Système urogénital

Pour récupérer des spermatozoïdes épididymaires destinés à une étude sur la congélation du sperme, trois ânes mâles sont castrés sous anesthésie générale, dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré. Réformés en raison de leur âge après avoir été utilisés comme reproducteurs dans l'élevage, ils reçoivent un cathéter jugulaire, puis des antibiotiques pendant trois jours, des anti-inflammatoires trois à cinq jours, des diurétiques en cas d'œdème et des morphiniques si des signes de douleur apparaissent. Le porteur retient l'infection du site opératoire et l'hémorragie comme complications classiques, et surveille la sudation, l'écartement des membres postérieurs et la contraction des muscles de la face. Ces trois ânes doivent être castrés parce que l'acheteur l'exige, l'étude scientifique se greffant sur une opération décidée pour permettre leur vente à des particuliers.

Objectifs

Notre unité expérimentale doit castrer ces 3 mâles pour permettre leur replacement ultérieur. Le scientifique responsable d'un projet relatif à la préservation de l'espèce asine s'est déclaré intéressé par la récupération des spermatozoïdes épididymaires.

Bénéfices attendus

Cette castration permettra au scientifique de compléter son étude de l'impact du plasma séminal sur la congélation.

Procédures

Une mise à jeun de moins de 16H, pose d'un cathéter jugulaire (2 minutes), anesthésie (15 minutes pour attendre d'estimer les effets de chaque produit injecté et éviter les surdosages), castration sous anesthésie générale (10 à 20 minutes selon la localisation du testicule, plus ou moins engagé dans le canal inguinal). Injections intramusculaires d'antibiotiques une fois par jour pendant 3 jours (

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être stressés par la mise à jeun et par les manipulations préalables à l'anesthésie. La pose du cathéter à la veine jugulaire est légèrement douloureuse (piqure d'aiguille). Il peut être ressenti une douleur post-opératoire malgré les injections préventives (variabilité individuelle). Les complications classiques d'une castration sont l'infection du site opératoire ou l'hémorragie.

Devenir

Dès récupération post-opératoire, ces trois ânes seront vendus à des particuliers compétents pour assurer des bons soins.

Remplacement

Ces trois animaux doivent être castrés pour faciliter leur replacement (vente à des particuliers). L'unité a donc contacté le scientifique responsable d'un projet intéressé pour récupérer les testicules et épididymes.

Réduction

Ces trois mâles doivent être replacés et être cédés à des particuliers. Ils doivent donc être castrés tous les trois. Aucune étude statistique n'est envisagée.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés lors d'un examen clinique préalable à l'intervention, ils seront manipulés dans le calme. Un cathéter jugulaire permettra d'optimiser les injections intraveineuses. Un congénère sera à proximité de l'animal hospitalisé lors des phases de mise à jeun et de réveil post-opératoire. L'analgésie sera assurée dès la prémédication et sera relayée en post-opératoire immédiat puis les 4 jours suivants l'intervention. Un anesthésique local sera injecté au niveau du site opératoire (il n'est pas possible de l'injecter dans les testicules car ceux-ci sont ensuite l'objet d'études histologiques). Le box de réveil sera paillé abondamment. Les animaux seront surveillés 3 fois par jour minimum les 3 jours suivant l'intervention. Du foin de qualité leur sera administré dès le réveil effectif. Ils retourneront dans leur aire d'élevage habituel dès que leur état clinique le permettra. La plaie sera surveillée pour détecter un éventuel oedème (traité par injection de diurétique), une hémorragie (hématome sous-cutané : en ce cas le traitement antibiotique sera prolongé) ou une infection (suture suintante, inflammée ; en ce cas, les antibiotiques seront prolongés). Les signes de douleur potentielle seront surveillés : sudation, posture (membres postérieurs écartés, éloignés de la ligne médiane), contraction des muscles de la face. En ce cas, l'injection d'analgésiques sera renforcée.

Choix des espèces

Ces trois ânes faisaient partie du troupeau des reproducteurs étudiés dans l'élevage (spermogramme, insémination artificielle). Ils doivent être réformés en raison de leur âge et nous souhaitons leur éviter l'euthanasie. Pour les replacer (ventes à des particuliers), il est demandé par l'acheteur de les castrer.

