : la moitié des femelles sera euthanasiée dès 3 mois pour évaluer l’état de leur composition ovarienne, tandis que l'autre moitié sera euthanasiée après les 70j de phénotypage de reproduction. Cela permettra de relier chaque phénotype de reproduction observé à la composition ovarienne correspondante. Pour la génération F3, les femelles euthanasiées entre 3 mois et 3 mois et 70 jours (dépendamment des résultats de phénotypage des pontes obtenues sur les F2 et leur ovaire sera prélevé pour des analyses transcriptomiques poussées permettant de connaitre l’expression des gènes au niveau cellulaire.

Un antibiotique choisi pour sa toxicité rénale est injecté à 48 petites roussettes juvéniles, de jeunes requins, afin de détruire une partie de leurs néphrons et d'observer comment le rein se reconstruit. Elles subissent une à quatre anesthésies et restent trois semaines en aquarium, dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger. Le RNT chiffre la nuisance de l'injection à quelques secondes et celle qui suit à trois semaines, sans autre qualification que "faible", alors que la lésion rénale est le but même du protocole. Toutes seront tuées à l'issue pour que leurs reins soient coupés en lames d'histologie, environ trois cents par individu.

Objectifs

Le rein est un organe essentiel pour, entre autre, maintenir l’homéostasie des fluides dans le corps, pour la régulation de la pression artérielle et pour l’élimination des déchets. L’unité fondamentale du rein est le néphron, composé d’une structure où se fait la filtration du sang et d’un ensemble de tubules acheminant le produit de filtration. Les néphrons sont issus d’une population de cellules souches présentes dans le rein uniquement pendant l’embryogenèse chez les mammifères. Suite à une lésion, les mammifères peuvent réparer les néphrons existants mais ne peuvent pas former de nouveaux néphrons. A l’inverse, les requins et les raies sont capables de former de nouveaux néphrons tout au long de la vie. Cela a également été montré de manière expérimentale chez la raie hérisson suite à une néphrectomie partielle chez l’adulte. La possibilité de former de nouveaux néphrons chez les poissons cartilagineux tout au long de la vie est liée à la persistance des cellules souches dans le rein au-delà de l’embryogenèse. Ces animaux sont donc des modèles très intéressants pour étudier les mécanismes moléculaires sous-tendant la régénération des néphrons. La mise à jour de ces mécanismes dans ces espèces pourrait permettre la réactivation du processus de formation de nouveaux néphrons chez les mammifères et ainsi aider à la récupération de la fonction rénale dans le cas de maladie chronique. Notre objectif est donc ici d’étudier la cinétique de régénération rénale chez la petite roussette, un petit requin abondant dans l’Atlantique Nord. Les lésions rénales seront induites par une méthode moins drastique que la néphrectomie partielle qui demande en outre une maîtrise chirurgicale de pointe. Comme alternative, nous utiliserons un antibiotique connu pour son effet nephrotoxique et non létal à des doses modérées. Ce modèle de régénération rénale induite par des lésions à la gentamicine a déjà été décrit sur des poissons téléostéens (poisson zèbre) adultes.

Bénéfices attendus

Bien que les propriétés de régénération rénale chez les requins soient connues depuis plus de 30 ans, aucune étude n’a encore envisagé d’analyser de manière histologique et moléculaire la cinétique de régénération rénale chez ces animaux suite à une lésion néphrotoxique d’ordre chimique. La mise en évidence de nouveaux néphrons chez la raie hérisson après une ablation partielle du rein a pu montrer que le processus de régénération n’était pas simplement physiologique mais pouvait aussi être induit lors d’une ablation partielle du rein, c’est-à-dire dans un contexte traumatique. Quels changements moléculaires subissent les cellules souches du néphron pour s’engager dans la formation de nouveaux néphrons suite à une lésion néphrotoxique? C’est la question que nous proposons d’explorer dans ce projet au travers du protocole d’injection d’un antibiotique dans des roussettes juvéniles. Ce projet nous permettra donc de déchiffrer les mécanismes moléculaires mis en œuvre dans la formation de nouveaux néphrons dans un contexte pathologique. La possibilité d’induire ces mécanismes moléculaires dans le but de réactiver la formation de nouveaux néphrons pourra alors un jour être testée chez les mammifères, ce qui pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques dans le cadre de maladies rénales chroniques.

