Système urogénital

5 321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de quelques jours reçoivent une injection de chimiothérapie, des mâles subissent une vasectomie et des femelles une réimplantation d'embryon, pour évaluer l'effet des traitements sur le sperme et l'embryon. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, des infections de plaie et une perte de poids possibles, et prévoit l'euthanasie avant prélèvement du tissu testiculaire ou des ovocytes. Il affirme que la spermatogenèse in vitro complète n'est réalisable que chez la souris et présente comme "indispensable" la recherche d'épi-mutations transmissibles.

Objectifs

Ce projet permet d’évaluer, chez un modèle murin, l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits. L’architecture de la chromatine ainsi que l’expression des transcrits dans les spermatozoïdes provenant de souris traitées par chimiothérapie sera évalué par une approche de sc-ATAC-seq et de sc-RNA-seq. Avant d’établir ce projet, une étude bibliographique a été réalisée au préalable. Aucune étude n’a évalué l’impact des agents de chimiothérapie sur (i) l’épigénome et la chromatine spermatique et (ii) le développement et l’épigénome de l’embryon précoce. Il apparait donc indispensable de rechercher la présence d’éventuelles épi-mutations dans le noyau des spermatozoïdes produits in vivo ou in vitro et d’évaluer les risques de transmission transgénérationnelle de ces altérations, qui pourraient être à l’origine de défauts du développement embryonnaire ou d’anomalies congénitales.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire d’évaluer l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits avant d’envisager une application chez les patients guéris de LAL mais devenus stériles. Les échantillons humains étant rares et précieux, nous utiliserons du tissu testiculaire murin pour attendre les objectifs du projet.

Procédures

Injections de molécules de chimiothérapie (et sérum physiologique) en intra-péritonéales sur souricaux de 3,5 jpp. 1 injection d'1 seule dose par animal. Acte nécessitant 2 minutes maximum par souriceau. Procédure chirurgicale : vasectomie de souris mâles. 1 acte chirurgical par animal (avec vasectomie bilatérale ; permettant de générer des mâles castrés, utiles pour l'obtention de femelles pseudo-gestantes). Acte nécessitant une procédure de 10-15 minutes par souris. Procédure chirurgicale : réimplantation d’embryon chez des femelles pseudo-gestantes au niveau de l'infundibulum. 1 acte chirurgical par animal. Acte nécessitant une procédure de 20-25 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Stress lié à l’injection de molécules de chimiothérapie, nuisances liées à l'acte chirurgical et stress lié à la mise à mort. La chirurgie peut entrainer des nuisances telles qu’une infection au niveau de la plaie, notamment suite à une déhiscence (séparation de bords de la plaie) ; des saignements ; une douleur, souvent au niveau de la cicatrice ou un état de fatigue. Lors de la croissance de l’animal, le principal critère sera la perte de poids par rapport à la moyenne du groupe témoin. Ce paramètre intègre non seulement l’éventuelle perte de poids de l’animal, mais aussi le différentiel de gain de poids, pathologique pour les souriceaux et très jeunes souris. Peu après les injections, des diarrhées (spécialement si le signe est prolongé plusieurs jours) seront également considérés comme des points limites. Pour des animaux plus âgés, la perte de poids par rapport au poids initial ou au poids le plus élevé de l’animal sera considérée comme anormale. Enfin, des points critiques classiques tels qu’un poil hérissé, un dos rond, un abdomen distendu, une léthargie ou tout signe clinique jugé par un technicien expérimenté comme indiquant un état moribond sévère seront considérés comme des points limites. Afin de pouvoir suivre le poids des animaux dans le temps, les souriceaux de 3,5 jpp seront marqués avec un stylo chirurgicale en attendant qu'il soit assez grand pour qu'une pose de puces au transpondeur soit possible pour poursuivre le suivie des souris à l'âge adulte.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas vivre après prélèvement chirurgical du tissu testiculaire sans traitement hormonal de substitution, ils seront euthanasiés en amont du prélèvement. Les femelles subissant un prélèvement de leurs ovocytes (post-stimulation ovarienne) seront euthanasiées en amont du prélèvement.

