Système urogénital

500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour le prélèvement de leurs reins. 128 d'entre elles enchaînent l'administration d'une molécule dans l'eau de boisson, une injection suivie d'un prélèvement sanguin de trois minutes sous anesthésie locale, dix jours de récupération, sept jours de surcharge en bicarbonate et cinq jours seules dans une cage métabolique, posées sur une grille pour la collecte quotidienne de leur urine. 168 autres reçoivent une molécule activant un gène, puis une surcharge en acide ou en bicarbonate pendant sept jours. Le porteur annonce 500 souris comme un plafond et écrit qu'il est "certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur", sans donner d'estimation.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment des cellules rénales, régulent l’équilibre acido-basique de l’organisme. Cet équilibre est essentiel pour le bon fonctionnement des organes et des réactions biochimiques. Les reins jouent un rôle clé en ajustant la quantité d’acide ou de base excrétée dans l’urine, en réponse aux variations de l’alimentation ou du métabolisme. Nous étudierons spécifiquement le rôle d’une protéine en réponse à une surcharge de base. Des résultats préliminaires dans des cellules en culture suggèrent que cette protéine est impliquée dans la réponse des cellules du rein aux bases et plus généralement dans la régulation de l’équilibre acido-basique. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, dont le gène codant pour cette protéine est inactivé. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent cet équilibre, et pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles acido-basiques qui peuvent survenir dans certaines maladies rénales ou métaboliques. Le projet se déroule dans 2 animaleries distinctes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet améliorera la compréhension des mécanismes régulant l’acidité du sang, un processus vital pour la santé. D’autre part, ils pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres de l’état acido-basiques visibles chez un nombre important de patients en réanimation, chez des malades sous dialyse ayant une maladie chronique du rein. Ces prises en charge représentent un coût important pour la société en raison des hospitalisations prolongées, des traitements lourds et de la diminution de la qualité de vie des patients. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces, permettant de réduire les complications médicales, d’améliorer la qualité de vie des patients et de diminuer les dépenses de santé associées. Ces résultats contribueront également à la recherche fondamentale sur le fonctionnement du rein et et le maintien de l’équilibre des ions dans l’organisme.

Procédures

Nombre total d’animaux : 500 souris (adultes, mâles et femelles). Les souris seront soumises aux interventions suivantes : -> 84 souris vigiles subissent une injection (durée de l’injection quelques secondes) ainsi qu’un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 56 souris vigiles subissent un traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours, un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 64 souris transgéniques vigiles subissent l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson (5 ou 10 jours) (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 128 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson pour inactiver un gène - injection d’une solution (quelques secondes) suivie d’un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale. - Après une récupération de 10 jours, une surcharge plus longue (7 jours) en bicarbonate est entreprise. Des mesures urinaires en cages métaboliques pendant 5 jours et prise de poids quotidienne sont réalisées. Un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale est ensuite réalisé à la fin de cette période. -> 168 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson ou par lors d’une injection (quelques secondes) pour activer un gène. - une surcharge en acide ou bicarbonate (7 jours) sera entreprise. Toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale chimique (10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2)

Impact sur les animaux

Le stress est modéré lors des prélèvements sanguins, atténué par l’utilisation d’anesthésiques locaux (collyre) ou lors d’une anesthésie générale. L’inconfort est transitoire après des prélèvements sanguins, avec surveillance post-opératoire pour détecter tout signe de souffrance (prostration, perte de poids importante). La perte de poids lors de l’habituation aux cages métaboliques est temporaire et limitée. De plus, les souris sont isolées de leurs congénères dans ces cages et placées sur une grille permettant la collecte quotidienne d’urine. La molécule permettant l’inactivation du gène ou la stimulation d’un autre gène est mélangée à une eau légèrement sucrée pour que les souris la boivent sans difficulté. La pesée des souris pour le suivi de leur poids ou avant une anesthésie n’induira qu’un stress minime. Une anesthésie générale est réalisée par du personnel expérimenté, la douleur générée est modérée au point d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de chaque procédure. Un prélèvement des tissus rénaux pour plusieurs types d’analyses est effectué pour l’ensemble des animaux de chaque procédure. Aucune réutilisation, adoption ou remplacement n’est possible, car les prélèvements nécessitent la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus (rein) et sanguins sont nécessaires pour analyser l’impact des traitements sur l’équilibre acido-basique et l’implication de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la complexité des interactions cellulaires dans le rein, ni la réponse systémique à une surcharge alcaline et à la perturbation de l’état acido-basique.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 500. Ce nombre maximal a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives entre les groupes expérimentaux. Cet effectif permet également de comparer les effets chez les mâles et les femelles. Néanmoins, il est certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions biologiques sur ces mêmes modèles et en réalisant une étude statistique de nos résultats.