Procédures

Les juvéniles seront soumis à une injection sous anesthésie puis placés dans un bac de réveil. Pendant la durée de l’expérience (3 semaines), les juvéniles sont maintenus dans des aquariums de 100 L. Les roussettes juvéniles seront soumises, selon les groupes, à une, deux, trois ou quatre anesthésies de quelques minutes chacune.

Impact sur les animaux

Nuisances lors de la pêche des juvéniles L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est d’une dizaine de secondes (transfert du bac où les juvéniles ont éclos vers la pièce voisine). Nuisances lors de la procédure d’injection L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est de quelques secondes (injection de 100 microlitres de solution) Nuisances après l’injection L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est de 3 semaines.

Devenir

Tous les juvéniles utilisés dans notre expérience seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et procéder à des analyses.

Remplacement

Les animaux choisis dans cette étude (les requins) possèdent une propriété biologique bien particulière: la possibilité de former de nouveaux néphrons tout au long de la vie et ceci dans un contexte à la fois physiologique (génération perpétuelle de néphrons) et traumatique (régénération de néphrons après une lésion mécanique). Cette propriété n’est pas présente chez les mammifères indiquant qu’elle s’est perdue au cours de l’évolution. Il est donc nécessaire de se tourner vers les requins pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette régénération. Ces mécanismes, qui impliquent d’analyser le comportement des cellules souches du néphron, doivent être étudiés dans l’animal entier. En effet, on sait aujourd’hui que le microenvironnement des cellules souches est un élément crucial pour indiquer si ces cellules doivent se différentier ou s’auto-renouveler. Nous avons également consulté l’annuaire des compétences en méthodes substitutives (AREA) afin de vérifier qu’il n’existe pas de modèles organoïdes chez les requins en France. Il n’en existe pour aucun organe chez ce groupe d’animaux. La règle de remplacement de l’animal entier ne peut donc pas être appliquée dans ce projet.

Réduction

Seulement 3 juvéniles seront analysés à chaque point de collecte (4 points de collecte en tout: Jour 2, semaine 1, semaine 2 et semaine 3). Les analyses suivant l’injection vont se faire sur des coupes d’échantillon enrobé dans de la paraffine. Chaque juvénile peut fournir environ 300 coupes de paraffine (épaisseur de chacune: 10 micromètres) offrant ainsi un nombre important de support pour collecter des mesures. Par exemple, au point de collecte «semaine 1», 3 juvéniles vont être prélevés. Chaque juvénile va fournir 300 coupes. Cent coupes pourront entrer dans l’analyse 1 offrant la possibilité de faire 100 mesures. Trois juvéniles étant analysés, 300 mesures peuvent être collectés. L’expérience étant répétée deux fois, nous pouvons obtenir 2 x 300 mesures pour l’analyse 1. L’utilisation de seulement 3 juvéniles est donc largement suffisante pour fournir un nombre important de mesures et pour permettre de réaliser des tests statistiques. La règle de réduction peut être appliquée.

Raffinement

Nous allons utiliser un anesthésique à deux reprises lors de la manipulation des juvéniles: lors de l’injection des solutions puis avant la mise à mort. Avant la mise à mort des animaux, ceux-ci seront maintenus dans des aquariums jusqu’à 3 semaines après l’injection des solutions. Dans chaque aquarium, un enrichissement environnemental sera proposé aux animaux sous la forme de pièce en pvc de taille adaptée pour que les animaux puissent se cacher à l’intérieur si besoin. Une nourriture variée et adaptée sera proposée à satiété aux juvéniles: colin, calamar et crevettes rose. Pendant cette période de 3 semaines où les animaux seront dans les aquariums, ils seront observés quotidiennement. Nous avons établi une grille de suivi des juvéniles après l’injection. Grâce à cette grille nous nous assurerons que les animaux injectés avec de la solution expérimentale se comportent comme les animaux injectés avec la solution contrôle. Le suivi des animaux inclut des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

