Système urogénital
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Synchronisation de la gamétogenèse pour études en biologie de la reproduction
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Mises à mort une à cinq jours après une stimulation hormonale pour prélever leurs ovules et leurs embryons, ou tuées pour récupérer testicules et spermatozoïdes, 3 420 souris vont être utilisées dans des procédures classées légères. Les femelles adultes reçoivent deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, les souriceaux mâles un traitement oral quotidien pendant sept jours suivi d'une injection. Le porteur revendique la souris comme "modèle de choix", ses régulations épigénétiques étant "bien conservées" avec l'humain. La finalité déclarée, comprendre le déclin de la fertilité humaine, reste générale, quand le prélèvement des gamètes impose la mise à mort de chaque animal.
Objectifs
Nous cherchons à comprendre comment l’épigénétique régule la fertilité. L’épigénétique correspond à de petites marques chimiques naturelles, déposées sur l’ADN ou sur les histones, les protéines autour desquelles l’ADN s’enroule. Ces marques déterminent si un gène est allumé ou éteint. Elles jouent donc un rôle central dans l’identité des cellules et leur bon développement. Les cellules reproductrices ou gamètes —les ovules et spermatozoïdes— possèdent des profils épigénétiques uniques, indispensables pour qu’ils accomplissent correctement leur rôle lors de la fécondation. Dans un contexte de baisse de la fertilité humaine, liée à l’exposition croissante à certains polluants, il devient essentiel de comprendre quand ces marques se forment lors du processus développemental qui conduit à la production de gamètes (gamétogenèse), où elles se placent dans le génome, comment elles sont établies et pourquoi elles influencent la qualité des gamètes ainsi que le développement de l’embryon après fécondation. En conclusion, notre étude a le potentiel de mieux comprendre l’origine des infertilités chez la femme et l’homme, dont l’incidence augmente dans les pays industrialisés.
Bénéfices attendus
La souris, espèce Mammifère, est le modèle de choix pour des expériences relatives au domaine de la biologie de la reproduction, domaine dont relève nos projets de recherche. La gamétogenèse et les régulations épigénétiques qui l’accompagnent sont bien conservées entre la Souris et l’Homme, ce qui nous permet d’appliquer directement les connaissances obtenues par l’étude de cet animal à la reproduction humaine. De plus, nous utilisons une collection de modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent de comprendre comment et pourquoi les marques épigénétiques sont indispensables à la production d’ovules et de spermatozoïdes et pour la fertilité. Cette recherche a un intérêt direct pour appréhender les origines, génétiques et environnementales, du déclin actuel de la fertilité humaine.
Procédures
Dans un premier lot, les souris femelles adultes vigiles sont soumises à deux injections successives d’hormones, avec une durée de 48h entre l’injection de chacune des hormones. Les femelles sont mises à mort entre 1 et 5 jours après la dernière injection d’hormones. Dans un deuxième lot, un traitement est administré oralement aux souriceaux mâles dès leur naissance. Ce produit, mélangé à de la gomme alimentaire, est fourni à l’aide d’une pipette souple une fois par jour pendant 7 jours. Puis, les souriceaux reçoivent un second traitement (injection unique sur animal vigile).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même, et sont de courte durée. Les produits injectés n’ont pas d’effet douloureux en eux-mêmes ou d’autre effet néfaste sur l’animal. Il en est de même pour l’administration orale aux souriceaux. Les nuisances sont principalement dues à la contention de l’animal et sont aussi d’une durée de quelques secondes. Le produit en lui-même n’est pas toxique et n’entraine pas d’effet secondaire.
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les ovules, et les embryons après fécondation. Il est aussi nécessaire de mettre à mort les mâles synchronisés pour récupération des testicules et des spermatozoïdes
Remplacement
Les toutes premières étapes de la gamétogenèse peuvent être modélisées in vitro, reproduisant de manière assez conforme ce qui se passe au tout début du développement embryonnaire (jours 6-10 de gestation chez la souris). Notre laboratoire utilise ce type d’approches, pour étudier le développement très précoce. Cependant, les conditions de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire l’ensemble de la gamétogenèse dans une boîte de culture, jusqu’à la production finale d’ovules et de spermatozoïdes matures, capables de réaliser le processus de fécondation. La gamétogenèse est en effet un processus de différenciation très complexe - qui dépend de signaux présents dans le testicule ou l’ovaire - dont la chimie et la cinétique de production ne sont pas totalement connues et qui ne peut être mimé de manière efficace et reproductible dans une boîte de culture.
Réduction
La finalité même des procédures ici présentées est de réduire le nombre d’animaux utilisés, en augmentant le rendement de production des gamètes, spermatozoïdes chez les mâles et ovules chez les femelles. Nous avons de plus raffiné nos procédures expérimentales pour réduire le nombre de gamètes utilisés par expérience et réduire ainsi le nombre de souris.
Raffinement
Les injections d’hormones et l’administration orale sont des procédures peu douloureuses et ne nécessitent pas d’anesthésie. De plus, les produits administrés ne sont pas toxiques et n’entrainent pas d’effet secondaire délétère. Une grille de score est mise en place afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux et proposer une réponse adaptée.
Choix des espèces
La gamétogenèse et les régulations épigénétiques qui l’accompagnent présentent chez les mammifères des caractéristiques uniques, absentes chez des espèces comme la mouche ou le poisson zèbre. En revanche, ces processus sont fortement conservés entre la souris et l’être humain, ce qui fait de la souris un modèle privilégié pour étudier la biologie de la reproduction. Les connaissances obtenues chez cet animal peuvent ainsi être transposées plus directement à l’Homme. Pour le protocole de superovulation en vue de collecter les ovules matures, nous utilisons des jeunes femelles adultes, âgées de 5 à 8 semaines. C’est à cette période que les femelles sont les plus réceptives à l’injection d’hormones.. Pour le protocole de synchronisation de la spermatogenèse, nous utilisons des mâles jeunes non sevrés (entre 2 jours et 3 semaines post-naissance). Pour obtenir des populations de cellules homogènes, il est nécessaire d’induire la synchronisation dès le premier cycle de spermatogenèse, qui commence à la naissance.
Étude de la Dipeptidyl Peptidase 3 (DPP3) dans l’insuffisance rénale et cardiaque aigue et chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour étudier une enzyme dans les défaillances du rein et du cœur lors d'un choc circulatoire. Chaque animal reçoit des traitements par injection ou voie orale, des prélèvements de sang et des examens d'imagerie sous anesthésie, dont des ponctions rétro-orbitaires. Interrogé sur les effets néfastes attendus, le RNT énumère les cinq libertés du bien-être animal plutôt que de décrire les atteintes concrètes. La mise à mort sert au prélèvement d'organes pour l'analyse des dommages tissulaires.
Objectifs
L’insuffisance circulatoire est une situation grave qui conduit souvent à une admission en réanimation et peut mettre la vie en danger. Elle apparaît généralement après un choc important d’origine cardiaque, hémorragique ou lié à une infection sévère et entraîne un mauvais fonctionnement du cœur, des vaisseaux sanguins et des reins. La protéine étudiée est une enzyme naturellement présente dans l’organisme qui modifie certaines molécules actives. Des travaux ont montré que cette protéine, lorsqu’elle circule en grande quantité, permet non seulement de prédire l’évolution des patients en insuffisance circulatoire, mais joue aussi un rôle direct dans l’aggravation de la défaillance des organes. Dans des modèles expérimentaux, bloquer cette protéine avec un anticorps spécifique protège le cœur. Objectif du projet : Mieux comprendre comment apparaissent les défaillances aiguës des organes, en particulier du rein, lors d’un choc circulatoire, et déterminer si cibler notre protéine d’intérêt pourrait prévenir ou limiter ces dommages.
