Système urogénital

Deux chirurgies rénales à une semaine d'intervalle pour 80 souris, un régime enrichi en adénine pendant sept semaines pour 48 autres, et pour 32 d'entre elles une ration quotidienne calquée sur ce que mange le groupe témoin pendant quatre semaines. 160 souris sont utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale après anesthésie. S'y ajoutent une perforation de l'oreille, quatre injections hebdomadaires, un jeûne de six heures et le port d'un capteur pendant une heure sur animal vigile. L'anticorps testé a été développé par un laboratoire pharmaceutique contre la dénutrition dans un autre domaine, et le porteur justifie le passage par l'animal en invoquant la réglementation, qui "impose de disposer de résultats précliniques solides avant d'autoriser un essai chez l'Homme".

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) est un problème de santé publique. Elle touche environ 10 % de la population mondiale et près de 6 millions de personnes en France. Elle correspond à une perte progressive et irréversible du fonctionnement des reins et s’accompagne de nombreuses complications cardiovasculaires, métaboliques et nutritionnelles (perte de poids et notamment de muscles). Des analyses récentes ont montré que plus la MRC est sévère, plus le taux dans le sang d’une certaine protéine (appelée ici X) est élevé. Dans un autre domaine de recherche que la MRC, un laboratoire pharmaceutique a développé un anticorps contre cette protéine pour lutter contre la dénutrition et la perte de muscles. Grâce à une collaboration avec ce laboratoire, nous souhaitons tester si cet anticorps peut aussi prévenir la dénutrition et la perte de muscles dans deux modèles de MRC chez la souris : • Le modèle adénine où un régime alimentaire spécifique entraîne la formation de cristaux dans les reins provoquant des lésions. • Le modèle chirurgical où une partie du rein est retirée. La partie restante doit alors travailler beaucoup plus ce qui finit par l’abîmer. Nous testerons deux façons d’utiliser l’anticorps : 1. Traitement précoce : l’anticorps est donné en même temps que l’induction de la MRC. 2. Traitement curatif : l’anticorps est donné après que la MRC a commencé à se développer, avec ou sans un régime pauvre en protéines. Ce type de régime est souvent utilisé pour ralentir la progression de la maladie, mais il peut augmenter le risque de dénutrition. Nous vérifierons donc si l’association anticorps + régime pauvre en protéines apporte un bénéfice supplémentaire par rapport à chaque stratégie prise séparément. Comme l’anticorps pourrait aussi augmenter naturellement l’appétit, nous utiliserons une méthode appelée pair-feeding. Cela signifie qu’un groupe de souris traitées recevra exactement la même quantité de nourriture qu’un groupe non traité. Cela permettra de savoir si les effets observés viennent vraiment de l’anticorps et non simplement d’une augmentation des apports alimentaires. Objectif principal : déterminer si l’anticorps peut améliorer les problèmes majeurs liés à la MRC — baisse de la fonction rénale, dénutrition et perte de muscles —, qui sont également des complications importantes chez les patients humains.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet servira à vérifier si un traitement avec l’anticorps anti-X, donné dans à stade précoce de la maladie ou pour soigner quand la maladie est déjà installée, peut améliorer le fonctionnement des reins et réduire les complications de la maladie rénale chronique (perte de poids et de muscles). Pour l’instant, on ne sait pas encore quels sont les effets de cet anticorps dans cette situation. Si les résultats sont bons, ils représenteront une étape importante vers la préparation d’une étude clinique chez l’Homme. À plus long terme, ces recherches pourraient permettre de développer une nouvelle façon de traiter la maladie rénale chronique, afin d’améliorer le fonctionnement des reins, l’état nutritionnel et la qualité de vie des patients.

