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Evaluation des effets des antidépresseurs sur des souris modèle d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des injections quotidiennes pendant cinq à dix jours, puis la mise à mort : 55 souris génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer et des activités épileptiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois antidépresseurs leur sont administrés pour déterminer lesquels aggravent ces crises, et leurs cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour y enregistrer l'activité des neurones. Le porteur souligne qu'aucune chirurgie ni aucun prélèvement n'est pratiqué sur les animaux de ce projet. Il indique par ailleurs que le traitement pourrait exacerber les activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères, l'ensemble restant déclaré en souffrance modérée.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d'Alzheimer (MA) et des activités épileptiques. Des études montrent une exacerbation de ces activités épileptiques lorsque les souris sont traitées avec certains antidépresseurs alors que d'autres pourraient avoir un effet protecteur vis-à-vis de ces activités. Notre objectif est d'élucider les mécanismes synaptiques et cellulaires par lesquels les antidépresseurs modulent à long terme l'activité épileptique des souris modèles de la MA. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l'activité neuronale de ces souris après un traitement antidépresseur. Trois antidépresseurs seront comparés. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la progression du déclin cognitif chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais ne provoquant pas d'aggravation des activités épileptiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs aggravent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer, si d'autres antidépresseurs ont un rôle plutôt protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités, et par quels mécanismes ces effets sont médiés. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera à court terme la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la MA en évitant de majorer les activités épileptiques et donc leurs troubles de la mémoire.
Procédures
Les antidépresseurs seront administrés aux animaux par voie orale en les mélangeant à l'eau de boisson ou injectés pendant 5 à 10 jours avant leur mise à mort. Le nombre maximum d'injections est fixé à 10 en tout à la fréquence d'une injection par jour. Aucune procédure chirurgicale ni aucun prélèvement ne sera effectué sur les animaux inclus dans ce projet.
Impact sur les animaux
Habituellement, les activités épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à des modifications comportementales. Mais l'administration chronique de certains antidépresseurs pourrait exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Des injections pourront être réalisées quotidiennement pour l'administration de l'un des antidépresseurs sont susceptibles d'induire un stress modéré.
Devenir
A l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des enregistrements de l'activité neuronale ex vivo.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer l’effet des antidépresseurs sur les activités épileptiques dans la maladie d’Alzheimer (MA) ainsi que les mécanismes par lesquels ces effets sont médiés. L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. De plus, des travaux récents montrent que les traitements antidépresseurs n’ont pas d’effet à court terme, ce qui implique qu’ils doivent être administrés aux animaux de manière chronique et non seulement appliqués sur les tissus d’intérêt. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle et est le seul actuellement existant pour reproduire les caractéristiques de la maladie présentes chez l'humain.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre plusieurs stratégies de réduction. Les enregistrements de l’activité neuronale, normale ou épileptique, sont réalisés sur deux échantillons enregistrées simultanément. Notre équipement permet de réaliser trois enregistrement simultanés. Cette approche réduit ainsi le nombre d’animaux nécessaires d’un facteur trois. Le nombre d’expériences est calculé sur la base d’une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont représentés de manière équilibrée afin de prendre en compte d’éventuelles différences biologiques. Nous prévoyons six groupes expérimentaux selon l’âge, le génotype et le traitement des animaux. Les souris non traitées permettront de caractériser les mécanismes à l’origine de l’activité épileptique. Les souris traitées seront utilisées pour évaluer les effets des antidépresseurs sur cette activité. Au total, 55 souris seront nécessaires pour obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille d'évaluation sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les antidépresseurs utilisés dans ce projet sont susceptibles d’induire une aggravation des activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la MA. Ce phénomène pourrait être à l’origine d’une altération du comportement des animaux. Afin de réduire la souffrance des animaux à cette étape du projet, nous nous baserons sur les résultats obtenus précédemment au cours d’un traitement antidépresseur chronique, pour déterminer la durée optimale du traitement antidépresseur à appliquer afin d’obtenir des résultats exploitables tout en limitant la souffrance des animaux. Dans tous les cas la durée de traitement sera comprise entre 5 et 10 jours en la limitant autant que possible à 8 jours. La procédure s’achèvera par la mise à mort des animaux après anesthésie.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : troubles de la mémoire et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur les activités épileptiques dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte entre 3 mois et 8 mois. À 3 mois, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer : elles présentent déjà des activités épileptiques mais à basses fréquences ; c’est également à cet âge que commencent à apparaître les troubles de la mémoire. Ainsi, si notre hypothèse se confirme, il sera plus facile de mettre en évidence un effet aggravant de certains antidépresseurs sur les activités épileptiques à cet âge. À 8 mois, les souris modèles de la MA sont à un stade avancé de la maladie d’Alzheimer : elles présentent des activités épileptiques et des troubles notables de la mémoire. Ainsi, si notre hypothèse se confirme, il sera plus facile de mettre en évidence un effet atténuateur d'autres antidépresseurs sur les activités épileptiques à cet âge.