Bénéfices attendus
Ce projet vise, à court terme, à disséquer les contributions cellulaires et systémique de notre protéine d’intérêt dans le choc circulatoire et les conséquences aigues et chroniques associés à la défaillance d’organes comme le rein et le cœur. A moyen terme, ce projet permettra de valider une biothérapie efficace contre le choc circulatoire. A moyen-long terme, les données récoltées par le projet fourniront des arguments précliniques essentiels à la mise en place d’une biothérapie visant à traiter ou même à prévenir les défaillances rénales et à améliorer la survie des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes procédures, plus ou moins invasives, susceptibles d’entraîner du stress. Des prélèvements de tissu seront réalisés à 3 semaines sur l’ensemble des souris. Des traitements seront administrés à l’ensemble des animaux, par injection ou par voie orale, avec contention si nécessaire. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’ensemble des souris sous anesthésie générale. Des examens d’imagerie ainsi que des évaluations du fonctionnement du cœur et des reins seront réalisés sous anesthésie générale chez les animaux concernés.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ces procédures expérimentales, toutes les mesures nécessaires seront mises en œuvre afin de respecter les cinq libertés fondamentales du bien-être animal. Les animaux auront en permanence accès à une alimentation équilibrée et à de l’eau ad libitum, garantissant l’absence de faim, de soif et de malnutrition. L’absence de peur et de détresse sera assurée par une manipulation réalisée par du personnel formé, une contention limitée au strict nécessaire pour les injections d’acide floique et l’utilisation systématique de l’anesthésie générale lors des procédures potentiellement stressantes ou douloureuses (prélèvements et injections rétro-orbitaires). L’absence de stress physique et/ou thermique sera garantie par le maintien des animaux dans des conditions environnementales contrôlées et adaptées à leur espèce, ainsi que par une surveillance continue pendant et après l’anesthésie. L’absence de douleur, de lésions et de maladie sera prise en compte par le recours à des protocoles anesthésiques validés (isoflurane, kétamine) et par un suivi clinique régulier permettant de détecter et traiter rapidement tout signe de souffrance (tableau de score). Enfin, la liberté d’expression des comportements normaux de l’espèce sera préservée en dehors des temps de manipulation grâce à un hébergement adapté, enrichi et conforme aux besoins comportementaux des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt
Remplacement
Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le cœur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome. Ainsi, les modèles in vitro et organoïdes ne peuvent mimer les phénomènes pathophysiologiques systémiques que nous étudierons et le petit animal, comme la souris, permet une analyse précise et indispensable des mécanismes mis en jeu dans cette physiopathologie.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été conçus de manière à utiliser le plus petit nombre possible d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe a été soigneusement déterminé à l’aide d’un calcul statistique, afin d’obtenir des données exploitables et significatives sans recourir à un nombre excessif de spécimens. Cette approche permet de prendre en compte la variabilité des réponses des souris au traitement à l’acide folique, tout en limitant strictement l’utilisation d’animaux aux besoins indispensables de l’étude
Raffinement
Les protocoles expérimentaux se feront sous anesthésie générale afin d’éviter le plus possible une quelconque douleur chez l’animal. Un collyre analgésique sera utilisé avant chaque injection et chaque prélèvement rétro-orbitaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. Des points limites adaptés permettent de prévenir toute forme de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Des souris mâles et femelles de 8 à 14 semaines seront utilisés dans notre étude. L'utilisation des souris jeunes adultes permet d'obtenir des résultats plus fiables et pertinents grâce à leur maturité physiologique, leur homogénéité et leur robustesse.
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur le potentiel métastatique de cellules tumorales prostatiques humaines sur un modèle de souris immuno-déprimées NOD Scid. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Rendues immunodéprimées pour accepter des cellules tumorales humaines, 75 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une implantation de cellules cancéreuses de la prostate dans l'abdomen, puis un traitement de la zone opérée par une torche à plasma froid. L'objectif est d'évaluer si ce procédé réduit le risque de récidive après ablation d'une tumeur. Le porteur décrit ce modèle comme "incontournable" et a porté l'effectif de 45 à 75 animaux.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.
Bénéfices attendus
Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.
Procédures
Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.
Remplacement
Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.
Choix des espèces
Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.
Etude des mécanismes moléculaires lors de la division de la cellule sexuelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Pour étudier la séparation des chromosomes lors de la formation des spermatozoïdes, 314 souris mâles prépubères reçoivent un produit par voie orale pendant dix jours et des injections sous-cutanées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le choix d'animaux prépubères sert à synchroniser le développement des cellules et à réduire les effectifs. Toutes sont tuées pour prélever leurs cellules sexuelles. Le porteur précise que les petits rejetés par leur mère ou dont la croissance décroche seront eux aussi euthanasiés.
Objectifs
Pour former des spermatozoïdes et ovocytes fonctionnels, les chromosomes d’origine maternelle et paternelle des cellules sexuelles se séparent lors d’une division cellulaire spécifique appelée méiose. Cette étape est cruciale : si les chromosomes ne se séparent pas correctement, cela aboutit à la stérilité ou à la transmission d’anomalies génétiques aux enfants. Ce projet vise à élucider les mécanismes qui contrôlent la séparation des chromosomes au cours de la méiose chez les mammifères, spécifiquement en étudiant le phénomène chez la souris. Ce projet permet de marquer les chromosomes d’une manière qui permet d’étudier comment chaque chromosome se positionne et interagit avec les autres durant la méiose. Grace à cette approche, il sera possible de mieux comprendre le mécanisme en jeu et d’identifier des gènes importants qui permettent de former des spermatozoïdes fonctionnels, qui contrôlent la fertilité et évitent la transmission d’anomalies génétiques.
Bénéfices attendus
A court terme : méthodologie novatrice pour analyser le rapprochement des chromosomes et la réparation de l’ADN dans les cellules sexuelles mâle (spermatocytes). A moyen terme : identification de mécanismes moléculaires, et de gènes, qui conduisent à l’infertilité ou à la transmission d’anomalies génétiques pathogènes, telles que les trisomies. A long terme : identification et compréhension du rôle de facteurs importants pour la fertilité et la stabilité du génome, qui peuvent être impliqué dans la fertilité, la transmission d’anomalies génétiques et la stabilité du génome en général.
Procédures
Les animaux recevront quotidiennement par voie orale (à la pipette) une goutte d’un produit non toxique pendant 10 jours, et deux ou trois injections à quelques jours d’intervalle, dans des conditions de contention destinées à rendre les manipulations rapides et à limiter le stress des animaux.
Impact sur les animaux
Contention de l’animal suivie de l’administration par voie orale (à la pipette) de quelques gouttes d’un produit non toxique, ce qui entraine un stress léger. Contention de l’animal suivie d’une injection sous la peau avec une seringue, ce qui entraine un stress léger et une douleur légère de courte durée, répétée 2 fois à quelques jours d’intervalle.
Devenir
La raison d’être de ce projet consiste en l’analyse post-mortem des cellules des individus traités. Nous devons donc euthanasier l’ensemble des animaux traités pour prélever le tissu d’intérêt et l’analyser.
Remplacement
La reproduction sexuée est un processus universel étudié chez des organismes non-mammifères (levures, plantes, invertébrés), mais de nombreux aspects sont spécifiques au contexte du développement des cellules sexuelles chez les mammifères, ce qui justifie l’étude chez ceux-ci, en prenant en compte les connaissances acquises chez d’autres organismes. Pour ce projet d’étude fine de l’organisation des chromosomes, qui nécessite un grand nombre de cellules sexuelles synchronisées à des stades précis, les systèmes de culture de cellules existants sont insuffisants parce que la synchronisation, l’efficacité et la similarité avec les propriétés in vivo ne sont pas suffisantes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ramené au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables et de vérifier leur reproductibilité. Il sera réduit autant que possible par une première phase de d’optimisation technique. La procédure de synchronisation en elle-même est conçue pour réduire d’un facteur 2 le nombre d’animaux, par rapport à l’utilisation d’animaux non traités, avec une meilleure qualité de résultat qui permet également de réduire le nombre de répétitions des expériences. La gestion de l’élevage des souris sera optimisée pour réduire autant que possible le nombre d’animaux surnuméraires.