Toutes tuées en fin de procédure pour que leurs organes soient prélevés, 552 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux injections intramusculaires, 360 subissent une ouverture du thorax ou de l'abdomen, et 144 sont enfermées seules en cage à métabolisme sur une grille métallique, quatre-vingt-seize heures la première fois. Quarante-huit autres sont gavées deux fois par jour pendant neuf jours, et le porteur évoque une chirurgie sans réveil alors que le tableau des gravités ne déclare aucun animal dans cette catégorie. Il affirme que seules des expériences sur des animaux non-humains permettent d'étudier les effets d'un excès d'aldostérone sur l'équilibre du potassium, les cellules en culture ne suffisant pas.

Objectifs

L’hyperaldostéronisme primaire est un syndrome dans lequel le taux d'aldostérone est anormalement élevé à cause d’un excès de sa production par les glandes surrénales. Cette hormone agit sur le rein et stimule la réabsorption de sel et la sécrétion de potassium. En condition d’hyperaldostéronisme, quand l’organisme n’a pas besoin de cette hormone mais qu’elle est tout de même produite, le rein va retenir le sel dans l’organisme ce qui conduit à une hypertension sévère, généralement résistante à tous les traitements classiques. Ainsi, l’hyperaldostéronisme primaire est à l’origine de 6-18 pourcents des cas d’hypertension selon les populations étudiées et représente presque un quart des hypertensions résistantes à tout traitement. En parallèle, l’excès d’aldostérone va stimuler l’excrétion rénale de potassium, conduisant à une perte de potassium dans les urines et une baisse sévère de sa concentration dans le sang (hypokaliémie) pouvant avoir des conséquences fatales sur le système cardiaque. Deux protéines travaillent de concert pour permettre de limiter les pertes rénales de potassium et l’hypokaliémie. Ce projet vise à étudier si ces deux protéines participent également à la réponse à l’hyperaldostéronisme en tentant de s’opposer à l’effet hypokalémiant de l’aldostérone.

Bénéfices attendus

L’hyperaldostéronisme primaire, maladie qui est caractérisée par une surproduction anormale de l’hormone aldostérone, conduit au développement d’une hypertension et d’une hypokaliémie (baisse de la concentration en potassium dans le sang). La découverte récente d’un lien entre un facteur de croissance, un transporteur rénal de potassium et la capacité du rein à retenir le potassium, nous a amené à envisager que cette voie pourrait être mis en œuvre dans le contexte de l’hyperaldostéronisme en réponse à l’hypokaliémie. Notre projet, qui utilisera des souris mâles et femelle invalidées ou non pour les gènes à tester permettra d’évaluer si cette voie existe, ce qui pourrait permettre d’envisager d’agir dessus pharmacologiquement au bénéfice des malades.

Procédures

Tous les animaux, vigiles, (552 souris) subiront deux injections intramusculaires sur deux sites d’injection différent le premier jour de chaque procédure (1 minute par animal). Une partie des animaux subiront une thoracotomie (180 souris, 15 minutes par animal) ou une laparotomie (180 souris, 15 minutes par animal) sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Pour une autre partie des animaux, trois recueils urinaires sur animal vigile en cage à métabolisme seront réalisés sur un groupe de 144 souris (96 heures en cage à métabolisme pour le premier dont 48h d’habituation et 24h pour les deux autres recueils). Nous effectuerons, également, 2 prélèvements sanguins à 7 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal, sur 144 souris). De plus, deux mesures de la composition corporelle par résonance magnétique nucléaire espacées de 7 jours (2 minutes par animal) seront effectuées sur ces 144 souris. Une autre partie des animaux (48 souris) sera soumise à un maximum de 9 jours de gavages deux fois par jour (30 secondes par animal) et subira un prélèvement sanguin unique sous anesthésie (1 minute par animal). Toutes les souris sont euthanasiées en fin de procédure (552 souris).

