Système urogénital
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Etude des mécanismes conduisant au développement de la cachexie rénale (EU ½)
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Gardées jusqu'à ce qu'elles développent une insuffisance rénale accompagnée d'un amaigrissement sévère, puis tuées pour analyse du sang, des urines et des organes, 1 636 souris vont être utilisées, dont 512 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui détériore leur fonction rénale ou reçoivent un régime au même effet, subissent des mesures toutes les deux semaines, jusqu'à sept jours seules en cage métabolique et des injections répétées jusqu'à deux fois par jour pendant quinze jours. Le porteur écrit que l'insuffisance rénale ne provoque ni douleur ni stress avant les stades avancés, stades que le projet cherche précisément à atteindre puisque la cachexie met plusieurs mois à s'installer. Il qualifie de légères toutes les nuisances listées, dans un projet où près d'un tiers des souris relève de la souffrance sévère.
Objectifs
La cachexie est un syndrome d’amaigrissement sévère et involontaire qui ne peut pas être corrigé simplement par une approche nutritionnelle, et qui réduit fortement la qualité et l’espérance de vie des patients. Elle touche souvent les patients à des stades avancés de maladies chroniques telles que le cancer, les maladies rénales, cardiaques et pulmonaires ou maladies infectieuses. Jusqu'à présent la plupart des études se sont concentrées sur la cachexie associée au cancer, les autres types de cachexie, et en particulier celle associée aux maladies rénales chroniques (MRC), ont été peu étudiées. Les maladies rénales constituent un grave problème de santé publique, puisqu'elles touchent plus de 850 millions de personnes et représentent l'une des dix principales causes de décès prématurés dans le monde. À un stade avancé de la maladie rénale, notamment chez les patients sous dialyse, un syndrome appelé cachexie rénale peut apparaître. Elle se caractérise par une perte de masse maigre et/ou grasse menant à une altération fonctionnelle des patients. Il n’existe aujourd’hui aucune norme de soin pour la cachexie rénale et une meilleure compréhension des altérations métaboliques menant à son développement représente un enjeu crucial. L’objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de la cachexie rénale. A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro qui permette de reproduire la complexité de la physiopathologie de la cachexie rénale, ce qui rend indispensable le recours à des modèles animaux pour appréhender les interactions biologiques complexes associées à cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
La cachexie rénale est un syndrome grave qui touche de nombreux patients atteints d’insuffisance rénale chronique. Elle réduit l’espérance de vie, entraîne une fatigue importante, des hospitalisations fréquentes, et rend difficile une vie sociale et professionnelle normale. Elle contribue donc au très fort impact économique des maladies rénales en Europe, qui est à la hauteur de 140 milliards d’euros par an. Ce projet de recherche vise à court terme à mieux comprendre la cachexie rénale et à développer des outils de diagnostic. À plus long terme, il pourrait mener à de nouveaux traitements, et ainsi améliorer la qualité de vie et la survie des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subiront des mesures de composition corporelle (3 minutes/animal), de force musculaire (5 minutes/ animal) et de fonction rénale (45 minutes/animal) au maximum toutes les 2 semaines à partir de l’âge de 6 semaines. Ces mesures se font chez les animaux vigiles et sont non-invasives, les animaux pourront cependant être anesthésiés pendant quelques minutes pour certains gestes techniques. Des prélèvements sanguins (2 minutes) seront réalisés sous anesthésie toutes les 2 semaines également. Les animaux seront mis en cages métaboliques une fois pendant une durée maximum de 7 jours. Certains lots d’animaux recevront des traitements : soit 3 injections par semaine pendant une durée maximale de 2 mois ; soit 2 injections par jour pendant une durée maximale de 15 jours ; soit une injection unique. Certains animaux seront mis sous régime particulier. Dans le second établissement utilisateur, seules les procédures terminales seront réalisées.
Impact sur les animaux
Certains animaux de sont porteurs d’une mutation génétique responsable du développement d’une maladie rénale chronique. Celle-ci provoque une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement, qui sont les critères recherchés dans notre projet. D’autres groupes d’animaux sont soumis à un régime alimentaire qui induit également une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement. Le poids des animaux et leur état général seront suivis attentivement. L’insuffisance rénale ne provoque pas de douleur, ni de stress avant des stades avancés au cours desquels une baisse de l’alimentation et une altération de l’état général peuvent apparaitre. Tous les animaux seront soumis à : (1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice-versa (2) prise de sang à la queue : léger stress et risque de saignement (3) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) (4) mesures du métabolisme : léger stress lié à l'isolement (7 jours au maximum) dans une cage individuelle (5) mesure de la fonction rénale: légère douleur liée à l’injection, et léger stress lié à la présence du capteur pendant 1h maximum (6) traitements pharmacologiques : léger stress dû à la contention + légère douleur liée à l’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
La cachexie est un syndrôme multifactoriel, initiée par le tissu affecté (ici le rein), qui va conduire à l’altération métabolique et à la dysfonction de nombreux tissus vitaux. Ces tissus vont à leur tour sécréter de nombreux médiateurs pro-cachectiques, initiant un cercle vicieux qui aggrave la fonte des tissus musculaires et adipeux. De telles interactions inter-tissulaires dans un contexte d’insuffisance rénale sont donc impossibles à reproduire in vitro. Une approche complémentaire ex vivo sur des cellules primaires en culture est également utilisée, elle permet d’obtenir une grande quantité de cellules à partir d’un nombre restreint d’animaux
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1636 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés, par groupes de 2 à 5 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement par les zootechniciens et plusieurs fois par semaine par les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être . Une grille de scoring et des points limites ont été établis. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (des anesthésiques et antalgiques seront utilisés pour les gestes qui le nécessitent, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale et la cachexie. Pour l’un des 2 modèles, nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines au début de l'expérience, afin d’effectuer des mesures en conditions basales avant tout amaigrissement et perte de fonction rénale. Pour l’autre modèle, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines au début du protocole. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. Nous garderons les animaux jusqu’à ce qu’ils aient développé une insuffisance rénale accompagnée d’une cachexie (processus se mettant en place sur plusieurs mois).