Impact du cycle circadien sur les lésions et la fonction vasculaire post-accident vasculaire cérébral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 souris vont être utilisées, chacune subissant deux chirurgies puis deux séances d'imagerie sous anesthésie en moins de vingt-quatre heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs leur provoquent un accident vasculaire cérébral par thrombus, avec pour suites annoncées une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et un affaiblissement de la patte avant gauche. Le porteur revendique par ailleurs que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement et ne présentent aucun signe de douleur. Le bénéfice attendu tient en une phrase, acquérir des données fondamentales sur la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral, face à quarante-huit AVC provoqués et quarante-huit mises à mort.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, différents compartiments vont être séquentiellement touchés : le compartiment vasculaire sera immédiatement affecté, suite à la formation d’un thrombus qui induit in situ une diminution du débit sanguin cérébral (DSC). S’ensuit une perte de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et l’apparition de dommages parenchymateux. Plusieurs observations cliniques ou précliniques suggèrent que plusieurs rythmes biologiques, en particulier le cycle circadien influence la physiologie de la BHE et du parenchyme cérébral. De fait, cette sensibilité variable au cours de la journée pourrait impacter le devenir post-AVC. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser l’influence du cycle circadien sur les altérations précoces du débit sanguin cérébral et la lésion cérébrale dans un modèle d’AVC thrombo-embolique. Ce projet s’inscrit dans une étude multicentrique, dans laquelle chaque laboratoire étudie l’impact du cycle circadien, sur le devenir histologique/fonctionnel chez la souris.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie de l’AVC et plus particulièrement sur l’impact du cycle circadien.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 2 chirurgies : approche pré-opératoire et induction d’un AVC ischémique (sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 40 à 45 minutes) et 2 protocoles d’imagerie : imagerie ultrasonore en phase précoce post-AVC (sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 40 minutes) et IRM à 24h (sous anesthésie générale d'une durée de 20 à 25 minutes)
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 3 semaines avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient pour l’ensemble des procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels, un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale pour apporter un niveau de preuve suffisant. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun signe de douleur. Des points limites ont été définis et seront appliqués au cours du projet. Les animaux bénéficieront de toutes les bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les AVC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, des animaux adultes âgés de 8-9 semaines seront nécessaires.
Etude de l’effet de gènes spécifiquement humains sur le fonctionnement des neurones et circuits neuronaux du cervelet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit, sous anesthésie et à des coordonnées précises, l'injection d'un vecteur viral dans le cervelet, avant une chirurgie terminale destinée à prélever son cerveau. L'objet est de faire exprimer chez la souris treize gènes propres à l'espèce humaine, pour comprendre ce qu'ils ont apporté au cervelet humain. Le porteur qualifie les nuisances de la chirurgie stéréotaxique de bien tolérées, et retient la souris comme "Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre du vivant", critère qui justifie à ses yeux d'y installer des gènes humains.
Objectifs
L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent sur des gènes exprimés chez l'humain et absent des autres espèces. Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur des neurones et circuits matures du cervelet, à l'échelle cellulaire et du circuit. Nous avons une liste de 13 gènes candidats. Pour étudier un effet cellulaire de ces gènes, nous devons faire des expériences où nous faisons exxprimer ces gènes dans un cervelet de Mammifère. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre du vivant. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer le cervelet mature.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse).
Procédures
Accès au cerveau sous anésthésie générale suivie de l'injection du vecteur viral aux coordonéées 3D précises: 30 - 45 minutes. Chirurgie terminale sous anesthésie générale dans le but de prélever le cerveau pour analyse hystologique.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent d'une part la réalisation des injections et d'autre part, les chirurgies stéréotaxiques. Les nuisances liées à la chirurgie stéréotaxique sont bien tolérées et n'ont que peu d'impact sur les animaux grâce aux soins post-opératoires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et utilisés dans les procédures décrites pour analyses histologiques.
Remplacement
Les modèles in vitro différentiés à partir de cellules souches humaines sont encore trop immatures, manquent certaines structures anatomiques, et de stimulation sensorielle, ce qui ne sera pas le cas in vivo. De plus, notre étude in vivo pourrait permettre d’augmenter nos connaissances pour améliorer les protocoles de différentiation in vitro.
Réduction
Ce projet nécessitera au maximum 94 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. De plus, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans des cages ventilées d'une surface adéquate, dans un environnement enrichi, et changés sous flux d'air. La chirurgie est effectuée dans une pièce dédiée sous analgésie locale et générale, et anesthésie, en température contrôlée (
Choix des espèces
Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre du vivant. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Nous utiliserons des souris matures agées de 2 mois de façon à ce que le circuit neuronal du cervelet ait terminé son développement.
