Système urogénital

58 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne sous anesthésie locale cinq jours sur sept pendant un mois, avant que leurs ovaires soient prélevés. Le porteur étudie une protéine qui modifie l'ADN et son rôle dans l'expression d'un récepteur qu'il qualifie d'"indispensable" à la fertilité, les applications thérapeutiques restant renvoyées au long terme. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité de l'ovaire au cours du cycle.

Objectifs

La fertilité de la femme est régulée par des hormones qui vont agir au niveau de différentes cellules de l’ovaire en se fixant sur des molécules spécifiques qu’on appelle des récepteurs. La régulation de l’expression de ces récepteurs au cours du cycle est cruciale pour assurer la fertilité de la femme. Des modifications de l’ADN au niveau des gènes de ces récepteurs permettent de réguler leur expression mais les protéines impliquées dans ces modifications ne sont pas connues. Au laboratoire nous avons observé une expression aberrante d’un récepteur normalement exprimé dans l’ovaire, dans des tumeurs de la glande surrénale. Nous avons montré que cette expression anormale est liée à l’absence d’une protéine spécifique qui est capable de modifier l’ADN. Cette protéine est aussi présente dans les cellules de l’ovaire qui expriment un récepteur nécessaire à la fertilité mais son rôle n’est pas connu. L’objectif de ce projet est de déterminer si dans l’ovaire, cette protéine qui modifie l’ADN permet la régulation de l’expression d’un récepteur nécessaire à la fertilité.

Bénéfices attendus

L’inhibition pharmacologique de l’activité de la protéine qui modifie l’ADN va permettre le tester l’hypothèse de son implication dans l’ovaire dans la régulation de l’expression du gène d’un récepteur indispensable à la fertilité chez la femme. A ce jour les molécules impliquées dans ce processus ne sont pas connues. A plus long terme, cela pourra ouvrir sur des stratégies thérapeutiques dans des pathologies où l’expression de ce récepteur est altérée comme dans certaines formes de syndrome des ovaires polykystiques (SOPK).

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie locale d’une durée de 2 min 5 jours/7 pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

La manipulation quotidienne des animaux pour les injections (5 jours/semaine) pourra générer un stress. Pour le limiter, l’injection sera réalisée par un personnel expérimenté avec du matériel stérile afin d’éviter les complications associées à ce geste, et sous anesthésie locale par crème lidocaïne. Une prise de poids en fonction de l'âge moins importante pourra être observée dans le groupe de souris recevant le traitement (nous estimons cette différence entre 10 et 20 % par rapport à un animal recevant un placebo).

Devenir

A l’issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les ovaires seront prélevés pour les différentes expérimentations.

Remplacement

L’ovaire est un système complexe composé de cellules de la reproduction et d’autres cellules qui communiquent entre elles. Il n’existe pas de modèle cellulaire qui permette de reproduire ce qui se passe dans l’ovaire. Le récepteur nécessaire à la fertilité que nous étudions est exprimé dans différentes cellules de l’ovaire en fonction du cycle. Notre étude nécessite d’étudier la temporalité de l’expression de ce récepteur et de la protéine qui modifie l’ADN en fonction du cycle. Il n’est donc pas possible d’utiliser une lignée de cellulaire.

Réduction

Il est essentiel d'utiliser le plus petit nombre d'animaux possible sans nuire à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a donc été intégrée à la construction du projet. En utilisant un calcul de puissance, nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe pour avoir des résultats exploitables statistiquement. Ce nombre minimal est de 12 animaux/groupe pour la procédure. Nous limitons ainsi le nombre d’expériences et de souris.

Raffinement

- Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites précoces qui ont été définis. - Les animaux seront pesés de façon hebdomadaire pour vérifier l’innocuité du traitement - Une anesthésie locale par crème lidocaïne sera utilisée pour les injections IP.

Choix des espèces

La souris est un animal dont les étapes de la physiologie ovarienne sont bien établies. Les souris femelles seront utilisées à 8 semaines, un stade où elles sont pubères et où tous les stades de développement folliculaire seront présents dans l’ovaire.

