Système urogénital

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un premier groupe subit une obstruction chirurgicale de l'uretère, un deuxième la même obstruction puis une reconnexion à la vessie deux jours plus tard, un troisième un pinçage de quinze minutes des vaisseaux qui alimentent le rein, avec douleur postopératoire et risque d'infection de la cicatrice. Les deux reins sont prélevés après la mise à mort pour suivre des fibroblastes rendus fluorescents, dans l'espoir de repérer les cellules qui déclenchent la maladie rénale chronique, les outils de diagnostic n'étant évoqués que pour le long terme. Le porteur conclut qu'il est "impossible" de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux, les modèles cellulaires ne rendant pas selon lui la complexité de la maladie.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie fréquente (10% de la population mondiale) et grave (elle est estimée devenir la 4ème cause de mortalité d’ici 2040). Les événements précoces dans le développement de la maladie rénale ne sont pas bien connus. Identifier des types de cellules qui participent à l’initiation des phénomènes de dégradation du rein est l’objectif de ce projet. En particulier, nous analyserons des animaux qui présentent des cellules fluorescentes, c'est à dire qui émettront une lumière vive lorsqu'observées avec un microscope particulier, permettant ainsi de les suivre durant le développement de la maladie rénale. Ces cellules sont appelées fibroblastes, et sont impliquées dans la maladie rénale chronique. Ce projet cherchera à évaluer leur rôle de manière très précoce

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension de ces phénomènes précoces, et plus particulièrement l’identification d’un type de cellule impliquée dans le développement des lésions permettra, à terme, de développer des outils diagnostics et thérapeutiques de la maladie rénale chronique. En effet, à ce jour, les tests diagnostics identifient la maladie à un stade souvent avancé, et les thérapeutiques permettent d’éviter l’aggravation de la maladie mais ne permettent pas sa régression. Identifier puis traiter à un stade précoce permettrait de lutter contre le développement de cette pathologie

Procédures

Trois types de chirurgie sous anesthésie générale auront lieu. Un premier lot d’animaux subira une obstruction de l’uretère (conduit reliant le rein à la vessie), durée de l’acte 5 minutes. Un 2e lot subira aussi une chirurgie d’obstruction de l’uretère puis 2 jours plus tard, nous le reconnecterons à la vessie afin d’étudier les capacités de réparation du rein – durée de l’acte : 30min. Et enfin sur un 3e lot, on pincera pendant 15 mn les vaisseaux sanguins qui alimentent le rein pour ensuite observer les dommages causés après quelques jours ou semaines

Impact sur les animaux

Les chirurgies risquent d’induire des nuisances, en particulier une douleur post opératoire, une irritation ou une inflammation au niveau de la cicatrice, voire une infection du site opératoire (exceptionnel). Uniquement dans ces cas, une perte de poids et/ou une modification du comportement pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux du projets seront euthanasiés afin de prélever en post-mortem les 2 reins et ainsi étudier les tissus.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie rénale chronique. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Une analyse statistique estime qu’un nombre total de 208 animaux est nécessaire. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement (c'est à dire l'apport de structures permettant d'améliorer le bien-être animal, comme des petites maisons en plastique, du coton...) , change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et ceux du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie. En cas d‘atteinte d’un point limite et selon le signe clinique observé, un antidouleur pourra être administré durant deux jours. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié

Choix des espèces

La souris est la seule espèce permettant à ce jour de suivre l’évolution des fibroblastes grâce à la présence de cellules fluorescentes, en particulier suite à une intervention permettant de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les interventions seront réalisées chez des souris adultes, la maladie rénale chronique chez l'homme concernant principalement des adultes.

Pour reproduire le syndrome des ovaires polykystiques et y tester des composés pharmacologiques, des souris et des rats reçoivent, certains dès 3 à 4 semaines d'âge, des hormones sexuelles ou d'autres molécules qui dérèglent leur équilibre hormonal, chaque jour ou par un dispositif sous la peau, pendant 1 à 24 semaines. 1072 rongeurs, 536 souris et 536 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs ovaires. Les rongeurs reçoivent en plus le composé testé, un témoin négatif ou une molécule de référence, un frottis vaginal par jour pendant au moins 14 jours et, selon les protocoles, des prises de sang et d'urine jusqu'à une fois par semaine. Selon le porteur, l'excès d'androgènes et les follicules immatures entraîneraient une infertilité et "ne devraient pas provoquer d'autres effets indésirables", mais il ne nomme ni les hormones ni les molécules employées. Il justifie le choix des rongeurs par le souci d'utiliser les espèces "les moins sensibles du point de vue neurophysiologique".