Remplacement

La technique de spermatogenèse in vitro complète permettant la génération de spermatozoïdes à partir de cellules souches germinales mâles (les spermatogonies) ne peut s'effectuer qu'à partir de tissus testiculaires vivants. La culture organotypique en interphase gaz-liquide d'explants testiculaires de souris permet d'obtenir des cellules haploïdes utilisables dans ce projet. Des techniques similaires se basant sur des organoïdes ou des cultures en 2D et 3D sont à l'étude mais (i) ces techniques ne sont pas encore au point et ne permettent pas d'obtenir des résultats similaires à ceux de la culture organotypique et (ii) elles utilisent des cellules issues de tissus testiculaire prépubères également.

Réduction

Nous utiliserons des tests paramétriques permettant d’obtenir des résultats exploitables à partir d’un petit nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le nombre de réplicas à n=6 souris par expériences. Tous les souriceaux mâles de chaque portée seront utilisés, quelle que soit la taille de la portée. Les tissus qui ne sont pas exploités le jour du prélèvement seront cryopréservés pour une mise en culture ultérieure. Le nombre d’animaux estimé sera revu à la baisse si nous nous apercevons qu’une molécule de chimiothérapie est trop délétère pour l’animal.

Raffinement

Les souris seront obtenues via reproductions au sein de notre Service de Ressources Biologiques ; limitant le stress lié à d’éventuels transports. Les souriceaux seront conservés auprès de leur mère jusqu’au prélèvement tissulaires à 6,5 jpp afin de ne pas perturber leur développement. Les animaux utilisés comme contrôles ou in vivo seront sevrés au bout de quatre à cinq semaines afin de limiter le nombre de souris par cage. Les animaux qui subiront un acte chirurgical seront anesthésiés avec un système d'anesthésie gazeuse diffusant 5% d’isoflurane dans un mélange protoxyde d’azote/oxygène (70%/30%) puis maintenu sous anesthésie avec 2% d’isofluorane. Vingt minutes avant l’opération, une injection de buprénorphine sera réalisée (Buprécare® 0.5 mg/kg ; IP) afin d’atténuer/limiter les douleurs de l’animal. Deux minutes avant incision, de la lidocaïne en gel sera appliquée pour atténuer la douleur. Des « points limites » (ou critère d’arrêt anticipé) seront observés quotidiennement, notamment sur les animaux post-chirurgie. Enfin, les données obtenues lors de ces expérimentations seront exploitées au mieux afin de donner des résultats scientifiquement exploitables de par la bonne prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Actuellement, la spermatogenèse in vitro complète par culture organotypique en interphase gaz-liquide n’est réalisable que chez la souris. Nous réaliserons les injections des différents traitements à 3,5 jpp. Nous travaillerons à partir de tissu testiculaire pré pubère issu de souris mâles de 6,5 jpp de façon à pouvoir mettre en culture le tissu avant le début de la première vague de spermatogenèse. Les souris âgées de 6,5 et 36,5 jpp seront utilisées comme contrôles in vivo pour permettre la comparaison avec les tissus testiculaires en culture in vitro d’âges correspondants (tissus prélevés à 6,5 jpp + 30 jours de culture). Les femelles donneuses d’ovocytes seront utilisées à l’âge de 5 à 9 semaines (période à laquelle les souris répondent le mieux aux traitements hormonales de stimulation ovarienne). Les mâles donneurs de spermatozoïdes testiculaires seront utilisés comme témoin à l’âge de 36,5 jpp (âge correspondant aux tissus testiculaires après 30 jours de cultures). Les mâles donneurs de tissus testiculaires seront utilisés à l’âge de 6,5 jpp, de façon à ce que les tissus testiculaires pré pubères soient mis en culture avant le début de la première vague de spermatogenèse qui commence à 8 jpp. Les mâles vasectomisés seront utilisés dès leur puberté (environ 5 semaines). Les femelles Black Swiss pseudo-gestantes seront utilisées dès leur puberté (environ 7 semaines). Nous utiliserons des femelles Black-Swiss afin de s’assurer que l’embryon obtenu est bien le résultat de l’ICSI réalisée au préalable. L’ICSI sera réalisée à partir d’un ovocyte d’un spermatozoïde de souris CD-1 (blanche) afin d’obtenir un embryon qui sera par la suite implanté dans une souris Black Swiss (noire). Lors de la césarienne, si le souriceau obtenu est blanc, cela nous permettra de valider notre ICSI.