369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Une maladie rénale chronique est induite par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, suivie de six semaines d'administration de probiotiques dans la joue puis par gavage, avec incisions répétées du bout de la queue, test de tolérance au glucose et passage en cage métabolique. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage, tout en indiquant n'avoir observé aucun comportement anormal lors de protocoles similaires. Il affirme qu'aucun modèle mathématique ou cellulaire ne peut répondre à la question et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

La maladie rénale chronique touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une diminution du fonctionnement des reins et par l’accumulation de déchets, les toxines urémiques, que le rein ne peut plus éliminer. Actuellement, la seule option thérapeutique pour diminuer ces toxines est la dialyse (solution thérapeutique lourde, invasive et réservée aux patients au stade terminal de la maladie). Récemment, le microbiote intestinal a emergé comme un acteur majeur de la production de ces toxines. Ainsi, l’utilisation de probiotiques dans le cadre de la maladie rénale chronique est une stratégie attractive visant à restaurer l’équilibre du microbiote, diminuer les toxines et donc améliorer l’état de santé. Pour rappel, les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui excercent un effet positif sur l’organisme qui les ingère. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de 6 probiotiques, sélectionnés selon des critères spécifiques, regroupés en 3 combinaisons différentes chez des souris ayant une maladie rénale chronique. Les paramètres étudiés seront : la production de toxines, la fonction rénale, le métabolisme du glucose et l’équilibre du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier un ou plusieurs probiotiques capables de diminuer la production des toxines à l’origine de la progression et des complications associées à la maladie rénale chronique. A moyen terme, ces probiotiques pourront être utilisés dans un essai clinique et ainsi, à plus long terme, être proposés comme solutions thérapeutiques aux patients souffrant d’une maladie rénale chronique. Comme mentionné précédemment, aucune solution n’est disponible pour ces patients.

Procédures

Grâce à une nourriture riche en adénine, la maladie rénale chronique sera induite de manière douce. 48 animaux recevront ce régime pendant 4 semaines (pause dans le régime tous les wek-ends, remise des croquettes contrôles). Les 8 autres souris recevront une alimentation normale pendant ces 4 semaines. Les fécès seront collectées avant le traitement aux probiotiques. Les 56 souris seront placées dans des cages individuelles propres pour collecter leurs fécès pendant 30 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé avant le traitement aux probiotiques et après 3 semaines de traitement pour mesurer l’urée (mesure le degré de fonction rénale). Une incision (- de 1mm) sera réalisée au scalpel sur souris vigiles à l’extrêmité de la queue et 15µL de sang seront recueillies avec un capillaire (propre et stérile). La durée du prélèvement sera inférieure à 1 minute/souris. Les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) dans le creux de la joue pendant les 3 premières semaines (5 jours/7). L’administration se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Pendant les 3 semaines suivantes, les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) par gavage dans l’estomac (6 jours/7). Le gavage se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Les 56 souris subiront un test de tolérance au glucose. Les souris seront mises à jeun le matin à 8h pour 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun. Une incision (- de 1 mm) sera réalisée au scalpel à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang sera deposée sur la bandelette de l’appareil mesurant la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera réalisée dans l’abdomen puis la glycémie sera mesurée en recueillant au bout de la queue une goutte de sang à différents temps après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 minutes). Au cours de la dernière semaine, les 56 souris seront déplacées pour 24 heures, 2 par 2, dans des cages métaboliques pour collecter leur urine et leur fécès. A l’issue de la procédure, les 56 souris seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise/animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

Cette prodécure expérimentale devrait entraîner des nuisances modérées. La nourriture riche en adénine induit une diminution de la prise alimentaire et donc un léger ralentissement de la croissance pondérale pendant les 4 semaines d’induction de la maladie rénale chronique. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer l’urée peut générer du stress chez l’animal. Une contention quotidienne est nécessaire pendant 6 semaines pour réaliser l’administration des probiotiques dans le creux de la joue ou par gavage. Cette contention peut générer un stress chez l’animal le temps de la manipulation (moins d’une minute). La répétition des gavages pendant 3 semaines à raison de 6 jours sur 7 peut générer une irritation de l’œsophage et donc un inconfort pour les animaux. Pour le test de tolérance au glucose, l’incision du bout de la queue, le prélèvement d’une goutte de sang à 6 reprises et l’injection de glucose dans l’abdomen peuvent générer un stress et une légère douleur chez les animaux. Le changement d’environnement lors du passage en cages métaboliques peut générer un léger stress. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant un stress, une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux.