Évaluation de l’effet d’une thérapie ciblée sur le développement des lésions endométriales dans des modèles murins d’endométriose.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Ovariectomisées pour une partie d'entre elles, puis opérées pour recevoir un fragment d'utérus hors de l'utérus, 384 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent dix semaines d'injections hormonales hebdomadaires, des injections de traitement en intraveineuse, jusqu'à neuf échographies sous anesthésie et trois nuits de seize heures passées seules pour observer si elles construisent encore un nid. Le porteur décrit une douleur chirurgicale modérée mais prolongée, des douleurs abdominales pendant les semaines de développement des lésions et un stress supplémentaire lié à l'isolement nocturne. Des points limites déclenchent la mise à mort des souris dont la douleur n'a pas pu être corrigée, les autres étant tuées à la fin pour prélever les lésions.
Objectifs
L'endométriose est une maladie gynécologique inflammatoire qui touche plus de 10 % des femmes en âge de se reproduire (190 millions). Elle se caractérise par la présence anormale de tissus/lésions endométrial(e)s en dehors de l'utérus. Cette maladie touche plusieurs organes situés dans l’abdomen. Huit à dix ans sont généralement nécessaires afin de détecter cette maladie. L'endométriose a un impact considérable sur la qualité de vie des femmes et sur l'économie mondiale (environ 80 milliards de dollars par an). Les traitements disponibles actuellement servent uniquement à diminuer les symptômes mais ne soignent pas cette maladie. Dans certains cas, les lésions peuvent être retirées par chirurgie cependant 30 % des femmes opérées ont de nouvelles lésions dans les 5 ans post chirurgie. La progression de la maladie et de ces lésions endométriales se rapproche de ce qui est observé dans le développement des cancers comme le développement anarchique de cellules en dehors de leur organe d’origine. Récemment, une protéine connue pour son implication dans le développement du système nerveux a été identifiée pour jouer un rôle potentiel dans l’endométriose. Notre objectif est de tester un nouvel anticorps permettant de bloquer cette protéine et de voir les effets potentiels de ce traitement sur le développement des lésions endométriales.
Bénéfices attendus
En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Ce projet fait partie du consortium national de recherche sur l’endométriose (dans le cadre du PEPR Santé des femmes, santé des couples). Cette demande d’expérimentation a pour objectif de tester l'efficacité d’une nouvelle thérapie afin d’améliorer le bien-être des femmes atteintes d’endométriose et également d'accroître les connaissances sur cette maladie.
Procédures
Les animaux subiront 1 ou 2 interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie parmi elles ; pour une partie des souris une ovariectomie (20 min/souris) qui vise à retirer les ovaires afin de contrôler la production d’hormones sexuelles, et pour toutes les souris une intervention permettant d’induire l’endométriose (selon 2 méthodes d’induction différentes ; soit la première 5 min/souris, soit la deuxième 15-20 min/souris). Les souris ovariectomisées recevront une injection hebdomadaire d’hormone en sous-cutanée pendant 10 semaines. Les injections sous-cutanées nécessitent une contention d’environ 30 secondes et les injections intraveineuses (pour les traitements) une contention de maximum 2min. Les souris subiront un test de comportements spontané pour lequel elles seront individualisées sur une nuit (16h) afin de voir leur capacité à former un nid reflétant leur bien-être. Ce test sera réalisé 3 fois au total.
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les procédures chirurgicales mais les douleurs post-chirurgies sont diminuées par la mise en place d'une analgésie spécifique et d’un suivi fréquent permettant de l’ajuster en cas de besoin. L'anesthésie des animaux peut entrainer une détresse légère et une courte hypothermie. La chirurgie peut entrainer une douleur modérée mais prolongée. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées et des traitements (injections sous-cutanées et/ou intraveineuses) et le suivi du développement des lésions par échographie (au maximum 9 fois). Ces manipulations peuvent entraîner du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil). Durant les semaines de développement de la maladie, il est possible que des douleurs abdominales apparaissent également. Les souris subiront un test de comportements spontané pour lequel elles seront individualisées sur une nuit (16h) pouvant induire un stress supplémentaire et ce test sera réalisé 3 fois (au départ puis sur les dernières semaines de suivi avec 1 semaine d’intervalle).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose et comparer les différents groupes de traitements.
Remplacement
L’endométriose est une maladie qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires entre organes. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence de tissu endométrial en dehors de l’utérus. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie dans un contexte « corps entier » en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif en culture cellulaire ou autre.
Réduction
Le nombre de groupes et l’effectif de chaque groupe d’animaux ont été réduits au maximum, en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques. Les observations sur la taille et le volume des lésions endométriales et l’amélioration du bien-être des animaux seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées, avec des groupes de 12 souris chacun. Les tests utilisés permettent de vérifier si le traitement a un effet réel sur le développement des lésions. La procédure est séparée en 2 lots d’animaux, le second lot ne sera réalisé que dans le cas où le premier lot a montré un effet sur le développement des lésions ou le bien être des animaux.
Raffinement
Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi post-opératoire etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au- delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Les procédures de chirurgie et les injections sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec anesthésie et analgésiques adaptés dès que nécessaire. Des mesures de confort sont mises en place : éléments de nidification supplémentaires, tapis chauffant pendant l’anesthésie, nourriture semi- liquide en cas de perte de poids, gel protecteur pour les yeux, et enrichissement des cages après les injections.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet, plus de 98% de ses gènes sont identiques à ceux de l’homme. Cette proximité physiologique et génétique permet de récapituler les évènements cellulaires observés chez l’homme et donc de l’utiliser comme modèle d’étude. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de celles observées chez les patientes atteintes d’endométriose. De plus, la protéine étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine de cette protéine et la forme murine, justifiant encore l'usage des souris. Les souris utilisées dans ce projet sont des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.
