Système urogénital

1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ablation d'un rein, des administrations répétées de composés jusqu'à deux fois par jour, des prélèvements sanguins, des échographies cardiaques et des séjours en cage métabolique, pour mettre au point un modèle de maladie rénale chronique. Le porteur qualifie la chirurgie d'induction d'invasive et douloureuse et décrit un stress chronique lié aux gestes répétés. Il reconnaît que des modèles in vitro à base de sphéroïdes ou d'organoïdes sont en développement dans la société, tout en concluant à l'usage du rat, la finalité restant le développement de thérapies pour les patients.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques peuvent avoir diverses origines : inflammatoires, insuffisances aigues, associées au diabète, infectieuses, …. Elles ont pour conséquence d’induire une perte de fonctionnalité rénale dont les traitements envisagés actuellement se résument à la dialyse ou la transplantation rénale. De plus, ces maladies peuvent induire des altérations cardiaques graves menant à l’insuffisance cardiaque. L'objectif de ce projet est de développer des modèles mimant les maladies rénales chroniques pour permettre le développement de thérapies moins impactantes pour la vie du patient que celles dont on dispose actuellement.

Bénéfices attendus

Seuls la dialyse ou la transplantation rénale sont envisagées pour traiter ces maladies rénales. Ce sont des traitements lourds qui impactent de façon importante la vie du patient. Ainsi, il est nécessaire de trouver de nouveaux axes thérapeutiques pour éviter d’arriver à ces thérapies relativement lourdes. La mise en place de ce type de modèle préclinique le permettra. De plus, des thérapies ciblant les conséquences au niveau du cœur peuvent être également testés.

Procédures

1 – l’induction de l'insuffisance rénale aigue : La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure 1h30. 2 - Les composés à tester/de référence seront administrés jusqu’à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutannée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié (pendant maximum 2 semaines). L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. 3- Des prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (quelques jours avant la chirurgie, puis 24h, 48h et 72h après la chirurgie et une fois par semaine pour les projets chroniques ) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. 4 - Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies et des mesures de pression artérielle sur animal anesthésié en début et fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration du rein (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang.)

Impact sur les animaux

1 – l’induction d'une insuffisance rénale aigue : cette chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. En induisant la pathologie, une différence de production d’urine peut être attendue. De la même façon, une différence de prise hydrique peut être attendue. 2 - Les prélèvements de sang peuvent engendrer des hématomes, les sites de prélèvements seront observés de près. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. L'echographie et la mesure de la pression artérielle sont non invasives mais nécessite une anesthésie légère, le reveil des animaux sera surveillé de près. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le rein, paramètres métaboliques et de fonction rénale dans le sang...)

Remplacement

L’insuffisance rénale aigue pourrait être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Des modèles in vitro à partir de système sphéroïde ou organoïde sont en cours de développement au sein de la société.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains (non néphrectomisés).

Raffinement

Lors de la chirurgie et en post-chirurgie, des stratégies analgésiques locales et systémiques seront utilisées pour réduire la douleur. L'animal est placé sur tapis thermorégulé avec sonde rectale de température avec mesure instantanée de la température corporelle, garantissant le maintien de l'animal à 37°C pendant la chirurgie. Un concentrateur à dioxygène est couplé à l'appareil à isoflurane pour favoriser la respiration des animaux anesthésiés. Les rats seront hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière pourra être déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure et la SBEA. Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points suivants : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier sera euthanasié. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, les animaux seront visités de façon biquotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne surprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, un gel d'hydratation peut être ajouté ou une injection sous cutanée de solution saline peut être envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme pour limiter le stress de l'animal. De la même façon, la prise hydrique sera monitoré plusieurs fois par semaine.

Choix des espèces

L’utilisation de rat permet d’étudier à la fois le pan rénal et le pan cardiaque de façon robuste. De plus, les traits de la pathologie sont comparables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux utilisés seront étudiés à l’âge adulte afin que la maturation de leur physiologie (hormonale, immunitaire) soit stable et garantir une homogénéité des résultats.

