Système urogénital

Toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus, 180 souris reçoivent des cellules de cancer de l'ovaire puis des injections répétées d'anticorps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales répétées risquent de provoquer des péritonites, que la chirurgie de pose des mini-pompes peut causer douleur et infection, et que le développement tumoral peut entraîner perte de poids et inactivité. Chaque souris subit en outre une séance hebdomadaire d'imagerie par fluorescence sous anesthésie. Les retombées annoncées pour les patientes restent au conditionnel, et le porteur conclut que le recours au modèle animal est "indispensable" faute de pouvoir reproduire l'environnement tumoral in vitro.

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde, représentant la cinquième cause de décès liés au cancer. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé, avec plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. Les traitements standard actuels ne sont toujours efficace pour améliorer la survie des patientes car il y a des récidives à cause du développement de résistances au traitement. La complexité biologique et génomique des CEO a conduit chercheurs et cliniciens à explorer des stratégies ciblées et plus adaptées pour contourner la toxicité des molécules utilisées en chimiothérapie. A ce jour, l’ensemble des tentatives thérapeutiques n'ont que très rarement conduit à des résultats concluants. Depuis une quinzaine d’années, la recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines d’intérêt. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales (cellules tapissant les vaisseaux sanguins). Nous avons démontré que les niveaux circulants d’une de ces protéines étaient significativement plus élevés chez les patientes atteintes de CEO, suggérant qu’elles joueraient un rôle important dans le développement et ou la progression de ce type de cancer. De plus, une collaboration récente avec des chercheurs du Pays-de-Galles a également mis en évidence l’implication d’un récepteur dans de nombreux cancers dont notamment celui de l’ovaire. Leur équipe ont pu mettre au point un anticorps dirigé contre ce récepteur qui a déjà démontré de son efficacité sur la croissance tumorale du cancer de l’endomètre. Par ailleurs, une étude préliminaire clinique nous a permis de démontrer que les récepteurs des protéines d’intérêt étaient fortement exprimés par les adipocytes (cellules permettant dans le stockage des lipides) et les cellules immunitaires de l’environnement tumoral, plus particulièrement par les macrophages et les neutrophiles. En raison de l’absence de l’environnement tumoral dans les études in vitro, nous souhaitons développer un modèle murin du cancer de l’ovaire afin d’évaluer l’efficacité, in vivo, de l’anticorps dirigé contre le récepteur en combinaison avec un traitement avec les protéines d’intérêt .

Bénéfices attendus

Les analyses, réalisées précédemment sur des échantillons cliniques (de patientes atteintes du CEO) et sur modèles précliniques, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans la croissance des tumeurs ovariennes par action directe sur l’environnement tumoral. L’action combinée entre un anticorps dirigé contre la tumeur et les prokinéticines pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique prometteuse, notamment chez les patientes qui développement des résistances aux traitement conventionnels. Le projet a pour but d’évaluer et de démontrer la valeur et l’efficacité thérapeutiques de l’anticorps seul ou en combinaison avec les prokinéticines dans le traitement de ce type de cancer.

Procédures

Les souris seront traitées par injection de l’anticorps sur animal anesthésié (durée : 1 minute), deux fois par semaine pendant 2 semaines, entre le 40ème et le 60ème jour après injection de cellules tumorales. La pose des mini-pompes dureront 20 minutes au maximum et Et seront installées pour deux semaines. Les souris seront imagées 1 fois/semaine par, un système d’imagerie utilisant la fluorescence. Cette procédure dure 15 minutes sous anesthesie. Au moment de l’euthanasie des animaux, un prélèvement sanguin qui durera au maximum 5 minutes, sera réalisé sur animaux préalablement analgésiés et anesthésiés.