Développement d’un protocole d’immunothérapie de l’endométriose
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
7 254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines pouvant recevoir jusqu'à sept administrations de traitement par semaine. Une partie subit une castration, puis une chirurgie d'implantation destinée à reproduire une endométriose, dont les lésions peuvent provoquer des douleurs abdominales pendant les 63 jours de la procédure. S'y ajoutent un prélèvement sanguin hebdomadaire et jusqu'à trois tests comportementaux par animal, dont un test d'hypersensibilité viscérale et une mesure de la capacité à faire son nid qui suppose quinze heures d'isolement. Le calcul d'effectif cité aboutit à dix souris par groupe pour des expériences reproduites deux fois, sans que le passage à 7 254 animaux soit expliqué.
Objectifs
Ce projet a un objectif principal : mettre au point un protocole d’immunothérapie de l’endométriose. Il permettra aussi de mieux comprendre l’importance de la composante immunitaire dans les mécanismes qui conduisent à l’endométriose.
Bénéfices attendus
L'endométriose est un trouble œstrogèno-dépendant fréquent chez les femmes en âge de procréer (10%). Cette pathologie se caractérise principalement par la présence de tissu endométrial à l'extérieur de l'utérus. Bien que les mécanismes qui conduisent à l’endométriose (pathogénèse) ne soit pas complètement décrits, on sait que le système immunitaire joue un rôle central dans son étiologie, sa pathophysiologie et les morbidités associées de douleur, d'infertilité. Il est maintenant admis que l'endométriose est une maladie inflammatoire chronique. Nous avons montré que cibler la réponse immunitaire peut diminuer l’installation et le développement des lésions. Nous avons identifié plusieurs médicaments en cours de développement dans des protocoles d’immunothérapie antitumorale qui pourraient permettre de moduler la réponse immunitaire et ainsi induire la disparition des lésions d’endométriose. L’objectif de ce projet est donc de developper un protocole de traitement et définir l’impact des traitements sur l’initiation et le développement des lésions d’endométriose, sur les cellules immunitaires et sur la douleur induite par l’implantation et le développement des lésions. Dans un deuxième temps et en fonction de toutes les premières observations, nous définirons les meilleurs protocoles d’administration de ces molécules dans le traitement de l’endométriose. Pour tout ce projet, nous utiliserons un modèle expérimental de référence déjà décrit dans la littérature et maîtrisé dans notre laboratoire. Globalement, ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’origine et le développement de l’endométriose. Ces mécanismes pourraient être exploités pour découvrir d’autres pistes thérapeutiques innovantes.
Procédures
Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris -Chirurgie pour modélisation de l'endométriose sous anesthésie générale (injection 30 sec)- des administration de traitement (durée moins de 1 min) au maximum 7 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure -des tests comportementaux: test du niveau d'anxiété 10 minutes, une fois par semaine, test des comportements compulsifs: 30 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité, 5 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité viscerale, 5 minutes une fois par semaine, capacité à faire son nid (représentatif de la douleur) 15h d'isolement, une fois par semaine. Tous les animaux ne seront pas soumis à tous les tests comportementaux (pas plus de trois tests par animal).
Impact sur les animaux
Une partie des animaux subira une castration. Les animaux récupèrent parfaitement de cette opération. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires (48 h maximum). Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires (moins de 5 minutes) au point d’injection. La croissance des lésions d’endométriose peut induire des douleurs abdominales pendant toute la durée de l'expérience (63 jours maximum). Ces douleurs potentielles seront évaluées quotidiennement par observation du comportement des souris dans les cages et avec des tests comportementaux. En cas de douleur, les souris recevront un analgésiant. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections) (durée maximum 5 minutes). les injections hebdomadaires peuvent induire un stress transitoire lié à la contention, une douleur brève au point d’injection (5 minutes maximum) et, occasionnellement, une réaction inflammatoire locale modérée (24h maximum). Les effets systémiques attendus sont limités aux variations physiologiques liées à la stimulation hormonale, sans altération durable de l’état général lorsqu’elles sont administrées aux doses usuelles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure
Remplacement
Les réponses immunes dans l’endométriose sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (l ésions, liquide péritonéal et ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées/reproduites in vitro.
Réduction
Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons analysé les résultats déjà obtenus sur ce projet et nous avons réalisé un calcul d'effectif avecun logiciel qui aide à calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour une expérience en se basant sur des études statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. Ce calcul nous a donné une valeurs de 10 souris par groupe Les expériences seront reproduites 2 fois (5 souris par groupe et par expérience). Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (matériel permettant la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du sérum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Une molécule permettant l'anesthésie locale sera administrée en intradermique au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures (injection intraveineuse d'une molécule analgésique). Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les acteurs de la réponse immunitaire chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site d’implantation des lésions ou dans les organes lymphoïdes). Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines d’âge correspondant à un système immunitaire fonctionnel
Effets d’un morphinique sur la fonction rénale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Pour caractériser les effets rénaux d'un morphinique que les protocoles d'expérimentation recommandent comme antidouleur, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des travaux antérieurs de la même équipe avaient relevé une baisse d'environ vingt pour cent de la filtration rénale et une hausse de la mortalité après opération. Toutes reçoivent deux injections sur animal vigile puis deux mesures de fonction rénale sous anesthésie générale, et une partie subit une chirurgie de 90 à 120 minutes pour la pose de deux cathéters, avec risque d'hémorragie et d'arrêt cardiorespiratoire. Douze souris sont tuées pour dosages, les 48 autres réutilisées ailleurs au motif qu'elles n'auront subi que des mesures qualifiées de non invasives.