Evaluation de traitements contre le phénotype épileptique dans le syndrome de Dravet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Identifiées par une biopsie de l'oreille, traitées chaque jour pendant quatre à huit semaines, implantées d'électrodes intracérébrales pour 150 d'entre elles, 480 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et l'autre moitié un niveau sévère. Toutes seront tuées pour des prélèvements d'organes, et le porteur indique qu'environ 40 % au maximum meurent avant l'âge de 60 jours, des crises d'épilepsie que leur modification génétique provoque. Le projet évalue des traitements contre le syndrome de Dravet, une épilepsie rare de l'enfant, sur des souriceaux traités dès le septième jour de vie. Les tests comportementaux, annoncés jusqu'à trois fois par animal pour des sessions de huit à trente minutes, ne sont pas nommés, alors que les symptômes recherchés sont l'hyperactivité, le déficit social et le défaut d'apprentissage.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’impact de traitements sur les symptômes et la survie d’un modèle animal du syndrome de Dravet. Le syndrome de Dravet est une épilepsie rare de l’enfant qui a pour cause une mutation du gène SCN1A. Ce syndrome épileptique est caractérisé par des crises épileptiques pouvant diminuer la survie des patients (phénotype de SUDEP = mort subite et inattendue chez les patients épileptiques). Des modèles animaux du syndrome de Dravet ont été établis, ce qui mène au développement de crises épileptiques, provoquant dans environ 40% des cas une mort prématurée (SUDEP). Nous proposons d’utiliser un modèle du syndrome de Dravet, spécifiquement des souris jeunes afin de modéliser les phases précoces de ce syndrome. L’objectif est d’évaluer l’impact de traitements sur 1) la survie des animaux, 2) l’apparition des crises épileptiques, et 3) les symptômes associés : hyperactivité, déficit social ou défaut d’apprentissage.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Dravet est un syndrome épileptique de l’enfant dont les traitements actuels ne permettent pas de soigner tous les patients. De plus, même si certaines crises sont atténuées par les traitements actuels, la survie ne semble pas être prolongée. Ce projet vise à tester de nouveaux traitements pour diminuer les crises d’épilepsie et augmenter la survie, ce qui permettra de proposer de nouveaux traitements chez l’Homme.
Procédures
Tous les nouveaux-nés modèle de Dravet et leurs contrôles (environ 480) seront identifiés à l’aide d’un prélèvement (biopsie) à l’oreille qui sera effectué une seule fois. Pour les traitements, les animaux seront administrés quotidiennement (une seule fois par jour) pendant la durée des expériences soit au maximum : 8 semaines pour 240 animaux, et au maximum : 4 semaines pour 150 autres animaux. Pour l’évaluation du comportement, les animaux seront testés au maximum 3 fois à l’aide de test allant de 8 min à 30 min/jour, le tout sur 2 semaines maximum. Cela concernera 240 animaux. Pour les enregistrements d’activité électrique cérébrale (EEG), environ 150 animaux subiront une procédure chirurgicale.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues (connues de la littérature) sont : 1) Le phénotype des souris transgéniques est dommageable, avec une survenue de crises épileptiques spontanées, qui peuvent entrainer une mort prématurée (environ 40% des animaux au maximum n’atteignent pas l’âge de 60 jours). 2) Un stress et une douleur associée à la biopsie d’oreille pour l’identification et le génotypage simultané 3) Un stress et une douleur dus à l’administration chronique des traitements proposés 4) Un stress dû aux tests comportementaux 5) Un stress dû à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes intracérébrales 6) Un stress dû à l’isolement (maximum 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises spontanées. Les traitements seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car le comportement (locomoteur, social, cognitif) ne peut être étudié au niveau cellulaire (in vitro) ou par modélisation (in silico). De plus, afin de mimer un syndrome d’origine génétique et ses conséquences sur un organisme en cours de développement, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable.
Réduction
Afin de limiter l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype dommageable, les animaux seront générés par fécondation in vitro d’ovules de femelles non transgéniques et de sperme issu de males transgéniques. Suite à nos précédents travaux, nous pouvons estimer le nombre de femelles gestantes nécessaires afin d’obtenir le nombre d’animaux permettant d’atteindre une puissance statistique adéquate. Le calcul du nombre des animaux est fait selon les procédures standards de statistiques. De plus, les animaux pouvant présenter des crises épileptiques létales, il nous faut au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer le phénotype des animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Environ 45 minutes avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée. Pendant la chirurgie, le dessèchement de la cornée est évité à l’aide d’un gel spécifique. Une injection d’anesthésique local est faite le long de la ligne d’incision pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant. Puis, l’analgésique est administré 5 à 6h après l’injection pré-opératoire. Le lendemain, si un signe de mal-être/douleur est identifié, alors l’administration d’analgésique sera continuée. Une distribution d'aliment hydraté ou d’une bouillie produite par dispersion de croquettes dans l’eau pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Les administrations seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.