Procédures

Les 160 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle adénine) : 48 souris recevront une alimentation enrichie en adénine, quotidiennement (sauf week-ends) pendant 7 semaines. – 2nde étude (modèle chirurgical) : 96 souris recevront 4 injections anesthésiantes (1 anesthésie générale + 1 locale à chaque chirurgie,

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Le régime alimentaire riche en adénine, utilisé pour provoquer la maladie rénale, réduit l’appétit et ralentit la prise de poids des animaux. Cela peut entraîner un inconfort. La méthode qui consiste à donner une quantité précise de nourriture à un groupe pour qu’il mange autant que le groupe contrôle peut créer une frustration, de la fatigue ou du stress, car les animaux ne peuvent pas manger autant qu’ils le souhaitent. De même, un régime pauvre en protéines peut entraîner une perte de poids. Les pesées régulières représentent un petit stress momentané. Les injections, que ce soit pour administrer l’anticorps, un placebo ou des produits d’anesthésie/analgésie, provoquent un stress court et une douleur légère. Aucune nuisance n'est attendue suite à l'injection de l'anticorps anti-X. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Devenir

Les 160 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le traitement par l’anticorps anti-X doit d’abord être testé chez l’animal avant d’être donné à l’être humain. Cette étape est nécessaire pour vérifier s’il est efficace et pour repérer d’éventuels effets indésirables. La réglementation impose de disposer de résultats précliniques solides avant d’autoriser un essai chez l’Homme. Les tests chez l’animal sont donc indispensables pour justifier l’utilisation de ce traitement chez les patients atteints de maladie rénale chronique.

Réduction

Le traitement par l’anticorps anti-X n’a encore jamais été testé dans la maladie rénale. En revanche, il a déjà été utilisé chez la souris pour d’autres maladies, ce qui nous laisse penser qu’il pourrait avoir un effet et limite le risque d’utiliser des animaux sans raison valable. Le nombre de souris nécessaires dans chaque groupe a été déterminé grâce à un calcul statistique. Ce calcul s’appuie sur nos résultats obtenus dans des études précédentes chez des souris avec une maladie rénale. Selon ce calcul, 16 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence réelle. Nous avons également choisi des méthodes non invasives (analyse de la composition corporelle et mesure de la fonction rénale) qui peuvent être faites deux fois sur les mêmes animaux : avant et après le traitement. Cela permet de réduire le nombre total d’animaux. Enfin, un maximum de tissus sera collecté au moment de la mise à mort et conservé. Ces échantillons permettront de répondre à d’autres questions scientifiques ou d’être utilisés dans des collaborations, évitant ainsi de refaire des expériences et de réutiliser des animaux inutilement.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés cinq fois par semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée deux fois par semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Pour la composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au tube de mesure (un entraînement à l’entrée dans le tube une semaine avant la mesure), ce qui réduira le stress durant la séance. Dans le cadre de la restriction alimentaire, plusieurs mesures limiteront le stress : rations ajustées tous les deux jours selon la consommation du groupe contrôle, distribution à horaire fixe, nourriture répartie en plusieurs points, et enrichissement supplémentaire des cages. L’alimentation enrichie en adénine sera interrompue chaque week-end pour limiter la perte de poids sans compromettre l’induction de la maladie. Les croquettes seront préparées avec du cacao pour maintenir une bonne appétence. Les volumes d’injection (anticorps, placebo, anesthésiques, analgésiques) seront réduits au minimum nécessaire. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour étudier la maladie rénale chronique. Les deux méthodes utilisées pour induire la maladie entraînent une forme modérée qui reproduit les principales atteintes observées chez l’Homme. Ces modèles sont bien connus et largement utilisés. Le choix de cette espèce permet aussi de comparer nos résultats avec nos travaux précédents menés chez la souris avec un régime pauvre en protéines. Par ailleurs, l’anticorps anti-X a déjà montré une efficacité dans d’autres modèles murins, ce qui renforce la probabilité d’obtenir un effet dans les modèles utilisés ici. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, elles ont terminé leur croissance, ce qui assure des réponses plus homogènes. Le régime enrichi en adénine est bien toléré et les deux chirurgies sont correctement supportées. La maladie rénale induite à cet âge est bien caractérisée et reproductible.

Mesurer si l'exposition des parents à une eau chaude se répercute sur leur descendance conduit ici à chauffer l'eau de 26 à 33 °C, par paliers d'un degré toutes les deux heures. 96 poissons medaka, 56 femelles et 40 mâles, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs ovaires et leurs testicules. Le porteur attend un stress thermique léger, avec réduction de l'exploration, repli dans les coins et nage désorganisée, tout en indiquant que les études antérieures du centre n'ont jamais rapporté de tels changements. Il qualifie de "non invasive" la collecte de sperme obtenue en pressant l'abdomen des mâles anesthésiés, geste répété au début puis à la fin du projet.

