Système urogénital

Concilier carrière sportive et carrière reproductive des juments de valeur, et ramener en France une technique de fécondation in vitro que les éleveurs vont chercher à l'étranger : 80 équidés sont utilisés, 20 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 60 dans des procédures modérées. Les donneuses subissent une à deux ponctions folliculaires par voie vaginale sous sédation, environ 40 minutes chacune, les receveuses une injection de synchronisation, toutes six échographies. Le porteur décrit une douleur ponctuelle malgré l'anesthésie, une inflammation ou une douleur pelvienne possible ensuite, et des risques d'infection locale ou de saignement interne. Aucune jument n'est tuée, toutes sont gardées vivantes et réutilisées pour d'autres protocoles, dans un projet que le porteur rattache aux "coûts de production" de la filière équine, la sauvegarde de races locales menacées venant ensuite.

Objectifs

Depuis 60 ans la filiere équine cherche à optimiser la reproduction des equidés afin de concilier carriere sportive et reproductive. La superovulation n'étant pas fiable dans l'espèce équine, le taux de récupération des embryons est d'environ 75 % et le taux de gestation attendu après transfert est d'environ 50 à 75 %. Une seconde option consiste à produire des embryons in vitro. Cette étude concerne le développement de 2 techniques de production in vitro d’embryons : 1) intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) par injection d’un spermatozoïde dans le cytoplasme de l’ovocyte. Dans l'espèce équine cette procédure, qui nécessite un équipement de micromanipulation coûteux et un personnel expérimenté, est la seule technique qui permet actuellement une production in vitro efficace d'embryons équins dans un cadre clinique mais elle n'est pas disponible en France. Les éleveurs français qui ont recours à cette technique doivent donc envoyer les ovules collectés dans différentes cliniques étrangères. 2)FIV (Fécondation in Vitro) : récemment une méthode a été mise au point, permettant le développement d'embryons. Des taux élevés de blastocystes ont été obtenus et la naissance de trois poulains en bonne santé a été rapportée par une équipe américaine. Tout en offrant une excellente occasion d'étudier les aspects fondamentaux de la fécondation, l'application pratique de la FIV dans un cadre clinique pose encore des défis supplémentaires : 1) jusqu'à présent, la FIV n'est possible qu'avec du sperme fraîchement éjaculé, alors que la flexibilité et le potentiel d'application du sperme refroidi ou congelé-décongelé sont bien plus importants ; 2) seule une longue période de pré-incubation des spermatozoïdes de 22 heures a permis de réussir la FIV 3) avec seulement trois poulains nés, on sait peu de choses sur les effets à long terme de la FIV utilisant ce protocole de traitement du sperme sur la santé du poulain, ou sur la différence entre la FIV et l'ICSI en termes d'épigénétique L'objectif de ce projet est donc d'établir et de valider la faisabilité et l'innocuité de la technique de FIV et ICSI, avec du sperme frais et congelé.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet a deux attentes: 1) optimiser la reproduction des équidés. Les coûts de production dans un élevage imposent d'optimiser la gestion des reproducteurs. Lorsque les reproducteurs ont une grande valeur génétique mais sont peu ou pas fertiles, la production d’un embryon nécessite des techniques de procréation assistée. C’est le cas pour des juments ayant des problèmes d’ovulation (le follicule se lutéinise sans libérer l’ovocyte) ou de tractus génital (oviducte ou utérus) empêchant la remontée des spermatozoïdes vers l’ovocyte, le transport de l’embryon vers l’utérus ou son implantation. C’est aussi le cas pour des étalons ayant une semence de mauvaise qualité ou des étalons morts pour lesquels le stock de paillettes congelées ne permet pas d'inséminer un grand nombre de juments 2) participer à la sauvegarde des espèces menacées dont les effectifs sont en constante diminution, au point de mettre en péril certaines races locales (anes:Grand Noir du Berry, chevaux de trait: Boulonnais ...)

Procédures

Des échographies seront réalisées sur tous les animaux (6 répétitions de ce geste par animal); l'acte dure 2 à 3 minutes. Une seule injection sous-cutanée (durée : 10 secondes) sera réalisée chez les juments receveuses pour les synchroniser et permettre le transfert embryonnaire. 1 à 2 ponctions folliculaires pour les donneuses d'ovocytes la durée de l'acte est d'environ 40mm avec la sedations et la préparation au niveau périnéale (la vulve est soigneusement désinfectée, rincée et séchée, la queue est bandée, pose de la sonde urinaire).

Impact sur les animaux

Lors de la ponction folliculaire, les juments peuvent être soumises à plusieurs nuisances. Tout d'abord, la manipulation et la contention nécessaires pour immobiliser l'animal engendrent un stress. Cette ponction, réalisée à l'aide d'une aiguille introduite à travers la paroi vaginale sous guidage échographique, peut occasionner une douleur ponctuelle malgré l’anesthésie. Une sensation de pression peut également être ressentie. Cette pratique peut provoquer des effets secondaires, tels que de la somnolence, une désorientation passagère ou un inconfort transitoire lié à l’anesthésie. Après l’intervention, une légère inflammation ou une douleur pelvienne passagère peut survenir. Les risques de complications incluent des infections locales, des saignements internes rares ou des irritations dues à la manipulation des organes reproducteurs. L’induction de l’ovulation se fait par voie sous-cutanée, ce qui peut générer du stress lors de la contention ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Lors de la fécondation, la préparation de l’appareil reproducteur et l’introduction d’un cathéter ou d’un endoscope peuvent entraîner un inconfort local. Ces manipulations, parfois répétées, peuvent aussi générer une gêne ou un stress supplémentaire. Bien que rares, des complications comme des infections ou des inflammations utérines peuvent survenir.