Raffinement
Durant les procédures, les animaux non sevrés seront surveillés quotidiennement afin de vérifier en particulier l’absence de rejet par leur mère (absence de lait visible 2 jours de suite) et leur croissance normale. En particulier, lors de l’administration d’un produit non toxique par voie orale (jour post-natal 1 à 10) les animaux seront pesés quotidiennement, et les animaux qui sont rejetés par leur mère, qui ne prennent pas du tout de poids, ou dont la prise de poids est inférieure de 80% à la prise de poids attendue, seront sortis de l’expérimentation et euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal chez lequel le protocole permettant de synchroniser le développement des cellules sexuelles est au point, chez lequel les aspects de l’organisation des chromosomes lors du développement des cellules sexuelles (spermatozoïdes) est le mieux connu, ce qui est essentiel pour contextualiser nos résultats, et pour lequel des modèles génétiques appropriés (mutations des gènes impliqués) sont disponibles. La taille de cet organisme est appropriée, puisqu’un nombre réduit d’animaux est nécessaire pour chaque expérience. Des souris mâles prépubères seront utilisées, parce que le projet nécessite des cellules sexuelles à un stade de développement précis (à quelques heures près), alors que le développement des cellules sexuelles est continue et non synchrone chez le mâle adulte. La synchronisation du développement des cellules sexuelles chez des souris mâles prépubères permet d’obtenir le plus grand nombre possible de cellules sexuelles synchronisées, et donc de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Impact de 3 métabolites dans un modèle murin de maladie rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Chacune subit deux chirurgies des reins à une semaine d'intervalle pour induire une maladie rénale chronique, puis un gavage quotidien pendant quatre semaines qui peut irriter l'œsophage. Le porteur juge le modèle animal "indispensable", aucune étude sur cellules ou chez l'humain ne pouvant selon lui explorer la fonction rénale. L'objectif reste d'évaluer trois molécules issues du tryptophane, un bénéfice pour les patients n'étant avancé qu'au conditionnel.
Objectifs
La maladie rénale chronique touche environ 3 millions de personnes en France. Elle correspond à un mauvais fonctionnement des reins, qui ne filtrent plus correctement le sang. Cela entraîne une accumulation de substances que l’organisme n’arrive plus à éliminer normalement. Certaines de ces substances peuvent devenir toxiques et participer aux complications associées à la maladie. Parmi ces substances, certaines proviennent de la transformation des protéines de l’alimentation, et en particulier d’un acide aminé appelé tryptophane. Des études récentes réalisées chez l’humain ont montré que certaines molécules issues de la dégradation du tryptophane sont associées à une aggravation de la maladie rénale chronique. En revanche, leur effet direct sur le fonctionnement des reins n’a jamais été étudié. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de ces molécules, appelées molécules XANA, KYNA, AAN, sur les reins de souris. Le projet se déroulera en deux parties : 1/ Déterminer les doses auxquelles ces molécules peuvent être administrées. 2/ Évaluer l’effet de ces molécules chez des souris atteintes de maladie rénale chronique. Plusieurs paramètres seront analysés afin de mesurer leur impact sur le fonctionnement des reins et sur le métabolisme général.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les molécules issues de la dégradation du tryptophane affectent la progression de la maladie rénale. Si ces molécules sont liées à une aggravation des problèmes rénaux, il serait possible d'utiliser des inhibiteurs pour réduire leur production. Cela pourrait offrir de nouvelles options de traitements pour ralentir la progression de la maladie chez les humains.
Procédures
Les 90 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle chirurgical) : 36 souris recevront une anesthésie gazeuse (15 min) + 1 locale à chaque chirurgie,
Impact sur les animaux
L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les molécules doivent être administrées par gavage, ce qui nécessite une contention quotidienne des animaux pendant 4 semaines (sauf samedi et dimanche). Cette manipulation peut être stressante, même si elle dure moins d’une minute. Les gavages répétés peuvent irriter l’œsophage et provoquer une douleur. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Devenir
Les 90 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Les mécanismes des molécules issues de la dégradation du tryptophane sont complexes et impliquent plusieurs organes. Ni la modélisation informatique ni les études in vitro ne permettent de répondre à cette question. Une étude chez l’Homme est impossible à ce stade, car il n’existe pas de moyens non invasifs pour étudier en détail la fonction rénale et le métabolisme. L’utilisation d’un modèle animal est donc actuellement indispensable pour évaluer l’impact de ces molécules sur la progression de la maladie rénale chronique.
Réduction
Les molécules étudiées dans ce projet n’ont jamais été testées dans le cadre de la maladie rénale chronique (MRC). Un nombre minimal de 12 souris a été choisi pour la première étude. Pour la seconde étude, le nombre de souris par groupe a été déterminé à l’aide d’un logiciel, sur la base de données issues de protocoles précédents utilisant des souris atteintes de MRC. Un effectif de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, tandis que 6 souris suffisent pour le groupe contrôle non malade. Un maximum de tissus sera collecté lors de la mise à mort et conservé afin de répondre à d’éventuelles nouvelles questions et d’éviter la répétition inutile des expériences. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres équipes.
Raffinement
Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés 7x/semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée 2x/semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. L’administration des métabolites se fera par gavage, uniquement en semaine, afin de limiter le stress et l’irritation œsophagienne. Les animaux seront surveillés 5 jours/7. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Pour la mesure de la composition corporelle, un apprentissage préalable sera effectué une fois, une semaine avant afin d’habituer les souris à entrer dans le tube de mesure. Cet entraînement vise à réduire le stress pendant la séance de mesure, qui dure moins de deux minutes. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.
Choix des espèces
Bien que la souris présente certaines différences par rapport à la physiologie humaine, elle constitue un excellent modèle pour étudier la maladie rénale et l’effet de molécules spécifiques. Sa physiologie est suffisamment proche de celle de l’humain pour reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients. Des souris âgées de 10-18 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux sont sortis de la phase de croissance ce qui garantit une meilleure homogénéité des réponses expérimentales. Les manifestations cliniques de la MRC induite à cet âge sont reproductibles et bien caractérisées.
Élevage, génotypage de lignées murines transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
- Système urogénital
Environ 3 000 de ces souris sont maintenues en vie pour la reproduction des lignées, les surnuméraires et celles au mauvais génotype étant tuées. 5 000 souris au total vont être utilisées, dans des procédures classées légères à modérées, pour l'élevage et le génotypage de lignées transgéniques. Chaque animal subit au sevrage une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire, certaines lignées développant un prolapsus anal ou des troubles respiratoires à l'âge adulte. Le porteur décrit ces lignées comme "indispensables" et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les défenses des muqueuses à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les souris sont utilisées pour le maintien et l’amplification de lignées transgéniques, y compris des lignées présentant ou susceptibles de présenter un phénotype dommageable. Elles sont identifiées au sevrage par pose de bague auriculaire et, lorsque nécessaire, par génotypage à partir d’une biopsie de queue.
Bénéfices attendus
Les lignées transgéniques sont indispensables pour des projets visant à démontrer le rôle d’une famille de gènes fortement conservée entre l’Homme et la souris dans la protection des muqueuses. Elles permettent également de mieux comprendre les relations entre la variabilité de ces gènes et les altérations des mécanismes de défense des muqueuses sécrétrices. Ces modèles contribuent au développement de stratégies thérapeutiques et, à terme, à la mise en place de méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour des études mécanistiques. Le projet permet également de maintenir un noyau de lignées transgéniques et de fournir des animaux à des laboratoires partenaires dans le cadre de collaborations scientifiques.
Procédures
La biopsie de queue (< 1 mm) est réalisée au sevrage sur des animaux vigiles, sous contention, pour le génotypage, concomitamment à la pose d’une bague auriculaire pour l’identification. Dans de rares cas, un génotypage complémentaire peut être réalisé à l’âge adulte par prélèvement au poinçon auriculaire sur animal vigile, sous contention.