Devenir

Les 56 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production des toxines et dans le développement de la maladie rénale chronique sont multifactoriels et le résultat de la communication entre plusieurs organes (intestins, reins, foie,…). Des modèles mathématiques ou de la culture cellulaire ne permettraient pas de répondre à la question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade car il est impossible d’étudier en profondeur la fonction intestinale, la fonction rénale et le métabolisme de façon non invasive. L’étude de l’impact des probiotiques sur la production des toxines et sur l’évolution de la fonction rénale ne peut donc se faire, à ce jour, sans l’aide d’un modèle animal.

Réduction

Les probiotiques utilisés ici n’ont jamais été testés dans le cadre de la maladie rénale chronique. Les dispositions nécessaires ont été prises pour éviter le double emploi de la procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel et sur la base des données obtenues dans de précédents procotoles utilisant des souris atteintes de maladie rénale chronique. Afin d’obtenir une différence significative entre les groupes expérimentaux un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Pour le groupe contrôle (pas de maladie rénale chronique), un effectif de 8 animaux est suffisant pour une obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre maximum d’animaux utilisés dans cette procédure sera de 56. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

L’utilisation du régime riche en adénine évite le récours à la méthode chirurgicale classique (2 interventions). Le régime sera interrompu tous les week-ends afin de limiter la perte de poids. Cette pause permet aux animaux de reprendre le poids perdu tout en ne nuisant pas au développement de la maladie. Les probiotiques seront donnés par gavage seulement pendant la seconde moitié du traitement (3 semaines/6) afin de réduire le stress et les irritations qui pourraient être liés aux gavages. Au cours des 3 premières semaines les administrations se feront dans le creux de la joue. Parmi les probiotiques testés certains sont anaérobies (ils ne doivent pas rentrer en contact avec l’air ambiant) et il a été démontré que l’administration de ces probiotiques par gavages donnaient de meilleurs résultats que l’administration dans le creux de la joue. Par conséquent, la phase de gavages ne peut pas totalement être éliminée du protocole au risque de diminuer fortement ses chances de réussite. Le volume des probiotiques administrés a été réduit au minimum. Les souris seront placées 2 par 2 dans les cages métaboliques pour limiter le stress dû à l’isolement et au changement d’environnement. Une période de 15 minutes d’habituation à ce nouvel environnement aura été réalisée un ou deux jours en amont afin de limiter encore d’avantage le stress des animaux. La concentration de la solution de glucose a été calculée de manière à limiter le volume injecté. Une seule incision au bout de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée en début de test pour recueillir la goutte de sang nécessaire à chaque mesure. Les animaux seront maintenus dans leur cage d’origine pour limiter le stress. La glycémie sera surveillée jusqu’à son retour à la valeur basale. Les animaux seront surveillés 3 fois/semaine pendant le régime adénine puis tous les jours par la personne qui réalisera les administrations de probiotiques. Les animaux seront pesés 2 fois/semaine. Les souris seront profondément anesthésiées pour permettre le prélèvement terminal de sang. Les gestes techniques : incisions du bout de la queue, administrations intra-buccales, gavages et injection seront réalisés par une personne expérimentée afin de limiter le stress de l’animal. Des points limites précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de nos précédents protocoles de ce type aucun mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier la maladie rénale chronique et les effets bénéfiques pouvant découler de la supplémentation en probiotiques. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’homme et permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients (accumulation des toxines, modifications du microbiote, modification du métabolisme). Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. A cet âge là, le régime riche en adénine est bien toléré par les animaux et on observe le développement d’une maladie rénale chronique modérée.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles reçoivent par voie orale de faibles doses de polluants pendant trente-cinq jours, passent un test comportemental, puis sont croisés avec des femelles dont les embryons sont analysés, tous les animaux étant tués pour prélever testicules, cerveau et foie. Le porteur annonce un stress minimal lié à l'administration et surveille le risque de fausse route, avec un point limite de perte de poids de 10 %. Il cherche à évaluer des effets épigénétiques de l'exposition paternelle et affirme que la spermatogenèse et le développement embryonnaire ne sont possibles qu'in vivo.