Impact sur les animaux

En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont isolés et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Ils subiront un prélèvement de sang sous anesthésie et antalgique pouvant entrainer une hémorragie. Certaines souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle par mesure de résonance nucléaire magnétique. Cette procédure peut entraîner un léger stress au moment de la manipulation des souris pour vider leur vessie par massage abdominale et le temps de la mesure (2 minutes). Des animaux subiront également un gavage qui pourrait conduire à une fausse route. Certains animaux subiront également une chirurgie sans réveil susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire. L’injection intra-musculaire peut entrainer également une douleur ponctuelle.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences physiopathologiques d’un hyperaldostéronisme primaire sur l’équilibre de la balance potassique. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 552 souris. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous l’avons calculé au plus faible à l’aide de tests statistiques et sur la base de notre expérience. Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et qui pourraient impacter négativement certains résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles ou si nous constatons que certaines de nos hypothèses concernant l’implication de nos protéines d’intérêt ne sont pas validées.

Raffinement

Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre sur cette grille ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier en n’étant plus en contact permanent avec la grille, ce dispositif n’altérant pas le recueil d’urine. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation classique avant que son état ne se détériore. Le suivi de ces points limites continuera afin de vérifier s’ils reviennent à la normal. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagé. Pour la mesure dans l’appareil à résonnance magnétique, les animaux seront habitués à être manipulés pour avoir la vessie vidée et à être placer dans le tube de mesure. Quelques jours seront consacrés à laisser les souris découvrir le tube de mesure, à y être placées puis ressorties. Ce tube est en plastique rouge pour diminuer le stress de la souris. Le tube est muni de trou pour permettre la circulation de l’air. La souris est maintenue dans le fond du tube par un piston de diamètre légèrement plus petit que le diamètre du tube. La hauteur du piston est réglable et permet de laisser la souris se mouvoir librement. La queue de la souris peut passer entre le piston et la paroi du tube sans être pincée. La mesure dure 2 minutes. Nous avons noté que les souris habituées stressent moins dans le tube après habituation : ne perdent pas de fèces pendant la mesure, sortent du tube sans hésitation. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil. L’ensemble des expériences sera mené dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur, par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associés à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles âgées de 8 à 15 semaines afin d’évaluer l’effet de l’induction d’un hyperaldostéronisme sur la balance du potassium et d’évaluer l’implication de deux facteurs protéiques dans la réponse à cette induction. Nous utilisons des souris mâles et femelles « normales » et transgéniques (invalidées pour nos gènes d'intérêts) âgées de 8 à 15 semaines afin d’évaluer l’effet de l’induction d’un hyperaldostéronisme sur la balance du potassium et d’évaluer l’implication d’un facteur de croissance et d’un transporteur ionique dans la réponse à cette induction.

Après cinq jours d'injections quotidiennes, des souris, en grande majorité des femelles, subissent sous anesthésie une chirurgie qui provoque un lymphœdème dans une patte, une injection de cellules tumorales, ou les deux. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un récepteur aux œstrogènes, ERα, dans les vaisseaux lymphatiques. Le porteur décrit le lymphœdème humain comme une "accumulation massive" de liquide et de graisse dans un membre, puis écrit que la chirurgie qui le provoque chez la souris "ne génère pas d'effet indésirable majeur", tout en annonçant "des douleurs modérées" liées aux chirurgies et aux tumeurs. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs tissus, et celles qui passent par une lymphographie, injection fluorescente dans les pattes sous anesthésie, sont tuées sans réveil.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Enfin les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Faire ovuler les juments au moment voulu, pour qu'elles produisent un poulain par an : 45 juments vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes gardées vivantes et réutilisées dans d'autres protocoles après examen vétérinaire. Chacune subit 4 à 14 échographies transrectales, une injection sous-cutanée, une insémination et une collecte d'embryon. Le porteur signale que l'introduction de la sonde dans le rectum peut lacérer la paroi interne et que le siphonnage de l'utérus pour récolter les embryons est douloureux. La molécule testée, un agoniste de GnRH déjà autorisé chez les vaches et les lapines, est présentée comme un "intérêt majeur pour la filière équine", les produits existants étant jugés trop chers ou peu satisfaisants sur le terrain.