Objectifs

Au cours des dernières décennies, le changement climatique et le réchauffement global ont eu des impacts profonds et étendus sur les écosystèmes aquatiques, affectant particulièrement la physiologie et la biologie moléculaire des poissons. De nombreuses études ont démontré que l'augmentation de la température de l'eau peut compromettre le succès reproductif des poissons en perturbant l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et en modifiant la signalisation hormonale. Cependant, des hypothèses émergentes suggèrent que l'exposition parentale au stress avant la fertilisation pourrait influencer la descendance par des mécanismes d'héritage non génétique. Ces mécanismes, qui n'impliquent pas de modifications de la séquence ADN ni de transmission d'allèles génétiques, pourraient jouer un rôle significatif dans la transmission de traits à la fois avantageux et délétères à la génération suivante. Les recherches chez les mammifères, notamment les rongeurs, ont fortement appuyé ce concept en démontrant que le stress paternel peut engendrer des effets durables sur le comportement et la physiologie de la descendance via un héritage non génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet explorera comment l’exposition des poissons parents à des températures élevées durant le développement des gamètes affecte le succès reproductif. Nous étudierons ces effets à la fois aux niveaux phénotypique et moléculaire, en mettant l’accent sur l’héritage non génétique — notamment les modifications de la composition et de l’expression des petits ARN dans les œufs, qui agissent comme des médiateurs clés des signaux environnementaux à travers les générations chez les vertébrés aquatiques. Les objectifs principaux du projet sont : 1. Évaluer la capacité du poisson medaka à s’adapter de manière transgénérationnelle aux températures élevées et identifier les vulnérabilités possibles dans la reproduction ; 2. Identifier les signaux moléculaires sensibles à la chaleur et les facteurs régulateurs chez les parents qui sont transmis via les gamètes à la génération suivante ; 3. Fournir des preuves mécanistiques démontrant comment les petits ARN contribuent à la transmission des effets environnementaux à la génération suivante ; 4. Identifier les voies moléculaires et épigénétiques induites par la température qui impactent la reproduction. Les résultats amélioreront notre compréhension de l’impact du réchauffement climatique sur l’écologie reproductive et la dynamique des populations aquatiques, tout en proposant des stratégies pratiques de gestion thermique en aquaculture. En définitive, en explorant la transmission épigénétique de l’information environnementale, notamment via les miARN, ce projet vise à améliorer les prévisions du potentiel d’adaptation chez les espèces aquatiques et à soutenir le développement de pratiques d’élevage plus résilientes face au réchauffement global.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : augmentation progressive de la température de l’eau pour les animaux des lots exposés: la température de l’eau passera progressivement de 26–27 °C à 32–33 °C, avec une augmentation d’environ 1 °C toutes les deux heures. Transfert des poissons entre les réservoirs : Le transfert des poissons du réservoir principal vers d’autres réservoirs d'une durée inférieure à 2 secondes. Collecte de sperme (1 fois au début du projet et une fois en fin de projet): pour l’échantillonnage du sperme, les mâles reproducteurs seront d’abord anesthésiés. Ensuite, en appliquant une pression douce sur la région abdominale, un petit volume de sperme (environ 1 à 2 microlitres) sera prélevé. Cette procédure est très brève (moins d’une minute) et non invasive. Prélèvement des gonades (testicules et ovaires): À la fin de l’expérience, tous les poissons de chaque groupe de température seront d’abord anesthésiés puis euthanasiés. Leurs testicules et ovaires seront soigneusement prélevés et conservés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