Choix des espèces
Afin de modéliser au mieux le syndrome de Dravet, qui est à plus de 80% dû à une mutation génétique, l’espèce souris dont la modification génétique du gène Scn1a déjà publié est la plus pertinente. Ce modèle récapitule bien le phénotype Dravet : crises fébriles, crises spontanées, SUDEP et symptômes psychiatriques. Pour la moitié, les animaux seront traités à partir du jour post-natal 7 (P7) au minimum afin d’avoir une exposition suffisante avant la diminution de la survie estimée à P20. Ces animaux seront évalués jusqu’à leur âge adulte (environ P45) où leurs comportements seront évalués. Pour l'autre moitié, les animaux seront utilisés après sevrage pour faire l’implantation d’électrodes et pouvoir mesurer les crises spontanées le plus tôt possible, les crises étant les plus visibles autour de P28.
Etude du rôle de la microglie dans les effets anxiolytiques et neurogéniques de la fluoxétine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
En cas de douleur manifeste ou de blessure persistant trois jours, les souris sont tuées par perfusion intracardiaque. 1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont privées d'abri et de matériel de nidification pendant quatre à sept semaines pour induire un stress, mises à jeun dix-huit heures, aspergées de sucrose sur le dos pour déclencher une heure de toilettage intense, puis placées seules dans une cage inconnue fortement éclairée, avec deux gavages qui exposent à une blessure de l'œsophage et à une fausse route. Il s'agit de savoir si des récepteurs à la sérotonine portés par la microglie conditionnent les effets de la fluoxétine, un antidépresseur inefficace chez un tiers des patients pour des raisons que le porteur dit indéterminées.
Objectifs
La dépression et l’anxiété représentent les troubles psychiatriques les plus répandus à l’échelle mondiale, touchant environ 332 millions de personnes. Les traitements de première intention appartiennent à la famille des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS), mais leur efficacité est très variable, et 1/3 des personnes traitées y sont insensibles pour des raisons encore indéterminées. Les ISRS, tels que la fluoxétine, augmentent les concentrations extracellulaires de sérotonine en bloquant sa recapture. Chez la souris, un traitement chronique de fluoxétine provoque à la fois une diminution de l’anxiété et des processus de plasticité dont une augmentation de la neurogenèse adulte dans l’hippocampe. Il a par ailleurs été montré que cette neurogenèse adulte est diminuée dans les modèles murins de dépression et qu’elle est nécessaire pour permettre les effets anxiolytiques de la fluoxétine. La microglie, c'est-à-dire les cellules immunitaires du cerveau, joue un rôle important dans la régulation de la neuroinflammation. En situation de stress, d’infection ou de lésion, elle adopte un phénotype pro-inflammatoire qui favorise la défense immunitaire. À l’inverse, lorsque la menace est résolue ou pour maintenir l’homéostasie, elle adopte un phénotype anti-inflammatoire qui soutient la réparation tissulaire, et favorise la neurogenèse adulte. Toutefois, une persistance de l’état pro-inflammatoire peut se produire, et un nombre croissant d’études suggère que cet état pourrait contribuer à la pathophysiologie de la dépression. Corrélativement, il a été montré que la fluoxétine peut réduire l’activation pro-inflammatoire de la microglie, suggérant une régulation de ces cellules par la sérotonine. Ce lien entre neuro-inflammation et dépression oriente la recherche vers des traitements ciblant la microglie et l’inflammation cérébrale, en particulier pour les patients résistants aux antidépresseurs classiques. La modulation de la microglie, sans supprimer son activité essentielle, pourrait représenter une stratégie pour améliorer les symptômes ou limiter les dégâts liés à la maladie. Dans ce cadre, nous nous intéresserons à des récepteurs à la sérotonine spécifiquement exprimés par la microglie. Notre projet a pour objectif de déterminer si l’expression de ces récepteurs par la microglie est nécessaire pour permettre les effets de la fluoxétine sur l’anxiété et la neurogenèse adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le rôle de la microglie, et de sa régulation par la sérotonine, dans les effets des antidépresseurs qui modulent les niveaux de sérotonine dans le cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre comment la sérotonine, un neurotransmetteur clé dans la régulation de l’humeur, influence la microglie, et donc d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions neurones - cellules immunitaires dans le cerveau. Elle pourrait également permettre d’identifier, de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dépression, notamment pour les patients qui présentent des résistances aux traitements pharmacologiques classiques.