Devenir

Tout les animaux sont gardés en vie et réutilisé pour d'autres protocoles après examens vétérinaires

Remplacement

L'objectif est de développer et améliorer une technique de production in vitro d'embryons équins par FIV et ICSI. Le développement de ces techniques peut se faire en partie avec des ovocytes collectés sur des juments abattues dans des abattoirs commerciaux. Toutefois, les résultats obtenus avec des ovocytes collectés dans les abattoirs ou in vivo par ponction folliculaire sont parfois différents. Notre objectif étant de produire des embryons à partir de femelles en carrière sportive ou de femelles subfertiles, nous devons mettre au point et améliorer nos techniques sur des ovocytes collectés in vivo par ponction, sans abattage des animaux. Les embryons équins seront transférés dans des juments receveuses car il n’existe pas actuellement de système in vitro permettant le développement embryonnaire au-delà de 8 jours.

Réduction

Les lot sont établis en fonction du nombre minimal d'animaux requis pour obtenir des embryons FIV et ICSI. Un à trois embryons transférables peuvent être obtenus à la fin de la période de développement in vitro, pour chaque séance de ponction folliculaire d'une jument au début du projet. Grâce à l'expérience, ce chiffre devrait croître.

Raffinement

Notre procédure sera raffinée, minimisant les interventions. Les juments seront logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec accès au pâturage, en visibilité et contact des congénères pour rendre le plus agréable possible leur environnement expérimental pendant toute la durée du projet. Les ponettes voient plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent attentivement leur comportement. L’enrichissement du milieu est assuré par des brosses, des jeux, des bouts de bois à ronger. Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux : les animaux sont habitués aux différentes procédures et les vivent sans stress. Les femelles soumises aux ponctions recevront un traitement à base de sédatifs, d'analgésiques, d'anti-inflammatoires et d'antibiotiques. Ce traitement sera précisé dans la description des procédures. Les animaux seront surveillés tout au long des procédures et après les procédures afin d'écarter tout probléme avant leur remise en troupeau.

Choix des espèces

Notre objectif étant d'améliorer les rendements de production et développement in vitro d'embryons équins grâce à la FIV et l'ICSI afin de répondre aux attentes de la filière équine française , nous sommes obligés d'utiliser cette espèce pour notre projet. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cycliques pour collecter les ovocytes de bonne qualité, aptes à être fécondés (donneuses). Nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 10 ans), cycliques pour assumer le développement embryonnaire et la gestation jusqu'au stade 25 jours (receveuses). A 25 jours l'activité cardiaque peut être visualisée lors d'un examen gynécologique. Cette activité est gage de bon développement embryonnaire et viabilité de l'embryon au départ. Toutes les juments gestantes après le transfert embryonnaire seront gardés pour le poulinage.

Gavées deux fois par jour pendant les vingt et un jours de leur gestation avec des antiépileptiques de troisième génération, des souris gestantes passent aussi des échographies destinées à mesurer la viabilité de leurs fœtus. 1 376 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 1 176 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 un niveau léger. Une partie des animaux reçoit un implant crânien d'électroencéphalographie sous anesthésie générale, suivi de séances d'enregistrement de six à huit heures, et les deux générations issues des mères traitées passent des tests comportementaux deux heures par jour pendant deux semaines. Ces tests ne sont pas nommés, seulement rattachés à "la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement", et les effets attendus sur les animaux tiennent en trois lignes : inconfort et douleur liés à l'implant, stress de l'isolement social, stress de la contention et du gavage.

Objectifs

L'administration de médicaments anticonvulsivants (ASM) pendant la grossesse représente un problème clinique majeur. Pour stopper les crises épileptiques, ces molécules sont disponibles avec des contre-indications variables. Notamment il existe des lacunes critiques sur les effets lors du développement des fœtus ou sur des trajectoires adverses neurologiques. Il existe des preuves que les anciens ASM, sont associés à des risques accrus de malformations fœtales. Dans le paysage des ASM disponibles, le choix des molécules à tester est crucial. Globalement, des études précliniques sur les risques neurodéveloppementaux de l'exposition pendant la grossesse existent pour les ASM de 1ère et 2ème génération, mais sont rares pour les ASM, les plus récents, de 3ème génération. C'est pourquoi nous examinerons les risques potentiels d'effets neurodéveloppementaux des ASM de 3e génération. Ces nouveaux ASM, aux mécanismes d'action diversifiés, pourraient élargir le choix thérapeutique afin d'améliorer la prise en charge des crises d'épilepsie pendant la grossesse.

Bénéfices attendus

Nous générerons des connaissances sur l'impact prénatal des ASM sélectionnées, en utilisant l'échographie 3D pour mesurer la viabilité et les changements anatomiques macroscopiques des fœtus et des placentas. Chez l'adulte, nous fournirons des données sur la présence de trouble de mémoire et d’anxiété en fonction de l’exposition prénatale d’ASM. L’ensemble de ses données fourniront des informations nouvelles sur des éventuels risques associés aux ASM de 3ème génération.

