Système urogénital

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs reins et d'autres organes, 456 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue diabétique par injection de streptozotocine, placée en cage à métabolisme sur grille pendant plusieurs jours, puis opérée sous anesthésie sans réveil. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel sur grille génère des nuisances et que la chirurgie comporte un risque d'arrêt cardio-respiratoire. L'objectif est de décrire la composition en lipides de segments du rein et le rôle d'une enzyme dans la néphropathie diabétique.

Objectifs

Les lipides constituent une classe hétérogène de molécules tant du point de vue structurel que de leurs fonctions biologiques. Chaque catégorie de lipide présente des propriétés chimiques distinctes qui déterminent leurs rôles biologiques variés. Ils sont les composants des membranes cellulaires, servent de stockage d’énergie et peuvent aussi être des hormones. L’analyse de l'ensemble des lipides, d’un organe, d’une cellule ou même d’un organite a conduit à la définition de signatures lipidiques qui peuvent être spécifiques des fonctions ou de l’état de l’objet considéré. Ainsi, les segments du tubule rénal, ayant des fonctions différentes, présentent des signatures différentes. De surcroit, cette signature est modifiée par l’obésité, ce qui tend à prouver que cette caractéristique est modifiable et présente une capacité à changer qui pourrait expliquer en partie les pertes de fonction rénale et l’apparition d’hypertension artérielle souvent associé à ce contexte. Un des segments testés a pour caractéristique d’être enrichie en lipides particuliers, Ce qui pourrait influencer le fonctionnement des transporteurs ioniques présents dans ce segment dont le rôle dans le maintien des fonctions du rein est essentiel. Ainsi, cette surabondance de lipides pourrait impacter directement la réabsorption de sel Nos données préliminaires indiquent que la présence d’une enzyme pourrait expliquer l’accumulation de ces lipides. Ce projet vise donc à décrire l’ensemble des lipides des segments rénaux dans différentes conditions et d'étudier le rôle de cette enzyme dans la fonction du rein.

Bénéfices attendus

Cette étude contribuera à une meilleure compréhension du rôle des lipides dans la fonction rénale, et permettra d’identifier le rôle d’une enzyme du métabolisme lipidique dans la physiologie au quotidien et la néphropathie diabétique, maladie extrêmement répandue (qui touche un tier des diabétiques) et qui est la première cause d’insuffisance rénale terminale dans les pays occidentaux.