Procédures
Dans ce projet, des animaux âgés de 4 à 6 semaines vont recevoir par gavage oral un composé pharmacologique pour bloquer l’expression d’un récepteur dans un type cellulaire spécifique. 2 prises espacées de 48h sont nécessaires. L’acte est réalisé sur animal vigile et dure moins de 30 secondes. Les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental (absence d’abri et de matériel pour faire un nid) afin d’induire un stress basal modéré pour une durée totale de 4 à 7 semaines selon la procédure et seront répartis dans 4 lots différents. Dans le lot 1, ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson pour une durée totale de 5-7 semaines. Au cours du traitement, ils seront soumis à 2 tests comportementaux : un qui mesure l’anhédonie (un marqueur de la dépression) sur une durée d’1 heure, et un qui mesure l’anxiété pendant une durée maximum de 10 minutes, avec 7 jours d’intervalle entre les 2 tests. Dans le lot 2, ils recevront un traitement anxiolytique par une injection unique sur animal vigile (geste durant moins de 20 secondes), et seront soumis à un test mesurant l’anxiété sur une période de 10 minutes maximum. - Dans le test d’anhédonie, les animaux sont aspergés sur le dos avec une solution de sucrose, ce qui déclenche une activité intense de toilettage pendant environ une heure, et la qualité du toilettage du pelage sera mesurée à l’aide d’un score dans l’heure qui suit, ainsi que 24h après. - Dans le test d’anxiété, les animaux préalablement soumis à un jeûne alimentaire la veille (durée du jeûne : 18 heures), sont placés individuellement dans une cage inconnue et fortement illuminée. La latence pour aller manger une croquette située au centre de la cage est mesurée sur une période de 10 min. - Dans les lots 3 et 4, les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental afin d’induire un stress basal pour une durée totale de 4 semaines, pendant laquelle ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson, également pendant 4 semaines. Ils recevront soit une unique injection intrapéritonéale d’un marqueur de division cellulaire (geste durant moins de 20 secondes), soit 2 injections à 2h d’intervalle et réalisées de chaque côté de l’animal pour limiter les douleurs répétées au même site d’injection. Enfin, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée à l’issue des 2 procédures. Ce geste dure moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’hébergement sans enrichissement environnemental, le jeûne alimentaire de 18h ainsi que le test comportemental associé à ce jeûne (test suppression de la prise alimentaire par la nouveauté) vont provoquer un stress modéré. Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par gavage, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure au niveau de l’œsophage lors de l’insertion de la sonde de gavage, et un risque mineur de “fausse route”. Le traitement pharmacologique dans l’eau de boisson peut entraîner une baisse de la consommation hydrique. L’injection IP peut générer une douleur légère et transitoire au point d’injection, avec un risque de péritonite si l’acte est répété. L'anesthésie peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire voire un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale et du lien entre microglie et effets des antidépresseurs et anxiolytiques.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales, induites par un traitement antidépresseur, sur la neurogenèse adulte et sur le comportement. De manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, leur remplacement par une approche cellulaire est toujours privilégié, comme des cultures primaires de neurones lorsque la question scientifique posée le permet. Nous pourrions envisager de mettre en place des cultures in vitro composées de microglies (cellules immunitaires du cerveau), de neurones sérotoninergiques et de cellules souches neurales (cellules peuvent donner naissance à des nouveaux neurones), afin d’observer l’effet des antidépresseurs sur ces différents types cellulaires, mais cette méthode ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre cellules et des circuits impliqués dans les effets des antidépresseurs, surtout au stade adulte. Par ailleurs, l’anxiété est un état qui se mesure par le comportement d’un animal éveillé, qui doit pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (odorat, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir, via les hormones de stress, plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, mais on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux effets des antidépresseurs de type ISRS.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des tests statistiques adéquats tels que des ANOVA pour des comparaisons multiples afin de comparer nos différents groupes de génotypes et de traitement, ou des t-test. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 1104 sur 5 ans.
Raffinement
Conditions d’hébergement : Dans nos expériences, les enrichissements seront retirés à l’âge de 10-12 semaines et ce pendant une durée de 4 à 7 semaines selon la procédure, pour générer un stress permettant d’obtenir un effet antidépresseur ou anxiolytique des composés pharmacologiques qui font l’objet de notre étude. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum la douleur et/ou le stress en termes de durée et d’intensité. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations sont effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Concernant le traitement antidépresseur, nous avons pris l’initiative d’administrer notre traitement dans l’eau de boisson (prise hydrique volontaire de l’animal), au lieu de l’injecter par voie intra-péritonéale, ce qui diminue considérablement la manipulation des animaux et évite les actes douloureux. Concernant la perfusion intracardiaque, les animaux sont injectés avec l'anesthésique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux réglementations, et de manière rapprochée pendant le déroulement de la procédure. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant/après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, injection de solution saline et/ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par perfusion intracardiaque pour être utilisés dans les mises au point.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour nos études car en tant que mammifère, son système nerveux présente des homologies importantes avec l’homme. En effet, l’organisation des structures cérébrales et des différentes voies qui les connectent sont similaires entre ces 2 espèces. Les voies sérotoninergiques ainsi que les récepteurs à la sérotonine, sont bien décrites chez la souris, et comparables avec ceux décrits chez l’homme. La souris adulte est le modèle standard pour l’évaluation des effets neurobiologiques des antidépresseurs de type ISRS et les paradigmes comportementaux sont validés. Utiliser la souris est essentiel pour garantir la comparabilité et la reproductibilité avec des études effectuées précédemment. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider des gènes précis spécifiquement dans un type cellulaire donné et à un stade ou âge donné. Dans notre étude, les animaux auront un développement normal, puis nous induirons à l’âge de 4 semaines, l’invalidation d’un gène spécifiquement dans la microglie. Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience. Les animaux seront ensuite traités à partir de 10 semaines avec un antidépresseur, classiquement donné en médecine humaine pour soigner les troubles dépressifs et anxieux.