Le stress, de manière générale, peut entraîner des modifications du comportement chez les poissons. Dans ce projet, les poissons exposés à une température de l’eau de 32 à 33 °C peuvent présenter un stress thermique léger par rapport à ceux maintenus à la température témoin de 26 à 27 °C. Ce stress thermique peut influencer le métabolisme énergétique, la prise alimentaire, ou une modification du niveau de curiosité et d’activité. Par « modification de la curiosité et de l’activité », on entend l’apparition de comportements tels qu’une réduction de l’exploration de l’environnement, un repli dans les coins, ou une nage désorganisée, qui peuvent être interprétés comme des indicateurs d’un niveau accru de stress thermique ou d’anxiété comportementale. Ces comportements seront suivis systématiquement tout au long de l’étude, à titre d’indicateurs observables de stress thermique. Ces mesures ont un caractère préventif, car les études précédemment menées sur le medaka dans ce centre, en réponse à une augmentation progressive de la température, n’ont jamais rapporté de modifications comportementales associées à un stress thermique.

Devenir

la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques, des échantillons d’ovaires et de testicules sont nécessaires. Par conséquent, après l’évaluation du phénotype reproducteur, tous les poissons seront euthanasiés afin de prélever leurs ovaires et testicules.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets non génétiques de l’augmentation de la température de l’eau sur les réponses transgénérationnelles. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle animal capable de répondre directement aux variations de température. Les poissons, en tant qu’organismes poïkilothermes (c’est-à-dire dont la température corporelle varie en fonction de l’environnement et qui ne peuvent pas réguler leur température interne), présentent des fonctions physiologiques et comportementales très sensibles aux changements de température environnementale. Cette caractéristique rend les poissons plus pertinents que les mammifères homéothermes (animaux à sang chaud capables de maintenir une température corporelle relativement constante, tels que les souris ou les lapins) pour l’étude des effets des variations de température. De plus, l’étude des effets transgénérationnels nécessite des espèces avec un cycle reproductif court, permettant l’observation de plusieurs générations dans un délai raisonnable. Les espèces poissons comme le medaka sont adaptées en raison de leur maturation rapide. À ce jour, aucune alternative adéquate, tels que les modèles in vitro, ne peut pleinement aborder l’impact de la température élevée sur les phénotypes au niveau de l’organisme, tels que le succès reproductif, ainsi que les aspects transgénérationnels de cette étude avec une pertinence et une exhaustivité comparables.

Réduction

Un total de 96 poissons (56 femelles et 40 mâles) sera utilisé pour évaluer les phénotypes reproducteurs sous deux conditions de température. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche, le sperme et les oeufs seront d’abord prélevés chez les poissons reproducteurs mâles et femelles afin d’évaluer leur phénotype reproducteur. Après cette étape, les mêmes poissons reproducteurs seront utilisés pour le prélèvement des ovaires et des testicules Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives entre les groupes, en utilisant des tests appropriés tels que le test t.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions optimales spécifiques à l’espèce, incluant une photopériode appropriée, une qualité de l’eau adaptée, une densité contrôlée et une gestion sanitaire rigoureuse. La seule exception concernera le groupe exposé à 32–33 °C, température qui, selon la littérature, n’induit pas de mortalité chez le medaka. Afin d’améliorer le bien-être animal, les aquariums seront enrichis avec des plantes artificielles. Les poissons seront maintenus dans des aquariums de 10 litres avec une densité maximale de 24 poissons par bac. Toutes les manipulations animales — y compris l’induction de la ponte, la collecte des œufs et du sperme — seront réalisées par du personnel compétent avec soin et rapidité afin de minimiser le stress. Le personnel portera des gants en nitrile et les poissons seront transférés à l’aide d’épuisettes de petite taille, en limitant au maximum le temps de manipulation. La collecte des œufs sera effectuée de manière douce, rapide et non invasive. La collecte du sperme et des gonades (ovaires et testicules, prélevés en fin d’expérience), qui nécessite une manipulation précise, sera réalisée sous anesthésie afin de limiter l’inconfort. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel formé de l’animalerie pour surveiller leur état de santé et leur comportement. Tout poisson présentant des signes d’infection ou des troubles de santé sera examiné par la personne responsable désignée du laboratoire, qui déterminera les soins appropriés, incluant l’euthanasie si nécessaire. Par ailleurs, l’unité est dotée d’une structure Bien-Être Animal de l’établissement, et qui est consultée pour chaque demande d’autorisation de projet garantissant l’application continue des techniques de raffinement les plus récentes. Celles-ci comprennent notamment l’enrichissement de l’environnement, comme l’ajout de plantes artificielles, afin d’optimiser les conditions d’élevage. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel qualifié, formé spécifiquement pour l’espèce et mettant régulièrement à jour ses compétences afin de maintenir des standards élevés de soins aux animaux.