Objectifs

L'objectif de l'étude est de révéler les effets de l'exposition chronique à faible dose sur le système reproducteur mâle en mettant l'accent sur les mécanismes épigénétiques. 1) Analyser les effets des polluants sur le nombre de spermatozoïdes et la méthylation de l'ADN. 2) Révéler les effets sur la méthylation de l'ADN dans le cerveau, le foie et les testicules embryonnaires. 3) Analyser les modifications du comportement de la descendance des animaux traités.

Bénéfices attendus

Nous répondrons à plusieurs questions. Nous chercherons à savoir si l'exposition à de faibles doses de polluants environnementaux persistants modifie la santé reproductive des souris mâles, le nombre de spermatozoïdes et si elle induit des altérations épigénétiques. Nous nous demanderons si les éventuels effets induits chez les mâles influencent le développement embryonnaire des futurs embryons tels que le cerveau, le foie et les testicules et, enfin, si le comportement des animaux adultes est altéré.

Procédures

Les animaux recoivent, par administration orale (0.1ml), des polluants à faible dose, 1 fois par jour, tous les 2 jours, pendant 35 jours. Cette intervention dure 30 secondes en moyenne. Le test de comportement durera 5 minutes et ne sera pas répété.

Impact sur les animaux

Les concentrations des polluants utilisés sont faibles et les composés seront dissous dans l'eau. Le stress lié à l'administration sera minimal. La fausse-route lors de l'administration est un risque qui sera surveillé. Le test de comportement peut générer une anxiété, un stress qui seront observés mais non répétés.

Devenir

Tous les animuax sont mis à mort à la fin de la procédure: nous analyserons les organes cibles de l'étude (testicules, cerveau et foie).

Remplacement

Le modèle de souris est couramment utilisé dans les études toxicologiques. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire très complexe et qui n’est possible qu’in vivo.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant, pour les trois groupes de composés téstés, un seul groupe d'animaux contrôles. Cependant, l’utilisation de souches non consanguines nécessite 12 animaux par lot en raison de la forte variation entre les animaux, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les composés seront administrés par voie orale, par des personnes formées et compétentes pour ce geste technique. Les souris seront traitées seulement tous les deux jours, ce qui aidera à réduire le stress. Les polluants testés sont dissous dans de l'eau. Application de points limites : perte de poids de 10% maximum, les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lot de 4.

Choix des espèces

La souche Swiss RjOrl, souche non consanguine, est un modèle de choix pour les études. Les souches non consanguines sont utilisées dans de nombreuses études toxicologiques. Pour comprendre comment des facteurs toxiques influencent la gamétogenèse au cours du développement, le modèle de la souris est judicieux car très utilisé dans l’étude du développement chez les mammifères. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets de la pollution. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes. Lorsque le traitement sera terminé, les animaux auront atteint l'âge de deux mois, de sorte que les mâles seront capables de féconder les femelles. Pour l'étude embryonnaire, nous croiserons ces animaux mâles avec des femelles âgées de 8 semaines (à cet âge les femelles sont fertiles) et les embryons de 15 jours seront analysés.

3 984 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une sonde introduite dans l'orifice urinaire sous anesthésie, puis reçoivent des injections répétées d'antibiotiques avant d'être tuées pour prélever vessie et prostate. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe extérieur d'infection ni de douleur, tout en reconnaissant un stress lié aux administrations répétées. Il présente l'étude des organes comme "impossible sans modèle animal" et oppose l'"organisme entier" aux analyses en tube à essai jugées "trop simplistes".