Etude et traitement thérapeutique des défauts cérébraux dans 2 modèles de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinquante-six injections intrapéritonéales ou cinquante-six gavages en un mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 3 840 d'entre elles et sévère pour 2 176, 240 étant tuées sans réveil. L'épilepsie est déclenchée par une injection de kaïnate qui provoque une détresse sévère pouvant aller jusqu'à la mort, et le gavage expose à la perforation de l'œsophage et au passage du produit dans les poumons. Le bénéfice mis en avant reste interne à la recherche, il s'agit de disposer de modèles animaux permettant de tester ensuite des médicaments déjà utilisés en clinique pour d'autres maladies.
Objectifs
Ce projet étudie deux gènes impliqués dans la formation du cil primaire, une petite antenne présente dans la plupart des cellules de l’organisme captant des signaux chimiques et mécaniques. Une anomalie de ce cil primaire entraine des maladies sévères affectant la plupart des organes. Ce projet vise à comprendre si les mutations de ces deux gènes chez la souris entrainent des défauts cérébraux ou des épilepsies. Enfin, ce projet évaluera 4 traitements médicamenteux sur le développement de ces défauts cérébraux.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est d’étudier si les mutations de 2 gènes importants pour la formation du cil primaire (petite antenne cellulaire présente sur la plupart des cellules de l’organisme) entrainent des troubles cognitifs et comportementaux. Ceci nous permettra de développer des modèles animaux sur lesquels nous pourrons tester des médicaments qui sont déjà utilisés en clinique pour d’autres applications ou qui ont montré un effet bénéfique dans d’autres pathologies chez la souris.
Procédures
- Contention et anesthésie (injection ip): 5 secondes, 1 fois/animal. - Chirurgie terminale sous anesthésie pour perfusion intracardiaque: 4 minutes, 1 fois/animal. - Injections ip de composés thérapeutiques : 10 secondes, maximum 2 fois/jour pendant 1 mois (max 56 injections ip/souris) - Administration orale de composés thérapeutiques : 30 secondes, maximum 2 fois/jour pendant 1 mois (max 56 gavage/souris) - Induction d’une épilepsie par injection ip de kainate : 2 heures, 1 fois/animal
Impact sur les animaux
- Contention : peut causer un stress léger de courte durée. - Chirurgie terminale sous anesthésie pour perfusion intracardiaque: douleur modérée - Injection ip : douleur légère et passagère ainsi qu’une irritation de la zone d’injection - Administration orale : risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. - Induction de l’épilepsie : provoque une détresse sévère chez l’animal pouvant induire une mort potentielle dépendant de la sévérité des crises.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l'étude pour prélèvement de tissus et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques étudiées dans ce projet ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. De plus ce projet étudiant l’épilepsie nécessite une approche qui n’est réalisable qu’à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux. Les animaux subissant un prélèvement de sang recevront une analgésie préalable à l’anesthésie générale. Afin de limiter la souffrance due aux injections, celles-ci seront réalisées avec des seringues à Insuline très fine qui donnent une injection quasi indolore. Afin de réduire les risques de perforation de l’œsophage liés aux administrations orales, des sondes adaptées seront utilisées. L’induction de l’épilepsie s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un développement du cortex cérébral et un fonctionnement du système nerveux similaires. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades juvéniles (avant la fin de maturation du cerveau) ou à l’âge adulte (quand la maturation du cerveau est bien finie).