Procédures

Certains animaux seront soumis à des traitement pharmacologiques (via la nourriture ou l’eau de boisson) et à des changements de régime alimentaires pour une durée de 15 jours. Certains seront rendus diabétiques par injection unique d’une substance pharmacologique en intrapéitonéal. Pour vérifier l’installation du diabète, une prise de sang aura lieu sur animaux vigile sous contention (deux minutes par animal). Suite à ces traitements, les animaux sont répartis en lot pour les expériences subséquentes. Une partie des animaux traités ou non subira une chirurgie terminale (moins de 10 minutes) sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Ils seront euthanasiés sous anesthésie et analgésie à la fin de la procédure. Pour une autre partie des animaux traités ou non, trois périodes de recueils urinaires sur animal vigile sera effectué, nécessitant de les placer, pour la première période 4 jours en cage à métabolisme (2 jours d’habituation et 2 jours pour le recueil), puis ils retourneront en cages à métabolisme pour une journée, 7 jours après traitement pour la deuxième période et 14 jours après traitement pour la troisième période. Ces mêmes animaux seront utilisés pour évaluer la filtration glomérulaire à la fin de la troisième période de recueil, ce qui nécessite l’injection d’un produit fluorescent sous anesthésie et la pause d’un enregistreur de fluorescence transdermal sur le flanc de l’animal (10 minutes/animal). Suite à leur réveil et après 2h d’enregistrement, l’enregistreur est retiré et l’animal retrouve sa cage de stabulation originelle avec ses congénères avant d’être anesthésiés et euthanasiés. Pour un lot d’animaux rendus diabétiques, la mesure de filtration glomérulaire telle que décrite ci-dessus se fera sans que les animaux ne soient passé en cages à métabolisme préalablement. Un autre lot d’animaux traités ou non subira 2 prélèvements sanguins à 7 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal). Suite au deuxième prélèvement, alors que les animaux sont anesthésiés, ils seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions prévues sont connus car déjà testés chez la souris dans d’autres contextes que celui de la présente demande. Ainsi, une partie des animaux subiront des modifications de diète qui pourront entrainer une baisse de la consommation alimentaire et d’eau de courte durée lors du changement de régime (néophobie de la souris). Certains animaux pourront ressentir une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille sous la peau lors des injections de composés pharmacologiques (streptozotocine, anesthésique) et lors de la mesure de la glycémie par incision superficiel de la peau. Certains traitements (streptozotocine, régime fort en sel) vont également engendrer des désagréments tels qu’une augmentation de la diurèse et de la consommation d’eau. Pour le prélèvement de leurs reins, certains animaux seront également sujet à une chirurgie sans réveil sous anesthésie et antalgie susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire (risque d’arrêt cardio-respiratoire). En fonction des groupes expérimentaux, une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (risque d’arrêt cardio-respiratoire) pouvant entrainer une hémorragie (stress hémodynamique). En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont isolés et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie pouvant entrainer une hémorragie. La mesure de la filtration glomérulaire nécessite d’équiper les animaux avec un enregistreur fixé sur le flanc pendant 2h pouvant entrainer un léger inconfort.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin, par exemple, de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Une partie du projet scientifique global consiste d’ailleurs à utiliser des cellules en culture. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences de différences ou de traitements systémiques (mâles/femelles, traitements pharmacologiques, diète) sur la composition lipidique et la fonctionnalité d’un segment du tubule rénal. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans et nécessitera l’utilisation de 456 souris. Nous avons calculé, en nous appuyant sur notre expérience des méthodes envisagées, la connaissance de leur reproductibilité et des calculs de puissance le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement robustes. Des tests statistiques seront effectués pour garantir des interprétations fiables et non biaisées de nos résultats Nous réduirons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et et/ou qui pourraient impacter négativement certains résultats, les rendant inexploitables. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse 1/ si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles 2/ si nous constatons que l’inhibition de notre protéine candidate n’a pas d’effet sur la composition lipidique, ceci annulera l’intérêt d’une grande partie du projet et 3/ si nous constatons que l’induction d’une néphropathie diabétique n’a pas d’effet sur la composition lipidique des tubules rénaux, ce qui annulera également l’intérêt d’une partie du projet.

Raffinement

Les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. Leur environnement sera enrichi avec au moins deux objets : du nid végétal et/ou des cylindres en carton et/ou des bouts de bois et/ou des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier sans être en contact avec la grille. Nous avons vérifié que la majorité des souris s’installent dans les coupelles pour dormir mais que cela ne change en rien les recueils d’urine et de féces. Ces cages sont situées sur des racks qui permettent aux souris de maintenir un lien olfactif, visuel et sonore entre elles. La détermination régulière du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation s’ils sont dépassés. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagée Le poids corporel avant tout traitement servira de référence et cette mesure sera répétée quotidiennement jusqu’à 3 jours post-traitement puis8 et 15 jours post-traitement. Une diminution égale ou supérieure à 20 pourcents du poids de référence sera considérée comme la limite provoquant l’interruption de la procédure. Par ailleurs, l’aspect général des animaux (vivacité, capacité à se mouvoir, propreté du pelage etc…) sera observé au moment de la mesure de poids corporelle et toutes anomalies sera prise en compte pour sortir l’animal considéré de la procédure ou lui fournir le soin adéquat. Les actes invasifs sont effectués par un personnel qualifié et formé à l’expérimentation animal et à la chirurgie avec utilisation d’antalgique.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris et pourrais nous être utiles pour la suite de ce projet. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associées ou comparées à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles commerciales standards âgées de 8 à 15 semaines afin d’évaluer les facteurs qui contribuent aux modifications du contenu en acide gras du rein et le rôle d'une protéine particulière dans ce processus. Les animaux seront donc matures sexuellement.