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent un phénotype dommageable avéré ou potentiel. Des souris d’une lignée peuvent développer un prolapsus anal associé à une inflammation colorectale, tandis que des troubles respiratoires peuvent apparaître dans une autre lignée. Ces phénotypes sont observés uniquement chez des souris homozygotes âgées de plus de 5 mois. Sur la base de l’expérience acquise sur ces deux lignées, suivies depuis plusieurs années chez des souris âgées de moins de 6 mois, le phénotype dommageable reste peu fréquent (
Devenir
Les souris avec des génotypes requis sont maintenues en vie pour l’établissement et l’entretien des lignées ainsi que pour leur utilisation dans les protocoles expérimentaux du présent projet ou de projets associés. Les souris ne présentant pas de génotype requis (souris surnuméraires ou non nécessaires) sont mises à mort, soit dans le cadre de la gestion des colonies, soit en fin d’utilisation expérimentale. Les souris présentant un phénotype dommageable sont également mises à mort en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses sécrétrices, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions au niveau de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme restent limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension approfondie des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour étudier des gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Certaines lignées utilisées dans ce projet contribueront également au développement d’approches complémentaires visant à réduire à terme le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La production de souris est planifiée en fonction des besoins expérimentaux, estimés à partir d’approches statistiques et de l’expérience acquise. Les schémas d’accouplement sont optimisés afin de produire le nombre nécessaire de souris présentant les génotypes requis. Le maintien de certaines lignées par accouplement d’animaux homozygotes permet de limiter le recours aux prélèvements invasifs pour le génotypage. Les lignées qui ne seront plus utilisées sont conservées par cryoconservation.
Raffinement
Les souris sont élevées et utilisées dans des locaux agréés disposant d’un statut sanitaire « exempt de pathogènes spécifiques » (EOPS). Elles sont hébergées en cages enrichies, par groupes de 2 à 5 individus, avec accès ad libitum à une alimentation standardisée stérile et à de l’eau de boisson stérile. Le personnel en charge de l’élevage et des manipulations est formé et habilité conformément à la réglementation en vigueur. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Les procédures réalisées dans le cadre du projet sont peu invasives et associées à une douleur de faible intensité. L’identification par bague auriculaire et le prélèvement d’une biopsie de queue (< 1 mm) pour le génotypage sont réalisés par du personnel formé, selon des gestes rapides et standardisés. Le poinçon auriculaire réalisé à l’âge adulte est effectué par du personnel formé, sur animal correctement maintenu, avec une contention brève et un geste rapide limitant le stress et permettant une lésion de petite taille à cicatrisation rapide. Les conditions d’hygiène sont adaptées afin de limiter tout risque de complication locale. Une anesthésie locale peut être envisagée en cas de sensibilité accrue ou d’évolution des pratiques. Les animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable sont identifiés afin de permettre un suivi adapté. En cas d’apparition de signes cliniques évocateurs d’un phénotype dommageable, ils sont soumis aux points limites définis dans le protocole et retirés de l’étude si nécessaire.
Choix des espèces
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses, en particulier les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuels ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions à l’échelle de l’organisme entier. Les investigations chez l’Homme sont limitées et reposent principalement sur des observations cliniques et des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans ces pathologies nécessite une compréhension détaillée des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent de recherche, permettant le contrôle de l’environnement expérimental et de la variabilité génétique. Son système immunitaire est bien caractérisé, son génome entièrement séquencé, et de nombreuses lignées transgéniques sont disponibles pour l’étude de gènes impliqués dans la défense des épithéliums. Tous les stades de développement postnataux peuvent être concernés, dans le cadre du maintien et de l’amplification des lignées utilisées pour les besoins de projets de recherche faisant l’objet d’autorisations spécifiques.
Prélèvement des tissus pour la caractérisation génétique de souris génétiquement modifiées et gestion de lignées à phénotype dommageable.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système urogénital
200 000 souris pour un seul acte de quelques secondes chacune, la coupe d'un bout d'oreille ou de queue, un prélèvement de sang ou d'un orteil pour lire leur génotype. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance déclaré léger pour 187 500 d'entre elles et modéré pour 12 500. Les souris qui portent le génotype recherché rejoignent d'autres projets ou l'élevage, les autres sont mises à mort. Le projet couvre des lignées dites à "phénotype dommageable", modifiées pour développer des anomalies, sans que le résumé précise lesquelles.
Objectifs
Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits. L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des projets de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'optimiser la gestion des élevages d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans des projets de recherche dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de maladies humaines.
Procédures
Prélèvements sur souris vigiles : Soit Un prélèvement de petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum) Soit un prélèvement de sang (50 à 100ul) Soit un prélèvement de phalange- Dans les 3 cas, moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention et de la douleur légère à modérée lors de la coupe du tissu.
Devenir
Les animaux du génotype d'intérêt sont utilisés dans les projets expérimentaux du laboratoire ou gardés en vie pour renouveler les reproducteurs nécessaires à l'entretien des colonies. Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt sont mis à mort.
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques. Bien que les chercheurs développent leurs hypothèses sur des systèmes alternatifs (moléculaires et cellulaires), le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable. L'étude de mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux nécessitent et justifient le recours à l'animal et la détermination du génotype des animaux ne peut être réalisé sans prélèvement de tissus.
Réduction
La production des souris génétiquement altérées est basée et réduite au stict besoins expérimentaux établis de façon statistique. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Nous utilisons des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques). Quand cela est possible nous utilisons des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage. Les élevages des lignées non utilisées sont arrêtées (cryoconservation). Les chercheurs donnent des consignes lorsqu'il n'est pas nécessaire de prélever du tissu des souris. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable.
Raffinement
Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées par des zootechniciens expérimentés dont le geste est précis. Les biopsies sont effectuées rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et adapté pour réduire le temps et l'intensité de la douleur. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites (activité, aspect physique, cicatrisation..) ont été mis en place pour détecter toute souffrance éventuelle et y remédier. Pour les lignées à phénotypes dommageables, la stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances et si besoin des conditions d’hébergement adaptées, une DAP spécifique (d’élevage ou avec l’expérimentation) sera soumise à évaluation.
Choix des espèces
La souris est un modèle trés développé pour la compréhension des pathologies humaines. Ce modèle présente de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’Homme. De plus son temps de génération est court et son élevage simple. Les biopsies de queue ou d'oreille seront faites sur des souris à partir de 10 jours d'âge jusqu'à 4 semaines. La phalangectomie sera effectuée de 5,5j à 10 jours d'âge. Les prélèvements de sang seront effectués sur des souris de 15 jours d'âge jusqu'à 4 semaines. Cela permet d'obtenir le génotype rapidement et de ne sélectionner au sevrage que les animaux d'intérêt.
Etude de la protéine PAXBP1 dans la physiologie testiculaire
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Injectées avec des molécules de chimiothérapie, jusqu'à une administration quotidienne pendant cinq jours, 3 840 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie des traitements est infligée à des souriceaux, du cinquième au dixième jour après la naissance. Le résumé annonce une perte de poids "légère et temporaire" de deux à trois jours comme principal effet, sans autre détail sur les atteintes. Les organes sont prélevés après la mise à mort, pour analyser les effets de l'invalidation d'un gène sur la fertilité.
Objectifs
L'objectif est d’étudier le rôle de la protéine PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales des gonades et son rôle dans la reprotoxicité induite par des traitement de chimiothérapie afin d’analyser la survenue des troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra : * De mettre en évidence le rôle clé de PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales et leur sensibilité aux traitements anti-cancéreux de chimiothérapies. * Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’infertilité * Décrypter les mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans les effets secondaires à long terme des médicaments sur la fertilité. * Ouvrir des pistes de traitements pour minimiser les effets reprotoxiques des chimiothérapies
Procédures
Les nuisances pour les animaux seront la préhension par l’expérimentateur et les injections des molécules de chimiothérapie. Au maximum, les souris subiront une injection quotidienne pendant 5 jours. Ces interventions seront réalisées du 5ième jour postnatal jusqu'au 10ième jour pour les traitements en période néonatale, ou bien pendant 5 jours consécutifs à 3 mois pour les traitements à l'âge adulte.
Impact sur les animaux
Les traitements par chimiothérapie chez la souris adulte pourraient conduire à une perte légère et temporaire perte de poids à partir du troisième jour du traitement. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélévement des organes afin d'analyser les impacts de l'invalidation du gène PAXBP1 lors de traitement de chimiothérapie sur la fonction de reproduction.
Remplacement
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permet à l'heure actuelle d'analyser les mécanismes des interactions cellulaires intra et inter-organes pouvant contrôler le développement et le maintien de la spermatogenèse sur le long terme (plusieurs semaines/mois) et d’analyser les impacts sur la santé de la descendance.