Objectifs
Des travaux antérieurs ont mis en évidence que l’administration préopératoire d’un morphinique, à des doses usuellement considérées comme faibles et recommandées en expérimentation animale dans les protocoles douloureux, induisait une diminution de la fonction rénale (capacité du rein à filtrer le sang) en conditions physiologiques normales chez le rat et la souris. Plus spécifiquement, la capacité de filtration du rein ou débit de filtration glomérulaire mesurée de manière non invasive était diminué d’environ vingt pour cent par rapport aux valeurs normales habituellement constatées. Ces observations suggèrent que le morphinique pourrait exercer, en conditions physiologiques normales, des effets directs sur le rein, indépendamment de toute pathologie. D’autre part, dans des modèles de maladies rénales, nous avons observé une hausse de la mortalité post opératoire avec les mêmes doses administrées plusieurs fois au cours des premiers jours. Dans le but de mieux appréhender les implications de l’utilisation de morphinique dans nos protocoles expérimentaux futurs, il apparaît essentiel de caractériser plus finement ses effets sur la fonction rénale dans un contexte physiologique sain. Trois axes principaux seront explorés dans cette étude : 1. Effet dose-dépendant du morphinique sur la fonction du rein Évaluer l’impact de doses croissantes sur le débit de filtration glomérulaire, reflet de la capacité de filtration du rein, chez la souris. 2. Cinétique des effets du morphinique sur la fonction du rein Étudier la dynamique temporelle des effets du morphinique sur la fonction rénale, afin de déterminer la durée et l’intensité des effets. 3. Effets du morphinique sur la pression artérielle et le débit sanguin rénal
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces données permettra d’identifier les mécanismes par lesquels le morphinique influence la fonction rénale en l’absence de pathologie. Elles contribueront également à affiner les conditions expérimentales futures, afin de réduire les biais pharmacologiques des projets de recherche dans le domaine des maladies rénales.
Procédures
Tous les animaux recevront deux injections de morphinique, administrées à l’état vigile. Chaque injection dure environ 10 secondes. Une partie des animaux recevra deux injections supplémentaires destinées à induire une anesthésie locale. Tous les animaux seront soumis à deux mesures de la fonction rénale à une semaine d’intervalle, impliquant l’injection du traceur fluorescent sous anesthésie générale, suivie de la pose d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal. Cette première étape dure environ 5 minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie générale sera pratiquée pour retirer le capteur, cette intervention ne durant que 2 minutes. Une partie des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et locale. Cette procédure consiste à poser deux cathéters afin de mesurer la pression artérielle et le débit sanguin rénal. La durée totale de cette intervention est estimée entre 90 et 120 minutes. Une partie des animaux sera euthanasiée à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. L’autre partie sera réutilisée.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent être générées par : 1.Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Les injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation. 2. La chirurgie pour les mesures de pression artérielle peut provoquer des douleurs et entraîner des saignements / hémorragies. 3. Les complications liées à l'anesthésie générale au moment de la chirurgie vasculaire et de la mesure de la fonction rénale : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.
Devenir
Afin d’effectuer des dosages et analyses spécifiques, douze animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les 48 autres seront réutilisées car elles n’auront reçu que deux injections de morphinique et auront eu deux mesures de fonction rénale non invasive.
Remplacement
Le rein est un tissu complexe, qui comporte des dizaines de types cellulaires. Les organoïdes rénaux ne sont pas encore optimaux, notamment car il est encore impossible d'y réaliser une circulation sanguine. Ils ne permettent pas de mesurer la fonction rénale, c'est-à-dire la fonction de filtration du sang par le rein. Or, ce paramètre est le critère majeur de la caractérisation de l'effet du morphinique sur le rein. Les mesures de pression artérielle ne peuvent être envisagées que sur un modèle in vivo.
Réduction
Du fait de la simplicité du modèle et du caractère pilote de l’étude, des lots de 6 animaux sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux. Les expériences seront renouvelées une fois de manière indépendante. Pour les mesures de pression artérielle, deux lots indépendants de 6 souris suffiront à mettre en évidence les effets potentiels du morphinique en aigu. Nous utiliserons des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux est de 60 souris dont 48 qui seront réutilisées.
Raffinement
1. Raffinement de l’hébergement et de la surveillance Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Le bien- être des animaux est également assuré par plusieurs types d’enrichissements. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. 2. Raffinement pour les injections Les injections sont réalisées à l’état vigile avec une aiguille très fine qui limite les risques hémorragiques et la douleur. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. 3. Raffinement pour la mesure de la fonction rénale : Après anesthésie générale, les souris sont placées sur un plateau chauffant. Après application d’une goutte d’anesthésique local, les injections du traceur sont réalisées avec une aiguille très fine qui va limiter les risques hémorragiques. Le site d’injection est alterné d’une mesure à l’autre. Un gel ophtalmique est appliqué ensuite pour atténuer la gêne après l’injection. Le produit utilisé comme traceur est parfaitement toléré, il appartient à la famille des sucres. Les souris sont placées dans une couveuse à 28 degrés Celsius , installée dans une pièce d'expérimentation de l'animalerie dans des cages individuelles pour ne pas risquer d'abimer le dispositif de mesure. Les souris ont accès à l'eau et à la nourriture. Les cages individuelles sont toutes placées dans la couveuse. A la fin de la mesure, les animaux sont remis dans leur cage initiale en respectant bien les groupes initiaux avec le même enrichissement. 4. Raffinement pour les mesures de pression artérielle et de débit sanguin rénal L’antalgie pré opératoire est assurée par des injections d’un anesthésique local aux sites d’incisions, dix minutes avant. La préparation chirurgicale pour la pose des cathéters et de la sonde rénale dure environ 30 minutes. Le morphinique injecté en bolus viendra prendre le relais de l’antalgie jusqu’à l’euthanasie finale après une heure d’enregistrement. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant pour mieux tolérer l’anesthésie. Une perfusion continue de sérum physiologique permet d’assurer la stabilité pendant toute la durée de l’expérience.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce utilisée dans ce projet. Elle constitue le modèle animal de référence pour la majorité de nos projets. Bien que des résultats similaires aient été observés antérieurement chez le rat et la souris, l’utilisation exclusive de la souris est suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le recours à une seconde espèce n’apporterait pas de bénéfice scientifique supplémentaire. Ce choix permet d’assurer la cohérence et la comparabilité des données avec les projets existants, tout en respectant le principe de Réduction en évitant l’utilisation d’une espèce animale supplémentaire. Pour toutes les procédures, les souris sont âgées entre 9 et 12 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système glomérulaire mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Sur 1 008 souris nées pour ce projet, 408 seront tuées pour "régulation de population" faute du bon profil génétique, 100 gardées pour la reproduction, 100 réutilisées pour l'apprentissage des gestes techniques, et 400 tuées après six heures de jeûne pour le prélèvement des reins, de l'intestin et du foie. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 608 d'entre elles, modéré pour 240 et sévère pour 160. Ce second établissement les accueille chaque mois à partir de six mois pour une IRM des reins sous anesthésie d'environ trente minutes, avant leur retour par la route. Le porteur décrit la souris comme "la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible", au motif que sa régulation du sucre ressemble à celle des humains et que les anticorps adaptés existent déjà au laboratoire.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet.