Lavages vaginaux d'abord quotidiens, puis chirurgie de retrait des ovaires et greffe de tissu ovarien de truie dans un muscle: 65 souris immunodéprimées vont être utilisées, classées en souffrance modérée. Le prélèvement de sang et de tissus en fin de protocole rend leur réveil impossible, elles seront donc toutes tuées. Le projet évalue si du tissu ovarien de jeune truie reprend sa croissance après congélation. La finalité tient à la filière porcine, avec la conservation de races d'élevage à forte valeur commerciale.

Objectifs

Notre équipe de recherche a été sollicitée dans le cadre de ce projet afin d’intervenir chez les races porcines à petit effectif pour lesquelles des chirurgies consistant à retirer les ovaires sont réalisées en pratique courante en élevage et permettent l’accès à du tissu ovarien au titre de déchets biologiques. Dans ce contexte, cette étude de transplantation de tissu ovariens de truie sur souris a pour objectif d’évaluer la reprise de croissance de la greffe de truie après cryoconservation (procédé de conservation à très basse température). En effet, un retour de la fonctionnalité permettrait d’étudier la croissance d’un tel tissu et de valider leur bonne qualité après cryoconservation.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu d’études ont été réalisées sur le tissu ovarien de truies prépubères. Par conséquent, à court terme, notre étude pourrait permettre d’acquérir davantage de données sur la croissance des cellules du tissu prépubère et surtout d’apporter des éléments de compréhension nouveaux sur l’effet de la cryoconservation sur la fonctionnalité de ce type de tissu. Par ailleurs, l’âge des donneuses (~2mois) utilisées dans notre étude permettra d’apprécier l’éventuelle mise en place de mécanismes de blocage/activation de la croissance de tissu ovarien certe prépubère mais très précoce. A plus long terme, des bénéfices pour la filière porcine pourraient découler de ce projet dans la mesure où la qualité de ce tissu cryoconservés serait validée par une reprise de croissance post greffe. En effet, la filière porcine pourrait de ce fait bénéficier d’un outil supplémentaire de conservation patrimoniale de races à fortes valeure ajoutée. En association avec d’autres biotechnologies de la reproduction comme la maturation in vitro et la fécondation in vitro cette méthode permettrait d’envisager l’obtention d’animaux vivants et serait utile à la filière aussi bien dans un objectif patrimonial que de sauvegarde dans un contexte sanitaire de plus en plus complexe (Peste porcine africaine PPA, Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc SDRP…).

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à des lavages vaginaux d’abord quotidiennement puis toutes les 2 semaines à partir de l’apparition des premieres cellules prouvant la bonne reprise de la greffe, la contention nécessaire à ce geste est estimé à quelques minutes par animal. Tous les animaux seront anesthésiés (gazeuse) pour la réalisation de la procédure chirurgicale. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de la réalisation des différents actes, soit au maximum 1h environ. Toutes les souris recevront une injection de 500µL de sérum physiologique sous la peau durant la chirurgie et 12h post chirurgie. Enfin des administrations d’analgésiques seront également réalisées avant la chirurgie et durant les 3 jours suivants (animale vigile), ces dernières seront faîtes 2 fois par jour sous la peau. La durée de ces gestes est estimée à quelques secondes (moins d'une minute par animal).