Impact sur les animaux

L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées qui risquent de provoquer le développement de péritonites, un stress à la souris, un léchage de la région d’injection La chirurgie pour la mise en place des mini-pompes peut présenter un stress chez la souris et un léchage de la région opérée, ainsi que de la douleur si une inflammation et une infection se développent. Le développement tumoral chez les souris peut aussi causer une perte de poids et de l’inactivité.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer des prélèvement de sang pour des dosages sanguins et tissulaires pour faire différentes analyses comparatives du développement tumoral in situ en utilisant les techniques permettant d’étudier les protéines d’intérêt qui serviront à caractériser l’effet de l’anticorps et des protéines d’intérêts sur le développement tumoral

Remplacement

Une étude récente sur le cancer de l’ovaire a permis de faire la preuve de concept que les prokinéticines et leurs récepteurs sont directement impliqués dans l’ensemble des causes de ce cancer. Les protéines d’intérêts semblent agir directement sur l’environnement tumoral pour atténuer de façon indirecte sa croissance et progression. Ainsi, nous souhaitons avoir recours à des animaux, pour valider ces observations et combiner leurs actions avec celles de molécules qui agiraient directement sur la tumeur comme le nouvel anticorps. Les modèles in vitro ne nous permettant pas de démontrer les effets des cellules immunitaires sur la progression de ce cancer le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.

Réduction

Au total nous envisageons d’utiliser 180 animaux répartis en 2 groupes : 60 animaux dans le groupe 1 et 120 animaux dans le groupe 2. Nous avons choisi d’inclure 20 souris pour chaque condition dans le groupe 1 (et 20 souris pour chaque condition dans le groupe 2 pour avoir le nombre nécessaire de souris différentes par technique envisagée dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’atteindre des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) quotidiennement. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le poids des souris sera mesuré tous les jours. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte afin de veiller au bien-être des animaux. Les interventions seront realisées sur animal anesthésié.

Choix des espèces

Le projet a pour but de déterminer l’efficacité d’un anticorps dans le contexte du cancer de l’ovaire et de caractériser le rôle des protéines d’intérêts dans l’environnement tumoral de ce cancer. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes, c’est-à-dire possédant un système immunitaire complet et compétent. Ce modèle nous permettra d’étudier les interactions complexes entre les différents composants du système immunitaire et la cellule tumorale du cancer de l’ovaire. Plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse (phénomène de nouveaux vaisseaux sanguins) et de l’inflammation. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur expose les fœtus puis les nouveau-nés à un cocktail de molécules polluantes par l'alimentation pendant 33 jours, et suit les atteintes du foie et de la fertilité jusqu'à huit mois. Les femelles servant à entretenir la colonie sont tuées à six mois, et les animaux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués vers trente jours, après génotypage. Il indique n'attendre aucun phénotype délétère majeur, tout en listant perte de poids anormale, hypoactivité, dos voûté et yeux enfoncés parmi les signes qu'il surveille.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir si les expositions à des polluants environnementaux lors de la grossesse ou bien lors de l'enfance peuvent entrainer des maladies à l'âge adulte et plus particulièrement des maladies du foie ou bien des troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

Les expositions environnementales sont suspectées d’être à l’origine d’un grand nombre de pathologies telles que les troubles de la fertilité ou l’apparition de maladies métaboliques. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces pathologies permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Cela est d’autant plus nécessaire que dans le cadre d’une exposition systémique, les communications entre les organes par des voies notamment endocriniennes, peuvent participer à l’apparition de pathologies multiples et parfois interdépendantes. Ce projet permettra de définir l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des pathologies hépatiques et des troubles de la fertilité masculine, tout en définissant la part relative des dialogues bidirectionnels entre le foie et les testicules dans l’apparition de ces pathologies. De plus ce projet définira de nouveaux marqueurs de diagnostic, de pronostics ; voire de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux seront soumis au prélèvement d'une biopsies pour le génotypage entre 7 à 10 jours après la naissance. Certains animaux sont des animaux génétiquement modifiés avec une invalidation tissu spécifique pour le gène CAR, les conséquences pouvant toucher les pathologies hépatiques et les troubles de la fertilité seront suivies au plus jusqu'à 8 mois. Les animaux seront soumis à des expositions à des cocktails de molécules environnementales part voie alimentaire pendant 33 jours (à partir de 6.5 jours de vie embryonnaire et jusqu'à 20 jours après la naissance). Les conséquences seront suivi au plus jusqu'à 8 mois.