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise donc à développer des modèles animaux pertinents, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques.

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.

Procédures

Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs afin de déterminer la présence de SOPK. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes

Impact sur les animaux

L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.

Réduction

La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.

Pour comparer la durée de la gestation entre deux lignées génétiquement modifiées, 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles gestantes passent deux échographies sous anesthésie gazeuse, restent isolées quatorze jours sous surveillance vidéo, puis reçoivent une injection intrapéritonéale d'anesthésique avant une ponction sanguine sous la mâchoire et l'ouverture de l'abdomen pour prélever les embryons et le liquide amniotique, juste avant leur mise à mort. Le porteur range parmi les effets attendus le stress lié à la manipulation et à l'isolement, ainsi qu'une douleur légère due aux anesthésies. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Objectifs

Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause d'évènements indésirables et de mortalité périnatales dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de morts-nés et de fragilité fœtale, ainsi qu’à un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de complications médicales chez la mère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux lignées de souris génétiquement modifiées pour étudier les différences de durée de gestation entre plusieurs lignées de souris. Ces études permettront de mieux comprendre le rôle de certains gènes dans la durée de la gestation, dans la prématurité et le dépassement de terme.

Bénéfices attendus

L’étude d’un contrôle génétique de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de l'accouchement. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine, de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré. , et éventuellement d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies de la grossesse humaine.

Procédures

Echographie sous anesthésie générale gazeuse, d'une durée de 5 mn (2 échographies pendant la gestation/ animal) Anesthésie générale par injection intrapéritonéale d'anesthésique (15 sec/souris), puis prélèvement sanguin par ponction sous-mandibulaire (

Impact sur les animaux

Stress du à la manipulation et à l’isolement. Douleur légère et stress dus à l'anesthésie gazeuse lors des échographies et aux injections intrapéritonéales d'anesthésiques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes et de sang

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Réduction

L'utilisation de lignées modifiées génétiquement permet de beaucoup réduire le nombre d'animaux utilisés, par rapport à une approche par croisements entre lignées. De plus, tous les animaux des lignées seront utilisables. L'échographie permet de détecter précocément la gestation et de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la comparaison des durées de gestation. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données. L'étude sera réalisée en deux phases afin de valider dans un premier temps notre hypothèse sur le rôle d’une séquence d’ADN sur la durée de la gestation. La 2ème phase, qui nous permettra d’explorer en profondeur les mécanismes impliqués dans la mise-bas, ne sera nécessaire que si l'hypothèse est validée dans la première phase de l'étude.

Raffinement

Les animaux disposeront d'enrichissement. Les durées d'isolement des animaux seront réduites au maximum. L'échographie et les procédures sous anesthésie générale permettront de limiter la souffrance et le stress des animaux. La vidéo infrarouge en continu permettra également un suivi sans perturber les animaux. Des points limites ont été définis entrainant une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est déjà utilisée comme modèle de la gestation humaine dans plusieurs articles, notamment au moment de la parturition et pour les questions relative à l'immunologie de la gestation . Les modèles murins sont très activement utilisés par la communauté scientifique internationale pour l'étude de la prématurité ainsi qu'attesté par de nombreuses revues récentes dans la littérature. Les souris âgées de 8 semaines seront utilisées pour les croisements : souris jeunes, sexuellement matures, n'ayant encore jamais développé de gestation.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

4 332 souris vont être utilisées, chacune subissant selon la procédure jusqu'à douze prélèvements d'urine sous contention manuelle, cinq prises de sang, quatre injections, puis une injection létale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et durent dix à douze semaines par animal. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour vieillir plus vite, ce qui les fait mourir plus tôt, et le projet leur inflige une maladie auto-immune du rein pour observer comment l'âge en accélère l'installation. Le porteur écrit que le développement de cette glomérulonéphrite "n'est pas douloureux pour l'animal", tout en déclarant l'ensemble des procédures en gravité modérée.