Impact sur les animaux

Tout au long de l’étude, les animaux seront manipulés et subiront une contention ainsi qu’un lavage vaginal à l’aide d’une irrigation vaginale au sérum physiologique. Cet acte sans douleur générera du stress. Les animaux seront soumis à des actes chirurgicaux (retrait des ovaires et greffe dans le muscle) pouvant engendrer de l'inconfort, une douleur modérée et du stress, durant quelques jours après la chirurgie (estimé à 3 jours) qui sera réduite au maximum par le suivi post-opératoire et les traitements analgésiques. Des complications avant et après la chirurgie ainsi que des signes de rejet de greffe peuvent aussi être observés chez les animaux. Ces souris possédant pas d'immunité, une attention particulière sera portée sur l'apparition de signe d'infection chez les animaux. Les contentions et injections pour les traitement provoqueront un stress et une douleur transitoire chez les animaux.

Devenir

Le volume de sang prélevé pour analyses en fin de protocole ainsi que les prélèvements tissulaires réalisés rendent impossible le réveil de l’animal à la fin de l’anesthésie.

Remplacement

A l’heure actuelle, la greffe reste le meilleur moyen d’évaluer les capacités fonctionnelles de ce tissu ovarien dans la mesure où les méthodes alternatives in vitro (culture de cellules) ne sont pas complètement maitrisées chez la truie et tiennent peu compte de l'environnement tissulaire. Dans un objectif d’étude de la fonctionnalité du tissu, le recours à des cellules isolées ne rélète que partiellement la fonction ovarienne et l’absence de l’environnement cellulaire classique ne permet pas d'assurer le développement cellulaire normalement observable dans un organisme vivant.

Réduction

Les résultats obtenus lors des premiers essais de greffe nous ont permis d’obtenir des données préliminaire et d’effectuer des calculs statistiques du nombre minimal d’individus nécessaires pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d'enrichissement adaptés à l’espèce. Les portoirs et cages sont placés de façon à ce que les animaux ne soient pas trop exposés à la lumière avec la présence d’un environnement sonore (radio) afin de réduire le stress des animaux durant le déroulé du projet. Les animaux recevront une récompense alimentaire après les manipulations stressantes (notamment les rinçages vaginaux) de façon à induire un renforcement positif. Les animaux seront hébergés par cages de 5 souris, et opérés en respectant cette répartition afin de gérer les phases de réveils des animaux au mieux. Durant la période post-opératoire (3 jours) une surveillance accrue des animaux sera effectuée avec l’utilisation de grilles de quantification de la douleur. Les animaux seront suivis de façon biquotidienne pour l’observation de l’état général, de l’état des cicatrices et du comportement des animaux. Une injection d’analgésique avant l'opération ainsi que 2 fois/jour durant les 3 jours suivants sera effectuée. Après cette période les animaux seront observés quotidiennement dans leur cage et un examen clinique avec pesée sera réalisé 1 fois par semaine. Un vétérinaire pourra, le cas échant, réaliser un examen clinique approfondi sur les animaux. Des points limites suffisament prédictifs ont été définis.

Choix des espèces

Le recours au modèle rongeur (souris) comme receveur permet l’utilisation d’animaux naturellement immunodéprimés, ayant un cycle de vie ainsi qu’un cycle reproducteur courts et une taille réduite. De plus, ce modèle a déjà été validé comme supportant la greffe de tissu ovarien provenant de nombreuses espèces. Les souris adultes seront reçues à 8 semaines de façon à être matures sexuellement et d’un gabarit suffisant pour les étapes de chirurgie.

Équipées par deux chirurgies sous anesthésie générale d'implants de télémétrie mesurant les contractions de l'utérus, 8 brebis vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'issue, elles ne sont pas tuées mais remises en élevage, où elles pourront servir à d'autres protocoles. L'objectif déclaré est de valider la brebis comme modèle pour tester des contraceptifs humains, et accessoirement d'améliorer l'insémination des brebis laitières. Le porteur présente ce travail comme une étape vers un modèle artificiel remplaçant l'animal, tout en équipant des brebis par chirurgie pour y parvenir.