Procédures

Les femelles gestantes vont recevoir 2 fois par jour les médicaments anticonvulsivants par gavage (30 secondes par souris) pendant toutes la durée de la gestation (21 jours). Elles vont passer une échographie (20 min par souris), qui est un acte non invasif pour suivre l'évolution de la grossesse et déterminer la viabilité des foetus. Ensuite les souriceaux issus de ces mères ne seront plus exposés aux médicaments anticonvulsivants. Les tests comportementaux, qui seront utilisés sur les deux générations, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront sur deux semaines à raison de 2 heures par jour. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale pour l'implantation du système d'électroencéphalographie (30 min). Enregistrements électroencéphalographiques, entre 6 et 8 heures pour chaque séance.

Impact sur les animaux

Inconfort et douleur dû à la pose d'un implant crânien. Stress due à l'isolement social temporaire. Stress causés par la contention et le gavage.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

Cette recherche nécessite un modèle murin car nous avons besoin d'étudier l'impact des médicaments antiépileptiques sur le placenta, le développement des fœtus, et la possibilité de trouble neuronal après exposition prénatal aux médicaments antiépileptiques.

Réduction

Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pour minimiser le stress des animaux, des dispositifs d'enrichissement (du coton, une buchette en bois et une maison igloo) sera disponible dans chaque cage.

Choix des espèces

Cette recherche nécessite l'utilisation de la souris car c'est un mammifère adéquat pour étudier les impacts pré et postnatal des médicaments. La souris est très utilisée dans les études précliniques pour le développement des médicaments antiépileptiques. Nous allons étudier l'impact des ASM à différents temps de développement allant du stade foetus au stade adulte. Certains ASM sont connus pour provoquer des malformations foetale. Certains ASM sont connus pour provoquer des malformations fœtales. Nous avons donc besoin de vérifier l’éventuelle présence de malformations fœtales après exposition des femelles gestantes aux ASM sélectionnés pour cette étude. Nous allons suivre les animaux exposés jusqu'au stade adulte pour étudier les éventuelles modifications cellulaires dans les générations F1 et F2.

Mettre au point la production d'embryons in vitro et le transfert entre espèces, sous couvert d'un programme de conservation de la biodiversité : 57 cervidés vont être utilisés, 52 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger. Les femelles donneuses sont soumises à des cycles de synchronisation puis à des prélèvements d'ovocytes par cœlioscopie sous anesthésie générale, jusqu'à quatre fois par an et huit fois sur quatre ans, chaque intervention pouvant durer deux heures de l'anesthésie au réveil. Les receveuses reçoivent un embryon par endoscopie une fois par an. Aucun animal n'est tué à l'issue, tous étant réutilisés puis susceptibles de rejoindre le groupe de reproduction, et les deux espèces employées, le cerf élaphe et le cerf sika du Japon, sont l'une comme l'autre communes, le porteur précisant que le sika "ne correspond pas à une espèce en voie de disparition".

Objectifs

Dans le cadre de ses missions de conservation de la biodiversité, notre laboratoire de recherche mène différents programmes de conservation ou d'amplification de la génétique d'espèces rares, basés sur l’utilisation de biotechnologies de la reproduction. Une stratégie pour augmenter le nombre de descendants à partir d'effectifs très limités de géniteurs, consiste à utiliser la production in vitro d'embryons pour l'espèce menacée couplée au transfert embryonnaire sur des femelles porteuses proches génétiquement (espèce ou sous espèce). Cette stratégie s'est déjà avérée concluante sur le plan conceptuel avec un premier succès mondial en 2006 (naissance d'un jeune cerf sika du Japon ou Cervus nippon nippon porté par une mère élaphe Cervus elaphus).

Bénéfices attendus

Les techniques modernes de procréation assistée telles que l’insémination artificielle, la fécondation in vitro, la gamétogenèse in vitro ou le transfert embryonnaire, sont autant d’outils qui permettront à l’avenir d'améliorer l'efficacité des programmes conservatoires ex situ. Le stockage patrimonial à long terme de la génétique des espèces les plus rares grâce à la cryo-conservation de semences, d’ovules, de tissus gonadiques et embryons dans l’azote liquide représente une stratégie complémentaire de conservation désormais applicable à la faune sauvage. Ces approches permettront, au-delà du stockage sur le long terme, un meilleur brassage génétique entre sites de conservation et une facilitation pour la réintroduction de cette génétique vers les sites in natura. En théorie, ces échantillons sont susceptibles d’être conservés plusieurs centaines d’années (le recul actuel montre que nous pouvons conserver ces échantillons à minimum à moyen terme 50 ans).

Procédures

Les animaux de lots distincts seront soumis à des procédures chirurgicales (chirurgie mini invasive) pour permettre soit la collecte d'ovocytes dans le but de produire des embryons soit pour permettre le transfert d'embryons produits in vitro. Les femelles donneuses d'ovocytes seront soumises à des cycles de synchronisation/prélèvements de gamètes après anesthésie un maximum de 4 fois par an et au total 8 fois sur 4 ans. Les femelles receveuses d'embryons (transfert embryonnaire par endoscopie sur animaux anesthésiés) pourront être transférées sous anesthésie générale une fois par an. Les procédures chirurgicales n'excèdent pas deux heures du moment de l'anesthésie au réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La conduite des protocoles de procréation médicalement assistée chez les cervidés repose généralement sur des protocoles conduits sous anesthésie générale après manipulation des animaux. Les nuisances ou effets indésirables attendus sont celles et ceux associés à cette pratique (le risque anesthésique et notamment le risque de détresse respiratoire est considéré comme étant le plus probable dans nos procédures).