Effets de l’acide valproïque sur la reproduction chez l’animal épileptique – Etude pilote MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris d'une souche non consanguine, choisies pour leur variabilité génétique, vont être rendues épileptiques à vie par injections répétées d'un agent convulsivant. 448 souris vont être utilisées au total, 96 femelles et 352 descendants, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'état convulsif recherché dure au moins trente minutes, avec des contractions musculaires involontaires douloureuses, et le porteur attend une mortalité de 30 à 50 % par arrêt cardio-respiratoire à cette seule étape. Les survivantes boivent ensuite de l'acide valproïque dilué dans leur eau pendant deux à huit semaines, sont mises à la reproduction, et leurs filles reçoivent deux injections d'hormones pour la récupération d'ovocytes, avant que toutes soient tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les médicaments antiépileptiques représentent un enjeu majeur dans la recherche pour la santé publique. L’épilepsie affecte plus de 60 millions de personnes dans le monde. De nombreuses études ont montré le risque de provoquer des malformations chez l’embryon au cours de son développement de certains traitements antiépileptiques. Cependant beaucoup de femmes atteintes d’épilepsie continuent d’être traitées au cours de leur grossesse et allaitement. En plus du risque de malformations au cours du développement, l’acide valproïque, un traitement antiépileptique largement prescrit ces cinquante dernières années, a montré des effets secondaires persistant sur plusieurs générations chez des rongeurs. Ces études ont utilisé des animaux non atteints d’épilepsie, de plus le traitement antiépileptique n’a été administré que sur de courtes périodes. Pour rendre compte de la réalité clinique, il est nécessaire de tester chez des animaux atteints d’épilepsie les effets secondaires sur plusieurs générations de l’acide valproïque et autres traitements sur une longue période, et ainsi montrer que l’exposition aux antiépileptiques peut être un facteur de risque chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but, dans un premier temps, de tester la possibilité d’induire une épilepsie chez une souche de souris non consanguine (souris générées par des croisements d’animaux non apparentés) ainsi que de s’assurer de la capacité de ces animaux à se reproduire. Utiliser une souche de souris non consanguine permet de se rapprocher au mieux de la réalité chez l’homme (forte variabilité génétique contrairement aux souches de souris consanguines) afin d’évaluer de potentiels facteurs de risque. Dans un second temps, l’objectif de cette étude pilote est de déterminer une concentration optimale d’acide valproïque qui permette de se rapprocher au mieux de la concentration thérapeutique utilisée chez les patients et qui n’empêche ni la reproduction des animaux épileptiques traités, ni la viabilité des portées engendrées par ces animaux. Valider les étapes expérimentales de cette étude pilote supporterait la mise en œuvre d’un projet dont l’objectif est de déterminer dans quelle mesure les médicaments antiépileptiques affectent les descendances (au moins sur trois générations) de souris femelles épileptiques exposées à ces traitements. Ces objectifs de recherche dans le traitement de l’épilepsie se placent dans un cadre de santé publique.
Bénéfices attendus
En validant la possibilité d’induire un modèle d’épilepsie chez des souris femelles et de reproduire ces animaux traités à l’acide valproïque, cette étude pilote permettra à plus long terme de mieux comprendre les effets observés sur plusieurs générations des médicaments antiépileptiques. Démontrer le facteur de risque pour l’Homme que représentent les antiépileptiques aidera à améliorer les traitements de l’épilepsie ainsi que de limiter les effets secondaires sur les futures générations.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement à un agent épileptogène qui permet le développement d'une épilepsie qui perdure à vie. Ce traitement est injecté à plusieurs reprises si nécessaire. Une première dose est injectée 30 minutes après l’administration d’un médicament protégeant des effets secondaires de ce traitement. Si au cours des 20 minutes suivant cette injection l’animal ne présente pas d’état convulsif, alors une seconde dose, plus faible, est injectée. Si aucun état convulsif n’est observé chez l’animal 10 minutes après cette seconde dose, alors une dose encore plus faible est administrée de façon répétée (toutes les 10 minutes) jusqu'à apparition d'un état convulsif. L’état convulsif doit durer au minimum 30 minutes pour qu’une souris soit considérée en épilepsie chronique. Passé ce délai, un anticonvulsivant est administré à l’animal. Ces animaux ingéreront un traitement antiépileptique directement dilué dans leur eau pour une durée minimum de deux semaines pouvant aller jusqu’à 8 semaines. MODIFICATION – Les femelles issues des portées recevront à 6-8 semaines 2 injections d’hormones espacées de 48heures.