Objectifs

Le développement de méthodes de contraception non hormonale chez la femme pour s’affranchir des risques associés aux traitements hormonaux est un sujet central de la recherche reproductive actuelle. L’évaluation de potentiels contraceptifs s’appuie sur des tests pré-cliniques sur modèles animaux de laboratoire de type rongeur. Toutefois le modèle rongeur ne permet pas de réaliser toutes les analyses nécessaires. Des modèles animaux de plus grande taille, comme la brebis, permettent par exemple de quantifier la distribution des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle par une méthode d’imagerie endoscopique. Un contraceptif de type gel vaginal, qui bloque le passage des spermatozoïdes au niveau du col de l’utérus, a été validé chez la brebis par cette méthode d’imagerie en 2023. Les grands animaux peuvent également être équipés d’implants de télémétrie permettant des mesures d’activité physiologique en continu et sans intervention humaine. Afin de valider le modèle brebis comme modèle animal de test de contraceptif, nous devons caractériser un élément important de la reproduction : la physiologie de l’utérus et plus précisément les contractions utérines. En effet, si les spermatozoïdes se déplacent dans le tractus génital par leur mobilité propre, ce sont les contractions utérines qui sont en grande partie responsables de leur remontée vers l’ovaire. Il existe désormais des implants sous cutanés télémétriques qui permettent de mesurer une activité myoélectrique d’un tissu. Des études récentes ont initié la caractérisation par télémétrie de l’activité utérine chez la brebis et la truie. Dans notre projet, nous souhaitons équiper des brebis avec des implants de télémétrie pour quantifier les contractions utérines (fréquence et intensité des contractions) dans diverses conditions physiologiques (stade du cycle) et comparer les résultats aux données existant chez l’humain. Une fois équipées, ces brebis pourront ensuite permettre le test de contraceptifs potentiels à visée utérine. LA MODIFICATION DEMANDEE VISE A PROFITER DE LA CHIRURGIE DE RETRAIT DES IMPLANTS POUR MESURER IN VIVO SOUS ANESTHESIE GENERALE LE DEPLACEMENT DE SPERMATOZOIDES MARQUES DANS LE TRACTUS ET ENREGISTRER EN SIMULTANE LES CONTRACTIONS UTERINES PAR LES IMPLANTS.

Bénéfices attendus

1. Biologie fondamentale : Données non biaisées : la télémétrie va permettre d’obtenir des données non biaisées de caractérisation de l’activité utérine chez la brebis car il est attendu que l’interaction de l’animal avec l’humain peut perturber l’activité utérine. Relation statut hormonal / activité utérine : Les mesures d’activité seront réalisées au cours du cycle oestral et permettront de relier le statut hormonal (oestrogènes / progestérone) et l’activité utérine. Nous pourrons également mesurer pour la première fois l’activité de chaque corne utérine en simultané et étudier d’éventuels mécanismes de synchronisation / désynchronisation des cornes utérines. Modèle alternatif à l’éxpérimentation animale : A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificiel (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel. 2. Biologie appliquée : Etude pré-clinique de contraceptifs humains non hormonaux : Dans le cadre d’un large projet de recherche international, des contraceptifs non hormonaux sont recherchés. Le contrôle des contractions utérines par un dispositif non hormonal comme moyen de contraception est une méthode envisagée et pourra s’appuyer sur notre modèle. Amélioration de la fertilité après insémination : La production de fromages de brebis s’appuie presque essentiellement sur l’utilisation de l’insémination animale après synchronisation de l’oestrus. Cette insémination nécessite la manipulation des brebis qui peut altérer l’activité utérine et limiter l’efficacité de l’insémination. Une étude de 2002 a déjà montré que la contention, même limitée, perturbe les contractions utérines et donc potentiellement le transport des spermatozoïdes, facteur clé de la réussite de fécondation. Ce projet pourrait permettre d’améliorer les pratiques d’élevage et l’efficacité de l’insémination.

