Système urogénital

436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune recevant dix à vingt administrations orales sur deux à quatre semaines. Une partie subit une chirurgie qui prive le rein de circulation sanguine, d'autres reçoivent des molécules toxiques pour les reins, dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer une dénutrition, une prostration et une altération de l'état général. La mesure de la fonction rénale impose deux anesthésies à deux heures d'intervalle, l'une pour fixer un capteur sur le dos de l'animal, l'autre pour le retirer, et l'opération se répète plusieurs jours différents sur la même souris. Le bénéfice annoncé, des thérapies ciblant les cellules rénales lésées plutôt que le système immunitaire dans son ensemble, reste à l'état de projet, quand l'insuffisance rénale, elle, est bien induite chez les 436 souris.

Objectifs

Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Le rein est constitué d'unités fonctionnelles de filtration, appelées néphron. Le néphron comprend deux compartiments : le glomérule et le tubule. Nous avons mis en évidence que la voie de signalisation d’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) est activée dans les tubules et les glomérules de patients atteints de maladies rénales. Afin de caractériser le rôle de cette voie dans les maladies du glomérule, nous avons étudié les conséquences de la suppression d’un gène impliqué dans la signalisation de l’interleukine, dans cette structure rénale. Nous avons ainsi montré que ce gène favorise la survie des glomérules lors d'une agression rénale chez la souris, permettant ainsi de réduire les conséquences néfastes de cette agression. Nous devons maintenant caractériser son rôle dans les tubules, ce qui représente le premier objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de la suppression du gène d’intérêt dans les tubules rénaux sur le développement d'une maladie rénale chez la souris. Afin de confirmer que l'activation de la voie de l'interleukine est bénéfique dans le contexte des maladies rénales, nous avons utilisé une molécule qui active sa voie de signalisation. Comme nous l'espérions, cette molécule a réduit les conséquences d'une agression glomérulaire chez la souris. Nous devons maintenant montrer si ce rôle protecteur est médié ou non par le gène d’intérêt. C'est le deuxième objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de l'administration de la molécule dans le développement d'une maladie rénale chez des souris produisant ou non le gène d’intérêt dans les glomérules ou les tubules.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie des cellules rénales conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie aigüe vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.

Procédures

(1) Administrations par voie orale ou injections : L’agent utilisé pour induire la modification génétique des souris sera administré par voie orale (pendant deux à quatre semaines, soit 10 ou 20 fois) à l’état vigile. L’administration orale dure 30 secondes. La molécule à tester sera injectée deux fois, diluée dans une solution non irritante. Cette injection est réalisée à l’état vigile. Pour l’induction des modèles expérimentaux, les animaux recevront une injection sous anesthésie gazeuse ou deux injections à l'état vigile. Chaque injection dure 30 secondes environ. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux au moment de l’euthanasie, sous anesthésie, sur un plateau chauffant ; durée entre 5 et 10 minutes. (3) Pesées : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (4) Mesure de la fonction rénale : une partie des souris du projet sera soumise à la mesure de la fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (2) Administrations par voie orale : Elles peuvent occasionner du stress, de l’inconfort, l’irritation de la gorge et des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes qui se traduire par un animal qui se met à gasper. Le composé administré peut entrainer une inflammation potentiellement douloureuse, d'intensité modérée. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : une de ces molécules peut entrainer une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Tous les animaux (436) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de six ou dix animaux (mâles et femelles sauf pour un modèle) sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 436 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance : Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes , de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour l’administration par voie orale : Ella aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables souples et plus ergonomiques. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Une pesée régulière permet de surveiller les points limites. (3) Raffinement injections : Toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Les volumes d'injection sont adaptés. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un gel ophtalmique est appliqué pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : Pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie : Les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux directement dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments chirurgicaux sont stérilisés.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Pour inactiver le gène d'intérêt, le composé est administré aux souris à l’âge de 5 semaines pour ne pas avoir des animaux trop vieux ensuite. Pour le reste des procédures, les souris seront âgées entre 9 et 11 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

Les rates donneuses sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les mères porteuses opérées le sont au plus tard au sevrage de leurs petits, faute de pouvoir être réutilisées après une chirurgie. 3 725 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, seules les femelles dont le cycle a été synchronisé sans opération pouvant repartir vers un autre projet, jusqu'à quatre fois. Les donneuses reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle sous contention, les mères porteuses quatre injections et une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, avec un risque d'automutilation de la cicatrice que le porteur signale. L'activité est vendue comme prestation de service, et le porteur écrit que la quantité d'animaux "a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats", sans approche statistique.

Objectifs

Notre travail est de créer, d’amplifier et d’archiver des lignées de rats génétiquement modifiées. Ces lignées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre coeur de métier est la création, l'amplification et l'archivage de lignées génétiquement modifiées de rats pour le service des chercheurs et de la commumauté scientifique. Notre rôle est de fournir aux chercheurs des lignées précises, établies et robustes en améliorant sans cesse nos techniques afin de répondre aux exigences de réduction et raffinement. La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente.