330 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée jusqu'à quatre fois et le reste tué. Ce projet est le premier volet d'un protocole en deux parties de collecte et de transfert d'embryons caprins. Les donneuses reçoivent quatorze injections de superovulation sur huit jours puis des incisions abdominales sous anesthésie pour récupérer les embryons, et les receveuses porteuses d'embryons génétiquement modifiés sont tuées après le sevrage. Le porteur revendique l'obtention rapide de descendants d'intérêt et affirme qu'"aucune stratégie de remplacement n'est possible".

Objectifs

L’objectif du projet consiste à obtenir, chez des chèvres, plusieurs descendants en une seule année. L’unique moyen d’obtenir de 10 à 20 descendants d’une chèvre en une seule saison de reproduction est d’avoir recours aux dons d’embryons de la part de la chèvre en question (chèvre donneuse) à des chèvres receveuses (« mères porteuses ») pour l’obtention des descendants. Les embryons des chèvres donneuses sont collectés au jour 7 de gestation. Ces collectes d’embryons impliquent un traitement de superovulation des chèvres donneuses, puis un rinçage des cornes utérines grâce à une petite incision abdominale sous anesthésie générale, afin de récupérer les embryons. Les embryons récupérés sont alors directement transférés dans des chèvres receveuses.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet consiste à obtenir plusieurs descendants à partir de chèvres génétiquement intéressantes en une seule année. L’unique moyen d’obtenir de 10 à 20 descendants d’une chèvre en une seule saison de reproduction est d’une part, d’avoir recours aux dons d’embryons de la part de la chèvre en question (chèvre donneuse) et à des chèvres receveuses (« mères porteuses ») pour l’obtention des descendants. Le bénéfice lié à ce protocole est d’arriver à obtenir suffisamment d’animaux d’intérêts dans un temps restreint afin d’atteindre les objectifs d’études de ces animaux dans la durée d’un contrat de recherche. Sans ce protocole, certaines tâches de contrat ne pourraient pas être atteintes.

Procédures

Série d’injections sur animal vigile pour les donneuses d’embryons (14 injections sur 8 jours, répétées 3-4 fois à 9 semaines d’intervalle minimum) et incision abdominale sous anesthésie générale et analgésie pour le prélèvement des embryons (1 heure, répétée 3-4 fois à 9 semaines d’intervalle minimum). Série d’injections sur animal vigile pour les receveuses d’embryons (4 injections sur 4 jours) et chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour le transfert d’embryons (30 minutes). Durée de chaque injections : quelques secondes.

Impact sur les animaux

La collecte d’embryons par incision abdominale et le transfert d’embryons sont des procédures assez classiques et rapides (respectivement 1 heure et 30 minutes maximum d’intervention). Les effets indésirables liés à l’anesthésie et la chirurgie peuvent être l’hypothermie et des douleurs post-opératoires.

Devenir

La collecte d’embryons par incision abdominale et le transfert d’embryons (procédures successives 1-3) sont des procédures assez classiques, rapides, et qui n'induisent pas d'effet secondaire pour les chèvres donneuses; elles seront donc gardées en vie et pourront être utilisées chacune 3 à 4 fois pour la procédure de collecte d'embryons à J7. Ce qui réduira grandement le nombre de chèvres donneuses nécessaires. Et elles pourront être réutilisées ensuite en élevage (mise en reproduction avec un bouc) ou replacées. Par contre, les chèvres receveuses d'embryons édités/modifiés sont considérées OGM car porteuses d’embryons OGM. Elles ne peuvent pas être replacées, ni utilisées dans d’autres protocoles; elles devront donc être euthanasiées après le sevrage de leurs petits.

Remplacement

Aucune stratégie de remplacement n’est possible sur ce projet, car l’étude d’animaux génétiquement modifiés ne peut pas être réalisée sans animaux.

Réduction

Ce stade de collecte permet la récupération d’embryons par chirurgie, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires au projet. Dès qu’une vingtaine d’animaux descendants de la chèvre donneuse seront obtenus, les expériences seront stoppées dans un but de restreindre le nombre d’animaux engagés. Les chèvres donneuses et les chèvres receveuses peuvent être utilisées jusqu’à 4 fois en respectant un temps de repos d’au moins 9 semaines entre 2 traitements. Ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires et utilisés dans le projet.