L'espèce choisie est la petite roussette. Cette espèce appartient au rang taxinomique des poissons cartilagineux qui regroupent les requins, les raies et les chimères. Une étude a montré en 2003 que les poissons cartilagineux possédaient la capacité de régénérer le rein après une néphrectomie partielle. L'union internationale pour la conservation de la nature (UICN) a défini le statut de conservation de la petite roussette comme "préoccupation mineure". Comme nous étudions un processus de régénération, nous ne pouvons pas travailler sur l’embryon. L’embryogenèse d’un organisme correspond à une étape de croissance et développement intense qui ne peut être assimilé à de la régénération. La régénération ne peut être analysée qu’au stade post-embryonnaire. Comme il s’agit d’expériences qui n’ont encore jamais été réalisées, il nous semblait difficile de les réaliser d’emblée sur des adultes. Notre choix s’est donc porté sur les juvéniles. Ils sont de petites tailles et facile à manipuler. Les roussettes seront utilisées au stade juvénile. Comme nous étudions un processus de régénération, nous ne pouvons pas travailler sur l’embryon. L’embryogenèse d’un organisme correspond à une étape de croissance et développement intense qui ne peut être assimiler à de la régénération. La régénération ne peut être analysée qu’au stade post-embryonnaire. Comme il s’agit d’expériences qui n’ont encore jamais été réalisées, il nous semblait difficile de les réaliser d’emblée sur des adultes. Notre choix s’est donc porté sur les juvéniles. Ils sont de petites tailles et facile à manipuler.

45 920 souriceaux se font couper un bout de queue à sept ou dix jours, en cinq secondes, sur animal éveillé, et tatouer les coussinets. Ces gestes servent uniquement à lire le génotype de chaque animal et à trier un élevage destiné à des projets sur les maladies rénales chroniques. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, le porteur retenant le stress de la contention et une douleur brève. Celles dont le génotype ne convient pas sont tuées, comme celles qui ont fini de servir à la reproduction, les autres partant vers des projets d'expérimentation autorisés séparément.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des maladies génétiques ou acquises caractérisées par une détérioration de la fonction et de la structure du rein. Pour la majorité́ de ces maladies, aucun traitement ne permet d’éviter l’évolution vers la perte complète de fonction des reins qui nécessite des traitements lourds comme la dialyse ou la transplantation. Ce projet a pour objectif la création et le maintien de lignées de souris génétiquement modifiés permettant l’étude des mécanismes aboutissant à la destruction des reins. Les modifications génétiques concernées n’entrainent soit pas de conséquences dommageables pour les souris soit le développement d’une maladie rénale dont l’apparition des signes cliniques est postérieure à ce projet. Cette demande de projet concerne strictement l’élevage, le marquage et le génotypage de ces animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de générer et de maintenir des modèles de souris permettant l’étude des mécanismes de maladies rénales chroniques pour lesquelles aucun traitement n’est actuellement disponible. Une meilleure compréhension de mécanismes responsables de la destruction du rein permettra d’améliorer les traitements à destination des patients atteints par ces maladies.

Procédures

Prélèvement de tissu caudal sur animal vigile (1 fois, 5sec)

Impact sur les animaux

La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une souffrance légère et transitoire. Induction spontanée d’une maladie rénale chronique et déclin de la fonction rénale. Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade.

Devenir

A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux sont mis à mort après accouplement ou si leur génotype n’est pas celui attendu. Les animaux de génotype souhaité mais non utilisés pour le maintien des colonies feront l'objet d'une utilisation continue dans le cadre de projets d'expérimentations faisant l’objet d’une demande d’autorisation séparée.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires rénales. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires ne permettent pas l’étude d’un rein entier. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible de substituer les modèles murins.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien les projets de recherche.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Des points limites spécifiques ont été établis. Tout animal en souffrance recevra un soin adapté (anti-septique, compression). Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort. Afin de limiter les nuisances liées à la maladie rénale chronique, les biberons d’eau et la propreté des cages seront contrôlés régulièrement.

Choix des espèces

La souris permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Afin de permettre l’identification des souris et l’analyse de leurs gènes avant leur sevrage, le tatouage des coussinets et le prélèvement de queue sont effectués entre 7 et 10 jours de vie.

4 317 souris vont être utilisées dans ce projet, chaque femelle traitée recevant deux immunosuppresseurs deux fois par jour pendant soixante-dix jours, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les micro-prélèvements de sang reviennent chaque semaine pendant dix semaines, avec douze prélèvements en douze heures pour dix-huit d'entre elles, et trois mesures de tension artérielle sous contention de dix à quinze minutes. Le porteur indique que des cultures de reins fœtaux humains, réalisées dans son laboratoire, ont déjà montré un effet négatif de ces médicaments sur le développement rénal, et affirme que ces cultures ne peuvent pas reproduire une exposition longue. Les mères et leurs premiers petits sont tués pour le prélèvement des organes, et les souris de la seconde génération, issues de grand-mères traitées, sont tuées à la naissance.