Objectifs

Les infections urinaires masculines (IUM) sont fréquentes et difficiles à traiter. Elles sont différentes des infections urinaires survenant chez la femme car chez l’homme, en plus de l’infection des urines et de la vessie il y a également une infection de la prostate. Malgré le traitement par antibiotique, les prostatites (infection de la prostate) récidivent très fréquemment, dans 20% des cas. Il a été montré que dans la grande majorité des cas, ces récidives sont dues à des bactéries qui n’ont pas été tuées par l’antibiotique et qui persistent donc dans la prostate. Ces rechutes vont être à l’origine d’une altération de la qualité de vie des patients et de la prescription de nouveaux antibiotiques qui peuvent provoquer des effets indésirables et sélectionner des bactéries résistantes au traitement antibiotique, rendant ainsi les infections plus difficiles à traiter. Il est donc urgent de comprendre pourquoi ces bactéries persistent dans la prostate, pour en améliorer le traitement. Pour cela, l’étude directe de la prostate est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans la prostate) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire de souris provoquant une infection de la prostate.

Bénéfices attendus

Notre objectif est d’améliorer le traitement des infections urinaires masculines pour éviter les rechutes.

Procédures

Tous les animaux sont infectés sous anesthésie générale. Les produits anesthésiants sont injectés dans le ventre de la souris à l’aide d’une petite aiguille. Les bactéries sont injectées à l’aide d’une petite sonde rentrée dans l’orifice urinaire. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 4 à 12 heures) ainsi que la durée du traitement (24 heures à 5 jours) dépendent de l’antibiotique utilisé. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée. -L’animal est mis à mort par surdosage en médicament anesthésiant administré sur animal vigile par une piqûre dans le ventre. -La vessie et la prostate sont ensuite prélevés stérilement après la mort de l’animal. -La durée de l'infection est variable de 48 heures à 21 jours.

Impact sur les animaux

Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans ce modèle. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotiques pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, prostate ) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.

Remplacement

L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire masculine (prostate et vessie) en dehors des urines reste très limitée chez l’homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les prostates et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.

Réduction

Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Nous étudierons des souris adultes de 8 à 12 semaines et uniquement de sexe masculin car la prostatite ne survient que chez les hommes adultes.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux mâles sont manipulés dès le lendemain de la naissance et reçoivent chaque jour par pipette un médicament bloquant la différenciation des spermatogonies jusqu'à dix-huit jours, avant d'être tués entre quinze et dix-neuf jours par une dose létale d'anesthésique suivie de la perfusion d'un fixateur, pour prélever leurs testicules et étudier le rôle de l'acide rétinoïque dans la méiose. Le porteur renvoie les retombées annoncées, des pistes sur l'infertilité masculine humaine et un éventuel contraceptif masculin, au conditionnel et au long terme. Il affirme que seule une expérimentation sur animaux répond à la question et qualifie le remplacement in vitro d'"impossible", au nom de l'"organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet nous bloquons la différenciation des spermatogonies par une méthode pharmacologique puis nous induisons la différenciation contrôlée et simultanée de toutes les spermatogonies par une méthode pharmacologique également, pour étudier le déroulement d’une des étapes de leur différenciation, à savoir la méiose. Les testicules des animaux traités servent à réaliser les analyses qui doivent permettre de comprendre le rôle de l’acide rétinoïque dans cette étape.