Devenir

Les animaux utilisés proviennent de l'élevage réalisé sur le site. Après utilisation dans le cadre des procédures expérimentales de ce projet, ces animaux pourront tout à fait rejoindre le groupe de reproduction naturelle. Par ailleurs, ces animaux feront l'objet d'études non invasives. Différentes études du comportement (reproduction, interactions sociales, expériences sur la communication acoustique ou comportement alimentaire) sont réalisées sur notre structure dans le cadre de protocoles hors-champ de l'expérimentation animale.

Remplacement

La mise au point des techniques de procréation assistée chez les mammifères nécessite l’utilisation d'animaux (cette étude ne peut être remplacée par des modélisations in silico). Le recours aux modèles in vitro sont déjà proposés dans l'étude permettant de minimiser le nombre d'interventions sur les animaux.

Réduction

Nos approches doivent permettre la collecte de gamètes en nombre suffisant (2 lots de 15 ovocytes) pour constituer des lots expérimentaux et comparer l'efficacité de 2 méthodologies de production in vitro (ovocytes fécondés par injection de spermatozoïdes vs. ovocytes fécondés par fécondation in vitro classique; ovocytes cryoconservés vs. ovocytes frais) sur la base de tests statistiques. La répétition de la procédure sur l'animal (5 à 6 ovocytes par femelle et par collecte) permet de réduire le nombre total d'animaux utilisés. La cryoconservation de semence permet de limiter les interventions sur le mâle. En effet, un même échantillon de semence cryoconservée peut être utilisé pour plusieurs inséminations ou fécondations in vitro (fractionnement de l’éjaculat avant cryoconservation) sur plusieurs années.

Raffinement

L'ensemble des procédures (élevage ou Procréation Médicalement Assistée) fait l'objet d'une bonne maîtrise technique par la structure. Afin de réduire le stress lié aux manipulations, un protocole d’habituation est appliqué par les soigneurs tout au long de l’année pour habituer les animaux aux procédures nécessaires au projet. Les animaux font l'objet d'une surveillance attentive par soigneurs et vétérinaires 7 jours sur 7. Dans le cas des procédures de coeliochirurgie sous anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront administrés aux sites d’insertions des trocarts afin de minimiser la douleur au réveil de l’animal. Les traitements anti-inflammatoires non-stéroïdiens, définis avec le vétérinaire référent, permettent de réduire la douleur post opératoire. Ces procédures sont réalisées sur nos espèces modèles en coelioscopie avec des matériels pédiatriques permettant de réduire la taille des trocarts utilisés, de minimiser les douleurs post opératoires pour les animaux et d'accélérer la cicatrisation. Un suivi est réalisé sur l'ensemble des individus et une fiche de score ou scoring est établie pour permettre de diagnostiquer et évaluer la douleur chez les animaux (absente, légère, modérée ou sévère). En cas de diagnostic d'une douleur sévère, la procédure est stoppée pour l'individu. Pour les douleurs légères et modérées, un signalement est réalisé au responsable de l'établissement utilisateur ainsi qu'au vétérinaire référent pour avis et traitement. S'il n'est pas constaté d'amélioration dans les 48 heures (pas de disparition des symptômes ou aggravation de la douleur), la procédure expérimentale est stoppée pour l'individu. Une prise en charge intégrale pour soins vétérinaires est réalisée pour les animaux.

Choix des espèces

De par sa collection unique d’espèces de cervidés rares et en voie d’extinction, les programmes de recherche développés par notre structure visent des applications pour la conservation d'espèces cervidés. Deux espèces communes de cervidés seront ici utilisés : l’espèce élaphe (Cervus elaphus) et l’espèce sika (Cervus nippon). L’espèce élaphe, du fait de sa disponibilité (espèce commune en France), de son grand gabarit et de la bonne connaissance de sa physiologie est une espèce de choix comme espèce receveuse d’embryons. L’espèce Sika du Japon, donneuse d’embryons ne correspond pas à une espèce en voie de disparition, mais est utilisée pour mettre à l’épreuve la faisabilité des techniques de production in vitro et du transfert d'embryons interspécifiques. Des transpositions de nos recherches pourront être faites sur les sous espèces de cerfs sika menacées dans le milieu naturel (ex C.n.taiouanus, C.n.pseudaxis, C. eldii).