Procédures

Les rates donneuses d'embryons vont subir 2 injections d'hormones à 48h d'intervalle pour stimuler la production d'embryons. Cet acte rapide se fait sur animaux vigiles et sous contention. Les rates mères-porteuses seront d'abord soumise à une injection de composé chimique pour synchroniser leur cycle (acte rapide, sur animaux vigiles sous contention), puis quelques jours plus tard (J+5), elles recevront lors de la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination artificilelle : Une injection d'analgésique 30 minutes avant l'injection du cocktail anesthésique (actes rapides, sur animaux vigiles sous contention). Une fois l'endormissment suffisamment profond, la chirugie est réalisée. Elle dure environ 5 minutes par animal. Avant le réveil des animaux, une dernière injection d'anti-inflammatoire combinée à une réhydratation sera pratiquée. Chaque femelle mère-porteuse recevra au total 4 injections. (composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire/réhydratation).

Impact sur les animaux

Les rats peuvent ressentir un léger stress de courte durée lors des manipulation/contentions pour réaliser les différentes injections. Lors des injections des différents produits utilisés dans cette procédure (hormones, composé pour la synchronisation, analgésique, anesthésique et anti-inflammatoire), les animaux vont sentir une légère douleur de courte durée, le temps de l'introduction de l'aiguille. Les composés injectés sont tous très bien tolérés, mais le site d'injection sera surveillé pour s'assurer qu'il n'y a pas d'inflammation, d'infection ou de lésions de grattage. En post-opératoire, l'animal peut ressentir une gêne, entièrement prise en charge par la couverture antalgique. La plaie générée par la chirurgie sera étroitement surveillée car elle peut s'inflammer ou s'infecter dans de très rares cas. Les animaux en post chirurgie peuvent s'attaquer à leur cicatrice : soit enlever les agrafes, soit ronger la peau autour (automutilation).

Devenir

Les donneuse d'embryons pour la création et l'archivage des lignées créées seront mises à mort pour récupérer les embryons au stade souhaité. Pour les mères-porteuses, dès lors qu'il y a eu la chirurgie de transfert d'embryon ou de gamètes, elle seront mises à mort soit le lendemain de la mise bas théorique (donc à J+23 de la chirurgie) pour pratiquer une césarienne, si elles n'ont pas mis bas naturellement, ou au plus tard au sevrage de leurs petits (soit 3-4 semaines post partum). Nous ne pouvons pas les réutiliser comme reproductrices ou de nouveau mère porteuses, ayant déjà subi une chirurgie. En revanche, pour les femelles mères porteuses dont le cycle a juste été synchronisé, donc sans avoir été opérées, elle peuvent être réutilisées dans la limite de 4 fois en respectant un temps de repos de minimum 21 jours entre les injections de synchronisation pour un autre projet dans le cadre de nos activités de service.

Remplacement

Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour toutes ces techniques de création, d'amplification et d'archivage de lignées de rats génétiquement modifiées. L'état actuel de nos connaissances ne permettent pas de s'affranchir d'utiliser des animaux en recherche fondamentale ou appliquée.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. L’amélioration des techniques permet sans cesse de répondre aux exigences de réduction et de raffinement. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés. Ces techniques sont utilisées en prestation de service, la quantité d'animaux utilisée a été adaptée pour chaque procédure afin de remplir les conditions stipulées dans les contrats avec les clients. Il n'y a donc pas d'approche statistique.

Raffinement

Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour palier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme (effets de l'anesthésie dissipés et reprise de mobilité), dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe dans la mesure du possible, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.

Choix des espèces

Le rat est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Il est couramment utilisé par les chercheurs pour des créations de lignées transgéniques. Les femelles utilisées pour produire les embryons sont prépubères car elles répondent mieux aux traitements hormonal de superovulation. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes matures. La souche choisie est connue pour être d’excellentes mères, très calmes, qui peuvent donner naissance à de grandes portées de nouveau- nés, ce qui permet de réduire significativement le nombre de femelles mères porteuses utilisées.

Déplacées d'un établissement utilisateur à un autre au cours du protocole, 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 2 458 d'entre elles et modéré pour 456, toutes tuées pour collecte d'organes. Les mâles sont rendus obèses par un régime riche en graisses, avec hyperglycémie à jeun et résistance à l'insuline, et subissent jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, un jeûne de vingt-quatre heures, des gavages de glucose et des injections d'insuline. Les femelles gestantes passent trois échographies sous anesthésie et sont contenues jusqu'à dix minutes chaque jour de leur gestation pour la mesure de la pression artérielle, les fœtus étant analysés en fin de gestation. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni aucun organoïde ne permet d'étudier l'effet d'un régime alimentaire sur les spermatozoïdes, et qu'un mammifère est requis pour transposer les résultats à l'humain.

Objectifs

De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.

Procédures

Interventions réalisées dans l'EU050: - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'EU053: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.

Comprendre pourquoi les hommes obèses sont moins fertiles, et ce que leurs spermatozoïdes transmettent à leur descendance, sert de cadre à ce projet. 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour collecte d'organes. Rendues obèses, hyperglycémiques et résistantes à l'insuline par un régime riche en lipides suivi jusqu'à vingt-quatre semaines, elles subissent des jeûnes de vingt-quatre heures, des gavages de glucose, des injections d'insuline et d'hormones, jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, et pour les femelles gestantes une mesure quotidienne de pression artérielle sous contention de dix minutes. Sur les effectifs, le porteur écrit s'assurer d'utiliser "le nombre d'animaux minimal", sans donner ni calcul ni détail des groupes derrière ces 2 914 souris.

Objectifs

De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.

Procédures

Interventions réalisées dans l'établissement 1 : - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'etablissement 2: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.