Bénéfices attendus

Dans la mesure où le médicament utilisé dans cette étude bloque la différenciation des spermatogonies dans de nombreuses espèces, y compris les êtres Humains, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts ici chez la souris sont pertinents pour les êtres Humains. Ainsi, en comprenant comment l'acide rétinoïque agit sur les spermatogonies chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de l'acide rétinoïque. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Administration d’un médicament pour bloquer la différenciation des spermatogonies. Réalisée quotidiennement dès la naissance jusqu'à l'âge de 18 jours au maximum. – Administration d’un médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 15 jours et 19 jours. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Il y aura une nuisance liée au fait que les souriceaux seront manipulés à partir du jour suivant leur naissance. Ils reçoivent quotidiennement par voie orale (à l'aide d'une pipette) le médicament permettant de bloquer la différenciation des spermatogonies. La pointe de la pipette (contenant le médicament) sera proposée à la bouche du souriceau jusqu'à ce qu'il commence à boire. En ce qui concerne l'administration du médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies ou l'administration d’anesthésique, la douleur sera similaire à celle provoquée par l'introduction d'une aiguille sous la peau.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et des cellules germinales sont essentielles pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont préservées. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permettra de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, nous ferons usage d'animaux de type sauvage issus d'un fond génétique mixte. Étant donné que notre étude se concentre sur la spermatogenèse, seuls les mâles (statistiquement, représentant la moitié des naissances) seront employés dans les expériences. Nous réduisons la fenêtre d’observation (donc de prélèvements) sur la période critique de la méiose, qui s’étale sur 5 jours. Nous avons besoin de 10 males pour chaque groupe expérimental : 5 pour des analyses histologiques et 5 pour des analyses moléculaires. Les testicules controlatéraux de chaque mâle serviront à évaluer l'efficacité des traitements administrés en utilisant des analyses en immunohistochimie. Le nombre d’animaux a été calculé de manière précise pour respecter les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés, tout en garantissant la qualité et la robustesse statistique des résultats obtenus. La possibilité d'abandon par la mère ou de cannibalisme au cours de la procédure expérimentale est une préoccupation légitime. Afin de prendre en considération ces risques et de respecter le principe de réduction de l'utilisation d'animaux, nous avons choisi de doubler notre effectif, évitant ainsi la nécessité de recommencer la procédure en cas de perte d'animaux. L’effectif total est de (5 jours) * (10 mâles) * (double) soit 100 souris. Nous mettons ainsi en œuvre la réduction du nombre d'animaux, conformément au principe des 3R.

Raffinement

Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Nous surveillons régulièrement leur état de santé et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment en ce qui concerne l'administration d'analgésiques, le cas échéant. Le bien-être des animaux fait l'objet d'une surveillance quotidienne, et toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les animaux sont manipulés avec précaution et reçoivent quotidiennement le médicament visant à inhiber les rétinaldéhyde déshydrogénases Dès l'âge d'un jour, ils sont habitués à prendre ce médicament par voie orale à l'aide d'une pipette. La pointe de la pipette (contenant le médicament) est placée près de la bouche des souriceaux jusqu'à ce qu'ils commencent à lécher ou à boire. Le médicament est administré sous forme de solution diluée dans de la gomme tragacanthe, connue pour sa viscosité et son goût neutre. Nos collaborateurs nous ont informés que les souriceaux acceptent volontiers cette solution dans ces conditions. Par ailleurs, Le médicament administré n'a pas d'effets notables connus sur la croissance ou le comportement des animaux. Par la suite, le traitement visant à restaurer la spermatogenèse sera administré par injection intrapéritonéale. Les manipulations et les traitements sont effectués par un expérimentateur qualifié afin de minimiser toute perturbation potentielle pour les animaux. Nous appliquons le principe du raffinement (troisième "R" de la règle des 3R) dans notre projet en optimisant les conditions de travail avec les animaux.

Choix des espèces

Notre étude vise à comprendre les effets de l'acide rétinoïque dans un système physiologique à part entière, notamment dans ses fonctions paracrines (entre les différents types cellulaires du testicule) et endocrines (dans l'organisme entier). Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans le testicule de souris sont conservés dans le testicule de l’Homme. Dans ce projet, nous entravons le processus de différenciation des spermatogonies en utilisant une méthode pharmacologique (Médicament1) qui inhibe la synthèse d'acide rétinoïque endogène, commençant dès le jour postnatal (P)1 et se poursuivant jusqu'au jour P18. Parallèlement, nous provoquons la différenciation contrôlée et simultanée de toutes les spermatogonies en recourant à une autre méthode pharmacologique (Médicament2) qui apporte de l'acide rétinoïque exogène, à P4. Cette approche nous permet d'obtenir différentes étapes de différenciation à des moments précis et bien définis. Le traitement continu avec le Médicament1 empêche toute influence de l'acide rétinoïque endogène, ce qui a pour résultat de bloquer toute différenciation indésirable de nouvelles spermatogonies. L'évolution de la méiose est analysée entre 11 et 15 jours après l'administration du Médicament2, se situant entre P15 et P19.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lésions précancéreuses de la prostate leur sont induites par des injections répétées, puis elles reçoivent pendant 28 jours des composés par injection intrapéritonéale ou par gavage, seuls ou combinés. Le porteur affirme que l'induction n'entraîne "pas de douleur ni de souffrance dans la fenêtre choisie" et n'attend pas d'effet indésirable des composés testés, l'objet étant de cibler une population cellulaire liée à la résistance du cancer. Il indique que des études en culture ont précédé le projet et envisage des organoïdes en trois dimensions s'ils reproduisent fidèlement les tumeurs.