Impact sur les animaux

Il est à noter que selon la littérature sur le l'invalidation du gène étudié ne présentent pas de phénotype délétère majeur. Aussi, le ciblage de l'invalidation dans un organe en particulier ne devrait pas engendrer de phénotypes dommageables systémiques conduisant à une atteinte majeure de la santé de l'individu. Cependant, les signes observés seront la perte anormale de poids de l’individu ou bien des troubles au niveau de son activité (hypoactivité), dos vouté, yeux enfoncés.... Chaque souris sera surveillée de façon quotidienne par le personnel animalier.

Devenir

Les animaux surnumérères de génotypes qui ne sont pas intéressants pour le projet seront mis à morts. Les animaux utilisés pour les analyses seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.

Remplacement

Afin d'analyser l'impact à long terme à l'âge adulte d'exposition à des polluants environnementaux survenues lors de la grossesse et pendant la petite enfance, il n'y a pas à l'heure actuelle de possibilité de remplacer les modèles in vivo. D'autant plus dans notre étude où en plus de la considération temporelle, nous analyserons également les impacts d'un point de vue des dialogues entre plusieurs organes (foie et testicule). Ces considérations de communications entre les organes combinées avec les aspects développementaux (embryons/enfants jusqu'à l'adulte) ne permettent donc pas d'utiliser les approches en culture cellulaire. Cependant des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Réduction

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible dans le contexte des hypothèses des origines développementales de la santé et des pathologies (DOHaD) car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de discussion bidirectionnelle entre les organes sur une cinétique de temps entre une exposition embryonnaire/néonatale et l'apparition de pathologies à l'âge adulte. Des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux à utilisés a été réduit au maximum Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre les groupes a été évalué en amont grâce aux expériences précédentes, menées ces dernières années dans le cadre d'autres projets et qui nous ont permis d'évaluer les variations attendues dans la réponse des animaux aux expositions à des polluants environnementaux. De plus, sur les animaux qui seront mis à mort dans le cadre de cette étude, nous prélèverons un maximum d'autres tissus que ceux directement ciblés par le projet, afin de pouvoir permettre le partage de tissus avec d'autres collègues permettant ainsi d'alimenter d'autres projets de recherche sans utiliser d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Le raffinement reposera sur un hébergement et une surveillance des animaux ainsi que l'élaboration de protocoles prenant en compte au maximum le bien-être animal. Cela reposera notamment avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages et un maintien de plusieurs animaux par cage. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement pour lequel le laboratoire a une très forte expertise dans l'analyse des impacts de molécules environnementales tant sur la physiologie hépatique que sur la physiopathologie testiculaire et les retombées sur la fertilité. Il s'agit ici d'exposition à un mélange de molécules environnementales permettant de développer ce type de pathologies avec une incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats statistiquement fiables. Des femelles seront utilisées pour l'entretien de la colonie et seront mis à mort à 6 mois; Les femelles et mâles qui ne seront pas utilisées ou de génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort après génotypages soit à 30 jours postnataux. Des mâles de génotypes intermediaires seront utlisés pour l'entretien de la colonie. Pour les mâles du génotype d'intérêt, nous utiliserons des souris à 5 jours, 10 jours, 1 mois, 3 mois et 12 mois postnatal pour l'analyse des phénotypes. Ces différents temps d'analyse correspondent à des moments précis où se déroulent des étapes clefs de la mise en place des fonctions testiculaires et hépatiques ainsi que la mise en place et le maintien de la fonction de reproduction.