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence.
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée; courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance. Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales.Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement.Les souris seront habituées à la contention au préalable. L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie, la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil. Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Biopsiées à l'oreille à sept jours, les souris subissent ensuite jusqu'à vingt prises de sang et vingt prélèvements d'urine, des trajets mensuels en voiture vers un second établissement et des IRM sous anesthésie d'une trentaine de minutes, jusqu'à l'âge de quinze mois. 1 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 608, modéré pour 240 et sévère pour 160. Seules 400 suivront le protocole complet : les 408 restantes, nées sans le bon profil génétique, seront tuées pour "régulation de population", 100 seront gardées pour la reproduction des lignées et 100 autres utilisées pour entraîner les zootechniciens aux prises de sang. Le porteur affirme que le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être des animaux non-humains, et décrit dans le même paragraphe une perte de poids, une prostration, une baisse du toilettage et des douleurs liées aux tumeurs du rein.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress.
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée;courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance.Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales. Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement. Les souris seront habituées à la contention au préalable.L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux dans des cages spécifiques. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie,la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil.Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Etude du rôle d’un gène impliqué dans le développement embryonnaire précoce
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent un traitement de superovulation, subissent une anesthésie de trois minutes avec un risque d'hypothermie, puis sont tuées pour que leurs ovules soient récoltés. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle d'un gène de la méthylation de l'ADN dans le développement embryonnaire précoce, dont l'absence réduit le réservoir ovarien et rend les femelles stériles. Le porteur affirme qu'aucun protocole ne permet d'étudier ce développement in vitro à partir d'ovules fécondés.
Objectifs
La méthylation de l'ADN est une modification chimique pouvant réguler l’expression des gènes sans modifier la séquence d’ADN. Ces modifications chimiques sont des groupements « méthyles » qui peuvent être ajoutés sur l’ADN et qui peuvent modifier la manière dont est perçu l’information génétique. Nous pourrions comparer la méthylation de l’ADN à la ponctuation d’une phrase. Prenez par exemple la phrase : « On va manger, mami ! ». Si vous enlevez la virgule et remplacer le « ! » par une « . » la phrase n’a plus du tout la même signification (On va manger mami.). Chez les mammifères, la méthylation de l’ADN peut induire une répression stable des gènes de façon réversible. En effet, il est important d’exprimer les gènes embryonnaires au bon stade du développement et pas à l’âge adulte. Ainsi, cette modification a des fonctions régulatrices importantes au cours du développement embryonnaire et gamétique et est transmise à travers les générations. Une altération de ces profils de méthylation est observée dans les cadres de cancers et autres maladies. L’objectifs de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’un nouvel acteur de la méthylation de l'ADN sur le développement embryonnaire précoce. En effet, des résultats préliminaires démontrent que son l’absence de ce gène conduit à une hypofertilité chez les femelles avec une réduction du réservoir ovarien ainsi qu’une stérilité (pas de naissance). Les données obtenues au cours de ce projet pourront avoir des retombées pour mieux comprendre l’infertilité humaine puisque ce gène est conservé chez l’être humain.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre le rôle d'un gène dans le développement des ovocytes et de mettre en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires qui régulent la fertilité et le développement embryonnaire chez la souris. L’objectif final de ce projet est de transposer nos résultats à l’homme dont les problèmes d'infertilité sont en constante augmentation et constituent un enjeu de santé publique majeur. En effet, ce gène étant conservé chez l’être humain, il serait envisageable d’utiliser ce dernier soit comme outils de diagnostic, soit comme nouvelle cible thérapeutique dans le cadre de la procréation médicalement assistée pour des maladies tel que l’IOP (Insuffisance ovarienne prématurée, prévalence de 1/10 000 chez les femmes de moins de 20 ans, 1/1 000 chez les femmes de moins de 30 ans et 1% chez les femmes de moins de 40 ans).
Procédures
Les animaux recevront deux injections espacées de 48h sous anesthésie. L'injection dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Il y a un risque d’hypothermie des animaux bien que l’anesthésie soit de courte durée (~3min).
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les ovules.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de protocole pour étudier le développement embryonnaire in vitro à partir d’ovules fécondés. C’est pourquoi nous effectuerons nos expériences sur des échantillons primaires isolés de souris.
Réduction
Le protocole de superovulation permet de stimuler la production d'ovocytes et donc de réduire le nombre de femelles utilisées. L’utilisation du protocole de culture in vitro d’embryons à la suite du protocole de superovulation permet d'étudier tous les stades de développement embryonnaire précoce et tardif simultanément pour un nombre significatif d’embryons. Ceci limite fortement le nombre de femelles utilisées par rapport à une approche in vivo qui nécessiterait de sacrifier des femelles à chaque stade de développement embryonnaire.
Raffinement
Les souris seront élevées en groupe dans des cages aux normes européennes et enrichies (maison, tube en carton, bâton en bois, frisures en carton pour la nidification…). Les enrichissements permettront : -de réduire le stress des animaux au cours de l’élevage en répondant à leur besoin de nidification et de cachette (maison, tube, frisures en carton) -de combler leur besoin de ronger/user leur dent afin de palier à la croissance continue de leurs incisives (bâton en bois) L’environnement et le bien-être des animaux seront vérifiés quotidiennement. Nous avons également établi des points limites afin d’atténuer la souffrance ou/et le stress des animaux. Dès lors que nous observerons un point limite, en fonction du degré de sévérité et de sa durée, soit nous soignerons l’animale, soit nous le mettrons à mort.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est justifié par les éléments suivants : (i) La méthylation de l’ADN est absente chez les modèles invertébrés tels que la levure, la drosophile (mouche du vinaigre) et le nématode (ver), (ii) les fonctions biologiques sont très conservées entre la souris et l’homme. (iii) la souris offre de nombreux modèles génétiques déjà existant, ce qui justifie son utilisation comme modèle d’étude. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris femelles âgées de 4 semaines pour la récolte d’ovules car il s’agit de l’âge auquel les femelles répondent le mieux à la stimulation hormonale.