3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections, des gavages pouvant causer des fausses routes et, pour une partie, une castration chirurgicale, les traitements aux glucocorticoïdes pouvant entraîner une fonte musculaire et une perte de poids de 20 %. Le porteur étudie le rôle controversé des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate résistant à la castration. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre cellules tumorales et cellules voisines.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez l’homme dans le monde et la seconde cause de mortalité par cancer. Il s’agit d’un cancer dépendant des androgènes, une hormone, qui, en se fixant à son récepteur favorisent la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques. Ainsi, les cancers de la prostate localement avancés et métastatiques sont traités par des anti-androgènes aussi appelée castration chimique afin de bloquer toute activation de la voie de signalisation des androgènes. Cependant, bien que ce traitement soit efficace durant les premiers mois, la majorité des patients rechutent et progressent vers un cancer résistant à la castration. Les glucocorticoïdes, une autre hormone qui se lient aux récepteurs des glucocorticoïdes, sont utilisés avec succès en combinaison avec les anti-androgènes depuis de nombreuses années, car ceux-ci atténuent les effets secondaires et potentialisent les traitements anti-androgène. Toutefois, l’utilisation des glucocorticoïdes dans le traitement du cancer de la prostate, est devenu un sujet controversé car le récepteur aux glucocorticoïdes pourrait également jouer un rôle dans la progression de la tumeur. Nos données préliminaires obtenues à l’aide des modèles murins de cancer de la prostate vont dans ce sens et montrent que : - Le récepteur des glucocorticoïdes est présent dans les cellules cancéreuses et les cellules avoisinantes - Le récepteur des glucocorticoïdes est important dans l’initiation du cancer de la prostate. Il devient donc urgent de mieux caractériser le rôle des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration.

Bénéfices attendus

Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate localement avancé et métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes par déprivation androgénique. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires lors de la déprivation androgénique). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre l’impact des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la déprivation androgénique. Cette étude est importante afin de définir le rôle favorable ou défavorable d’un traitement aux glucocorticoïdes sur le développement du cancer de la prostate.

Procédures

•Dans un premier temps, 1760 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris) afin d’inactiver le gène d’intérêt. 1, 3, 6, 9, et 12 mois après l’inactivation du gène, les souris seront traitées avec des glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements. •Dans un second temps, 1280 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris). 640 souris seront castrées chirurgicalement et 640 seront uniquement ouvertes sans castration (groupe contrôle (Sham)) (3 mois ou 9 mois après inactivation du gène d’intérêt). Cette intervention dure environ 10 minutes pour chaque souris.7 jours après opération : les souris castrées ou non seront traitées avec glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements.

Impact sur les animaux

Les souris de cette étude sont exposées à des nuisances : lors de leurs gavages, des différentes injections ainsi que lors de la chirurgie et le développement d’une tumeur. En effet, les souris sont sujettes à un stress physique lors de la contention, et des lésions et/ou douleurs lors des différentes procédures. Le grossissement de la tumeur peut également générer un inconfort qui sera contrôler par palpation de la prostate et observation de l’apparence générale de la souris. Des effets indésirables peuvent également être observés lors de ces différentes manipulations : - Le gavage peut conduire à des fausses routes. - La chirurgie peut induire une hémorragie en cas de mauvaise ligature des artères et une infection post opératoire. - Les injections peuvent entrainer une infection. - Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de poids de 20%, qui par conséquent pourrait altérer le bien-être des animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale définie dans ce projet, l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie que nous utilisons habituellement au laboratoire. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en oeuvre du projet de recherche.

Remplacement

Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle des glucocorticoïdes le développement du cancer de la prostate et la résistance aux traitements utilisés actuellement. Les communications entre les cellules avoisinant la tumeur comme par exemple les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A noter que le récepteur aux glucocorticoïdes est exprimé dans les cellules cancéreuses prostatiques mais également dans les cellules avoisinant la tumeur. Ceci implique donc qu’un traitement aux glucocorticoïdes agit sur les deux compartiments cellulaires. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. En effet, il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. Par ailleurs une étude pilote sera réalisée afin d’éviter d’utiliser un protocole d’injection de glucocorticoïdes non adapté, et ne nous permettant pas d’apporter de conclusion. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler l’apparence générale de la souris, sa posture et son comportement tout au long de leur vie. Concernant la partie chirurgicale, les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Afin d’analyser le bien-être animal, les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité et palpation abdominales. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’histologie de la prostate murine et humaine est similaire. -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses dont certaines seulement évoluent en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme, ce qui est crucial pour la mise en oeuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Les traitements pour induire la mutation se feront à 8 – 10 semaines d'âge et les animaux seront mis à mort comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle des glucocorticoïdes à tous les stades de la maladie. Concernant la partie castration, uniquement deux temps de cinétique ont été choisis, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (un temps précoce et un temps plus tardif).