Réduction
L’analyse en temps réel des données recueillies à chaque expérience nous permettra, si nécessaire, d’ajuster le protocole : certains timings d’étude pourront être supprimés sur les répétitions prévues, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Notre stratégie de repose sur différents éléments reprenant les points clés : Nous minimiserons les animaux pouvant présenter des phénotypes dommageables grâce à la génération d’animaux présentant une invalidation ciblée de la protéine d’intérêt dans un seul type cellulaire. Afin de limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum); Les animaux seront hébergés en présence d’environnement contrôlé et enrichi (tunnel, coton…) avec un accès illimité à la nourriture et la boisson. Nous veillerons au bien- être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Pour les transferts des souris d'une cage à l'autre nous utiliserons des méthodes low stress (Cupping). Pour les observations, les souris seront manipulées à la suite de leur entrée dans un petit tube afin d’être déposé sur la grille puis manipulées. Le suivi régulier des animaux nous permettra au mieux d’identifier les signes d’alerte afin de réaliser des mesures visant à minimiser la douleur, souffrance ou angoisse induite par les contraintes liées aux procédures expérimentales. Ce rythme de surveillance sera accru si un animal devait présenter des signes importants de souffrance, douleur. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré. En ce sens, nous avons défini des points limites spécifiques et adaptés pour les expériences menées.
Choix des espèces
Choix des espèces. Nous utiliserons des souris car les modèles génétiquement modifiés pour PAXBP1 sont disponibles permettant ainsi l'analyse de l'impact de la perte du gène PAXBP1 lors de traitement anti-cancéreux sur la fertilité et la physiologie des gonades. La souris présente une physiologie testiculaire proche de l’espèce humaine et elle est un modèle mammifère de choix pour réaliser des études au cours du développement de la gonade et pour l'analyse de la fertilité. Ainsi, ce travail se base sur les points communs de la physiologie des cellules germinales entre les espèces : dans la mise en place des cellules souches dans la période prépubère, l’entrée en méiose à la puberté et la production des spermatozoïdes de la puberté à la mort de l’individu. De plus, le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre différentes espèces notamment l’homme et la souris. Choix des stades: Pour l'analyse de l'impact des chimiothérapies, nous travaillerons sur des souris mâles traités aux chimiothérapies lors de la période néonatale (traitement de 5 à 10 jours). Pour l'analyse des impacts sur la physiologie testiculaire, nous suivrons les souris mâles à différents âges. Cela aura pour but d'analyser la mise en place des cellules germinales (de P5 à P15 post-natal), leur maintien de la puberté à l'âge adulte (de 20 jours à 365 jours), dans le but de définir l'impact sur la fertilité. Pour cela, nous mettrons à mort des souris à P6, P10, P15, P20, P40, P60, P90, P180. Pour l’analyse chez les souris adultes, ces dernières seront mises à mort à différents temps après traitement afin de définir l'impact de PAXBP1 dans la réponse aux molécules de chimiothérapie sur la perte des cellules germinales et de la fertilité puis pour l'analyse des capacités régénératives de cellules germinales et le retour de la fertilité. AInsi, nous mettrons à mort des souris 1jour, 4 jours, 7 jours, 10 jours, 20 jours, 60 jours, 90 jours et 180 jours après le début du traitement.
Etude de la voie de l’hypusination dans le cancer de la prostate (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
1 152 souris vont être utilisées dans une étude sur le cancer de la prostate, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leurs organes. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales puis subissent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe diffusant en continu un inhibiteur. Les tumeurs se développent pendant plusieurs mois avant l'analyse, sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les mutations du cancer prostatique humain. L'équipe affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses, concluant à la nécessité de l'expérience sur l'animal.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les effets d'inhiber une forme de modification post-traduction de protéine qu'on appelle "hypusination" sur le développement du cancer de la prostate dans un modèle de souris. Nos résultats préliminaires démontrent qu'inhiber cette voie par un composé disponible commercialement bloque la multiplication des cellules cancéreuses de prostate. Afin de valider ces résultats chez la souris, nous traiterons les souris avec ce composé en diffusion continue grâce à l’utilisation de mini-pompes couramment utilisées en expérimentation animale. La diffusion est gérée par la mini-pompe qui envoie une concentration régulière du traitement afin de traiter l’animal en continue et en maitrisant la dose délivrée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la voie de l’hypusination est impliquée dans la tumorigénèse du cancer de la prostate. Si c’est le cas, cette étude ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate qui dans ses formes résistantes à la castration possède actuellement un pronostic très sombre pour les patients avec une médiane de survie n'excédant pas 15 mois. Modification : Ce projet permettra également de déterminer le rôle de l'hypusination en fonction de l'agressivité de la tumeur et du stade de la tumeur ainsi que sur la formation des métastases.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours, soit 5 x 1 minutes, puis à une procédure chirurgicale sous inhalation durant 45 minutes, temps d'implantation de la mini-pompe. Aucun prélèvement ne sera fait sur l'animal vigile. Modification : Après réévaluation et observation du geste chirurgicale, l'implantation de la pompe ne durera que 10 minutes. La durée totale des interventions sera de 5 minutes pour les 5 injections et 10 minutes pour l'implantation de la pompe pour un total de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir une éventuelle douleur post-opératoire ou une infection post-opératoire. Cependant, toutes les mesures seront prises pour éviter ces nuisances, avec une prise en charge sous asepsie et une administration systématique d'antalgiques, ainsi que surveillance et réévaluation rapprochée dans les suites. Modification : Les tumeurs ne sont pas cliniquement palpables jusqu'à 9 mois après l'injection du composé qui déclenche la formation des tumeurs. L'évolution de la tumeur sera suivie et des mesures seront prises en cas de douleur due à une évolution plus rapide de la tumeur.
Devenir
Modification :tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organes suivis d'analyses.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Modification : En raison de l'hétérogénéité des tumeurs, et pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, il est nécessaire d'inclure 18 souris par groupe par génotypage et par temps (5 souris pour les analyses histologiques, 8 souris pour les analyses immunophénotypiques (FACS) et 5 souris pour l'analyse des transcrits (RNA). Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (t-tests). Etant donné la variabilité inter-individuelle observée dans nos études précédentes (d'environ 15%), nous avons estimé que 18 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement avec une p-valeur de 5%.
Raffinement
Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’implantation de la pompe avec surveillance des points de suture et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de la buprénorphine sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Enfin, il a été fait le choix de l'implantation des mini-pompes afin d'améliorer le bien-être animal en évitant les injections quotidiennes en intra-péritonéales du composé qui peuvent causer des nuisances. La surveillance générale sera visuelle, avec un suivi de l'aspect global de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal presente un dos voute, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort immédiatement. Une nourriture enrichie sous forme de nourriture gelifiée pourra être mise dans les cages durant toute la durée du traitement par mini-pompe afin de favoriser une bonne alimentation des animaux.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer prostatique humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux seront injectés à 8 semaines de vie, puis les mini-pompes seront implantées à partir de 3 mois plus tard, soit à 5 mois de vie. A ce stade, les souris présentent des lésions prénéoplasiques. Nous aurons 4 temps au bout desquels un groupe de souris sera mis à mort pour étudier l'effet du composé à différents temps : 1, 3, 6 ,10 semaines après implantation de la pompe. Modification : Les animaux seront injectés entre 8 et 12 semaines de vie afin d'élaborer des groupes expérimentaux plus conséquents et afin de réaliser les implantations des pompes simultanément. Ces injections ne peuvent se faire qu'au moment de la puberté qui se déroule entre 8 et 12 semaines car le système d'invalidation des gènes permettant la formation des tumeurs ne peut être induit qu'au moment de la puberté. Les mini pompes seront également implantées à partir de 5 mois après injection de tamoxifène soit à 7 mois de vie. A ce stade les souris présentent des adénocarcinomes.
Programmation et reprogrammation épigénétique du destin cellulaire chez Xenopus Laevis-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Réutilisées d'une ponte à l'autre après stimulation hormonale, 100 femelles xénopes sont maintenues en vie, tandis que 500 autres xénopes sont tués pour prélever ovaires et testicules. Les animaux relèvent d'un niveau de souffrance sans réveil ou léger, dans un projet de recherche fondamentale sur la reprogrammation épigénétique du destin cellulaire. Chaque semaine, un mâle est tué pour la purification de cellules germinales et une femelle pour ses ovaires. Les autres femelles servent de façon répétée à la ponte, induites tous les six mois, avant d'être à leur tour utilisées.