Prolifération cellulaire saisonnière hypothalamique : analyse du rôle biologique sur la fonction de reproduction chez le hamster syrien et évaluation du mécanisme d’action de la mélatonine chez la souris-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
Hamsters dorés : 452
Transférés en photopériode courte puis hébergés seuls jusqu'à la fin de la procédure, les hamsters syriens subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale, puis chaque semaine une mesure de la taille des testicules et un prélèvement sanguin, certains passant en plus des tests de mémoire et d'olfaction d'une semaine chacun. 452 hamsters syriens et 120 souris vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les hamsters et léger pour les souris, tous tués à l'issue. L'ensemble sert à établir le rôle de la prolifération cellulaire de l'hypothalamus dans la reproduction saisonnière, les souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine étant utilisées pour situer le point d'action de l'hormone. Le texte annonce la mise à mort de 540 animaux, soit 452 hamsters et 88 souris, quand la déclaration porte sur 120 souris, écart de 32 individus qu'aucune ligne n'explique.
Objectifs
Il est bien établi que les variations des concentrations de mélatonine nocturne permettent l’intégration des saisons au niveau de l’hypothalamus, une zone cérébrale connue pour contrôler la fonction de reproduction. L’hypothalamus comprend des cellules gliales spécifiques bordant le 3ème ventricule, appelées tanycytes, qui jouent un rôle important dans la physiologie saisonnière et dans la prolifération cellulaire. De récents résultats de l’équipe, obtenus chez le hamster syrien (rongeur saisonnier) indiquent que le nombre de cellules néoformées augmente rapidement après le transfert en photopériode courte (hiver, période de l’année où la durée du jour est plus courte que celle de la nuit). Cette augmentation de la prolifération cellulaire en photopériode courte a été préalablement observée chez une autre espèce saisonnière, la brebis et il a été montré qu’elle participait à la synchronisation saisonnière de la fonction de reproduction. La brebis se reproduit en photopériode courte (automne/hiver), contrairement au hamster qui se reproduit en photopériode longue (printemps/été), ce qui interroge sur le rôle de la prolifération cellulaire hypothalamique sur la fonction de reproduction du hamster. De plus, nous avons récemment observé que l’augmentation de la durée de production nocturne de mélatonine en photopériode courte entraine l’augmentation de cellules néoformées dans l’hypothalamus. De plus, notre étude montre également que la mélatonine n’agit pas classiquement via l’hormone thyroïdienne (T3) intra-hypothalamique, suggérant qu’elle pourrait agir directement via ses récepteurs MT1 et/ou MT2 , pour contrôler la prolifération cellulaire. Pour vérifier notre hypothèse d’un effet direct de la mélatonine, il est nécessaire d’utiliser des animaux génétiquement modifiés, présentant des mutations pour les récepteurs à la mélatonine (MT1 et/ou MT2), ce qui est possible uniquement chez la souris. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez le hamster syrien le rôle biologique de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus sur la synchronisation saisonnière de la reproduction, et d’établir chez la souris les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire saisonnière. MODIFICATION : La production des souris mutées MT2 s'est avérée compliquée et l'âge des animaux s'en est trouvé très variable. Or l'âge des animaux impacte la neurogenèse. La modification porte sur l'ajout de 32 souris d'âge homogène afin de reproduire une des études du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à mieux comprendre d’une part, les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire hypothalamique, et d’autre part le rôle biologique de cette prolifération cellulaire saisonnière sur le contrôle annuel de l’activité de reproduction chez un mammifère saisonnier. En effet, la neurogenèse (formation de nouveaux neurones) chez les mammifères adultes est un sujet de recherche assez récent, c’est pourquoi la recherche des facteurs environnementaux influençant cette neurogenèse, comme ici les saisons, est nécessaire à la compréhension des mécanismes et du rôle biologique de celle-ci dans le cerveau adulte. Par ailleurs, ces travaux ont des implications cliniques car de plus en plus d’études montrent l’impact physiologique des saisons chez l’humain. Une étude a montré que les concentrations circulantes d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance varient selon les saisons. L’étude des mécanismes d’intégration des saisons dans le système nerveux central est donc indispensable pour comprendre comment les différentes espèces, dont l’humain, s’adaptent aux cycles annuels de leur environnement.
Procédures
Les hamsters pourront être soumis à une procédure chirurgicale (d’une durée d’environ 2h00) effectuée sous anesthésie générale. La mesure de la taille des testicules et le prélèvement de sang des hamsters seront effectués sous anesthésie générale à la fréquence d'une fois/semaine sur la durée de la procédure. Chaque geste durera environ 2-3 minutes par animal. Certains hamsters seront soumis à des tests comportementaux (1 à 2 fois) afin d’évaluer la mémoire et l’olfaction (durée d’1 semaine pour chaque type de test). L’hébergement en cage individuelle aura lieu suite au transfert en photopériode courte jusqu’à la fin de la procédure expérimentale. La totalité des souris et certains hamsters seront soumis à une injection sur animal vigile, une seule fois, 24 heures avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’intervention chirurgicale est jugée douloureuse et inflammatoire, et donc entrainer une perte de poids post-opératoire ; 2) la préhension de l’animal afin d’effectuer les injections intrapéritonéales pourra engendrer un stress et une irritation de la zone injectée ; 3) les prélèvements de sangs récurrents pourront induire une irritation, une douleur légère, des ecchymoses, une hémorragie, une compensation temporaire via le membre opposé pour se déplacer ou une infection ; 4) les tests comportementaux peuvent induire un stress aigu.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 540 animaux, soit 452 hamsters syriens et 88 souris. Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus et organes pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps. Par conséquent ce projet ne peut pas être réalisé chez des invertébrés, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques. Dans ce contexte nous ne pouvons pas proposé d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l’aide des tests statistiques appropriés. Les études préparatoires sont mises en place afin de maitriser et d’améliorer les gestes techniques ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux dans la procédure en elle-même. Dès que l’expérience s’y prête, un suivi longitudinal a été privilégié. C’est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs semaines, cela permet une réduction du nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les hamsters et les souris seront hébergés en groupes sociaux ou seront isolés, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress, les cages seront enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et avec apport d’eau et de nourriture à volonté et un tunnel. Ce tunnel sera utilisé pour déplacer les animaux lors du change ou pour capturer l’animal. Après leur arrivée à l’animalerie, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, ils seront manipulés quotidiennement pendant 1 semaine avant le début des procédures expérimentales. Toute procédure invasive est réalisée sous anesthésie/analgésie et après entrainement au geste technique. Tous les animaux seront observés et pesés hebdomadairement. Des points limites ont été établis afin de d’identifier les animaux en souffrance et de pouvoir les y soustraire.