Raffinement

Les 500 souris seront pesées au moment de leur arrivée à l’animalerie. Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Pour minimiser leur stress, les souris sont progressivement adaptées aux cages métaboliques pour limiter la perte de poids (pesée quotidienne). Un enrichissement de l’environnement dans ces cages limite l’inconfort des souris. Une anesthésie chimique locale est réalisée pour certains prélèvements sanguins. D’autres prélèvements sont réalisés sous anesthésie chimique générale. Une analgésie adaptée sera systématiquement mise en œuvre pour les procédures susceptibles d’entraîner de la douleur ou de l’inconfort. Des collectes d’urine non invasives seront réalisées chez un maximum de 268 souris afin de limiter le recours aux cages métaboliques, qui peuvent être source de stress pour les animaux. Selon la nature des prélèvements sanguins réalisés, une anesthésie locale ou une anesthésie générale sera utilisée. Lorsque certains traitements sont administrés dans l’eau de boisson, un agent sucrant pourra être ajouté afin d’améliorer l’acceptabilité de l’eau traitée et de maintenir une consommation normale. Lorsque les objectifs scientifiques le permettent, la perfusion des tissus sera réalisée après la mort de l’animal plutôt que sous anesthésie terminale avant le décès, afin de réduire les interventions pratiquées sur l’animal vivant.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier le fonctionnement du rein. Cette espèce possède un fonctionnement du rein proche de celui de l'Homme et permet d'étudier cette fonction par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris et permettant l’inactivation d’un gène. Cette inactivation sera déclenchée à deux âges différents car l’efficacité de cette méthode peut varier selon le stade de développement de la souris. Tester deux périodes permettra de déterminer les conditions les plus adaptées pour obtenir une inactivation efficace du gène dans les cellules rénales étudiées. Nous explorerons la fonction rénale chez des souris âgées minimum de 11-12 semaines pour lesquelles le rein est complètement développé.

Privés de circulation sanguine dans les deux reins pendant 25 à 40 minutes, ou intoxiqués par une molécule toxique pour le rein, 225 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent une nuit seuls en cage métabolique sans litière, sur une grille, subissent des recueils d'urine par frottement de la vessie et des anesthésies répétées pour poser puis retirer un capteur de fluorescence fixé sur le dos. Le porteur décrit une prostration, une perte de poids et des œdèmes, et cherche à savoir si l'analyse de l'ADN circulant pourrait remplacer la biopsie rénale chez les patients. Tous sont tués pour prélever reins, cœur, foie et cerveau, le rat ayant été préféré à la souris parce qu'il fournit un volume de plasma et d'urine plus important.

Objectifs

L'insuffisance rénale aiguë (IRA) correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant dans 10 pour cent des hospitalisations et chez 50 pour cent des patients en réanimation. Un épisode d'IRA est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique (MRC), qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Lors d'une IRA, différentes structures rénales sont agressées. Les symptômes étant similaires, l'identification de la structure lésée sur le seul tableau clinique est impossible. Connaître l'origine de l'IRA est pourtant nécessaire car cela permet d'orienter le traitement. L'identification de la structure agressée repose aujourd'hui sur l'analyse d'une biopsie rénale, réalisée sous anesthésie locale. C'est un acte invasif qui présente certains risques, comme une hémorragie rénale. De plus, cette biopsie ne peut être répétée pendant des jours consécutifs. Mettre au point une méthode diagnostique permettant d'identifier les cellules lésées et de suivre l'évolution de l'IRA représenterait une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Lors d'une IRA, les cellules agressées vont mourir et libérer leur ADN dans la circulation et/ou l'urine. Cependant, d'autres cellules non-rénales (comme les cellules inflammatoires) libèrent de façon normale et constante leur ADN dans la circulation. Il faut donc trouver un moyen d'identifier spécifiquement l'ADN des cellules rénales. Un de ces moyens est la caractérisation de la méthylation, qui correspond à l'addition d'un groupement méthyl sur l'ADN de façon spécifique à chaque type cellulaire. Ainsi, par exemple, l'ADN d’un type de cellules rénales ne sera pas méthylé de la même façon que celui des cellules inflammatoires ou d’autres cellules rénales. Caractériser la méthylation de l'ADN présent dans le sang et/ou l'urine pourrait donc permettre d'identifier le type de cellules agressées lors d'une IRA à partir d'une simple prise de sang ou de collection d'urine. Afin de vérifier cette hypothèse, nous allons étudier trois modèles d'IRA expérimentaux chez le rat qui ciblent des structures rénales différentes. Nous analyserons la méthylation de l'ADN sanguin et urinaire à différents stades de la maladie et comparerons les résultats avec l'analyse classique de biopsie de rein.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et médical. Les maladies rénales sont un problème de santé publique. Une personne sur dix est en effet atteinte par une maladie rénale chronique. Une partie importante de ces malades va évoluer vers l'insuffisance rénale terminale, qui est associée à un taux de mortalité élevé. Les seuls traitements de cette insuffisance rénale terminale sont la transplantation et la dialyse, dont le coût est extrêmement élevé (4 milliards par an). Ils représentent le premier budget de la sécurité sociale en France. L'insuffisance rénale aigue est un facteur de risque de maladie rénale chronique. Il est donc absolument essentiel d'améliorer le dépistage et le suivi des patients atteints de cette maladie afin d'optimiser leur prise en charge et réduire le risque d'évolution vers la maladie rénale chronique.