Objectifs
Le projet vise à décrire les mécanismes épigénétiques permettant la programmation et la reprogrammation du destin cellulaire. Nous abordons trois questions en relation avec cette thématique. 1-Dans quelle mesure les modifications associées aux histones retenues dans le spermatozoïde contribuent a la régulation du développement embryonnaire précoce ? Pour cela nous décrivons le paysage épigénétique du spermatozoïde par des techniques de ChIP-seq quantitative puis évaluons l’effet de perturbation de ces instructions épigénétiques paternelles sur le développement de l’embryon. 2-Quels sont les mécanismes épigénétiques qui stabilisent le destin des cellules somatiques ? Nous réalisons des expériences de clonage au cours desquels un embryon est généré par transplantation du noyau d’une cellule différenciée dans un œuf énucléé. Le développement d’un tel clone est limité par des verrous épigénétiques présent au sein de la chromatine de la cellule donneuse. Pour identifier ces mécanismes de stabilisation du destin cellulaire, nous désactivons des voies épigénétiques de la cellule différenciée et évaluons si cela réduit la résistance a la reprogrammation par les composantes de l’œuf (ce traduisant par une amélioration du clonage). 3-Quels sont les mécanismes moléculaires et cellulaires qui gouvernent les processus de régénération ? Nous tirons bénéfice du fait que les têtards de Xenopus Laevis présentent des capacités de régénération (queue, pattes) qui varient au cours du développement pour réaliser des études comparatives permettant d’identifier les processus moléculaires et cellulaire associées a un bon déroulement de la régénération. Nous focalisons nos études sur l’influence du système immunitaire dans la réponse régénérative. MODIFICATIONS Pour tester la fonction de voies épigénétiques d’intérêt a des stades précoces du développement, les stratégies reposant sur des injections d’ARNm dans des zygotes sont les approches déployées. Cependant les ARNm ne persistent pas suffisamment longtemps pour exercer des effets aux stades tardifs. D’autre part les stratégies reposant sur des injections d’ARNm ne permettent pas de réaliser des interférences spécifiquement dans certains tissus. En conséquence, pour permettre des tests fonctionnels a des stades développementaux tardifs et de façon tissue spécifique nous employons dans ce cas des animaux transgeniques qui nous permettent ce niveau de contrôle spatiaux-temporel.
Bénéfices attendus
Notre recherche fondamentale a pour objectif de mieux comprendre des mécanismes moléculaires et cellulaires dont la compréhension a un fort potentiel pour la santé humaine : 1- Compréhension des mécanismes de transmission d’information épigénétiques entre générations. Une meilleure description/compréhension de ces mécanismes, en particulier de la possibilité que la lignée germinale male puisse transmettre à la descendance l’effet de l’exposition paternelle a l’environnement peut aider à orienter les politiques de santé publique. 2-Compréhension des mécanismes stabilisant le destin cellulaire. Un déséquilibre de ces mécanismes peut contribuer a des pathologies chez l’homme (déstabilisation dans le cas de cancer par Example). 3- Le déchiffrage des processus permettant la régénération, très efficace chez le Xenope, peut identifier des voies moléculaires et cellulaires a cibler pour améliorer les processus régénératifs chez l’homme.
Procédures
Les animaux subissent uniquement des injections d'homones. Pour les femelles il sagit de deux injections en sous-cutannee espacees de 2 a 7 jours , repetees tous les 6 mois. Les animaux sont manipulés pour moins de une minute: prelevement du bac d’elevage pour immobilisation sur paillasse humide suivie d’injection (quelques secondes) puis retour en bac de ponte.
Impact sur les animaux
Les procédures decrites ont des effets modérés sur les animaux. Il s’agit uniquement d’injection sous cutanées d’hormones pour stimuler la ponte. L’injection sous-cutanée ne provoque pas de saignement et n’induit pas de douleurs pour l’animal. Le produit injecté n’est pas toxique pour les animaux. Par précaution les animaux soumis à injection ne sont pas nourris le jour précédant, car les injections provoquent quelques fois des phénomènes de regurgitations
Devenir
Apres stimulation de la ponte les femelles sont mise au repos puis reutilisees ulterieurement pour de nouvelles pontes. Ceci permet d'obtenir regulierement des oeufs de bonne qualite tout en lilitant le nombre d'animaux utilises. Dans le cas des prelevements d'organes, les animaux sont mis a mort.
Remplacement
Il n’y pas d’alternative actuelle a l’utilisation d’animaux pour l’obtention de cellules germinales fonctionnelles. Les efforts actuels, chez la souris en particulier, de production de cellules germinales in vitro à partir de cellules souches ne permettent pas d’atteindre des cellules pleinement différentiées. L’utilisation de dérivés de cellules souches mimant le développement embryonnaire précoce n’est également pas une option car nous nous intéressons a l’influence de l’épigénome de la lignée germinale sur le déroulement du développement embryonnaire précoce. Cependant, les études de la spermatogenèse en cours dans notre laboratoire nous amène a développer un modèle de spermatogenèse Ex-vivo qui pourrait conduire á la mise en place d’un protocole de spermatogenèse in vitro, réduisant ainsi l’utilisation de males.1
Réduction
Les pratiques pour réduire l’utilisation des animaux dans notre laboratoire sont les suivantes : 1-Mutualisation des animaux utilisés : Étant donne l’abondance des œuf/ovocytes produits par une femelle, le matériel produit permet dans la majeure partie des cas la réalisation d’une multitude d’expériences. En conséquence, la planification de l’utilisation des animaux est optimisée pour accommoder les besoins du plus grand nombre possible d’expérimentateurs. 2-Reutilisation des animaux : Les femelles utilisées pour la ponte sont réutilisées suite à une période de repos. 3-Optimisation de l’utilisation des testicules pour les fécondations in vitro. Les testicules issus d’un males peuvent être utilisées pour réaliser plus de 10 fécondations in vitro. La durée de stockage de ces testicules est de 15 jours. En conséquence les expériences impliquant les FIVs sont regroupées dans le temps afin de maximiser l’utilisation des testicules et limiter le nombre de males sacrifiés. 4-De la même façon nous avons optimisé l’utilisation des ovaires en améliorant les conditions de d’utilisation des organes prélevés. Les ovocytes sont dissociés par une solution enzymatique, tries manuellement, puis stockes a 14 degré dans une solution contenant des antibiotiques. Chaque jours, une élimination des ovocytes défectueux et un renouvellement du milieux de culture permet d’étendre la survie de ces cellules au-delà d’une semaine. La détermination du nombre d’animaux utilisés est basée sur les calculs suivants : Nous envisageons l’utilisation de ~350 femelles et de ~ 250 males Xenopus Laevis. L’utilisation se décompose en 3 modes : 1/Animaux réutilisés au cours du projet : Les femelles sont utilisées par lot de 2 pour la ponte. Deux pontes par semaine en moyenne >soit environ 200 pontes par an> 100 femelles (les femelles sont induites pour ponte tous les 6 mois). 2/ Prélèvement d’ovaires. Sacrifice d’une femelle par semaine pour prélèvement d’ovaires > ~ 250 femelles 3/ Prélèvement de testicules. Sacrifice d'un male par semaine pour prélèvement de testicules et purification de cellules germinales > ~250 males
Raffinement
Un nouveau protocole de stimulation de ponte a été testé permettant l’utilisation d’une même femelle pour deux pontes successives espacées de 1 a deux semaines, l’animal étant ensuite mis au repos pour ~3mois. Ce protocole permet d’obtenir deux fois plus d’œufs, de qualité comparable, a partir d’une même femelle, réduisant ainsi le pool d’animaux utilse2 pour la ponte. Pour les expériences de régénération nous avons mis au point une protocole de régénération ex-vivo qui permet de recapituler certaines étapes de la régénération d’un membre. Ce protocole permet d’étudier la régénération après euthanasie, réduisant ainsi la souffrance de l’animal. En outre il permet d’amputer les deux membres d’un animal plutôt qu’un seul lorsque les études sont réalisées in vivo.