Choix des espèces
Le hamster syrien est un modèle de rongeur saisonnier dont les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la physiologie saisonnière sont largement étudiés. De récents résultats ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique induite par un transfert en photopériode courte (hiver). Par conséquent, il est opportun d’utiliser la même espèce pour analyser le rôle biologique de cette prolifération saisonnière, d’autant que nous maitrisons les procédures expérimentales proposées chez cette espèce. Des injections quotidiennes de mélatonine pendant 1 semaine augmentent la prolifération cellulaire hypothalamique chez le hamster. La détermination de sites d’action de la mélatonine nécessite des individus mutés pour les récepteurs de la mélatonine. Comme nous ne disposons pas de ces outils génétiques chez le hamster, nous utiliserons des souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine. Pour cette étude, nous utiliserons des hamsters syriens jeunes adultes (3-8 mois), et des souris mâle jeunes adultes (7-8 semaines), période où la maturité sexuelle est optimale.
Etude du rôle du récepteur ERa sur la fonction endothéliale lymphatique. MODIFICATION. EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
Cinq jours d'injections quotidiennes, une échographie de vingt minutes sous anesthésie, une chirurgie de quinze minutes, une injection de cellules tumorales, trois mesures de composition corporelle par RMN sur animal éveillé, deux gavages suivis de huit puis quatre prélèvements sanguins à la queue : 530 souris femelles enchaînent ces actes entre cinq et vingt-deux semaines d'âge, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La dernière étape, une lymphographie sous anesthésie générale, se termine sans réveil. Le projet cherche le rôle des œstrogènes dans le lymphœdème et la dissémination métastatique, maladie que le porteur décrit comme incurable et touchant majoritairement les femmes. Toutes les souris sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour récolter les tissus.
Objectifs
Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. L’AJOUT DE DEUX TECHNIQUES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ (MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE ET TEST DE TOLÉRANCE ORALE AUX LIPIDES).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateurs seront réalisées les procédures suivantes : dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). TROIS FOIS AU COURS DU PROTOCOLE, UNE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, un test de tolérance au glucose et UN TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE SERONT RÉALISÉS, ESPACÉS DE DEUX JOURS. LA COMPOSITION CORPORELLE SERA ÉVALUÉE PAR RMN (MINISPEC, BRUKER) CHEZ DES SOURIS ÉVEILLÉES (2 MINS). LES TESTS DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET LIPIDES IMPLIQUENT UN GAVAGE (20 SEC), SUIVI DE PRÉLÈVEMENTS SANGUINS SÉQUENTIELS À LA QUEUE (8 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET 4 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE). Dans le second établissement utilisateur, les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place. LE MINISPEC PEUT PROVOQUER UN STRESS LÉGER ET TEMPORAIRE DÛ AU CONFINEMENT. LE GAVAGE PEUT CAUSER UN STRESS TEMPORAIRE, UNE LÉGÈRE IRRITATION DE L’ŒSOPHAGE ET UN RISQUE D’ASPIRATION, AVEC UN RISQUE MINIME DE LÉSIONS SI LA TECHNIQUE EST CORRECTE.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet
Remplacement
Les effets pleiotropies des oestrogenes, synthetisees majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.
Réduction
Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement
Raffinement
Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car c’est le seul modele pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de metastases ou l'apparition du lymphoedeme secondaire apres curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation genique du recepteur aux oestrogenes ERα a ete genere seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant a une invalidation du ERα de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 22 semaines
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 7000
660 000 souris et rats sont élevés pour être livrés aux laboratoires porteurs de la mutation voulue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 535 000 d'entre eux et modéré pour 125 000. Chacun peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue pour vérifier son génotype, jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour et une injection d'hormone destinée à activer sa mutation. Une partie part vers d'autres établissements, le reste est mis à mort, ces animaux appartenant au scientifique et ne pouvant, selon le porteur, être replacés. Il annonce une hausse d'environ 10 % des effectifs et indique que les scientifiques s'engagent par écrit à l'absence de solution de remplacement, l'objectif affiché étant de leur livrer le "modèle parfaitement adapté" à leurs expérimentations.