Procédures

Chaque brebis subira DEUX interventionS chirurgicaleS sous anesthésie générale d’une durée d’une heure, DEUX injectionS par voie intraveineuse pour l’induction de l’anesthésie (30 secondes avec contention), et 6 injections par voie intramusculaire pour les traitements post-opératoires (2 injections par jour pendant 3 jours, 1 minute à chaque fois avec contention). Les animaux vivront quelques moments de stress de 5 à 10 minutes lors des déplacements, manipulations et contentions.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une chirurgie qui peut entrainer des douleurs post opératoires. La mise en place des implants va perturber de manière transitoire l’activité utérine. Les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour l’induction de l’anesthésie, puis l’administration des traitements post-opératoires et des synchronisations de l'oestrus. Ces injections par voie intra veineuse et intra musculaire peuvent induire une douleur ainsi qu’un hématome.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont replacés en élevage et pourront être utilisés pour d’autres protocoles expérimentaux ou des phases d'élevage.

Remplacement

La mesure de l’activité utérine de la brebis nécessite la réalisation de mesures chez l’animal vivant. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale. A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificielle (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel.

Réduction

Le projet vise à obtenir des informations provenant de deux types d’implants donc deux lots d’animaux sont nécessaires. Le nombre de 4 animaux par lot a été calculé pour avoir un nombre minimal de 3 animaux par lot en tenant compte d’un éventuel défaut expérimental (chirurgie ou équipement de télémétrie) pour 1 animal sur 4. Les animaux seront analysés pendant plusieurs mois, ce qui permettra d’obtenir des réplicats biologiques sur chaque animal. Les tests statistiques réalisés seront des tests non paramétriques en données répétées car chaque animal sera son propre témoin. Par exemple, au cours du cycle oestral, les paramètres de contraction utérine seront comparés, pour plusieurs cycles successifs, entre le moment de l’oestrus et la phase lutéale au sein de chaque cycle oestral de chaque animal.

Raffinement

Les brebis sont logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée, en groupe social stable. Les brebis proviennent d’un EU fournisseur très proche de notre plateforme ce qui limitera le stress du déplacement. Pour un transit digestif optimal, du foin de qualité sera distribué matin et soir. La douleur est traitée préventivement avant l'acte chirurgical dès induction de l'anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu'à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l'état normal est estimé à 3 à 4 jours post-opératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. De plus, les implants utérins permettront de mesurer en continu la température interne et l’activité locomotrice. Une éventuelle augmentation de la température, signe d’une infection, pourra être détectée et conduire à un traitement antibiotique adapté. L’activité locomotrice sera mesurée comme paramètre de bien être animal. Deux caméras vidéo, présentes dans le logement et couplées aux implants par télémétrie, permettront de suivre les animaux en temps réel dans leur logement et de détecter tout signe de douleur ou mal être. La douleur est également prévenue par l’administration de sérum physiologique stérile et tiédi dans la cavité abdominale : ce geste prévient la formation des adhérences qui peuvent être très douloureuses. Du fait des visites régulières, les animaux seront socialisés et familiarisés à l’humain. Des récompenses après les contentions et manipulations renforceront cette socialisation. Un animal anorexique, prostré, en décubitus latéral prolongé recevra l'administration d'analgésique. Sans réponse physiologique satisfaisante rapide, il sera fait appel au vétérinaire agréé. La décision d’euthanasie par voie médicamenteuse et sous anesthésie sera prise en concertation avec les différents acteurs du projet.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi comme modèle expérimental par ses points communs avec l’anatomie humaine concernant la morphologie du tractus génital femelle et la physiologie utérine. Chez ces deux espèces, les contractions utérines sont sous contrôle nerveux et hormonal (l’oestrogène stimule et la progestérone inhibe les contractions utérines). Les brebis seront des femelles multipares et cycliques pour exprimer une activité utérine d’un adulte capable de reproduction.

Immunisées puis prélevées à répétition, 372 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à douze injections et subit jusqu'à quatre prises de sang et dix-sept prélèvements d'urine sous contention, au risque de douleurs, d'infections et, dans les formes sévères, d'une rétention d'eau. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'une maladie rénale auto-immune et le porteur justifie l'espèce par sa proximité physiologique avec l'humain. L'objectif tient toutefois en une phrase et ne nomme ni le modèle précis ni les substances injectées.