Choix des espèces
Les espèces ont été choisie en raison de l’abondance, de l’accessibilité du matériel biologique étudié (ovocytes, spermatozoïdes, embryons). Ce modèle permet la réalisation a grande échelle d’expériences de clonage, d'• Injection Intracytoplasmic de spermatozoide (ICSI), et de production d’embryons haploïdes. Enfin il présente des caractéristiques uniques de la spermatogenèse (remodelage partiel des nucléosomes) permettant des analyses épigénétiques qui ne sont pas possibles dans d’autres modelés animaux tel que souris, zebrafish, drosophille, ou le nématode Caenorhabditis Elegans. Une autre caractéristique cruciale de ce tétrapode est l’existence d’une période étendue (8 division cellulaire) entre la fécondation et l’initiation de la transcription du génome zygotique. Cette caractéristique est cruciale pour l’étude de la transmission des caractères epigenetiques dérivés de la lignées germinales. En effet cette fenêtre temporelle de 8 cycle cellulaires permet par example de perturber la transmission des marques epigenetiques derivées du spermatozoide et d’en etudier l’impact sur l’activation des genes zygotiques. Enfin l’abondance des œufs permets la production d’extrait qui peuvent etre utiliser pour identifier les facteurs maternelles impliques dans la reconaissance/propagation des signaux epigenetiques issus du spermtozoide. Les animaux sont sexuellement matures, soit >= 1 an chez Xenopus Laevis
Evaluation de l’efficacité de nouveaux outils thérapeutiques dans un modèle d’infection du tractus urinaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inoculation sous anesthésie déclenche une infection urinaire aiguë ou chronique, suivie de prélèvements d'urine et de sang, de séances d'imagerie jusqu'à trois fois par semaine et d'administrations répétées de composés, pour tester de nouveaux anti-infectieux face à l'antibiorésistance. Le porteur signale une hématurie, de la léthargie et une perte de poids possibles pendant l'infection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la colonisation des voies urinaires et conclut que le recours à la souris reste "indispensable".
Objectifs
Les infections du tractus urinaire (ITU) représentent un enjeu majeur de santé publique, en raison de leur fréquence élevée, de leur tendance à la récidive, en particulier chez les patientes, et de l’augmentation préoccupante de la résistance aux antibiotiques. Dans ce contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-infectieuses constitue un besoin médical prioritaire. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-infectieux dans des modèles murins d’infections urinaires aiguës et chroniques. Ces modèles, largement décrits dans la littérature scientifique, permettent de reproduire de manière contrôlée les différentes phases de l’infection et d’étudier la dynamique bactérienne ainsi que la réponse aux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser l’évolution de l’infection urinaire dans des conditions aiguës (jusqu’à 6 jours) et chroniques (jusqu’à 4 semaines) après inoculation bactérienne et évaluer l’efficacité thérapeutique de composés candidats administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intra-péritonéale ou intra-veineuse), en mesurant leur capacité à réduire la charge bactérienne. Les procédure permettront de suivre longitudinalement la progression de l’infection chez l’animal vivant grâce à une approche d’imagerie non invasive basée sur la bioluminescence bactérienne, permettant une évaluation quantitative et répétée. Une analyse de la distribution bactérienne et l’impact des traitements au niveau des organes cibles (vessie, urètre, reins) en fin d’étude sera effectuée. Ce projet permettra ainsi de générer des données précliniques essentielles pour identifier et caractériser de nouvelles molécules à potentiel thérapeutique contre les infections urinaires, contribuant à répondre à la problématique croissante de l’antibiorésistance.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation urinaire réalisée sous anesthésie inhalatoire, comprenant deux administrations rapprochées effectuées lors d’une même séance (environ 10 minutes au total par administration). Cette intervention a lieu une seule fois par animal, dans les deux procédures. Des prélèvements d’urine seront réalisés sur animaux vigiles : 2 à 3 prélèvements sur une durée maximale de 6 jours pour le modèle aigu, et un prélèvement par semaine pendant 4 semaines pour le modèle chronique. Chaque prélèvement dure environ une minute et consiste en une collecte non invasive lors d’une miction spontanée. Les traitements expérimentaux seront administrés selon la voie choisie (orale, parentérale, topique ou intraveineuse), avec une fréquence maximale quotidienne ou biquotidienne selon la voie. Chaque administration dure quelques secondes à une minute. Une imagerie in vivo pourra être réalisée afin de suivre l’évolution de l’infection de manière non invasive. Cette procédure dure environ 5 à 10 minutes sous anesthésie et pourra être effectuée jusqu’à trois fois par semaine. Les animaux seront observés quotidiennement (une à deux fois par jour selon le modèle), avec une durée d’observation inférieure à une minute, afin d’assurer leur suivi clinique et leur bien-être. En fin d’étude, chaque animal sera soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde, suivie d’une euthanasie réglementaire et de prélèvements d’organes. Cette intervention dure environ 5 à 10 minutes. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois par semaine sous anésthésie et l'intervention durera 5 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvre dans ce projet peuvent entraîner des nuisances ou effets indésirables, principalement liés à l’induction de l’infection et aux administrations de traitements. L’instillation transurétrale, réalisée sous anesthésie, peut provoquer une irritation locale de l’urètre et de la vessie, ainsi qu’un inconfort transitoire au réveil. Ces risques sont limités par l’utilisation de matériel adapté et par du personnel formé. Dans le modèle aigu, une inflammation locale, une hématurie modérée et une altération transitoire de l’état général (léthargie, baisse d’activité) peuvent être observées. Dans le modèle chronique, les signes sont généralement plus modérés, avec une gêne persistante et une inflammation de bas grade. Une perte de poids modérée peut survenir, en particulier en phase initiale. Les anesthésies répétées à l’isoflurane peuvent induire un stress léger et transitoire. Les prélèvements urinaires et sanguins peuvent également générer une gêne ponctuelle liée à la contention ou à la ponction. L’administration des traitements (gavage, injections) peut entraîner un stress ou un inconfort léger selon la voie utilisée. Des mesures seront appliquées afin de limiter l’intensité et la durée de ces effets.
Devenir
À la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière fiable l’ensemble des aspects physiopathologiques impliqués dans les infections urinaires, en particulier la colonisation des voies urinaires, les réponses immunitaires locales, la persistance bactérienne et la pharmacocinétique des traitements. Les modèles cellulaires ou organoïdes ne permettent pas d’évaluer l’efficacité de traitements dans un contexte d’infection systémique ou tissulaire, ni d’intégrer les paramètres pharmaco-dynamiques in vivo. Par conséquent, le recours au modèle murin reste indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le projet intègre plusieurs mesures concrètes visant à limiter le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction des 3R. Le nombre d’animaux a été estimé sur la base de calculs de puissance statistique à partir de données préliminaires internes et de la littérature, afin de garantir que seuls les effectifs strictement nécessaires seront mobilisés pour répondre aux objectifs scientifiques. L’utilisation d’une technologie d’imagerie bioluminescente permet un suivi non invasif et longitudinal de l’infection sur un même animal, réduisant ainsi le recours à des euthanasies inter-médiaires pour le recueil de données. Cette approche limite significativement le nombre total d’animaux requis pour l’analyse cinétique de la réponse au traitement. Les groupes de contrôle (témoin négatif et témoin positif) seront mutualisés entre plusieurs ex-périmentations lorsque cela est possible, notamment lors du criblage de différents composés, afin d’éviter la duplication de lots témoins. L’exploitation complète des animaux en fin d’expérimentation est prévue, avec prélèvements de plusieurs organes (vessie, urètre, reins) pour différentes analyses (microbiologie, histologie, biologie moléculaire), optimisant ainsi les données obtenues par individu. Une phase pilote, menée sur un effectif réduit, permettra de valider et d’ajuster les protocoles d’infection et de traitement avant les séries expérimentales principales, afin d’éviter des essais non concluants. Les tissus prélevés sont partagés pour analyses complémentaires validées afin de réduire le nombre d’animaux supplémentaires. Les analyses statistiques seront effectuées afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser tout en assurant la robustesse des résultats.