Toute femelle dont l'inconfort ne pourra pas être soulagé rapidement sera mise à mort, le point limite est posé d'emblée. 40 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre, 20 tuées à l'issue et 20 réutilisées après quinze jours de repos. Elles reçoivent deux injections hormonales à 24 heures d'intervalle pour synchroniser leur cycle, et 20 d'entre elles subissent une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes sous anesthésie. Les souriceaux qui naîtront de ces transferts seront tués à dix jours, le porteur indiquant ne pas pouvoir s'en servir. La finalité est logistique : valider une méthode qui diviserait par sept ou huit le nombre de femelles gardées en stock pour les activités de service de l'animalerie.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester une nouvelle méthode, appelée synchronisation, afin de générer des femelles souris en pseudogestation. Nous avons besoin de femelles en pseudogestation pour effectuer des transferts d'embryons. Cette technologie de reproduction est essentielle pour la production de nouvelles souches animales et le maintien des ressources génétiques. Le transfert d'embryons est couramment utilisé dans nos laboratoires et animaleries dans diverses applications : redérivation de souches de souris, revitalisation d'embryons congelés et de spermatozoïdes congelés par fécondation in vitro (FIV). Pour générer ces futures mères-porteuses, l'accouplement des femelles est possible uniquement dans la phase d'acceptation du mâle, une phase bien précise du cycle de reproduction de la souris. Il faut donc pouvoir identifier cette période. Actuellement, la technique utilisée pour générer de futures mères-porteuses c'est le tri visuel. Elle est très connue, mais chronophage et nécessite l'utilisation de nombreux animaux. On regarde chaque souris individuellement pour déterminer la période de son cycle et ainsi déterminer les femelles prêtes à s'accoupler. Tous les centres de recherche utilisent cette technique pour obtenir des mères-porteuses. La nouvelle technique que nous souhaitons tester consiste à injecter aux souris femelles une hormone pour synchroniser leur cycle. Ainsi, quatre jours après l'injection, toutes les femelles seront en phase d'acceptation du mâle, propice à l'accouplement. Ces femelles seront accouplées avec des mâles vasectomisés pour générer des femelles en pseudogestation. On souhaite valider cette technique afin de la mettre en application en routine dans notre laboratoire, ce qui nous permettrait sans altérer la qualité de nos prestations de réduire drastiquement le nombre d'animaux en stock.

Bénéfices attendus

Nos objectifs sont d'évaluer la technique de synchronisation dans un lot de souris femelles, en déterminant l'efficacité de celle-ci dans nos procédures de routine par rapport au tri manuel et visuel des femelles dans un grand groupe de femelles. On cherche à valider cette technique dans notre laboratoire pour considérablement réduire le nombre de femelles nécessaires en stock (de l'ordre de 7-8 fois moins). De plus, le nombre de mâles vasectomisés nécessaire sera aussi,considérablement réduit car les rendements attendus seront meilleurs. La technique contribue donc aux 3R en réduisant le nombre d'animaux et en affinant la technique d'obtention de pseudo-gestantes.

Procédures

Les souris recevront 2 injections sous contention rapides de 5 secondes, à 24h d'intervalle, visant la synchronisation. Puis certaines, (maximum 20) auront une chirurgie de transfert d'embryons (5 minutes) sous anesthésie et analgésie. Ces dernières recevront 3 injections pour induire l'anesthésie/analgésie, dont 2 sous contention rapide de 5 secondes et une lorsqu'elle dormiront encore afin de limiter le stress de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter un léger stress de courte durée lors de la contention pour pratiquer les injections. Une petite douleur peut être ressentie par l'animal lors des injections (hormone de synchronisation, antalgique et anesthésique). Les points de surveillance pour les injections sont les suivants (cas très rares) : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au site d'injection. Les animaux opérés pour le transfert d'embryons (acte chirurgical), sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique efficace pour limiter au maximum les nuisances. Les points de surveillance pour ce type de chirurgie sont l'apparence de l'animal (état du poil, mimiques faciales...), son comportement (mobilité, éveil...), l'aspect du site de chirurgie (rougeur, gonflement, écoulement, automutilation...). Ce sont, là encore, des cas très rares, car nous avons une grande expérience de ce type de procédures.

Devenir

Les femelles pseudogestantes sur lesquelles sera pratiqué un transfert d'embryons par chirurgie seront mises à mort à l'issu des tests afin d'enregister les données nécessaires à l'analyse de cette étude. Les animaux nés issus des transferts d'embryons, seront mis à mort à 10 jours puisque nous ne pouvons pas nous en servir pour nos diverses activités de service. Les femelles pseudogestantes qui ne présentent pas de bouchon vaginal ou non utilisées en transfert d'embryons seront remises en stock afin de les utiliser pour d'autres activités de service après une période de repos de 15 jours.

Remplacement

Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de la synchronisation du cycle oestral sur le bon déroulement de la production de la pseudogestation, puis sur la chirurgie de transfert d'embryons, de la gestation et des naissnces de nouveaux-nés.

Réduction

La production de souris femelles pseudogestantes avec le tri manuel des femelles en proestrus et les transfert d'embryons sont des techniques bien connues. Il existe bon nombre de données témoins. Ainsi, nous avons uniquement besoin de faire des groupes expérimentaux pour la production de femelles pseudogestantes avec la synchonisation. Nous avons choisi un effectif de 40 femelles réparties en 4 lot de 10 femelles pour chaque expérience de synchronisation. Parmi ces 40 femelles, seulement 5 maximum par lot, soit 20 femelles au total seront anesthésiées et subiront un transfert d’embryons par chirurgie. Ces effectifs ont été calculés afin d'obtenir des résultats suffisamment robustes pour l'analyse de l'effet de la synchronisation.