Objectifs

Notre projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes immunologiques responsables de l'apparition d'une maladie rénale auto-immune dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqués dans l'apparition et la progression d'une maladie rénale auto-immune. Ces connaissances fondamentales pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutique plus personnalisées, visant à contrôler plus efficacement l’activité de la maladie et à limiter les rechutes chez l'Homme.

Procédures

1 à 12 injections sur animaux vigiles 30 secondes par injection; 1 à 4 prélèvements sanguins sur animaux vigiles, 30 secondes par prélèvement. 4 à 17 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle, 20 secondes par prélèvement. Lorsqu'il y aura des prélèvements sanguins, ceux-ci seront réalisés le même jour que les prélèvements d'urine. 1 prélèvement sanguin terminal,30 secondes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Lors des manipulations, peuvent être sujettes à stress et angoisse voire des douleurs modérées liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les d’injections, prélèvements d’urine et de sang. Des complications peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation, d’injection ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un léger saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou stress lié à la contention. Une rétention d'eau modérée peut survenir dans les formes sévères de la maladie. Une immunodéficience peut être présente.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique

Remplacement

Le modèle de souirs permet une étude sur l'être vivant et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. La souris est adaptée à notre étude car sa proximité avec l’être humain se traduit par la présence chez cette espèce d’homologies physiologiques très étroites avec notre espèce, notamment en ce qui concerne le système immunitaire et le système rénal auxquels nous nous intéressons.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et robustes. Le nombre d’animaux a également été fixé qu'à partir des données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Les souris immunodéprimées seront séparéées et hébergées dans un milieu protecteur adapté à leur statut immunitaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne (comportement, apparence générale, signes cliniques) par le personnel animalier ainsi que par les personnes en charge de l’expérimentation. Toute apparition de signes de douleur ou de souffrance, tels que la prostration, le dos voûté, l’isolement ou le poil hérissé, entraînera l’ouverture d’une fiche de score comportant des points limites clairement définis, pouvant conduire, le cas échéant, à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée au site d’injection abdominale (recherche de rougeur ou de signes inflammatoires) ainsi qu’au suivi du poids.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, ce modèle murin est déjà publié et développé. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature). C'est également l'age des souris dans les articles publiés.

Nourris avec des croquettes toxiques pour les reins ou injectés avec un antibiotique néphrotoxique, 320 rats développent une insuffisance rénale, puis subissent trois, sept ou quinze jours plus tard une chirurgie vasculaire de pose de cathéters suivie d'une séance de dialyse de deux à quatre heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur y attend des saignements, des hémorragies, un œdème ou une nécrose au point d'injection, une prostration et une perte de poids. Il écrit que ces atteintes ne peuvent pas être complètement évitées parce que l'induction d'une insuffisance rénale est "absolument indispensable" au projet. Aucun rat ne quitte vivant la table d'opération, tous sont tués à la fin de la séance pour prélèvements.

Objectifs

L’insuffisance rénale aiguë est une maladie très fréquente associée à une importante mortalité, particulièrement dans les services de soins intensifs. L’hypothèse d’atteintes rénales induites par la dialyse menée de manière trop systématique a été proposée depuis longtemps. Des arguments récents en faveur de cette hypothèse ont émergé d’analyses statistiques d’essais de recherche clinique comparant différentes stratégies de dialyses au cours de l’insuffisance rénale aiguë en réanimation. Cependant, aucune étude animale ni humaine n’a jamais été réalisée pour étudier précisément cette hypothèse et les mécanismes physiopathologiques en découlant. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle expérimental de dialyse chez le rat qui va permettre une meilleure compréhension du sujet. Nous envisageons d’explorer plusieurs modèles expérimentaux de maladies rénales ciblant différentes cellules rénales, dans le but de renforcer la pertinence physiopathologique du dispositif expérimental. Enfin, nous prévoyons d’optimiser la procédure de dialyse elle-même, notamment en intégrant de nouvelles membranes de dialyse plus performantes et en augmentant la durée, dans le but d’accroître l’efficacité. L’objectif du projet est de poursuivre l’étude des complications de la dialyse et d’améliorer l’efficacité du modèle.