Objectifs

La maîtrise du moment de l’ovulation permet d’optimiser l’insémination des poulinières et représente un intérêt économique important pour les éleveurs produire un poulain par an. Cependant à l’heure actuelle les éleveurs ne possèdent qu’un faible nombre de molécules capables d’induire l’ovulation. De plus ces molécules ne donnent pas des résultats terrain complètement satisfaisants. Dans ce contexte, la recherche de nouvelles molécules plus performantes représente un intérêt majeur pour la filière équine. Les résultats d’études précédentes montrent qu'un agoniste de la Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) disponible comme médicament vétérinaire en Europe (autorisé pour les vaches et les lapins) est un bon candidat pour la maîtrise de l’ovulation chez la jument. Les molécules actuellement disponibles sur le marché sont : 1) La gonadotropine chorionique humaine (L’hCG) : produit peu onéreux mais entraine la production d’anticorps, et plus de 70 % des ponettes sont traitées plusieurs fois par an. 2) La déslorelin : agoniste de GnRH qui est onéreux. Bien qu’il soit biodégradable c’est un implant qui doit quand même être retiré ce qui nécessite une petite intervention invasive. 3) La triptoréline : agoniste de GnRH utilisé à faible doses à raison d'une injection sous cutanée induit l'ovulation mais cette molécule est un médicament utilisé chez l'homme pour des traitement spécifiques.

Bénéfices attendus

La maîtrise de la reproduction chez les mammifères passe par une prédiction précise du moment de l’ovulation. A l’heure actuelle, chez la jument, aucun traitement disposant d’une Autorisation de Mise sur le Marché ne satisfait complètement la filière équine. Dans ce contexte nous souhaitons confirmer que la LICERELINE connu comme inducteur de l’ovulation chez les bovins et les lapins, pourrait l’être pour l’espèce équine. Si le site d'injection peu améliorer l'induction de l’ovulation chez la jument . L'objectif global de ces travaux est de mettre à disposition de la filière équine une molécule permettant d'induire l'ovulation chez la jument avec un médicament vétérinaire ayant un agrément sur d'autres éspèces.

Procédures

Chaque ponette aura : 4 à 14 échographies transréctal, chaque échographie dure environ 3-4mn par animal, 1 injéction sous-cutanée 30sc, 1 insémination 3-5mn, 1 collecte d'embryon 10-15mn

Impact sur les animaux

L’injection en sous-cutanée pour induire l’ovulation peut entrainer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site d’injection. L’introduction de la sonde dans le rectum pour les différentes échographies peut également engendrer une légère douleur et une gêne temporaire. Cet examen transrectal peut comporter des risques comme une lacération de la paroi interne du rectum. Les siphonnages de l’utérus pour la récolte d’embryons peut aussi engendrer une douleur pour la jument. Enfin, la contention pour la réalisation de ces différents actes peut être un moment stressant pour les animaux.

Devenir

Tout les animaux sont gardés en vie et réutilisé pour d'autres protocoles après examens vétérinaires

Remplacement

L’objectif principal de ce projet étant d’évaluer l'efficacité et la voie d'abord de la Licereline et voire l'impacte sur la fertilité des femelles après insémination, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation des juments par un autre modèle.

Réduction

Ce projet a pour objectif également de réduire au maximum le nombre des animaux vivants utilisés à des fins scientifiques ainsi que les interventions sur chacun de ces animaux.

Raffinement

Notre procédure sera raffinée, minimisant les interventions. Les juments seront logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec accès au pâturage, en visibilité et contact des congénères pour rendre le plus agréable possible leur environnement expérimental pendant toute la durée du projet. Les ponettes voient plusieurs fois par jours les animaliers et les expérimentateurs qui surveillent attentivement leur comportement. L’enrichissement du milieu est assuré par des brosses, des jeux, des bouts de bois à ronger. Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux : les animaux sont habitués aux différentes procédures et tout est fait pour minimiser le stress. Mais pour le confort de l'animal et de l'operateur avant certaines interventions,une légère sédation (Sédivet) sera systématiquement réalisée.Les animaliers ont suivi une formation à la manipulation éthologique des animaux (méthode Pat Parelli) : les animaux sont habitués aux différentes procédures (clicker training) et tout est fait pour minimiser le stress.