Raffinement

Le personnel en charge de cette étude est habitué à ces gestes techniques car ils sont pratiqués en routine depuis des années dans notre laboratoire. Les femelles restent sous surveillance après leurs injections afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Lors de la chirurgie de transfert d'embryons, les animaux sont anesthésiés et reçoivent un traitement antalgique adapté à ce type de procédure. Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Une injection conjointe de sérum physiologique tiédi sera réalisée pour compenser les éventuelles pertes hydriques liées à la chirurgie et limiter la déperdition de chaleur. Cette compensation a pour objectif de permettre aux animaux une récupération idéale post chirurgie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme. Des enrichissements sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation (nids et croquettes). Les femelles en stock seront hébergées en groupe pour leur permettre de garder un lien social. Comme il s'agit ici d'un test de validation d'une technique, si une douleur ou un inconfort est détecté sans pouvoir la soulager rapidement et efficacement, la femelle sera mise à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons générer des souris pseudo-gestantes pour être mères-porteuses. Il faut donc des femelles et qu'elles soient en âge de procréer soit entre 9 semaines et 6 mois. Pour chaque lot, les femelles auront un âge variable, comme lors de nos activités de service, sans incidence sur les expériences.

Endormies au masque, implantées une fois avec des cellules tumorales sous la peau, dans le péritoine ou dans la bouche, puis attrapées trois fois par semaine pour le suivi, 2 520 souris vont être utilisées dans ce projet sur le microenvironnement immunitaire des tumeurs. Suivent douze injections de substrat pour l'imagerie par bioluminescence, trois injections d'immunothérapie et deux administrations nasales d'un vaccin expérimental. 1 376 souris relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 144 d'un niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever les tumeurs et un grand nombre d'organes associés, le porteur indiquant que 70 % des expériences s'arrêtent au dixième jour, avant les premiers signes de douleur.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes liés aux cellules immunitaires se trouvant à l’intérieur des tumeurs et en particulier aux lymphocytes qui sont les cellules immunitaires tueuses de tumeurs. A l'intérieur des tumeurs, la capacité tueuse des lymphocytes est inhibée par l'expression de molécules, appelées "checkpoints", à la surface des lymphocytes. Nous cherchons à comprendre les mécanismes menant à l'expression des "checkpoints" sur les lymphocytes. Nous cherchons à tester dans nos modèles précliniques l’efficacité de traitements bloqueurs de chekpoints (dont certains sont déjà utilisés en clinique) ainsi que d’un vaccin anti-cancer et comprendre ce que leur utilisation déclenche dans l’organisme. Nous planifions d’utiliser des modèles précliniques tumoraux permettant d’étudier 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d'oncologie préclinique), 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopique (c’est-à-dire dans l’organe duquel les cellules tumorales sont issues, comme par exemple intra-oral pour les tumeurs de cancers oraux).

Bénéfices attendus

En utilisant ces modèles précliniques de cancer, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires caractéristiques des lymphocytes "tueurs de tumeurs". Nous comprendrons comment les tumeurs contournent leur activité cytotoxique en induisant l'expression des checkpoints. Pour cela, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans leur organe d'origine. D'où l'utilisation des modèles d'implantations orhtotopiques, qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d'origine. Ainsi, en ciblant, de façon appropriée à chaque type tumoral, les checkpoints exprimés par les lymphocytes, et en développant des vaccins permettant d'activer ces mêmes lymphocytes, nous pourrons proposer une amélioration des stratégies thérapeutiques déjà en place. Cela pourrait permettre, à terme, de faire évoluer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancers oraux, du col de l'utérus, des ovaires.

Procédures

Les animaux sont soumis: 1) à des procédures d'implantations de cellules tumorales (implantation sous-cutanée (SC), implantation orthotopique intra-péritonéale (IP), implantation intra-orale (IO), 2) à des procédures d'injection intra-péritonéale de composants de type: anesthésiant, substrat de l'enzyme exprimée par les cellules tumorales, immunothérapies (anticorps inhibiteurs de checkpoints), et 3) à une procédure d'administration intra-nasale de vaccin - Les procédures d’implantation de cellules tumorales ne seront effectuées qu'1 seule fois par animal, chacune dure environ 5 min par animal. - Les procédures d’ injection d'anesthésiant IP seront effectuées 2 fois par animal (1 fois à l'implantation du cancer), elles durent 2 min par animal. L’injection de substrat sera effectuée 12 fois par animal (à chaque mesure lors du suivi par caméra bioluminescente), sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal. 2): l'immunothérapie sera injectée 3 fois par animal, elle dure 2 min par animal. – L’administration du vaccin sera effectuée 2 fois par animal, sur animal anesthésié, elle prendra 5 min par animal.

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Notre étude vise à explorer les mécanismes immunitaires dans les tumeurs épithéliales de plusieurs origines afin de développer des immunothérapies (anticorps et vaccin) et de comprendre la résistance des tumeurs aux immunothérapies actuelles. Le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi-cellulaire d'une tumeur avec son microenvironnement. Nous ne pouvons pas in vitro (ni dans des organoïdes, ni dans une flasque de culture in vitro) reconstituer un microenvironnement complet autour des cellules tumorales, qui contiendrait un réseau complexe multicellulaire et reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature actuelle concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer à 2, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous désignons également nos manips afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le groupe témoin sera utilisé pour comparaison avec plusieurs lots d’animaux afin de diminuer l’utilisation inutile d’animaux.