Raffinement

Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux engagés dans ce projet nous allons : (i) Réaliser les interventions sous anesthésie générale précédée d'une analgésie adaptée et d'une antalgie post-opératoire chez les donneuses et chez les receveuses ; (ii) Réaliser les interventions avec monitoring de la température, utilisation de tapis chauffant pendant la chirurgie et de lampes infrarouge en post-opératoire. Ce qui permet de limiter l’hypothermie des chèvres ; (iii) Réaliser les transferts d’embryons sous coelioscopie pour limiter la taille des incisions et le nombre de points de suture. Les chèvres seront hébergées dans un bâtiment fermé. Elles seront en lot afin de conserver leurs relations sociales. Elles auront de l’eau et du fourrage sec à volonté et des compléments alimentaires (granulés) rationnés. Elles bénéficieront d’un milieu enrichi, approprié à l’espèce caprine. Dans le cadre des 4 procédures de ce projet, les animaux seront surveillés quotidiennement par les personnes responsables du bien-être animal. Un traitement antalgique et/ou antibiotique sera réalisé si nécessaire. Le comportement, des chèvres sera surveillé quotidiennement. Si une chèvre montrait des signes de douleur (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire serait consulté et son avis serait suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation qui s’avèrerait extrême). Cependant s’il y avait des complications péri-opératoire (hémorragie incontrôlable, problème au réveil,…) les chèvres concernées seraient euthanasiées.

Choix des espèces

Ce projet concerne l’espèce caprine. Tous les animaux seront au stade adulte car les chèvres utilisées doivent avoir atteint la maturité sexuelle.

330 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée jusqu'à quatre fois et le reste tué. Les donneuses reçoivent quatorze injections de superovulation sur huit jours puis une incision abdominale sous anesthésie pour prélever les embryons, répétée trois à quatre fois, et les receveuses portant des embryons génétiquement modifiés sont euthanasiées après le sevrage de leurs petits. L'objectif est d'obtenir dix à vingt descendants d'une même chèvre en une seule saison, pour tenir les délais d'un "contrat de recherche". Le porteur affirme qu'"aucune stratégie de remplacement n'est possible" car l'étude porte sur des animaux non-humains génétiquement modifiés.

Objectifs

L’objectif du projet consiste à obtenir, chez des chèvres, plusieurs descendants en une seule année. L’unique moyen d’obtenir de 10 à 20 descendants d’une chèvre en une seule saison de reproduction est d’avoir recours aux dons d’embryons de la part de la chèvre en question (chèvre donneuse) à des chèvres receveuses (« mères porteuses ») pour l’obtention des descendants. Les embryons des chèvres donneuses sont collectés au jour 7 de gestation. Ces collectes d’embryons impliquent un traitement de superovulation des chèvres donneuses, puis un rinçage des cornes utérines grâce à une petite incision abdominale sous anesthésie générale, afin de récupérer les embryons. Les embryons récupérés sont alors directement transférés dans des chèvres receveuses.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet consiste à obtenir plusieurs descendants à partir de chèvres génétiquement intéressantes en une seule année. L’unique moyen d’obtenir de 10 à 20 descendants d’une chèvre en une seule saison de reproduction est d’une part, d’avoir recours aux dons d’embryons de la part de la chèvre en question (chèvre donneuse) et à des chèvres receveuses (« mères porteuses ») pour l’obtention des descendants. Le bénéfice lié à ce protocole est d’arriver à obtenir suffisamment d’animaux d’intérêts dans un temps restreint afin d’atteindre les objectifs d’études de ces animaux dans la durée d’un contrat de recherche. Sans ce protocole, certaines tâches de contrat ne pourraient pas être atteintes.

Procédures

Série d’injections sur animal vigile pour les donneuses d’embryons (14 injections sur 8 jours, répétées 3-4 fois à 9 semaines d’intervalle minimum) et incision abdominale sous anesthésie générale et analgésie pour le prélèvement des embryons (1 heure, répétée 3-4 fois à 9 semaines d’intervalle minimum). Série d’injections sur animal vigile pour les receveuses d’embryons (4 injections sur 4 jours) et chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour le transfert d’embryons (30 minutes). Durée de chaque injections : quelques secondes.

Impact sur les animaux

La collecte d’embryons par incision abdominale et le transfert d’embryons sont des procédures assez classiques et rapides (respectivement 1 heure et 30 minutes maximum d’intervention). Les effets indésirables liés à l’anesthésie et la chirurgie peuvent être l’hypothermie et des douleurs post-opératoires.