Choix des espèces

Le poisson medaka (Oryzias latipes) a été choisi comme espèce modèle en raison de ses avantages biologiques et expérimentaux en accord avec les objectifs du projet. Le medaka possède un temps de génération court (environ 3 mois), ce qui permet une évaluation rapide des effets intergénérationnels et épigénétiques. Sa reproduction continue et quotidienne offre un accès répété à des œufs à différents stades, idéal pour les analyses moléculaires et phénotypiques. La fécondation et le développement embryonnaire externes permettent un contrôle strict de l’environnement après la fécondation, réduisant les effets maternels confondants et favorisant une investigation précise des facteurs pré-fécondation. De plus, le medaka bénéficie d’un génome entièrement séquencé et de ressources moléculaires importantes (par exemple, bases de données bioinformatiques), ce qui en fait un modèle puissant pour l’étude des interactions gène-environnement. Ces caractéristiques rendent le medaka un modèle fiable, reproductible et éthiquement gérable pour les études multigénérationnelles. Dans cette étude, les poissons sont à l’état adulte afin d’évaluer précisément le phénotype reproducteur, de collecter les œufs et de réaliser les analyses moléculaires nécessaires.

15 180 souris vont être utilisées dans l'étude de la réponse immunitaire de la vessie, chacune pouvant recevoir quatre injections et deux administrations sous anesthésie, puis subir jusqu'à neuf prélèvements urinaires et trois prélèvements sanguins. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées pour que leurs tissus soient collectés. Le porteur décrit par ailleurs deux modèles sans animaux déjà développés dans son laboratoire, un organe sur puce à partir de cellules progénitrices humaines et un modèle ex vivo réutilisant des tissus issus d'autres projets. L'objectif du projet tient en une phrase, les nuisances attendues en deux lignes, et aucun calcul n'est produit pour justifier ces 15 180 animaux.

Objectifs

L’objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection et aux immunothérapies dans la vessie.

Bénéfices attendus

Nous comprendrons mieux le fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie ce qui permettra d’identifier des cibles thérapeutiques afin de développer de nouvelles thérapie et ainsi améliorer la prise en charge et le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 4 injections, 2 administrations sous anesthésie, 9 prélèvements urinaires, 3 prélèvements sanguins maximum. Chaque intervention sera inférieure à 30 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Les injections et administrations de composés ainsi que les prélèvements peuvent provoquer une légère douleur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus.

Remplacement

En complément de ce projet in vivo, nous avons développé deux modèles pour remplacer nos expériences sur les animaux. Le premier est un modèle d'organe sur puce utilisant des cellules progénitrices humaines. Ce modèle peut remplacer certains aspects du modèle d'infection in vivo, comme la mesure de l'attachement des bactéries aux tissus. Nous pouvons également tester le rôle du sexe biologique dans ce modèle en utilisant des cellules de femmes ou d’hommes ou de l'urine de femmes ou d’hommes. Le deuxième modèle est un modèle ex vivo permettant la réutilisation d'animaux ou de tissus provenant d'autres projets.

Réduction

Le nombre de groupe de souris (groupes témoins et groupes tests) a été optimisé pour utiliser le moins d'animaux possible. Dans la mesure du possible, sans compromettre l'intégrité de l'expérience, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes tests afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'utilisation de tissus provenant d'autres équipes qui mettent à mort des souris pour d'autres recherches (notre modèle ex vivo) contribuera également à réduire le nombre de souris dont nous avons besoin. Enfin, une veille bibliographique sera effectuée afin de ne pas répéter inutilement des connaissances bien établies.