Procédures

(1) Induction des modèles d’insuffisance rénale : Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 à 40 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40-55 minutes. Une autre cohorte d’animaux sera répartie en deux groupes distincts, chacun recevant, sous anesthésie, l’administration d’une molécule toxique pour les reins. L’induction de ces deux autres modèles ne dure que 5 minutes. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine par miction spontanée puis, si besoin, avec un léger frottement sur la vessie (3-10 minutes). Une autre partie sera placée en cage métabolique une nuit pour recueillir un volume plus important d'urine. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux, sous anesthésie générale au moment de l’euthanasie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Mesure de la fonction rénale : une partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (4) Tous les animaux sont euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes peuvent être générées. (1) Stress lié aux manipulations régulières pour les injections et les pesées (stress lors de la contention). (2) Stress lié à passage d’une nuit en cage métabolique : animal en hébergement individuel dans un cage sans litière, sur une grille. (3) Les injections : les douleurs induites sont de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins, soit une prise de poids en raison d’œdèmes, soit une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une mise en place d’une analgésie péri opératoire (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet. La possibilité d'améliorer le diagnostic et le suivi de l'insuffisance rénale aigue représentera un bénéfice important pour la santé humaine.

Devenir

Tous les animaux (225) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Nous devons en effet prélever des organes (rein, cœur, foie, cerveau) pour des analyses. Ce prélèvement sera réalisé après constatation de l’absence de battements cardio-respiratoires.

Remplacement

L'objectif du projet est d'évaluer si l'analyse de la méthylation de l'ADN libre circulant est aussi informative que la biopsie rénale et de déterminer dans quel fluide (urine ou sang) cette analyse doit être effectuée. Il est donc impossible d'effectuer cette étude dans un modèle non animal.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du paramètre principal étudié (altération de la fonction rénale) dans nos modèles d'insuffisance rénale. Pour les procédures de mise au point, des lots de 5 groupes sont nécessaires. Pour les procédures dédiées à l'analyse de l'ADN circulant, des lots de 10 animaux de maladie rénale et 5 animaux contrôles sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d’un module statistique de calcul de puissance. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour l'analyse des résultats. Le nombre total d'animaux est de 225 rats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance. Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée excepté pour une courte période d’hébergement individuel en cage métabolique. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée quotidienne pendant toute la durée des protocoles. Le bien-être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'hébergement individuel limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les rats restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. (2) Raffinement injections. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté avec des aiguilles adaptées. De plus, certaines injections sont réalisées sous anesthésie générale, sur un plateau thermostaté à 37 degrés. (3) Raffinement Chirurgie. Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les rats seront placés dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. De la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. (4) Raffinement anesthésie. Pour limiter les complications liées à l’anesthésie les rats sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement cage métabolique : le temps passé dans ces cages est réduit au maximum (14 heures environ, en fin de journée). Les animaux ont un accès libre à l'eau et la nourriture. (6) Des points limites associés aux injections, à la chirurgie et aux différents modèles d’insuffisance rénale du projet ont été définis.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles pertinents de maladie rénale. Nous avons choisi d'utiliser le rat plutôt que la souris car un volume important de plasma et d'urine est nécessaire pour obtenir une quantité suffisance d'ADN libre circulant pour l'analyse de la méthylation. Pour toutes les procédures, les rats sont âgés de 9 à 10 semaines car à cet âge, ils ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.

Objectifs

Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.

Remplacement

Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.

Raffinement

Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.

Ascite et œdèmes attendus après l'injection du sérum néphrotoxique, au point que les animaux prennent du poids au lieu d'en perdre. 1 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les organes. Une chimiothérapie ou un sérum néphrotoxique leur est injecté sous anesthésie pour provoquer deux formes de maladie rénale, des minipompes osmotiques sont implantées chirurgicalement, et quatre prélèvements d'urine sont pratiqués au fil du protocole. Le porteur cherche à savoir si deux protéines protègent le rein et espère à terme un essai clinique chez des patients que les traitements actuels n'aident pas. Il retient la souris pour la simplicité de son hébergement, la maîtrise du modèle par son équipe et l'abondance de données déjà produites sur cette espèce, et note que les protocoles sont assez courts pour qu'aucune insuffisance rénale terminale ne devrait apparaître.