Raffinement
Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. L’injection intra-urétrale de l’inoculum bactérien est réalisée sous anesthésie générale par isoflurane, avec une contention douce et un matériel adapté (cathéter à petit calibre). Pour limiter l’inconfort lors de l’instillation transurétrale, un lubrifiant stérile et un analgésique local (lidocaïne) seront appliqués sur la sonde. Ces mesures de raffinement visent à réduire la douleur et l’irritation sans interférer avec l’infection ou les traitements testés. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique quotidien incluant l’observation du comportement ainsi que la prise de poids. Des critères d’arrêt seront appliqués si un animal présente des signes cliniques dépassant les seuils définis. L’utilisation d’un suivi par imagerie bioluminescente limite les interventions répétées, les prélèvements invasifs, ainsi que le stress induit par des manipulations fréquentes. Les prélèvements d’urine sont réalisés sur animal vigile, sans ponction, par simple recueil de mictions spontanées au moment de la contention. Des mesures de raffinement sont également adaptées à chaque voie d’administration afin de limiter le stress et l’inconfort. Pour le gavage, l’utilisation de sondes adaptées, de volumes contrôlés et d’un personnel expérimenté permet de réduire les risques (fausse route, lésions). Une habituation à la contention est recommandée. Pour les injections sous-cutanées et intrapéritonéales, l’emploi d’aiguilles fines, de volumes adaptés et l’alternance des sites limitent la douleur et les réactions locales. La voie intraveineuse nécessite un personnel formé afin de réduire les échecs et les lésions. Pour la voie topique, l’utilisation de formulations non irritantes est privilégiée. La voie la moins invasive sera choisie lorsque possible, avec une surveillance des sites d’administration afin de détecter toute réaction et d’adapter les pratiques si nécessaire. En cas de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par isoflurane suivie d’une méthode physique validée (dislocation cervicale). Enfin, tous les personnels intervenant sur le projet sont formés à la manipulation des animaux, aux procédures d’anesthésie, d’injection et de suivi clinique, conformément aux exigences règlementaires.
Choix des espèces
L’espèce choisie pour ce projet est la souris, qui constitue le modèle de référence pour l’étude des infections urinaires bactériennes. Ce modèle est largement documenté dans la littérature scientifique et présente une très bonne reproductibilité des infections. La physiopathologie de l’infection urinaire chez la souris reproduit de manière fiable les principales étapes observées chez l’Homme, notamment la colonisation de la vessie, l’ascension vers les reins et la réponse inflammatoire locale. La souris permet en outre de combiner des approches d’imagerie in vivo, des analyses moléculaires fines et des évaluations quantitatives de la charge bactérienne. Elle constitue donc un modèle robuste, validé et pertinent pour répondre aux objectifs de ce projet, en particulier pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-infectieux dans des conditions expérimentales proches de la physiologie humaine. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes, âgées de 6 à 12 semaines au moment de l’inoculation bactérienne. Ce stade de développement correspond à des animaux immunologiquement matures, physiologiquement stables, et adaptés à l’établissement reproductible du modèle d’infection urinaire utilisé dans cette étude.
Etude des mécanismes épigénétiques régulant la fonction gonadotrope hypophysaire au cours du cycle sexuel femelle en conditions physiologiques et pathologiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
240 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'unique geste répété est un frottis vaginal quotidien pendant deux semaines, précédé d'une semaine d'accoutumance à la contention. Le modèle retenu est la ratte Goto-Kakizaki, qui présente spontanément des traits proches du syndrome des ovaires polykystiques. Chaque animal est ensuite tué par décapitation sous sédation, afin de prélever l'hypophyse sans en modifier la composition.
Objectifs
L’infertilité est aujourd’hui une question majeure de santé publique. On estime qu’environ une personne sur six rencontre des difficultés à concevoir un enfant. Chez les femmes, la cause la plus fréquente est le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Cette maladie est liée à un déséquilibre des hormones qui contrôlent la reproduction, mais les mécanismes précis à l’origine de ce dérèglement restent encore mal compris. Chez les mammifères, y compris l’être humain, la reproduction est contrôlée par un système appelé axe gonadotrope. Ce système relie trois organes : l’hypothalamus dans le cerveau, l’hypophyse située à sa base et les gonades (les ovaires chez la femelle). Dans l’hypophyse se trouvent des cellules particulières appelées cellules gonadotropes. Elles jouent un rôle central dans la fertilité. Ces cellules reçoivent de nombreux signaux provenant de l’organisme et, en réponse, produisent deux hormones essentielles : la LH (hormone lutéinisante) et la FSH (hormone folliculo-stimulante). Ces hormones contrôlent le fonctionnement des ovaires et permettent le bon déroulement des cycles reproducteurs. Une perturbation du niveau de ces hormones dans le sang est d’ailleurs l’une des caractéristiques du SOPK. Comprendre précisément comment des défauts dans les cellules gonadotropes contribuent à l’apparition du SOPK reste difficile, car l’hypophyse est un organe complexe et les études réalisées sur des cellules isolées en laboratoire ne reproduisent pas toujours fidèlement ce qui se passe dans l’organisme vivant. Les nouvelles technologies permettant d’analyser les cellules une par une offrent cependant aujourd’hui la possibilité d’étudier beaucoup plus précisément le fonctionnement des cellules gonadotropes. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment l’équilibre hormonal qui contrôle la fertilité est régulé et comment il peut être perturbé dans des maladies comme le SOPK. Pour cela, nous utiliserons un modèle animal bien caractérisé, le rat Goto-Kakizaki, qui présente spontanément des caractéristiques proches de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre comment une cellule intègre une signalisation complexe afin de réaliser sa fonction dans un contexte physiologique. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la fonction gonadotrope et donc dans la régulation de la fertilité chez les mammifères. En étudiant les déregulations qui prennent place dans le modèle GK, les résultats de ce projet permettrera d’identifier de nouvelles causes génétiques des infertilités humaines, un sujet de préoccupation émergent dans nos sociétés modernes.
Procédures
Les frottis vaginaux seront réalisés sur des animaux vigiles, sans anesthésie, de façon quotidienne (une fois par jour, le matin entre 9 h 30 et 10 h) pendant deux semaines. Tous les animaux du projet sont concernés.
Impact sur les animaux
Ce projet ne fait intervenir qu’une étape, hors mise à mort, pouvant induire un inconfort : la réalisation des frottis vaginaux. Ceux-ci seront cependant réalisés par un personnel compétent qui veillera à réduire l’inconfort des animaux. Ce geste, quand il est réalisé dans les règles de l’art, ne prend que 20 secondes et n’induit pas de nuisance au-delà de l’acte de contention.
Devenir
Le prélèvement de l’hypophyse nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
La mise à mort fera intervenir une sédation profonde à l’isoflurane, suivie d’une décapitation. Nous utilisons cette méthode car, contrairement aux autres méthodes de mise à mort, elle n’induit pas de modifications majeures dans l’hypophyse.
Réduction
Comme indiqué si dessous, la robustesse des événements physiologiques programmant la fertilité femelle chez la ratte permet de limiter le nombre d'animaux necessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, les echantillons seront analysés par des methodes de pointe (signel cell multiome) permettant l'acquisition d'une grand nombre de donnée sur le même echantillon. Cela permet donc de réduire le nombre d'échantillon necessaire. Notre expérience passée démontre que trois hypophyses prélévées au même moment du cycle donnent une representation statistiquement fiable des evenements moléculaires qui se déroulent à ce moment précis.
Raffinement
Le projet ne fait pas intervenir de pratique invasive générant des dommages sur animaux vivants. Les frottis vaginaux necessitant toutefois une contention, les animaux seront accoutumés quotidienement à la contention et par simulation d’un frottis pendant une semaine avant le début des vrais frottis. .
Choix des espèces
Comme déja indiqué, le rat est une espèce de choix pour l'étude des processus de régulation neuro-hormonale de la fertilité femelle chez les mammifères de part : 1) la régularité des cycles sexuelles 2) par l'existence d'une bibliographie étendue sur le sujet. 3) l'existance du modèle GK de SOPK L’étude du cycle reproducteur femelle nécessite des animaux pubères. Nous utiliserons donc des rattes de 8 semaines.