Raffinement

Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress et la douleur au cours de ces expériences. Les souris seront surveillées plusieurs fois par semaine pour vérifier leur bien-être. En cas de signes de douleur, des analgésiques seront administrés. Enfin, les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car les infections urinaires chez les souris reflètent, à bien des égards, la maladie observée chez l'homme. La voie utilisée par les bactéries chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme modèle approprié pour l'infection des voies urinaires. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 48 semaines. Cet âge chez la souris est équivalent à l'âge adulte chez l'homme.

Seuls des mâles adultes de deux à quatre ans, écartés de l'effort reproducteur annuel de la colonie, sont retenus dans ce projet sur un primate à saisonnalité marquée. 22 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux biopsies testiculaires d'un millimètre carré sous anesthésie générale, à trois mois d'intervalle, chaque prélèvement étant suivi d'une ponction de sang à la patte arrière. Les 22 animaux retournent ensuite dans la population de l'établissement, avec un suivi de cicatrisation renforcé et des cachettes supplémentaires pour limiter les agressions entre congénères que le porteur qualifie de naturelles.

Objectifs

La compétition spermatique in-utero est à l’origine de l’évolution du système reproducteur des mâles chez de nombreuses espèces, dont les primates. Les variations saisonnières du statut sexuel des femelles peuvent intensifier la compétition entre mâles reproducteurs. Ceci peut engendrer des variations physiologiques du système reproducteur des mâles au cours de la saison de reproduction, telles qu’une augmentation du taux de testostérone, une augmentation du volume testiculaire, ou encore la réactivation de la spermatogenèse. Plus largement, l'objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes génétiques sous-jacents à la variation phénotypique de la reproduction saisonnière chez les primates en identifiant les gènes qui sont impliqués dans la spermatogénèse et la maturation spermatique, en particulier ceux impliqués dans des fonctions particulières telles que la réponse au stress oxydatif ou à l’immunité.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre d'augmenter la compréhension de l’impact des variations moléculaires associées à la reproduction saisonnière chez les primates, dans une approche comparative. L’espèce concernée faisant partie de la branche primitive des primates, les résultats de ce projet contribueront à clarifier les processus évolutifs qui ont contribué la régulation du système reproducteur chez l'humain. L'objectif sera ici de mettre en évidence les mécanismes moléculaires responsables de l’arrêt momentané puis de la reprise de la spermatogenèse selon la saison chez un primate saisonnier. Ceci permettra ainsi de progresser dans la compréhension de l’ensemble des nombreux contributeurs à la régulation de la fertilité chez les mâles, tels que ceux observés au niveau du système immunitaire ou encore pour lutter contre le stress oxydatif. Par ailleurs les résultats attendus ont également un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'humain, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Procédures

Chaque animal du projet aura 2 prélèvements successifs, réalisés sous anesthésie générale et à 3 mois d'intervalle. Les prélèvements consisteront en une biopsie testiculaire de 1mm² réalisée avec un dispositif stérile dédié, suivie d'un prélèvement sanguin réalisé à la patte arrière de l'animal, dans la limite de 200µL maximum de sang par animal et par prélèvement.

Impact sur les animaux

Les gestes associés à cette procédure sont maîtrisés par les expérimentateurs et réalisés sous contrôle vétérinaire. Seuls les individus mâles adultes ne présentant aucune contre-indication vétérinaire et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel participeront à ce projet. De plus, un contrôle quotidien renforcé sera réalisé les jours suivant l’échantillonnage afin de s’assurer de la bonne cicatrisation des zones de biopsie et de l’absence d’interactions antagonistes au sein des groupes. Un enrichissement adapté et renforcé sera mis en place dans les hébergements concernés. Les produits vétérinaires utilisés dans cette procédure sont régulièrement utilisés au sein du laboratoire et les effets secondaires potentiels sont bien identifiés. Enfin, une étude pilote sur 2 animaux sera menée en amont afin de s'assurer du maintien du bien-être animal sur le long-terme et de valider la mise en place de la procédure expérimentale d'échantillonage sur la majorité des animaux (N=20) concernés par ce projet.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée 2 fois sur une durée de 3 mois, les 22 animaux du projet retourneront dans la population.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives compte-tenu de la nature des processus explorés. L'animal utilisé dans ce projet est un modèle particulièrement adapté à l’étude de l’influence de la saisonnalité sur la spermatogenèse chez les primates, car il est soumis à une compétition spermatique extrême lors de la saison de reproduction qui est très courte. Les mâles participent à une compétition intense pour l’accès à l’accouplement, sachant que les femelles vont s’accoupler avec plusieurs mâles lors de la période de reproduction. A cause de cette très forte compétition spermatique, les mâles ont un des plus haut ratio taille des testicules/ taille du corps chez les primates ; leurs testicules vont augmenter de 4 à 5 fois leur volume initial en préparation de la saison de reproduction. Ce processus démarre 2 à 3 mois avant l’entrée des femelles en oestrus et la spermatogenèse est totalement arrêtée au cours de la saison de repos.