Toutes tuées entre neuf et quatorze jours de vie, 280 souris subissent une biopsie de la queue puis l'administration d'une substance activant la voie de l'acide rétinoïque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des mâles, écartés après génotypage parce que leur génotype ne convient pas, sont tués sans même être prélevés. La mise à mort passe par une anesthésie à dose létale suivie d'une perfusion de dix minutes, pour prélever les testicules. Le porteur affirme qu'une approche sur animaux est "indispensable" et qu'un système in vitro est impossible, et cite un contraceptif masculin parmi les retombées envisagées.

Objectifs

L’acide rétinoïque et les récepteurs de l’acide rétinoïque sont indispensables à la différentiation des spermatogonies pendant la spermatogenèse. Nos études suggèrent l'existence de différentes populations de spermatogonies qui émergent à différents stades du développement prépubère et qui seraient contrôlées par l’un ou l’autre des récepteurs de l’acide rétinoïque. Dans ce projet nous induisons la différentiation de spermatogonies chez des souris présentant un arrêt de la spermatogenèse par administration de diverses substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Les testicules des animaux traités sont soumis à des analyses visant à élucider l’émergence de plusieurs populations de spermatogonies pendant la période prépubère.

Bénéfices attendus

Dans la mesure où inhiber la synthèse d’acide rétinoïque bloque la différenciation des spermatogonies dans de nombreuses espèces, y compris les êtres Humains, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts ici chez des souris altérées dans la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont pertinents pour les êtres Humains. En comprenant comment la voie de signalisation de l'acide rétinoïque agit sur les spermatogonies chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour ou entre le 5e et le 10e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours pour rétablir la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 9 jours et 14 jours. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à un type cellulaire du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. L’administration de substances entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.

Devenir

Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt (contrôles non mutants) seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (1/2 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La spermatogenèse est un processus complexe impliquant divers types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et germinales sont cruciales pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque dans le maintien de ces interactions cellulaires dans un contexte physiologique. Il est important de souligner que l'utilisation d'une approche expérimentale avec des animaux est indispensable pour répondre à ces questions. Un remplacement par un système in vitro (conformément au 1e R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires est calculé de manière précise pour répondre aux exigences de réduction de l'utilisation d'animaux, tout en garantissant la qualité des résultats et la robustesse de leur validité statistique. Étant donné que notre étude se focalise sur la spermatogenèse, seuls les mâles (représentant statistiquement la moitié des naissances) sont inclus dans les expériences. Les traitements sont administrés exclusivement aux mâles mutants préalablement sélectionnés par génotypage. Les mâles mutants représentent la moitié des individus produits par les croisements, et cette proportion ne peut être augmentée. Les testicules controlatéraux de chaque mâle sont utilisés pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés de manière distincte et servent à deux voire trois types d'analyses, ce qui s'aligne parfaitement avec le 2e R de la règle des 3R en réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance constante de leur état de santé est assurée. En cas de souffrance ou de modification de leur comportement, des mesures correctives sont rapidement prises en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli du testicule, ce qui ne cause aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité non obstructive des mâles. Ce génotype d'intérêt concerne la moitié des mâles produits avec les croisements en place, et cette proportion ne peut être augmentée. Les procédures débutent par l'identification des mâles et la biopsie de queue pour le génotypage. Ces étapes sont effectuées avant l'administration du médicament, permettant ainsi une sélection visant exclusivement les animaux mutants d'intérêt. Ainsi, le raffinement (conformément au 3e R de la règle des 3R) est pleinement intégré dans notre projet.