Raffinement

Pour optimiser le raffinement, notre long recul (>18ans) sur ces modèles permettra un suivi et une évaluation au plus juste de l’inconfort et de l’éventuelle apparition de souffrance. En effet, 70% des expériences seront arrêtées à J10, bien avant les 1ers signes de douleur. Dans les 30% d’expériences de suivi longitudinal, aucune nécessité de maintenir les animaux en souffrance, ainsi les animaux seront euthanasiés avant d’atteindre le point limite. Les procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés à l’expérimentation animale et au bien-être animal. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie, pour éviter le stress et la douleur. La préhension des animaux se fera en dirigeant doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de la poser sur une grille et d’effectuer la contention. Puis une fois endormis, les animaux seront posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Du gel oculaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs : les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien réveillés afin d’éviter une baisse de température liée à la ventilation dans les cages. Egalement en post-opératoire, les souris recevront une alimentation enrichie dans des contenants déposés au sol afin qu’elles n’aient pas à se redresser pour se nourrir. Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations européennes, dans des cages collectives. Des objets appropriés (tubes cartons, lanières papier kraft, papier absorbant.) seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress, de faciliter leur thermorégulation et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques des souris. Même si les points limites ne devraient pas être atteints pour nos procédures, nous veillerons à éviter toute souffrance ou détresse chez les animaux. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise et aucun animal ne sera maintenu en souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -La litérature scientifique, définissant le système immunitaire murin comme pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille qui facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie). -la biodisponibilité des souris transgéniques permettant d’étudier des mécanismes immunitaires en détail. Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet, nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.

Six mesures de glycémie sur une goutte de sang obtenue en coupant un millimètre du bout de la queue au scalpel: 50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 42 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 8 un niveau léger. Une maladie rénale chronique est induite chez 36 d'entre elles par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, avec des gavages cinq jours sur sept qui peuvent irriter l'œsophage si l'eau de boisson se révèle inappétente, et vingt-quatre heures passées à deux en cage métabolique. Le projet cherche à mesurer la toxicité rénale de deux molécules issues de la dégradation des acides aminés, jamais testées jusqu'ici dans ce contexte. Le porteur reconnaît que la souris a "certaines limites par rapport à la physiologie humaine" avant de la retenir quand même, l'âge de huit semaines étant choisi pour sa bonne tolérance au régime à l'adénine.

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) touche environ 3 millions de Français. Elle se manifeste par un mauvais fonctionnement des reins, ce qui entraîne l'accumulation de substances dans le corps qui ne sont plus éliminées correctement. Ces substances peuvent être toxiques et contribuer à divers problèmes de santé associés à la maladie. Une attention particulière est portée à certaines molécules issues de la dégradation des acides aminés. Des études récentes chez les humains ont montré que ces molécules sont liées à la progression de la MRC. Cependant, leur effet direct sur le fonctionnement des reins n’a jamais été étudié. L'objectif de ce projet est d’évaluer la toxicité de deux molécules (appelées molécules 1 et 2) sur les reins de souris. Le projet sera divisé en deux parties : (1) La première partie vérifiera si les molécules 1 et 2 peuvent être administrées via l’eau de boisson des souris, ce qui permettrait d’éviter les gavages ; (2) La seconde partie mesurera la toxicité de ces molécules chez des souris atteintes de MRC. Plusieurs paramètres seront analysés pour évaluer leur impact sur le fonctionnement rénal et le métabolisme général.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les molécules issues de la dégradation des acides aminés affectent la progression de la maladie rénale. Si ces molécules sont liées à une aggravation des problèmes rénaux, il serait possible d'utiliser des inhibiteurs pour réduire leur production. Cela pourrait offrir de nouvelles options de traitement pour ralentir la progression de la maladie chez les humains.

Procédures

Première partie : Les 8 souris recevront de l’eau normale pendant 3 jours, suivis de 3 jours d’eau contenant les molécules à tester. Pendant ces 6 jours, toutes les souris seront pesées quotidiennement. Si la consommation d'eau diminue en présence des molécules, un nouveau test sera effectué : les 8 souris recevront de l’eau normale pendant 3 jours, puis de l’eau avec un édulcorant et les molécules pendant 3 jours. Elles seront pesées tous les jours durant cette période. Deuxième partie: Pour induire la maladie rénale, 36 souris recevront une nourriture riche en adénine pendant 4 semaines, avec des pauses chaque week-end où elles recevront des croquettes normales. Les 6 autres souris auront une alimentation normale pendant cette période. Pendant 4 semaines, 18 souris auront de l’eau du robinet, 12 souris recevront de l’eau du robinet supplémentée avec la molécule 1, et 12 souris recevront de l’eau du robinet avec la molécule 2. Si les résultats de la 1ère partie montrent que les molécules 1 et 2 ne peuvent pas être administrées via le biberon, elles seront administrées par gavage. Dans ce cas, pendant 3 semaines (5 jours/semaine), 18 souris recevront de l’eau du robinet par gavage, 12 souris recevront la molécule 1 par gavage, et 12 souris recevront la molécule 2 par gavage. Chaque administration sera faite sur un animal vigile et durera 30 secondes, y compris la contention. Tous les 42 animaux subiront un test de tolérance au glucose. Le matin à 8h, ils seront mis à jeun pendant 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun (les 6 heures de jeune permettent d’équilibrer les glycémies et de mesurer correctement la réponse de l’organisme au glucose). Une incision de - de 1 mm sera réalisée à l’extrémité de la queue avec un scalpel, et une goutte de sang sera déposée sur une bandelette pour mesurer la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera faite dans l’abdomen, et la glycémie sera mesurée en prélevant une goutte de sang à la queue à différents moments après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 min). Les 42 souris seront également placées, 2 par 2, dans des cages métaboliques pendant 24h pour recueillir leurs urines et leurs fèces. À la fin du traitement, les 42 souris seront anesthésiées par une injection dans l’abdomen (durée : 15 sec, contention incluse) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 sec). Les souris anesthésiées seront immédiatement mises à mort après le prélèvement (2 sec).