Objectifs

Depuis les années 1980, de nombreuses femmes porteuses de greffes d’organes ou sous immunosuppresseurs (IS) pour une maladie auto-immune, ont mené des grossesses à terme. De plus, des greffes d’utérus sont maintenant envisageables pour des femmes nées sans utérus, souhaitant mener une grossesse. Pendant et juste avant la grossesse, le traitement IS doit être optimisé pour contrôler le risque de rejet, protéger l’immunité anti-infectieuse, et préserver le fœtus de la toxicité des médicaments. Les IS fréquemment utilisés pendant la grossesse chez les femmes porteuses de greffes d’organe ou traitées pour une maladie auto-immune sont ceux que nous allons tester. Quelques études (données épidémiologiques et travaux ex vivo) ont déjà été menées pour suivre la toxicité des IS sur le rein et sur la fertilité. Les traitements aux IS, qui ne peuvent pas être interrompus pendant la grossesse, exposent le fœtus à une concentration potentiellement élevée de ces médicaments. Après la naissance, des études ont estimé que les concentrations sanguines de médicaments étaient faibles et sans conséquence pour le développement ultérieur de l'enfant. Néanmoins aucune étude n'a été effectuée pour suivre le développement de l'enfant jusqu'à l’âge adulte et pour contrôler ses fonctions rénales et reproductives. Pourtant, cette exposition in utero pourrait provoquer une maladie rénale chronique chez l’enfant, ainsi que de l'hypertension artérielle et des problèmes de fertilité, qui sont des pathologies pour lesquelles un dépistage précoce peut amener à une prise en charge adaptée. Ce projet vise à étudier, chez la souris, l’impact de deux immunosuppresseurs sur 1) la gestation, 2) la toxicité sur le rein, 3) la fonction de reproduction des descendants exposés in utero 4) la fonction rénale des descendants exposés in utero. Cette étude doit non seulement permettre de déterminer les effets possibles des IS sur les fonctions rénale et reproductive (étude de la fertilité) de la mère, mais également un suivi de la descendance sera effectué pour déterminer si son développement est normal et si les fonctions rénales et reproductives ne sont pas altérées. Le modèle choisi (souris) pour mener ces expériences présente l’avantage d’étudier les effets des IS sur la mère et sa descendance, sur un temps court, limitant les risques liés à l'immunosuppression.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n’existe pas de données épidémiologiques concernant le risque d’hypertension artérielle ou de maladie rénale chronique à long terme et en particulier à l’âge adulte après exposition in utero à ces médicaments, alors que la santé des enfants nés de femmes transplantées d’organe est une préoccupation majeure des parents et des praticiens qui les suivent. L’impact des IS in utero sur la fertilité de la descendance est quant à lui totalement inconnu et non étudié à ce jour. Ce projet se concentre sur deux IS et pourrait permettre de mettre en évidence l’existence d’une hypertension artérielle, d’anomalies de la fonction rénale ou de troubles de la fertilité chez les descendants et de caractériser les anomalies dans les reins, et les organes reproducteurs. A plus long terme, d’autres études sur l’impact de nouveaux IS pourront être menées ultérieurement par l’équipe pour étudier l’effet séparé ou en combinaison de ces différents traitements. Les résultats escomptés permettront d’améliorer le conseil prénatal des femmes qui envisagent une grossesse sous IS, de favoriser le dépistage et la prévention chez les enfants et les jeunes adultes qui ont été exposés in utero à ces traitements IS

Procédures

Administration douce (volontaire) de deux immunosuppresseurs, 1-2 minutes,deux fois par jour pendant 70 jours. Micro-prélèvements sanguins (30 secondes) 1 fois par semaine , pendant 10 semaines et pour un groupe de souris (n=18), 12 micro-prélèvements additionnels,sur 12 heures. Mesure de la tension artérielle, induisant une contention de 10 à 15 minutes, 3 fois par animal. Prélèvement d'urine par contention (10 secondes, 1 fois)

Impact sur les animaux

Effets des IS sur les mères traitées et sur leur descendance : 1- risque de néphrotoxicité : le dosage de la créatinine, mesuré par des micro prélèvements répétés de sang, permet de faire le dépistage de l'insuffisance rénale. Ces micro-prélèvements de sang répétés entraineront du stress, une douleur légère. Recueils d’urine : léger stress de la contention. 2-risque d'hypertensension artérielle : léger stress de la contention pendant la mesure de la pression artérielle.