Choix des espèces

La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court ; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre qui impliquent la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont conservés chez l’Homme. Nous identifions et génotypons tous les souriceaux mâles âgés de 1 à 10 jours pour choisir les mâles mutants qui seront traités par la suite. Les souris contrôles (non mutantes) dont le génotype n'est pas compatible à la suite de la procédure sont euthanasiées. Nous déclenchons la différenciation de toutes les spermatogonies à l'âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours en utilisant une méthode pharmacologique. Ces périodes correspondent aux moments où les gènes codant pour les récepteurs de l’acide rétinoïque commencent à s'exprimer, permettant une comparaison pertinente entre les moments d'expression et les moments d'administration des traitements. Nous analysons la différenciation des spermatogonies 24 heures après le traitement.

Pour étudier le rôle de l'acide rétinoïque dans la production des spermatozoïdes, 1 050 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre l'âge de quinze et vingt-neuf jours par perfusion d'un fixateur sous anesthésie létale. Les souriceaux subissent une biopsie de queue dès le premier jour de vie, puis des injections de rétinoïdes, d'inhibiteurs de kinases et d'un traceur cellulaire. Trois mâles sur quatre n'ont pas le génotype recherché et sont tués sans qu'aucun prélèvement soit fait sur eux, et le porteur ajoute 25 % d'animaux pour couvrir un risque qu'il qualifie d'"élevé" d'abandon ou de cannibalisme par la mère, provoqué par la manipulation précoce des nouveau-nés. Il conclut que le remplacement par un système in vitro est "impossible".

Objectifs

La spermatogenèse est le processus de formation des gamètes mâles - les spermatozoïdes, à partir des cellules souches appelées spermatogonies. Ce processus se déroule dans les tubes séminifères du testicule. Une étape cruciale de la spermatogenèse est la méiose, qui permet des échanges entre les gènes, contribuant ainsi à la diversité génétique. Selon la littérature, l'acide rétinoïque, le métabolite actif de la vitamine A, est une molécule essentielle qui régule différentes phases de la méiose. L'inactivation d'un ou plusieurs acteurs de la voie de signalisation de l'acide rétinoïque conduit à un blocage de la spermatogenèse, entraînant par conséquent l'infertilité. L’acide rétinoïque peut exercer des effets génomiques, en se liant à ses récepteurs dans le noyau de la cellule, mais il peut également induire des effets non génomiques, en régulant des protéines kinases présentes dans le cytoplasme de la cellule. Dans ce projet nous utilisons des souris mutantes (pour les voies de synthèse de l’acide rétinoïque) présentant un arrêt de la spermatogénèse. Chez ces souris mutantes, on note également une sur-activation de certaines protéines kinases dans le testicule. En employant une approche pharmacologique, nous déclenchons de manière contrôlée et simultanée la différenciation de toutes les spermatogonies puis nous administrons différentes substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque ou inhibitrices de tyrosine kinases, afin d'étudier leur implication dans le processus de la méiose. Les testicules des animaux traités servent à réaliser les analyses qui doivent permettre de comprendre le rôle de ces différentes voies dans la méiose.

Bénéfices attendus

Des études pharmacologiques montrent un blocage de différenciation des spermatogonies chez l’Homme, lorsque la synthèse de l’acide rétinoïque est bloquée. En comprenant comment les voies de signalisation de l'acide rétinoïque et des tyrosines kinases (potentiellement contrôlées par l'acide rétinoïque) agissent sur les spermatogonies et la méiose chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge entre 10 et 12 jours (1 injection pour les rétinoïdes, 3 injections pour les inhibiteurs des kinases) pour sauver les cellules méiotiques de la mort. - Administration d’une molécule traceuse de cellules à l’âge de 10 jours pour suivre l’évolution d’une cellule. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 15 jours et 29 jours. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à deux types cellulaires du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. La taille de l’échantillon de queue ne dépasse pas 0.5mm pour limiter la nuisance engendrée par cette biopsie. L’administration de substances (rétinoïdes, inhibiteurs de kinases, traceur cellulaire, anesthésique ou analgésique) entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.

Devenir

Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (3/4 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.