Impact sur les animaux

La première partie du projet pourrait causer des nuisances légères. Ajouter des métabolites dans l’eau de boisson peut réduire la consommation d'eau, entraînant une légère déshydratation et un inconfort pour les animaux. De plus, les pesées quotidiennes peuvent provoquer du stress. La seconde partie pourrait entraîner des nuisances modérées. Une alimentation riche en adénine peut diminuer la consommation de nourriture et ralentir la prise de poids des souris pendant les 4 semaines d'induction de la maladie rénale chronique (MRC). Si les métabolites doivent être administrés par gavage, cela nécessitera une contention des animaux chaque jour pendant 3 semaines (sauf samedi et dimanche), ce qui peut être stressant, même si la manipulation dure moins d'une minute. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et causer une douleur. Pour le test de tolérance au glucose, une petite incision à la queue sera faite pour prélever une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Cette incision sera réalisée une seule fois au début du test, suivie de six prélèvements de sang à différents moments. Une injection de glucose sera également faite ce qui peut causer du stress et une douleur. Pour recueillir les urines sur 24 heures, les souris seront placées par deux dans des cages métaboliques, ce qui peut également les stresser. Avant le prélèvement final de sang, les souris recevront une injection d'anesthésiques, qui peut provoquer de la douleur. Il est important de noter qu’aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires.

Devenir

Les 50 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes de toxicité des molécules issues de la dégradation des acides aminés sont complexes et impliquent plusieurs organes. Ni la modélisation informatique ni les études en laboratoire ne peuvent répondre à cette question. Une étude chez l'Homme est impossible à ce stade, car il n'existe pas de moyens non invasifs pour étudier en détail la fonction rénale et le métabolisme. L'utilisation d'un modèle animal est donc actuellement indispensable pour étudier l'impact de ces molécules sur la progression de la MRC.

Réduction

Les molécules étudiées dans ce projet n’ont jamais été testées dans le cadre de la MRC. Première partie du projet : Le nombre de souris a été réduit au minimum pour tester l’appétence de l’eau contenant les molécules, avec 4 souris par molécule. Chaque groupe est son propre contrôle pour éviter de multiplier les groupes inutilement. Étant donné le caractère exploratoire de cette phase, un calcul formel de l’effectif n’est pas possible. Deuxième partie du projet : Le nombre de souris par groupe a été déterminé à l'aide d'un logiciel, basé sur des données de précédents protocoles avec des souris atteintes de MRC. Un effectif de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, tandis que 6 souris suffisent pour le groupe contrôle non malade. Un maximum de tissus sera collecté lors de la mise à mort et conservé, afin de répondre à d'éventuelles nouvelles questions et d'éviter de répéter inutilement l'expérience. Ces échantillons pourront également être partagés avec d'autres équipes.

Raffinement

Première partie du projet : Pour éviter l'administration des molécules par gavage, cette phase testera leur administration via l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés quotidiennement, avec un suivi de leur prise d’eau et de leur poids. Si nécessaire, un édulcorant sera ajouté à l’eau pour améliorer l’appétence et garantir une hydratation optimale. Deuxième partie du projet : Une méthode non chirurgicale sera utilisée pour induire la MRC, évitant ainsi l’anesthésie et les douleurs. Le régime riche en adénine sera interrompu chaque week-end pour limiter la perte de poids et assurer le bien-être des animaux. Si le gavage est nécessaire (selon les résultats de la première phase), la durée du traitement sera réduite d’une semaine et le gavage se fera uniquement en semaine pour minimiser le stress et les irritations œsophagiennes. Les concentrations des solutions seront optimisées pour limiter les volumes administrés. Pour la collecte d’urine, les souris seront placées par paires dans des cages métaboliques pour limiter le stress. Une période d’habituation de 15 minutes sera prévue un ou deux jours avant. Concernant le test de sensibilité au glucose, une seule petite incision sera faite au bout de la queue pour recueillir une goutte de sang. Les souris resteront dans leur cage d'origine, et la glycémie sera surveillée jusqu'à son retour à la normale. Les animaux seront observés trois fois par semaine pendant l'induction de la MRC, deux fois par semaine pendant le retour à un régime normal, et cinq jours par semaine lors des administrations de molécules. Ils seront pesés deux fois par semaine tout au long de cette phase. Le prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie, et tous les gestes seront effectués par une personne expérimentée pour minimiser le stress. Des point limites prédéfinis, prédictifs et précoces ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Lors de protocoles précédents similaires, aucun signe de mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.

Choix des espèces

Bien que la souris ait certaines limites par rapport à la physiologie humaine, elle reste un excellent modèle pour étudier la maladie rénale et la toxicité de certaines molécules associées. Sa physiologie est proche de celle de l'humain, ce qui permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients. Des souris de 8 semaines seront utilisées, car à cet âge, elles tolèrent bien le régime riche en adénine, qui permet le développement d'une maladie rénale modérée.