Choix des espèces

L'obtention de l’ovulation ne peut pas être obtenu sans la réalisation d'une expérience sur un animal. Nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation des juments par un autre modèle. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cyclées pour cette étude. Nous avons l'intention d'utiliser 45 juments adultes, dont 15 seront traitées, 15 seront témoins, et 5 nous permettrons de diminuer la dose. L'induction se fera quand un follicule pré-ovulatoire de 33-38 mm de diamètre sera mesuré par échographie.

Clampage de l'artère rénale sous anesthésie, irradiation du corps entier, reconstitution de moelle osseuse, injections rétro-orbitaires : 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six prélèvements sanguins et six prélèvements d'urine, et jusqu'à quatre mesures du débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, réparties sur un mois. Une partie d'entre elles voyage entre deux établissements utilisateurs installés sur des sites différents. Sur le remplacement, le porteur se contente d'une phrase, l'insuffisance rénale aiguë serait "impossible à reproduire in vitro".

Objectifs

Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. Ce peptide est également différentiellement représenté dans les urines pré-opératoires des patients développant une IRA post-opératoire. CD99 est une protéine transmembranaire principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 « rénal » (c’est à dire à la surface des cellules endothéliales et immunitaires résidentes) modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule deux EU (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.

Procédures

1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque rélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront : 1/Une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. 2/Une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) résultant en une détérioration de leur fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l'alimentation liée à l’agression rénale et dans peu de cas, des complications suite à l'acte chirurgical. C'est pour cela que les souris sont surveillées attentivement pendant les heures qui suivent l'intervention. Les animaux ne doivent pas resentir de stress mais pourraient ressentir une douleur lors de l'acte chirurgical et après réveil, c'est pour cela que nous injectons en sous cutanée un analgésique avant chirurgie et après. 3/ Une mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) n'est normalement pas suceptible d'induire de douleur. L'anesthésie permet de faciliter la procédure pour l’expérimentateur et en particulier d’être sûr que l’animal est complètement immobile pour l’injection rétro-orbitaire afin d’éviter toute blessure. Notre expérience de ce système montre que la plupart des animaux tolèrent très bien le dispositif et se comportent normalement pendant la période de mesure. Cependant, certains animaux peuvent être gênés, si des signes de stress importants sont observés (agitation), le dispositif est retiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.

Jusqu'à deux gavages par jour pendant vingt-huit jours consécutifs, trois séjours de 48 heures en cage métabolique et un prélèvement sanguin quotidien de quinze minutes sur les trois derniers jours : 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale sous sédation pour prélever la vessie et la prostate. Elles vivent avec une obstruction de l'urètre, une rétention urinaire, une fréquence mictionnelle augmentée et des calculs dans la vessie. L'objet est de mesurer l'effet de candidats médicaments sur l'hypertrophie bénigne de la prostate. Les souris utilisées sont transgéniques et surexpriment la prolactine de rat dans le tissu prostatique, et le porteur précise qu'elles seront âgées, la maladie visée touchant l'homme vieillissant.

Objectifs

L’hypertrophie bénigne de la prostate (HBP) est la maladie la plus fréquente de l’homme âgé (90 % d’atteintes histologiques chez les sujets de 80 ans). Au plan clinique, elle se manifeste par des troubles urinaires du bas appareil urinaire. La pathogénèse de l’HBP n’est pas entièrement élucidée. Ce développement débute vers la quatrième décennie pour ne devenir macroscopique que vers la sixième ou septième décennie, c’est-à-dire chez le sujet âgé. Pour ce qui concerne l’épidémiologie, diverses études internationales ont montré des prévalences variées, néanmoins, toutes montrent une augmentation avec l’âge, et des extrêmes de 12 % à 25 % pour des symptômes modérés, et de 2 % à 6 % pour les symptômes sévères. Les patients ayant une HBP symptomatique qui ne relève ni de la simple surveillance, ni d’un traitement chirurgical, sont candidats à un traitement pharmacologique. Quatre classes thérapeutiques peuvent être utilisées dans le traitement de l’HBP : les alpha-bloquants, les inhibiteurs de l’enzyme 5-alpha réductase, les anticholinergiques et la phytothérapie. Toutefois, l’efficacité de ces traitements est assez limitée et en plus associée à de nombreux effets secondaires, à l’exception de la phytothérapie. Il y a donc une forte demande de la part des patients et des urologues pour tester de nouveaux traitements qui soient plus efficaces et ayant très peu d’effets indésirables.