Devenir

La collecte d’embryons par incision abdominale et le transfert d’embryons (procédures successives 1-3) sont des procédures assez classiques, rapides, et qui n'induisent pas d'effet secondaire pour les chèvres donneuses; elles seront donc gardées en vie et pourront être utilisées chacune 3 à 4 fois pour la procédure de collecte d'embryons à J7. Ce qui réduira grandement le nombre de chèvres donneuses nécessaires. Et elles pourront être réutilisées ensuite en élevage (mise en reproduction avec un bouc) ou replacées. Par contre, les chèvres receveuses d'embryons édités/modifiés sont considérées OGM car porteuses d’embryons OGM. Elles ne peuvent pas être replacées, ni utilisées dans d’autres protocoles; elles devront donc être euthanasiées après le sevrage de leurs petits.

Remplacement

Aucune stratégie de remplacement n’est possible sur ce projet, car l’étude d’animaux génétiquement modifiés ne peut pas être réalisée sans animaux.

Réduction

Ce stade de collecte permet la récupération d’embryons par chirurgie, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires au projet. Dès qu’une vingtaine d’animaux descendants de la chèvre donneuse seront obtenus, les expériences seront stoppées dans un but de restreindre le nombre d’animaux engagés. Les chèvres donneuses et les chèvres receveuses peuvent être utilisées jusqu’à 4 fois en respectant un temps de repos d’au moins 9 semaines entre 2 traitements. Ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires et utilisés dans le projet.

Raffinement

Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux engagés dans ce projet nous allons : (i) Réaliser les interventions sous anesthésie générale précédée d'une analgésie adaptée et d'une antalgie post-opératoire chez les donneuses et chez les receveuses ; (ii) Réaliser les interventions avec monitoring de la température, utilisation de tapis chauffant pendant la chirurgie et de lampes infrarouge en post-opératoire. Ce qui permet de limiter l’hypothermie des chèvres ; (iii) Réaliser les transferts d’embryons sous cœlioscopie pour limiter la taille des incisions et le nombre de points de suture. Les chèvres seront hébergées dans un bâtiment fermé. Elles seront en lot afin de conserver leurs relations sociales. Elles auront de l’eau et du fourrage sec à volonté et des compléments alimentaires (granulés) rationnés. Elles bénéficieront d’un milieu enrichi, approprié à l’espèce caprine. Dans le cadre des 4 procédures de ce projet, les animaux seront surveillés quotidiennement par les personnes responsables du bien-être animal. Un traitement antalgique et/ou antibiotique sera réalisé si nécessaire. Le comportement, des chèvres sera surveillé quotidiennement. Si une chèvre montrait des signes de douleur (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire serait consulté et son avis serait suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation qui s’avèrerait extrême). Cependant s’il y avait des complications péri-opératoire (hémorragie incontrôlable, problème au réveil,…) les chèvres concernées seraient euthanasiées.

Choix des espèces

Ce projet concerne l’espèce caprine. Tous les animaux seront au stade adulte car les chèvres utilisées doivent avoir atteint la maturité sexuelle.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. Le porteur reconnaît que l'infection peut causer des douleurs et qu'une tumeur à croissance rapide peut obstruer l'urètre. Il décrit ces travaux comme visant une "meilleure compréhension" des mécanismes immunitaires et affirme le recours à l'animal "absolument nécessaire", faute d'alternative.

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier des syndromes d'hypercroissance liés au gène PIK3CA. Une partie est gavée pendant deux mois avec un inhibiteur, d'autres reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules mutées, plusieurs lignées génétiquement modifiées étant entretenues en parallèle. Le porteur indique que les souris de maintien de lignée restent en vie, celles des procédures étant tuées pour exploration anatomique et histologique. Il affirme que ces syndromes ne peuvent pas s'étudier in vitro, hors de leur environnement, et que la souris est le seul animal chez qui la protéine PIK3CA a été mutée.

Objectifs

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Nous souhaitons maintenant : 1-Étudier l’effet de la mutation PIK3CA dans chaque tissu de l’organisme (graisse, muscle, os, vaisseaux lymphatiques, vaisseaux artériels, vaisseaux veineux et les nerfs) en utilisant des modèles génétiques appropriés. 2- Tester l’efficacité d'un inhibiteur dans chacune des conditions. 3- Comprendre la physiopathologie de ces syndromes.