Remplacement

La production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse, est un processus complexe qui implique différentes cellules dans les testicules. Les interactions entre ces cellules sont cruciales pour assurer une production constante de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque – métabolite actif de la vitamine A, et des protéines de type tyrosine kinases, qui sont potentiellement régulées par l’acide rétinoïque, dans un contexte physiologique naturel préservant ces interactions cellulaires. Il est donc indispensable qu’une approche expérimentale avec des animaux soit employée pour répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Notre étude se concentre sur la production des spermatozoïdes, donc seulement les mâles (environ la moitié des naissances) participent aux expériences. On identifie et prélève un petit échantillon de queue le plus tôt possible afin de déterminer le type génétique et sélectionner les mâles mutants. La suite de la procédure n’est réalisée que pour les mâles mutants sélectionnés. Ils représentent un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Il sera donc nécessaire de quadrupler l’effectif (quadruple). Le risque d'abandon par la mère ou de cannibalisme au cours de la procédure expérimentale est élevé dû à la manipulation précoce des nouveau-nés. Afin de prendre en considération ces risques, nous prévoyons d’augmenter l’effectif des animaux de 25%. Cependant, dès que le nombre de mâles requis pour un traitement donné sera atteint, les prélèvements pour le lot correspondant seront arrêtés, 25% représentant une valeur limite maximale. Par ailleurs, au cours de notre étude, nous serons à même d’estimer plus finement le pourcentage de risque lié à la manipulation des nouveau-nés, ce qui permettra d’ajuster les effectifs et de réduire au maximum l’utilisation des animaux dans les futurs projets. Nous comparons et analysons des groupes de mâles mutants traités de différentes manières (7 conditions au total). Nous analysons l’évolution de la méiose - processus de combinaison des gènes maternels et paternels assurant la formation d’une nouvelle cellule qui va se maturer en spermatozoïde. Nous étudions 2 points clé de la méiose et nous analysons aussi son produit final à un stade plus tardif (3 stades). Nous avons besoin de 10 mâles pour chaque groupe expérimental : 5 pour des analyses de tissu et 5 pour des analyses moléculaires. Nous utilisons le deuxième testicule de chaque mâle pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés différemment et utilisés pour deux voire trois types d’analyses, ce qui répond parfaitement à une réduction du nombre d’animaux en accord avec le 2e R de la règle des 3R.

Raffinement

Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance de leur état de santé et des soins appropriés (analgésie) est assurée si nécessaire. En cas de souffrance ou d’altération du comportement des animaux, des mesures correctives nécessaires sont prises rapidement en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli et les cellules germinales du testicule (Ser-/- ; Germ-/-), ce qui n’induit aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité des mâles. Ce génotype d’intérêt concerne un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Les procédures expérimentales commencent par l’identification des mâles suivie de la biopsie de queue en vue du génotypage. Ces procédures sont conduites au stade P0-3, précédant l'administration du Médicament1 afin de permettre une sélection ciblée visant à traiter exclusivement les animaux mutants d’intérêt. Les procédures expérimentales sont conduites de façon à diminuer le stress de l’animal. Ainsi, dans le cadre de la Procédure 1, les injections des molécules destinées à être administrées le même jour (rétinoïdes et traceur) sont espacées d’un intervalle de 8 heures. Pour assurer le bien-être des nouveaux-nés, des nids sont aménagés dans les cages, offrant ainsi un environnement chaleureux et sécurisé pour les souriceaux. Afin de garantir leur confort, les animaux sont maintenus en groupe avec leur mère jusqu'au moment de l'euthanasie. Ainsi, l'intégration totale du raffinement, conformément au principe du 3e "R" de la règle des 3R, est une caractéristique fondamentale de notre approche expérimentale.