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) représente un enjeu majeur de la santé publique, affectant environ dix pourcents de la population mondiale. Parmi les MRC, les glomérulonéphrites (GN) constituent une cause importante d’insuffisance rénale terminale, pour lesquelles aucun traitement curatif n’est disponible à ce jour. Les traitements actuels présentent de nombreux effets secondaires ce qui complique la prise en charge de ces maladies. Des données récentes suggèrent le rôle protecteur de deux protéines dans le rein. Ainsi, notre étude vise à explorer le potentiel thérapeutique de ces protéines dans les maladies rénales. Deux modèles de maladies rénales seront utilisés qui présentent des lésions similaires à celles retrouvées chez les patients. L’utilisation de ces deux modèles permettra de : 1. Caractériser le rôle de ces deux protéines dans des maladies rénales. 2. Etudier les limites et effets secondaires des traitements actuels de ces protéines. 3. Etudier l’effet d’un traitement actuel pour la GN sur l’expression des protéines. 4. Tester l’activation pharmacologique d'une des protéines. Ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour le traitement des GN

Bénéfices attendus

La maladie rénale chronique (MRC) est un problème majeur de santé publique socio-économique affectant 10 pourcents de la population mondiale. Elle est la cause d’insuffisance rénale (IR) terminale nécessitant dialyse et transplantation, en raison d’absence de traitement curatif. L’IR est associée à une mortalité très élevée, même avant le stade de l’IR terminale. Les traitements utilisés ont des effets secondaires néfastes importants pour les patients. Le développement de nouvelles thérapies est primordial, c’est pour cela que ce projet a l'ambition de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Des études antérieures réalisées par notre groupe et d’autres équipes de recherches ont pu démontrer le potentiel protecteur de deux protéines dans le rein mais leur rôle dans les MRC et particulièrement dans les glomérulonéphrites n’a pas été étudié. Nous souhaitons ici étudier le rôle de ces deux protéines dans la MRC, identifier leur rôle et à quel moment ces protéines sont induites et exprimées afin de pouvoir établir le moment propice pour les cibler en thérapeutique. Ce projet, pourraient déboucher sur un essai clinique chez l’homme, en particulier chez des patients pour lesquels les traitements actuels n’ont aucun bénéfice, voire ont des effets secondaires néfastes.

Procédures

(1) Une partie des animaux recevra une injection de sérum physiologique ou d’une chimiothérapie pour induire un modèle de maladie rénale qui entraine une atteinte des podocytes. Environ 5 minutes par souris sous anesthésie générale. (2) D’autres animaux recevront une injection de sérum physiologique ou d’un sérum induisant une maladie rénale qui touche les glomérules. Environ 5 minutes par souris sous anesthésie générale. (3) Les traitement thérapeutiques seront administrés chirurgicalement avec implantation de minipompes osmotiques. Environ 5 minutes par souris sous anesthésie générale et analgésie. (4) L'ensemble des souris auront à subir un prélèvement d'urines quatre fois tout au long du protocole. Environ 1 minute par souris, sur animal vigile. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie, 1 minute environ par souris ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1. Douleur locale suite aux injections. Les injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention. 2. Stress en raison de manipulations des souris, les pesées et le recueil des urines qui se feront chaque 3 ou 5 jours. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum néphrotoxique, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des œdèmes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement courts, nous ne devrions pas observer de complications associées à l'insuffisance rénale terminale (perte de poids, baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésique par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique, de créatinine et d'urée.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans les deux modèles. Un effectif de 10 à 15 animaux par groupe a été déterminé sur la base d’un calcul de puissance statistique réalisé à priori, permettant de détecter les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 1140 souris

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses. Des mesures de soins seront prises pour limiter l’inconfort des animaux suite aux injections en intraveineuse (nécessaire pour l’induction du modèle).

Choix des espèces

-Pertinence du modèle souris en tant que mammifère grâces aux conditions simples à mettre en place pour son hébergement, tout en respectant les principes éthiques liés à l’expérimentation animale. -Modèle bien maitrisé dans cette espèce par le personnel du laboratoire -Nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique, et ont été obtenues grâces à cette espèce. -Lignée de souris génétiquement modifiées déjà générée et sans phénotype dommageable. Les procédures seront réalisées sur des souris livrées à l’âge de 8 semaines. Après une semaine d’acclimatation, les animaux seront soumis aux procédures à l’âge de 9 semaines (correspondant à un stade adulte jeune où la fonction rénale est mature sans présenter des lésions de vieillissement). Les souris génétiquement modifiées produites au laboratoire seront utilisées au même âge.