Bénéfices attendus

Le but de notre étude est de quantifier l’effet d'un traitement chronique avec des candidates médicaments sur l’hypertrophie bénigne de la prostate et l’inflammation des lobes de la prostate de souris. Le but ultime est donc d'identifier les candidats médicaments les plus prometteurs , qui seront ensuite testés chez le patients dans les différentes phases cliniques. Cela permettra de trouver de nouveaux médicaments plus satisfaisants pour soigner les patients touchés par les troubles urinaires engendrés par l'hypertrophie bénigne de la prostate.

Procédures

Les animaux feront un maximum de 3 sessions de 48 h en cage métabolique et auront 1 à 2 gavages par jour pendant 28 jours consécutifs. La dureéé de chaque gavage est de 1 minute. Il y aura aussi un prélèvement de sang chaque jour pendant 3 jours, lors des derniers jours du traitement chronique de 28 jours consécutifs. Le temps nécessaire pour effectuer un prélèvement de sang pour chaque souris est de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sujets aux nuisances typiques de l’hyperplasia de la prostate : obstruction urétrale, rétention urinaire et augmentation de la fréquence mictionnelle ainsi que calculs dans la vessie. Nous ne connaissons pas à l’avance les effets secondaires des molécules à tester sur ce modèle expérimental mais le but de ces études et de trouver des médicaments qui soient capables de réduire les nuisances liées à l’hyperplasie de la prostate, donc les molécules testées pourraient diminuer la fréquence mictionnelle et /ou l’obstruction urétrale et /ou l’hyperplasia prostatique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par disclocation cervicale sous sédation à l'isoflurane, car la vessie et la prostate doivent êtres prélevées.

Remplacement

Le but de notre étude est de quantifier l’effet chronique de molécules ayant des mécanismes d’actions différents sur l’hypertrophie bénigne de la prostate et l’inflammation des différents lobes de la prostate de souris. Entant donner la complexité des mécanismes biologiques, encore mal connus, qui sont responsables de la prolifération du stroma de la prostate, l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro, car les facteurs biologiques responsables de la croissance prostatique sont encore mal connus.

Réduction

Etant donné que les souris peuvent être placés plusieurs fois dans les cages métaboliques, cela réduit considérablement leur nombre. De plus, le nombre de souris utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type à ventilation individuelle en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5 ou 6 par cage d’hébergement, en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Les responsables de l'application des procédures, de la manipulation et du bien-être des animaux, sont une technicienne en recherche et développement et un ingénieur, tous deux expérimentés et formés pour reconnaitre tout signes éventuels de stress, douleurs et inconfort. Ils observeront les animaux tous les jours (du lundi au dimanche), pour déceler les mauvais signes cliniques et remplirons quotidiennement une fiche de suivi par animal. La zootechnicienne, en charge de la surveillance et du change des animaux, observeras également les animaux une fois par jour (du lundi au vendredi) et s'assurera que tous les animaux disposent assez d'aliment et d'eau de boisson.

Choix des espèces

Les souris transgéniques utilisées dans notre laboratoire sont caractérisées par une surexpression de la prolactine de rat dans le tissu prostatique. Ce modèle transgénique est similaire à la pathologie humaine car il est caractérisé par une hypertrophie des lobes prostatiques, une hyperplasie stromale, des zones de dysplasie épithéliale et néoplasies intra-épithéliales ainsi que la présence de biomarkers d’inflammation chronique avec des infiltrats de lymphocytes et macrophages. Plusieurs études ont déjà montré que ces souris sont caractérisées par une hypertrophie prostatique importante, une obstruction urétrale, une rétention urinaire et une augmentation de la fréquence mictionnelle. Ce modèle expérimental mime la pathologie humaine à la différence d’autres modèles couramment utilisés. Il est donc un modèle de choix pour l’étude des effets des candidats médicaments visant à réduire l’hyperplasie bénigne et l’inflammation de la prostate. Les souris utilisées en experimentation seront âgées car l'hyperplasie prostatique chez l'homme est une pathologie liée au vieillissement.