Bénéfices attendus

Environ un tiers des patients admis en unité de soins intensifs développe une insuffisance rénale aiguë, caractérisée par une diminution soudaine et significative de la fonction rénale. Il est désormais bien établi que même un épisode modéré d’insuffisance rénale augmente le risque de mortalité. Par ailleurs, de nombreuses études ont démontré que l’insuffisance rénale aiguë constitue un facteur de risque majeur dans la progression vers une insuffisance rénale chronique, y compris chez les enfants, et ce, dans un délai de quelques semaines à quelques mois. Dans ce contexte, il apparaît essentiel d’améliorer la prise en charge des patients en optimisant les modalités de dialyse, afin de limiter la transition vers la maladie chronique.

Procédures

(1) Induction des modèles d’insuffisance rénale. Une partie des animaux sera nourrie avec des croquettes toxiques pour les reins et une autre recevra un antibiotique toxique pour les reins sous forme de deux injections réalisées à l’état vigile (durée 15 secondes). Une autre partie recevra une molécule toxique pour les reins avec une injection sous anesthésie générale (5 min). (2) Chirurgie réalisée 3, 7 ou 15 jours (selon le modèle d’insuffisance) sous analgésie et anesthésie. Des prélèvements sanguins sont effectués. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant. A la fin de cette étape de deux à quatre heures, les animaux sont euthanasiés par une méthode règlementaire. Ce protocole a une durée de 2,5 à 4,5 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par (1) Stress lié aux manipulations régulières pour les injections et les pesées (stress lors de la contention). (2) Les douleurs induites sont de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une nécrose. (3) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins et au régime riche en adénine. L'induction d'une insuffisance rénale entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. L’injection d'une molécule peut s’accompagner d’une perte de l’appétit et donc d’une dénutrition. (4) Les complications liées à la chirurgie vasculaire (pose des cathéters) pouvant provoquer des saignements, hémorragies et des douleurs malgré une prise en charge de la douleur. (5) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.

Devenir

Tous les animaux (320) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

Il n'est pas possible d’envisager des méthodes de remplacement pour notre projet, l’étude des effets de la dialyse ne pouvant être réalisée in vitro sur des lignées de cellules rénales ou au cours d’une étude clinique chez l’homme du fait des gestes invasifs engendrés Cependant, une étape de mise au point et amélioration du circuit de dialyse sera réalisée sans animal avec une solution physiologique contenant de l’albumine et de l’urée. Ces tests permettront d’évaluer la capacité de filtration et de sélectivité de nos membranes.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (fonction rénale) dans nos modèles d'insuffisance rénale. Des lots de vingt animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique. Nous utiliserons des test statistiques appropriés pour l'analyse des résultats. Le nombre total d'animaux est de 320 rats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance. Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les rats sont placés au nombre de deux par cage. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée régulière pendant toute la durée des protocoles. Le bien- être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. (2) Les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Lors de certaines injections, les rats sont sous anesthésie générale et placées sur un plateau chauffant. Une compression à l’aide d’une compresse sera appliquée afin d’arrêter le saignement. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. (3) Raffinement Chirurgie. Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats mâles âgés de plus de 6 mois pour plusieurs raisons : - ils présentent une physiologie rénale comparable à celle de l’homme. - ils présentent une taille et un poids plus importants que les souris et que les rats Lewis par exemple, permettant une mise en place plus adéquate du modèle d’hémodialyse. - ils présentent un volume sanguin total théoriquement suffisant pour éviter toute transfusion sanguine.