Choix des espèces

La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court, génome connu, outils moléculaires). Par ailleurs, la souris partage 99% d'identité génétique avec l'homme, et les mécanismes de la spermatogenèse sont conservés chez les deux espèces. Nous induisons la différenciation de toutes les spermatogonies en utilisant une méthode pharmacologique (Médicament1 : acide rétinoïque) à l’âge de 4 jours (P4). Cet âge a été sélectionné afin de correspondre au mieux à la période habituelle de différenciation des spermatogonies chez les souris sauvages, permettant ainsi une comparaison pertinente. Cependant, chez les mutants synchronisés, la méiose ne se finalise pas et les cellules meurent de par l’absence d’acide rétinoïque ou d’une dérégulation des voies qu’il contrôle en aval. Le traitement avec le Médicament2 vise à préserver les cellules méiotiques de la mort. Pour les rétinoïdes, nous envisageons une seule injection à P10 (Médicament1+6 jours). Cet âge a été choisi en raison de l'émergence des premières cellules méiotiques productrices d'acide rétinoïque chez les souris synchronisées, correspondant ainsi à la période propice. En revanche, pour les inhibiteurs des kinases, nous prévoyons une injection quotidienne entre P10 et P12 (Médicament1 + 6 à 8 jours). Cette fréquence de traitement a été délibérément choisie pour garantir une inhibition constante des kinases juste après la période de production d’acide rétinoïque. La méiose dure environ 15 jours chez la souris. Nous analysons l'évolution de la méiose à deux points clé (à P15 et à P19) et nous analysons aussi son produit final (à P29).

Traitées 21 jours par deux médicaments anticancéreux, avec sept injections intrapéritonéales et une administration orale un jour sur deux, 96 souris mâles seront toutes tuées pour prélever leurs organes reproducteurs, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la toxicité peut provoquer une perte de poids et une inactivité, et que l'administration orale peut entraîner des fausses routes, les animaux perdant 15 % de leur poids étant retirés du projet et tués. Le projet vise à décrire l'effet de ces médicaments sur la production de spermatozoïdes, à partir d'une hypothèse sur l'augmentation des mutations. Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que la spermatogenèse est trop complexe pour un système in vitro.

Objectifs

Dans ce projet, nous examinerons les effets de 2 médicaments anticancéreux sur la différenciation de cellules sexuelles mâles (spermatogenèse). Nous visons à révéler comment les médicaments anticancéreux affectent la division cellulaire et aussi comment ils affectent la réparation de l'ADN. Nous étudions les médicaments qui ont reçu beaucoup d'attention en raison de leur efficacité dans le traitement du cancer, mais les mécanismes de leur action sur la spermatogenèse normale ne sont pas bien compris. Nous émettons l'hypothèse que les perturbations des mécanismes épigénétiques (qui modifient l'expression des gènes sans altérer la séquence génétique) conduiront à une augmentation des mutations. L'objectif de ce projet est de révéler l'impact des médicaments épigénétiques sur la spermatogenèse normale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des médicaments épigénétiques sur la spermatogenèse normale afin de développer de meilleures stratégies pour les thérapies anticancéreuses. Nous identifierons également les cibles potentielles affectées par ces médicaments.

Procédures

Les animaux seront traités avec 2 médicaments , séparément, pendant 21 jours. L'administration de la première molécule se fait par injection intra-péritonéale (durée de l'injection : 30 secondes) à la fréquence d'un jour sur 3 (au total 7 injections). le traitement au second médicament se fera par administration orale (durée de l'administration: 30 secondes), à la fréquence d'un jour sur 2, pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale et la toxicité du médicament 1 pourrait avoir des effets indésirables, tels que la douleur et le stress. Nous avons réduit le nombre d'injections, de sorte que les souris ne recevront que 7 injections au total. L'administration orale du second médicament pourraient induire des effets négatifs tels que des fausses-routes. La toxicité de la deuxiéme molécule pourrait induire une perte de poids, une inactivité. Des points limites adaptés sont mis en place.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet: les organes reproducteurs seront prélevés pour les analyses moléculaires.