739 poissons médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mâles passent cinq semaines dans une eau à 32 °C, une température qui réduit fortement la mobilité de leurs spermatozoïdes, puis subissent sous anesthésie un prélèvement de sperme par pression sur le ventre, et leurs descendants sont étudiés sur une ou deux générations. Les poissons élevés à 32 °C et leurs descendants sont tués, comme une partie des témoins dont on prélève les testicules, tandis que 157 témoins élevés à 25 °C pourront être réutilisés. Les retombées annoncées visent l'aquaculture, où selon le porteur le coût de la réfrigération impose de connaître les températures qui permettent de "maintenir le bien-être et les performances des animaux". Sa réponse sur le remplacement tient en une phrase : il n'existe "pas d'alternative", puisque l'équipe étudie précisément la spermatogenèse à température élevée.

Objectifs

Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites «méthyle » (groupements CH3), constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. On appelle méthylome l'ensemble des groupes méthyle pour une cellule ou pour un tissu donné. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Dans un contexte de réchauffement climatique, ces résultats soulignent la nécessité de tester comment des variations épigénétiques du spermatozoïde induites par une augmentations de température peuvent impacter les performances des descendants de première (F1), voire puis seconde (F2) génération. L'objectif de ce projet est donc d'aborder le rôle de la méthylation de l'ADN dans la transmission paternelle inter et transgénérationnelle des effets de température chez le poisson. Pour ce type d'étude, l'espèce modèle médaka (Oryzias latipes) est parfaitement adaptée, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Notre première hypothèse de travail : le méthylome de l'ADN du sperme de médaka est sensible à la température d'élevage au cours de de la spermatogenèse. La deuxième hypothèse : le méthylome de l'ADN du sperme contribue au développement embryonnaire et adulte et module les phénotypes. La troisième hypothèse : les altérations du méthylome de l'ADN sont transmises de génération en génération à travers la ligné germinale mâle et persistent même lorsque les individus ne sont plus exposés à la température élevée.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaître les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.

Procédures

Les interventions prévues sont des prélèvements de sperme. Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela,après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 µL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Pour cette procédure, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.

Impact sur les animaux

Une première expérience a permis de déterminer la température et la durée d’exposition. La température d’exposition à 32°C pendant 5 semaines a été validée : les poissons médaka élevés à 32°C pendant un cycle de spermatogénèse présentent une forte diminution de la motilité des spermatozoïdes, mais néanmoins, les mâles testés étaient toujours capables de féconder des œufs et de produire une progéniture, (embryons éclos). D'après la littérature et nos premières observations, l'exposition à 32 °C pendant 5 semaines pendant la spermatogenèse ne produit pas de phénotype dommageable chez la descendance. De plus, aucun comportement de type pathologique n'a été observé après exposition à 32°C lors de notre expérience précédente. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergétique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.

Devenir

Les animaux élevés à 32°C et leurs descendants ne pourront être réutilisés. En effet nous suspectons que ce dispositif expérimental affecte un certain nombre de paramètres biologiques, dont l'épigénétique des poissons. Ils seront euthanasiés. Parmis les animaux contrôles issus de contrôles (élevés à 25°C), certains devront être euthanasiés afin de prélever leurs testicules pour des analayses moléculaires ou cellulaires. En revanche, 157 animaux contrôles issus de contrôles (élevés à 25°C) pourront être réutilisé après avoir participé au test de fécondance ou à la génération suivante.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.

Réduction

Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus. En outre, nous organisons l'emploi des animaux et les méthodes de manière à réutiliser les animaux pour plusieurs approches : les femelles utilisées pour les tests de motilité du sperme seront également utilisées pour la génération des F1, les mâles analysés en motilité du sperme permettront également de réaliser les analyses moléculaires (méthylation ADN et transcriptomique), et les mâles étudiés au niveau histologique seront également testés pour la qualité mitochondriale de leur sperme.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’oeufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (moins de deux minutes par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).

Choix des espèces

Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 4.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois).

416 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie pour être infectés par des bactéries rendues luminescentes, puis des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, avant d'être tués pour dénombrer les bactéries dans leurs tissus. Le porteur indique une perte de poids et une possible prostration liées à l'infection, et présente ce projet pilote comme un préalable à l'étude de nouveaux antibiotiques. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire ces infections et rend l'étude "indispensable".