Bénéfices attendus

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Identification des tissus sensibles à une inhibition pharmacologique.

Procédures

Au cours de la procédure 2, un gavage sera effectué par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souples et non traumatisante pour l’animal. Au cours de la procédure 3, des cellules de différents types de tissus portant une mutation PI3KCA seront injectées en sous cutanée chez des souris immunodéficientes. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté, chez des souris anesthesiées et un injectant le plus petit volume possible.

Impact sur les animaux

1-Le gavage quotidien qui débutera à la semaine 6 de vie et sera effectué pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. 2- Injection sous cutanée de cellules mutées PIK3CA chez des souris immunodéficientes (une injection unique).Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage ou à l'injection sous cutanée.

Devenir

Procédure 1: maintien de lignée, donc souris maintenues en vie Prodédures 2 et 3: animaux sacrifiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur lces syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus avec des modèles murins peuvent tout au mieux être complétés par des expériences in vitro.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n-25), minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque le gavage sera réalisé sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par du BYL719. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori l'inhibiteur de PIK3CA devrait améliorer le phénotype des souris. Nous injecterons également 1 million de cellules en sous cutanée chez des souris. Ces injections seront réalisées chez des souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de Kétamine (128 mg/kg)/Xylazine (6,4 mg/kg)), par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul).

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul animal pour lequel la protéine PIK3CA a été mutée Jeunes souris de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

8 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis maintenus en vie. Quatre mères allaitantes subissent deux prélèvements de lait sous anesthésie, et leurs quatre nouveau-nés deux prélèvements de selles ou un écouvillon anal, chaque binôme mère-petit étant isolé de son groupe pendant 24 à 36 heures. Le porteur mentionne le stress de la capture, le risque de blessure du nouveau-né et les effets de l'anesthésie de la mère sur les soins au petit. Il présente le projet dans une perspective de médecine évolutive comparant le lait humain à celui d'autres primates, et affirme qu'il n'existe pas de banque d'échantillons de lait de primates non humains.

Objectifs

Les bénéfices de l’allaitement maternel pour la santé du nouveau-né sont aujourd’hui largement admis dans la communauté scientifique : ce type d’alimentation précoce permet notamment de protéger le nouveau-né des infections gastro-intestinales, des infections respiratoires et des affections allergiques. A long terme, l’allaitement maternel serait associé à une réduction des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de l’obésité et du diabète. La compréhension des mécanismes protecteurs générés par l’allaitement maternel représente donc un enjeu de santé publique. La composition du lait revêt une grande importance dans le développement de l’enfant. Deux types de composant semblent être déterminants dans le lait humain : les saccharides et les lipides. Les saccharides jouent un rôle dans la constitution du microbiote intestinal par l’intermédiaire des HMO (Human Milk Oligosaccharride) tandis que les lipides permettraient de soutenir la croissance cérébrale de l’enfant. Les raisons pour lesquelles les HMO sont présents dans le lait maternel humain sont encore l’objet de nombreuses recherches et constituent l’un des objectifs de notre travail. Il existe plus de 200 HMO répartis en 13 familles. Au sein de ces 13 familles, on distingue les oligosaccharides de type I et II. L’activité prébiotique et antimicrobienne des HMO de type I suggèrent qu’ils jouent un rôle dans la protection du tube digestif contre le risque infectieux notamment par le fait qu’ils aient présélectionné la présence des bifidobactéries qui ont un rôle majeur dans la défense contre les bactéries pathogènes. La prédominance d’HMO de type I n’est pas observée chez les PNH mais les études sur le lait de PNH sont peu nombreuses. Nous souhaitons rechercher dans le lait maternel et les selles de juvéniles de PNH la présence de composants différents de l’Homme moderne. Pour apprécier ce qui fait la spécificité du lait humain, il faut rechercher ce qui le distingue des autres primates. Les saccharides et les lipides sont bien identifiés chez les humains modernes. Néanmoins, s’agit-il de spécificités propres aux humains ? Si oui, se sont-elles mises en place au cours de notre évolution, et à quel moment ? Ce travail de recherche est donc réalisé dans une perspective de médecine évolutive et a pour ambition de mieux comprendre l’origine des spécificités du lait des humains modernes.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons savoir si le comportement d’apprentissage de l’allaitement est effectivement une caractéristique propre à l’Homme, ou bien s’il est aussi présent chez d’autres primates et faisons l’hypothèse que la qualité de l’allaitement est corrélée à une amélioration de l’expérience maternelle. Ce travail a pour objectif d’améliorer la compréhension de la spécificité du lait humain dans une perspective de médecine évolutive. L’analyse des HMO et des lipides de babouins permettra de mieux comprendre quels lipides et quels HMO sont spécifiquement humains. C’est par une compréhension à une plus large échelle (celles de l’ordre des primates) qu’il sera possible d’appréhender toutes les spécificités du lait humain au sein de notre espèce, puis de saisir en quoi cette spécificité contribue à protéger l’état de santé du nouveau-né, et à long terme, celui de l’adulte.