Réduction

Nous collecterons 44 biopsies testiculaires et 44 échantillons sanguins sur 22 mâles adultes au total (phase pilote + expérimentale). Chaque mâle sera donc échantillonné à deux reprises: au cours de la réactivation de l’activité sexuelle (quelques semaines avant l'accouplement) puis lorsque l’axe reproducteur est complètement actif (pendant la période d'accouplement). Ces deux périodes de l’année correspondent à des états physiologiques, et en particulier de l’axe reproducteur, très contrastés et très bien documentés, qui supplanteront la potentielle variabilité inter-individuelle. Comme nous souhaitons réaliser du séquençage ARN sur ces échantillons, ce nombre d'individus total est conditionné par le fait qu'une analyse de puissance de l'expression génique différentielle attendue a été effectuée.

Raffinement

Une étude pilote va être menée sur 2 individus en amont du projet afin de valider la procédure et de s'assurer du maintien du bien-être animal après la procédure. Tous les produits vétérinaires utilisés dans la procédure sont connus et leurs effets sont maîtrisés par les expérimentateurs. Dès l'apparition éventuelle d'inconfort, ou de souffrance (absence d’alimentation, prostration, agressivité anormale, réaction à la palpation), l'animal sera sorti du projet et un suivi vétérinaire sera enclenché. D'un point de vue zootechnique, un enrichissement adapté sera développé au sein des zones d'hébergements concernées afin de limiter les intéractions antagonistes qui existent de manière naturelle entre les animaux, notamment lors de la periode de reproduction. Ainsi des cachettes supplémentaires seront ajoutées, les zones de fourragements seront multipliées et le taux d'occupation des hébéregement pourra être diminué si nécessauire.

Choix des espèces

Outre sa proximité phylogénétique avec l’humain, l'espèce utilisée dans ce projet est un modèle particulièrement adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans le contrôle de la reproduction, qui est saisonnière même en captivité, ce qui est rendu possible par un contrôle du régime photopériodique. Seuls des animaux mâles adultes, matures sexuellement (entre 2 et 4 ans) et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel seront échantillonnés. Les résultats attendus ont un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'Homme, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Les souris utilisées sont des NOD Scid, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, condition posée par le porteur pour que des cellules tumorales prostatiques humaines s'implantent et se disséminent. 75 souris sont ainsi exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour collecte des tissus. Chacune reçoit une greffe de cellules PC3-GFP par ouverture de la cavité péritonéale sur cinq à six millimètres, puis un traitement de 120 secondes par torche à plasma froid par la même voie d'entrée. Le porteur écrit que les lots déjà traités n'ont présenté "aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables", tout en reconnaissant que l'implantation de cellules tumorales peut être associée à des douleurs et altérer l'état sanitaire de l'animal.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la prostate vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. À six mois au moins, avec un carcinome installé, elles subissent une ouverture de l'abdomen de dix minutes et l'exposition de leur prostate antérieure à une torche à plasma froid, ou à un jet d'hélium pour les témoins, puis sont gardées sept jours avant d'être tuées. L'enjeu déclaré est le traitement des marges chirurgicales lors des prostatectomies robotisées chez l'humain, un domaine que le porteur présente comme une aire de développement technologique de premier plan. Il écrit que les organoïdes et tumoroïdes permettent "de ne pas recourir à l'expérimentation animale", et conclut dans la même rubrique que la souris reste "indispensable".

Objectifs

Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).

Procédures

Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.

Remplacement

La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.

Réduction

Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.

Raffinement

Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).