Remplacement

Le modèle de la souris est couramment utilisé dans les études sur la méiose. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire, ce qui n'est possible qu'in vivo.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant un nombre minimal de souris pour garantir des résultats statistiquement significatifs. La méthode d'injection du premier médicament chez l'animal nécessite 12 animaux par lot (traités et contrôles), en raison du risque d'effets indésirables, liés à sa toxicité. Pour l'exposition au second médicament, nous utiliserons deux groupes de 12 souris ( traités et contrôles), ce qui est suffisant pour les tests statistiques, car les souris consanguines donnent des résultats plus homogènes. Nous prévoyons de répéter une fois l'expérience.

Raffinement

Les composés seront administrés par des personnes formées et compétentes dans cette procédure technique. Les souris ne seront traitées qu'un jour sur deux, ou un jour sur trois ,pendant 21 jours, ce qui permettra de réduire le stress dû à l'administration. Application des points limites : perte de poids maximale de 15% (comparaison avec le groupe contrôle), les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lots de 4. Si l'animal montre des signes de souffrance (selon notre grille de suivi des points limites) le traitement sera interrompu et l'animal sera euthanasié. Normalement, les doses de médicament sont faibles (15 fois inférieur à la dose maximale) et les souris la tolèrent bien. Si le traitement provoque des effets limités tels qu'une perte de poids corporel, une réduction des activités et que l'animal montre des signes de souffrance, le traitement sera interrompu.

Choix des espèces

Nous utiliserons une souche de souris pour laquelle de nombreuses données publiques sont disponibles. Nous utiliserons le mâle adulte parce que la méiose est bien établie chez le mâle adulte et que les souris sont sexuellement matures pour produire des gamètes. Le modèle souris est l'un des meilleurs pour étudier la méiose et la recombinaison homologue parce que le mécanisme est très conservé entre l'homme et la souris. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes.

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur vingt semaines, chaque animal reçoit des injections, six prélèvements sanguins et vingt prélèvements d'urine sous contention, les trois quarts subissant en plus vingt-quatre instillations nasales et une chirurgie terminale, pour reproduire une maladie rénale auto-immune liée aux particules fines. Le porteur indique que les contentions répétées provoquent stress et douleurs, avec des risques de saignement, d'infection et de chute de tension. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne confirme in vivo l'effet de la pollution, les retombées de santé publique restant à envisager.

Objectifs

Notre projet vise à étudier l’impact des particules fines contenues dans la pollution atmosphérique dans la physiopathologie de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait une meilleure compréhension de l’impact de la pollution sur le système immunitaire et le développement des maladies auto-immunes, notamment de la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Cela pourrait déboucher sur la mise en place de politiques de santé publique et d’une prise en charge spécifique visant à bloquer la suractivation des voies de signalisation inflammatoires.

Procédures

Par animal sur tous les animaux du projet (20 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 20 Prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 procédure chirurgicale terminale sous anesthésie/analgésie Par animal, sur 75% des animaux du projet : - 24 instillations intranasales (8 semaines de traitement X 3 instillations par semaine). 15 secondes par instillations.

Impact sur les animaux

Les nuisances et complications eventuelles de la procdure incluents : - Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, de prélèvements d’urine et de sang et les instillations nasales. - Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou une chute de la tension artérielle voire une hypovolémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique des organes d’intérêts (reins).

Remplacement

Nos résultats préliminaires in vitro sur cellules immunitaires périphériques et ex vivo suggèrent que la pollution atmosphérique induit une réponse immunitaire pro-inflammatoire favorisant le développement de maladies auto-immunes comme la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour confirmer l’impact des particules fines dans le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les groupes.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limite précoces et adaptés appuyés sur des fiches de suivi individuels des animaux tout au long du projet.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, il existe des études publiées montrant l'efficacité du modèle d’immunisation active de souris avec la protéine d'intérêt pour reproduire exactement la pathologie etudiée, la glomérulonéphrite extra-membraneuse. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).