Objectifs

Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements actuels. Notre laboratoire et d'autres ont identifié des populations des cellules épithéliales résistantes aux traitements dans des modèles "souris" qui reproduisent l'évolution du cancer de la prostate chez l'homme. Par des analyses moléculaires, nos collaborateurs ont identifié des molécules régulatrices de cellules résistantes aux traitements. Ces facteurs réprésentent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour les formes aggressives du cancer de la prostate. L'efficacité des composés chimiques ciblant ces facteurs a déjà été demontré par nos collaborateurs dans des systèmes cellulaires en culture. Nous aimerions continuer leur charactérisation dans le modèle de souris pour étudier l'effet de ces drogues sur les tumeurs prostatiques aggressives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des potentielles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer de la prostate aggressif.

Procédures

Les animaux seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition des lésion précancéreuses prostatiques. Une fois que les lésions précancéreuses deviennent sufisamment avancées (3 ou 5 mois après injection initiale), des injections quotidiennnes d'un des composés en intra-péritonéale pendant 28 jours seront réalisées (30 souris/lot). Un autre composé sera administré aux souris par gavage tous les 3 jours pendant 28 jours (30 souris/lot). Enfin, une thérapie combinée sera également vérifiée avec un composé injecté en intrapéritonéal et l'autre - administré par gavage à la même souris (30 souris/lot). Les injections intra-péritonéales comprennent une préhension de souris et l'injection en elle-même ce qui prend environ 10 secondes. Les gavages comprennent une préhension de souris et le gavage en lui-même, environ 15 secondes sont réquises pour effectuer ce geste par le personnel formé.

Impact sur les animaux

Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux gavages.Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux composés administrés. L'induction des lésions précancereuses dans notre modèle de souris conduit à une augmentation de taille de prostate mais ne cause pas de douleur ou de souffrance dans la fenêtre choisie pour cette étude d'après les analyses longitudinales de cette lignée effectués dans le cadre du projet antérieur.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort et sa prostate sera utilisé pour les analyses moléculaires et cellulaires.

Remplacement

Des études préliminaires ont été ménées par nos collaborateurs sur les modèles cellulaires en culture pour montrer l'efficacité des drogues sur les cellules épithéliales similaires à celles retrouvées dans notre modèle de souris. Nous allons mettre en place des cultures d'organoides (cultures cellulaires en 3D) à partir des souris non-traîtées et si ces derniers reproduisent de manière assez fidèle les charactéristiques moléculaires de nos tumeurs, nous envisageons de les utiliser davantage dans le cadre de ce projet.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser 30 souris par lot expérimental dont 10 souris pour les analyses histologiques, 10 souris pour les analyses de populations cellulaire et 10 souris pour les expériences sur les organoides. A l'aide des calculs statistiques, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement sur les populations cellulaires étudiées.

Raffinement

Immédiatement après et la semaine suivante les injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les signes de douleurs, des irritations ou d'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Immédiatement après le gavage oral, la souris sera surveillée pour détecter les signes de passage de traitement dans les conduits respiratoires. Suite aux traitements, les souris seront pésées quotidiennement. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage en cas de perte de poids. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude et mis à mort.

Choix des espèces

Notre modèle de souris récapitule de manière fidèle l'évolution des lésions précancéreuses et du cancer de la prostate chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'efficacité des traitements, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitement ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.