Devenir

Tous les animaux traités et les premiers descendants sont euthanasiés pour prélèvement des organes nécessaires aux analyses. Les animaux de seconde génération, issus de grand-mères traitées, seront euthanasiés à la naissance.

Remplacement

Des études réalisées chez des femmes exposées aux IS suite à une transplantation rénale, ont estimé que les concentrations sanguines de médicament chez le nouveau-né était très faible et sans conséquence pour son développement ultérieur dans les premières années de vie. Par ailleurs, des études ex vivo de reins fœtaux humains exposés aux IS et réalisés au laboratoire, ont montré un effet négatif sur le développement rénal, après 7 jours d’exposition. Ces cultures ex vivo ne peuvent cependant pas mimer un temps long d’exposition aux IS. Pour connaitre l’impact des expositions in utero des IS, et mettre en évidence l’existence d’une hypertension artérielle, d’anomalies de la fonction rénale ou de troubles de la fertilité chez les descendants, le modèle souris présente l’avantage de pouvoir réaliser une exposition avant, pendant et après la gestation couvrant toute la période de l’allaitement, ce qui n’est pas possible sur le modèle ex vivo de la culture d'organes déjà réalisée. De plus il permet d’étudier sur un temps court les effets des IS sur la mère et sa descendance.

Réduction

Pour l’expérience pilote , le nombre de souris femelles utilisées est restreint au minimum soit 3 souris par traitement IS. Trois doses différentes par IS seront distribuées aux souris. Par conséquent, pour les deux IS testés, 18 souris femelles de 5 semaines seront utilisées. Pour l’expérience complète , le nombre de souris est ajusté en utilisant un test statistique et correspondant au nombre minimal d’animaux nécessaires pour des analyses statistiques valides. La procédure pliote permettra d’établir la dose à administrer dans la seconde procédure ce qui limitera à un seul groupe de traitement. Comme les deux IS seront repris dans le même mélange huile de tournesol/lait concentré, un seul groupe placebo pourra être exploité et utilisé comme contrôle pour les deux IS.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. De l’enrichissement est ajouté : matériel de nidification et un objet pour se mettre à l’abri. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront de prévenir la survenue de problèmes potentiels. Une grille du suivi du bien-être des animaux est établie et inclue les critères de poids corporel, d’’apparence générale et de comportement. Le comportement maternel (allaitement, déplacement et toilettage des petits) sera également contrôlé. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques à chaque procédure seront appliqués, comme la perte de poids ou une altération de l'apparence et du comportement. Pour limiter le stress des animaux, l’administration des médicaments se fera par une nouvelle méthode volontaire, par voie orale, alternative douce à la technique du gavage ; Après 2 semaines d’entrainement, aucune contention n’étant nécessaire pour la prise du médicament, le stress est diminué. Le volume de sang nécessaire aux analyses nous permet de réaliser des micro prélèvements, peu invasifs ; le recueil des urines et la mesure de la tension artérielle nécessitent une légère contention de l’animal (avec isolement des animaux pendant 15 minutes comprenant la préparation de l’animal, son acclimatation à l’environnement et la mesure).

Choix des espèces

Le modèle choisi pour mener ces expériences est la souris car il présente l’avantage d’étudier sur un temps court les effets des IS sur la mère et sa descendance. Afin de conserver une variabilité inter-individus comme cela est observée chez l’Homme, nous utiliserons l’espèce non consanguine qui est couramment utilisée pour étudier l’effet de substances chimiques ou pharmacologiques. Cette lignée possède également d’autres avantages comme une taille de la portée au sevrage d'environ 12 souriceaux et une faible mortalité post-natale, ce qui augmente la puissance statistique. Des souris adultes et matures sexuellement (femelles traitées aux IS) et leur petits (mâles et femelles) sont suivies pour déterminer leur capacités reproductrices.