Objectifs

La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des rechutes sont observées, associées au développement de résistances. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des schémas thérapeutiques est donc nécessaire afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. L’évaluation de l’efficacité de ces nouveaux schémas thérapeutiques est indispensable in vivo chez l’animal infecté avant d’envisager d’éventuels essais cliniques chez l'Homme. Ce projet pilote va nous permettre la mise en place de deux modèles d’infections bactériennes, une infection intrapéritonéale (péritonite) et une infection intra-rénale (pyélonéphrite) à deux entérobactéries (E. Coli et K. pneumoniae) majeures dans l’apparition de l’antibiorésistance. Pour ce faire, l'infection est provoquée en utilisant des bactéries qui ont été modifiées en laboratoire pour être luminescentes. La quantité de luminescence mesurée par un appareil d'imagerie devrait être proportionnelle à la concentration bactérienne ; c'est ce qui sera vérifiée grâce à cette étude. Cette mise en place permet de définir les paramètres optimaux de chaque infection d’un point de vue scientifique (concentration bactérienne adéquate pour maintenir une infection sur plusieurs jours sans traitement antibiotique) et d’un point de vue éthique concernant le bien-être animal (infection provoquant des signes cliniques légers). L’objectif de ce projet pilote permettra de raffiner les procédures et de réduire le nombre d’animaux dans le projet final qui portera sur l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques d’une nouvelle combinaison d’antibiotiques chez le rat infecté par une infection à entérobactérie. Raffiner à l’aide de l'imagerie (bioluminescence) qui est un outil de suivi non invasif de l’infection.

Bénéfices attendus

A court terme, le projet pilote permettra de mettre au point 2 modèles d'infection et 1 méthode d'imagerie pour le suivi des infections. A long terme, ces modèles et méthode seront utilisés dans un projet plus vaste visant à étudier de nouvelles stratégies antibiotiques, avec un bénéfice direct pour les malades souffrant d'une infection résistante aux antibiotiques.

Procédures

Tous les animaux recevront 2 fois par jour une injection d'antalgique en condition vigile par voie sous cutanée. Le nombre d'injection sera de 2 à 8 injections ( durée de 30 secondes maximum). Le jour de l'infection, chirurgie sous anesthésie générale et locale avec imagerie (bioluminescence) durée totale de l'anesthésie de 20 minutes pour tous les animaux. Les jours suivants l'infection, imagerie pour mesure de la bioluminescence pour les rats mâles : - 4 anesthésies sur 4 jours consécutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 3 anesthésies sur 3 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 2 anesthésies sur 2 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 1 anesthésie : durée 10 min pour 96 animaux. Pour les 32 animaux femelles, le nombre d'anesthésie pourra varier de 1 à 4 en fonction des résultats obtenus chez le rat mâle.

Impact sur les animaux

Anesthésie : un inconfort léger lors de la phase de réveil de l’anesthésie est attendu. Actes chirurgicaux : une légere douler est attendue post-chirurgie réduit au maximum avec une couverture antalgique adéquate. Infection : une perte légère de poids inférieure 5 pour cent est à prévoir au cours du développement de l’infection, une prostration ou une perte de mobilité transitoire jusqu'à 24 heures post-infection peut survenir.

Devenir

Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne par comptage direct et établir une corrélation avec l'imagerie.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro ou in silico permettant de reproduire ces modèles d’infections et permettant de mimer l’apparition de mutations bactériennes in vivo. Cette étude pré-clinique in vivo est donc indispensable à une éventuelle transposition chez l’homme. Le développement de ces modèles est la première étape de ce projet transversal d’amélioration de l’utilisation des antibiotiques en association dans le traitement des infections sévères.

Réduction

Ce projet correspond à une étude pilote pour un projet futur ainsi, seul le nombre minimum d'animaux nécessaire à l'analyse statistique des résultats sera utilisé. Ce nombre a été déterminé par un test statistique . Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux et d’étudier la variabilité inter-sexe, les études des modèles d’infection seront effectués seulement sur les mâles. Une approche progressive de l'évaluation du choix de l'inoculum sera mise en place : Le 1er inoculum testé sera l'inoculum avec la concentration la plus faible, si l'infection ne se maintient pas pendant 4 jours et/ou n'est pas quantifiable par méthode d'imagerie, un second inoculum sera testé à une concentration bactérienne supérieure. Si ce deuxième inoculum ne permet toujours pas d'avoir une infection stable pendant 4 jours, l'inoculum le plus concentré sera évalué . Le nombre d'animaux indiqué dans ce projet est donc un nombre maximal. Une fois qu’un inoculum bactérien unique et une durée unique d’infection seront définis, une étude de variabilité inter-sexe sera réalisée sur des femelles permettant ainsi de reduire le nombre d'animaux dans ce projet pilote.