Objectifs
Ce projet consiste à maintenir des lignées de rongeurs dont certains gènes ont été modifiés. Ces modifications peuvent provoquer chez les animaux des changements visibles ou des symptômes particuliers, appelés phénotypes. L’objectif est d’observer ces animaux, de comprendre si la mutation génétique a un impact sur leur santé et leur bienêtre, et d’ajuster la manière dont ils sont suivis et soignés en fonction de ces observations. Ces animaux sont utilisés comme modèles dans la recherche scientifique, par exemple pour mieux comprendre des maladies génétiques comme la mucoviscidose, l’hémophilie ou certaines myopathies, et contribuer au développement de nouveaux médicaments. Pour savoir si un animal porte réellement la mutation recherchée, on effectue une biopsie, généralement en prélevant un morceau d’oreille. Ce prélèvement sert à extraire l’ADN et à vérifier si la mutation est présente. Cela est indispensable, car dans une même portée, tous les animaux ne sont pas forcément porteurs, et il faut pouvoir identifier précisément ceux qui seront utiles pour les recherches et garantir la fiabilité des résultats. Lorsqu’une nouvelle lignée génétiquement modifiée arrive ou est créée, et que l’on ne connaît pas encore les effets de la mutation, une phase d’observation détaillée est mise en place pour comprendre comment celleci influence l’animal et s’assurer que son bienêtre est préservé. Lorsque les effets de la mutation sont déjà connus, le suivi et les soins sont adaptés directement, en surveillant les éventuels signes cliniques et en mettant en place des mesures de prévention ou de traitement si nécessaire. Pour certaines lignées, la mutation ne s’exprime que lorsque l’animal reçoit une substance déclenchante, par exemple une hormone, ce que l’on appelle un ligand. Une administration peut donc être réalisée afin d’activer la mutation et de permettre à l’animal de manifester les caractéristiques liées à cette modification génétique. Dans l’ensemble du projet, environ 660 000 animaux sont concernés, avec une augmentation d’environ 10 % liée à une utilisation croissante de ces modèles. Ils sont répartis dans 500 à 600 projets de recherche différents. Parmi ces projets, environ 35 % portent sur des lignées génétiquement modifiées, pour lesquelles les animaux font l’objet d’une attention particulière en matière de suivi et d’évaluation des phénotypes, afin d’anticiper et de limiter au maximum l’impact potentiel de la mutation sur leur bienêtre.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait dû être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptées à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le modèle parfaitement adapté pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis (par animal) : à 1 à 2 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique : un prélèvement par animal à la queue maximum) (maximum 4 biopsies sur validation par l’équipe vétérinaire), acte d’une durée maximale de 2sec par biopsie. à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de max 3sec. à une injection d’un ligand, acte d’une durée maximale de 10sec par injection. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite).
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité innatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dus à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergés et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur génétiquement altéré quand il est accouplé avec des animaux non génétiquement altéréesafin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, n’est utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypage. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européennes (au moins 7 animaux de chaque sexe et génotype, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés au suivi vétérinaire des animaux. Pour les lignées à phénotype dommageable, des observations cliniques plus fréquentes et spécifiques, avec des points limites, peuvent être mises en place. Pour limiter la douleur, une euthanasie pourrait être demandée à un point limite ou âge précis pour éviter l’expression du phénotype. Cela est évalué lors de la caractérisation du phénotype, en lien avec le scientifique et les vétérinaires. Les observations sont facilitées par des outils internes comme des grilles de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype, des points d’intervention sont adoptés pour un suivi précis et des soins adaptés (soutien nutritionnel…). Si des signes cliniques peuvent être atténués ou guéris par traitement, avec accord du scientifique, le traitement est mis en place. Les animaux présentant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final pour assurer leur réception et utilisation selon les normes éthiques et de bien-être animal.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement altérés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5 jours après la fécondation.
Evaluation de la capacité d’une hormone recombinante à induire des ovulations fertiles chez la brebis
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Soumises trois fois à la pose d'une éponge intravaginale, à une injection intramusculaire d'hormone puis à quinze jours de prélèvements sanguins quotidiens à la jugulaire, 75 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une hormone recombinante censée remplacer celle qui est aujourd'hui purifiée à partir du sang de juments gestantes, prélèvements suivis d'avortements provoqués que le porteur décrit comme plus rentables pour la production. Il présente le bénéfice principal comme une réponse aux "attentes sociétales" sur le bien-être des animaux non-humains, et affirme que le "besoin" d'une molécule de ce type est "réel et pressant" pour les entreprises et les éleveurs. Les 25 brebis traitées avec l'hormone naturelle retournent à l'élevage, les 50 autres, traitées avec la recombinante faute d'autorisation de mise sur le marché, sont tuées et envoyées à l'équarrissage.
Objectifs
La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.
Bénéfices attendus
Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.
Procédures
Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie, en fonction des lots experimentaux, par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis ou d'un seul prélevement 8 jours après l'injection de l'hormone. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.
Impact sur les animaux
Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.
Devenir
Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.
Remplacement
La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci
Réduction
Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser trois lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).
Raffinement
Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.
Choix des espèces
La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.
Etude du rôle du récepteur ERa sur la fonction endothéliale lymphatique. EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
Gavage quotidien pendant cinq jours, chirurgie du lymphœdème, injection de cellules tumorales, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins à la queue par test de tolérance : 530 souris, en grande majorité des femelles, subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le rôle des hormones féminines dans le système lymphatique et la diffusion métastatique, et se déroule dans deux établissements entre lesquels les animaux sont transportés. Le porteur écrit que la chirurgie du lymphœdème ne génère pas d'effet indésirable majeur, tout en listant les signes qui déclencheraient un analgésique, dos voûté, yeux plissés, absence de toilettage. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour récolter les tissus.
Objectifs
Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. L’AJOUT DE DEUX TECHNIQUES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ (MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE ET TEST DE TOLÉRANCE ORALE AUX LIPIDES).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.
Procédures
Dans le premier établissements utilisateur : dans un premier temps, une gavage quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). TROIS FOIS AU COURS DU PROTOCOLE, UNE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, un test de tolérance au glucose et UN TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE SERONT RÉALISÉS, ESPACÉS DE DEUX JOURS. LA COMPOSITION CORPORELLE SERA ÉVALUÉE PAR RMN (MINISPEC, BRUKER) CHEZ DES SOURIS ÉVEILLÉES (2 MINS). LES TESTS DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET LIPIDES IMPLIQUENT UN GAVAGE (20 SEC), SUIVI DE PRÉLÈVEMENTS SANGUINS SÉQUENTIELS À LA QUEUE (8 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET 4 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE). Dans le second établissement utilisateur : les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie juste avant la mise à mort. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place. LE MINISPEC PEUT PROVOQUER UN STRESS LÉGER ET TEMPORAIRE DÛ AU CONFINEMENT. LE GAVAGE PEUT CAUSER UN STRESS TEMPORAIRE, UNE LÉGÈRE IRRITATION DE L’ŒSOPHAGE ET UN RISQUE D’ASPIRATION, AVEC UN RISQUE MINIME DE LÉSIONS SI LA TECHNIQUE EST CORRECTE.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 22 semaines.