Procédures

Les 4 mères allaitantes seront soumises à 2 prélèvements de lait maternel sous anesthésie (à J10-15 post partum et 3 mois post partum). Chaque anesthésie devrait durer entre 20 minutes et 1 heure maximum, le prélèvement devrait durer entre 5 et 20 minutes. Les 4 nouveaux nés seront soumis à 2 prélèvements de selles chacun (à J10-15 et 3 mois de vie). Ces prélèvements seront réalisés vigiles lors de l’anesthésie de la mère : soit le petit émet des selles naturellement et celle-ci sont collectées, soit un écouvillon des marges anales est réalisé en fin d’anesthésie de la mère s’il n’a pas fait de selles. Cet écouvillon est réalisé vigile, le petit étant accroché à sa mère la queue est juste relevée. Ces prélèvements seront réalisés en moins de 5 minutes. Les binômes d’animaux ne seront isolés de leur groupe d’origine que transitoirement (24h à 36h maximum).

Impact sur les animaux

Stress lors de la capture et risque de blessure du nouveau-né. Isolement transitoire du groupe d’origine (par binôme). Anesthésie de la mère. Réveil de la mère et effets de l’anesthésie sur les soins prodigués au nouveau né.

Devenir

Tous les animaux seront maintenus en vie car les prélèvements ne sont pas invasifs ni douloureux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux. De plus la lactation est un phénomène tissulaire complexe qui ne peut pas être étudié fonctionnellement sur des cellules en culture et il n’existe pas de banque d’échantillons de lait provenant de primates non humains. Enfin, nous allons rapprocher l’analyse du microbiote intestinal du nouveau-né de la composition du lait maternel, ce qui nécessite des prélèvements simultanés chez les deux individus.

Réduction

Les analyses statistiques demandent au moins n= 3, nous limitons donc le nombre d'individus sélectionné à 8 : 4 mères et 4 nouveaux-nés. Les 4 mères sont réutilisées de projets antérieurs. Etant donné le faible effectif considéré, nous choisirons de réaliser des tests de comparaison adaptés aux petits échantillons (test de Mann-Whitney, test de Wilcoxon)

Raffinement

Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsables du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Concernant la capture, elle est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Les prélèvements de lait seront réalisés sous anesthésie. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés par les vétérinaires. Lors de l’anesthésie les nouveaux-nés seront laissés accrochés à leurs mères afin de réduire le stress qui serait lié à la séparation. Les animaux seront réintroduits dans leurs groupes sociaux suivant la procédure validée par la structure du bien-être animal puis suivis quotidiennement pendant 1 semaine, une grille spécifique de suivi des nouveaux nés sera utilisée.

Choix des espèces

Les primates non humains peuvent par leur proximité phylogénétique avec les primates humains constituer un modèle approprié aux études sur l’évolution de l’Homme. Par leur proximité phylogénétique le lait maternel de primates non humains est ce qui se rapproche le plus du lait maternel humain. Les Papio anubis représentent une espèce idéale car ils ont un cycle reproductif rapide. De plus, cette espèce n’a pas encore fait l'objet d’investigation sur le profil glucidique (proportion et type de saccharides) et sur le profil lipidique du lait (proportion de triacylglycérides et de phospholipides, d’AGPI notamment DHA). L'étude nécessitant des échantillons de lait maternel et de selles de juvéniles, les animaux sélectionnés seront des adultes en âge de procréer avec leur descendance et plus précisément 4 femelles adultes allaitantes avec leur nouveau né.