Raffinement

Les rats suivent une acclimatation de 10 jours et sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et sur planche thermostatée avec analgésie opératoire et postopératoire : cette couverture antalgique sera maintenue en continue sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre 2 fois par jour les animaux tout au long du projet. Des points limites gradés, suffisamment précoces et bien identifiés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettant d'agir rapidement pour améliorer le bien être .

Choix des espèces

La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. De plus, cette lignée n'est pas une lignée génétiquement modifiée. Dans la littérature , cette souche a été utilisée pour développer des modèles d'infection similaires à ceux presentés dans ce projet. Les animaux seront agés de 8 semaines ce qui leur garantit une maturité physiologique notamment de leur système immunitaire pour résister à l’infection.

20 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ovariectomie, l'implantation d'une capsule hormonale et des injections destinées à induire une endométriose, avec des douleurs post-chirurgicales et abdominales attendues. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Ce projet pilote vise seulement à mettre au point le modèle, le porteur affirmant qu'aucune méthode in vitro ou ex vivo n'existe et envisageant, en cas de succès, de tester ensuite une molécule sans refaire "toutes les étapes de toxicité".

Objectifs

L'endométriose est une affection gynécologique peristante qui se caractérise par la présence anormale de glandes endométriales et de tissu conjonctif en dehors de l'utérus. Ces lésions sont accompagnées d'une inflammation chronique. L'endométriose touche principalement les jeunes filles et les femmes en âge de procréer. Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Récemment, le rôle dans l’endométriose d’une protéine impliquée dans le développement du système nerveux central a été suggéré. Ce projet pilote qui utilisera au maximum 20 animaux a pour objectif de mettre en place un modèle murin d’endométriose afin d'étudier dans un prochain projet le rôle de cette protéine dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Il existe actuellement peu de solution thérapeutique pour les patientes souffrant de formes sévères de l’endométriose. En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Cette demande d’expérimentation a pour objectif la maitrise d’un modèle murin d’endométriose permettant de tester des nouvelles thérapies. Ainsi, nous devrions à terme être capables de tester un candidat médicament ciblant une protéine impliquée dans l’endométriose. A terme, nous proposerons un projet visant à tester l’effet d’une molécule thérapeutique ayant déjà montré un rôle prometteur dans une pathologie gynécologique : le cancer de l’endomètre. Il est important de noter que beaucoup de mécanismes cellulaires décrits dans l’endométriose rappellent ceux observés dans le cancer (multiplication cellulaire, migration à distance). Par conséquent, si nous montrons un effet de cette molécule dans un modèle murin d’endométriose, nous pourrons rapidement prévoir de faire des tests cliniques chez l’homme sans avoir à réaliser toutes les étapes de toxicités.

Procédures

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Ils subiront une ovariectomie qui visera à retirer les ovaires pour éviter la production d’hormones sexuelles. Les animaux seront également implantés avec une capsule délivrant des hormones. Enfin, les animaux recevront des injections sous-cutanées et une injection intrapéritonéale lors de l’induction de l’endométriose

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les douleurs post-chirurgicales. En effet, chaque animal subira l’ovariectomie. Ensuite, les animaux qui développeront l’endométriose pourraient être soumis à des douleurs abdominales liées à la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose.

Remplacement

L’endométriose est une maladie multifactorielle qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence d’un tissu anormalement localisé. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie chez l’animal en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou ex vivo.

Réduction

Afin de réaliser ce projet de mise au point de ce modèle murin d’endométriose, nous avons décidé de réaliser 5 expériences avec 4 souris par expérience. La taille de l’échantillon testé ne repose sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la difficulté expérimentale. C'est une procédure pilote. Dans le cas où nous maitrisons le geste au bout de 3 essais, nous ne réaliserons pas les essais supplémentaires.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, nous réaliserons l’intégralité des opérations chirurgicales sous anesthésie avec injection pré et post opératoire d’anti-douleur. Nous réaliserons les interventions de chirurgie dans des conditions d’antisepsie (application d’un produit antiseptique sur la région incisée. Avant de commencer la réalisation des chirurgies, il est important de noter que nous nous entrainerons pour la réalisation de ces gestes chirugicaux sur des cadavres (animaux mise à mort surnuméraires ou avec un mauvais génotype).

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement, c’est un organisme modèle en biologie. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de ceux observés chez les patientes touchées par l’endométriose. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.