Objectifs

L’altération progressive et irréversible du rein est une caractéristique du vieillissement chez l’homme conduisant à terme à l’insuffisance rénale chronique (IRC) puis à l’insuffisance rénale terminale nécessitant la mise en place de dialyse ou de greffe rénale Tandis que les fonctions immunitaires déclinent avec l’âge, le vieillissement est aussi caractérisé par une une augmentation du risque d’être atteint de maladies auto-immunes. Dans ces maladies, notre propre système immunitaire se retourne contre nous et produit des anticorps attaquant nos propre cellules. Parmi elles, la glomérulonéphrite extra-membraneuse (GEM) est une maladie auto-immune où des anticorps cible des cellules du rein. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans la compréhension de cette maladie, les facteurs favorisant son initiation restent peu compris, que ce soit du point de vue de l’induction de l’auto-immunité ou de la progression de la maladie. De plus, malgré un pic d’incidence de la GEM autour des 55-60 ans, l’influence du vieillissement sur la physiopathologie de la maladie n’a jamais été étudiée. Notre projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le vieillissement, au niveau rénal mais aussi immunologique, favorise l’induction et la progression de cette maladie rénale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur l’induction et la progression de la GEM. Ceci permettra à terme de proposer de nouveaux outils diagnostiques ou pronostiques en identifiant des marqueurs de prédisposition à la GEM mais aussi d’ouvrir de nouvelles perspectives de voies thérapeutiques pour les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Au cours de la procédure 1, par animal sur tous les animaux du projet (12 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 12 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection lethale. Au cours de la procédure 2, par animal sur tous les animaux du projet (10 semaines) : - 1 injection sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 5 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 10 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection léthale.

Impact sur les animaux

Certaines des souris utilisées sont génétiquement modifiées pour avoir une accélération du vieillissement, ce qui entraine une mortalité à des âges plus précoces. Lors des expériences, les souris pourraient être sujettes à un stress et angoisse liées à leur manipulation voire des douleurs liées aux injections, prélèvements d’urine et de sang effectuées sur ces souris. Des complications éventuelles peuvent survenir suite à l’utilisation de seringue notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement. Le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse n'est pas douloureux pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d'effectuer une cinétique d'induction ou de progression de la maladie.

Remplacement

L’analyse des altérations au cours du vieillissement peut être étudiée in vitro sur modèles de cellules en 3D. La mise au point dans notre équipe de ce protocole in vitro, est à un stade précoce. De plus, bien que ces modèles cellulaires aient un potentiel important pour remplacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La GEM étant une pathologie où le système immunitaire produit des anticorps ciblant les cellules du rein, seul un modèle animal permettra de caractériser et surtout d'établir une cinétique permettant de mieux comprendre les mécanismes favorisant au cours du vieillissement l’induction et la progression de la maladie.

Réduction

Les souris disposant de deux reins, nous optimiserons l’utilisation de ces souris en effectuant différentes méthodes d’analyses sur chaque rein. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet en prenant en compte les effets attendus et le type de tests statistiques effectués.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures, tels que les traitements, que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur, de complications ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire une fois par semaine sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de suivi adaptée au modèle.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui nous permettra d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser de nombreuses analyses nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, des études au sein de nombreuses équipes, dont la nôtre, montrent que les méthodes d’induction de la maladie utilisées reproduit l’ensemble des symptômes observés chez les patients GEM. Ceci permet d’établir ce modèle de souris comme un bon modèle de la maladie humaine. Enfin, les souris génétiquement modiiées pour avoir un vieillissement prématuré sont un modèle qui est déjà disponible et nous avons les expertises nécessaires pour diriger un modèle murin.

Comme l'hormone recombinante testée n'a pas d'autorisation de mise sur le marché, les brebis qui la reçoivent seront tuées et envoyées à l'équarrissage, tandis que les 25 brebis traitées avec l'hormone extraite du sang de juments gestantes retourneront dans l'élevage. 75 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et 50 d'entre elles seront donc tuées. Chacune passe par trois séries d'expériences, avec à chaque fois la pose d'une éponge dans le vagin, une injection d'hormone dans le muscle et, selon les lots, quinze jours de prises de sang quotidiennes à la jugulaire ou une prise unique. Le porteur affirme répondre aux attentes sociétales concernant "le bien-être animal" des juments, prélevées en grands volumes de sang puis souvent avortées, et fixe comme objectif final le "dépôt d'une demande de brevet" pour protéger la propriété intellectuelle.

Objectifs

La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.

Bénéfices attendus

Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie, en fonction des lots experimentaux, par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis ou d'un seul prélevement 8 jours après l'injection de l'hormone. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.

Devenir

Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.

Remplacement

La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci

Réduction

Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser trois lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).

Raffinement

Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.

Choix des espèces

La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.