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus durant l’induction de l’épilepsie. Pour induire cette épilepsie il est nécessaire de déclencher un état convulsif chez les souris naïves. Pour obtenir cet état convulsif, les animaux subissent des injections répétées d’un agent épileptogène qui peuvent induire un stress au cours de la contention de l’animal. L’état convulsif dure au minimum 30 minutes au cours desquelles les animaux peuvent ressentir des douleurs dues aux contractions musculaires involontaires. Une perte de poids peut subvenir mais elle se rattrape dès le deuxième/troisième jour suivant l’induction de l’épilepsie. Au cours de cette procédure une mortalité de 30 à 50% est attendue due aux effets secondaires de l’agent épileptogène injecté (arrêts cardio-respiratoires). L'ajout du traitement antiépileptique dans l'eau des boissons des animaux pourrait avoir des effets indésirables sur les animaux tels qu'une diminution dans la prise d'eau et perte de poids. Ces effets seront surveillés afin de ne pas dépasser de points limites. Les effets de l’épilepsie et du traitement à l’acide valproïque étant inconnus sur le comportement de reproduction des femelles, des nuisances pourraient être occasionnées par celles-ci sur leurs portées telles qu’un manque de soin (peu ou pas d’allaitement) ou des blessures physiques. Également, durant les périodes de gestation, des complications pourraient survenir engendrant un état de stress et de douleur (contractions prolongées, terme de mise-bas dépassé). MODIFICATION – Les deux injections d’hormones pour stimuler l’ovulation et récupérer les ovocytes chez les femelles des portées peut engendrer un stress à la suite de la contention et une légère douleur à l’introduction de l’aiguille. A la fin de l’étude ou dans le cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront transférés dans une cuve d'induction afin de les anesthésier avant euthanasie. Cette manipulation peut engendrer un stress chez l'animal avant d'être complètement anesthésié.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Au cours de cette étude pilote, il sera développé et utilisé un modèle d’épilepsie chez la souris reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’Homme (affects cognitifs et comportementaux). L’épilepsie est une pathologie dont l’origine est localisée dans le cerveau, qui est un organe contrôlant l’ensemble des fonctions de l’organisme. De ce fait, les effets recherchés du traitement antiépileptique nécessitent l’accès à l’organisme entier (étude du comportement de reproduction, atteintes anatomiques sur les portées générées), ce qui n’est pas compatible avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale telles que la modélisation informatique ou bien les expériences in vitro. De plus, il est compliqué d’étudier les conséquences d’un traitement sur plusieurs générations chez un modèle humain. C’est pourquoi le modèle animal se retrouve nécessaire pour mener ce projet de recherche dont le but est de mieux comprendre les effets secondaires transgénérationnels, potentiellement dangereux pour la santé, des antiépileptiques.
Réduction
Le caractère méconnu des mécanismes cérébraux de l’épilepsie ne permet pas de calculer un nombre précis d’animaux pour les différentes procédures de cette étude pilote. L’induction de l’épilepsie peut engendrer une mortalité de 30 à 50% chez les animaux. Compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle, du comportement de reproduction inconnu chez les souris épileptique et de ce taux de mortalité, le nombre d’animaux a été optimisé à 448 souris CD-1 (96 femelles et une estimation de 352 souris générées par reproduction d’une partie de ces souris) pour permettre d’obtenir les observations nécessaires à cette étude, tout en réduisant au minimum le nombre d’animaux. L’organisation des animaux en différents lots permettra dans le cas d’un taux de mortalité plus faible que prévu de ne pas avoir recours au nombre total d’animaux estimé pour cette étude. Les souris femelles seront utilisées pour l’ensemble des procédures.
Raffinement
Au cours de cette étude pilote, des points limites suffisamment précoces et adaptés pour chaque procédure (induction épilepsie et traitement antiepileptique) seront mis en place pour réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse chez les animaux durant les manipulations ainsi qu’en dehors de ces périodes. Les animaux seront suivis quotidiennement jusqu’à leur mort. Leur poids ainsi que différentes variables, regroupées sur des fiches de suivi, seront surveillés afin de pallier quelconques signes de douleur ou de souffrance. Selon les observations, un protocole prévoit une action curative pouvant impliquer l’utilisation de médications pour soulager rapidement la douleur. L’induction de l’épilepsie chez les souris nécessite l’injection répétée de substance épileptogène. Le comportement de chaque souris sera surveillé entre chaque injection et permettra de prendre la décision de réinjecter ou non chaque animal individuellement. Ce protocole individualisé permet de réduire le temps de souffrance que les souris peuvent subir jusqu’à l’apparition d’une épilepsie chronique et accélère leur rétablissement. La semaine suivant l’induction de l’épilepsie, les animaux seront observés deux fois par jour pour s’assurer de leur bonne récupération, surtout dans la perte de poids qui peut survenir les 2 premiers jours. Des croquettes ramollies dans de l’eau avec du sucre seront placées dans les cages afin de réduire la perte de poids et faciliter la convalescence. Au cours du début du traitement antiépileptique, une attention particulière sera portée sur l’abreuvement des animaux. Si le traitement présente un caractère trop aversif et provoque des déshydrations trop importantes, celui-ci sera interrompu. Après accouplement, les femelles seront surveillées 2 fois par jour au cours de la dernière semaine de gestation afin de s’assurer que la mise-bas se déroule correctement. Les portées générées seront également surveillées et pesées quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne croissance jusqu’au sevrage. Une attention particulière sera portée sur le comportement des mères envers leurs portées pour s’assurer que les souriceaux sont bien allaités et ne subissent pas de violences physiques. Le bien-être des animaux est également privilégié au niveau de leurs conditions d’hébergement. Ils seront regroupés par 2 jusqu’à 4 selon la taille des cages. Des études montrent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu’ils sont hébergés en groupe.
Choix des espèces
De nombreuses études ont montré la similarité des régions cérébrales impliquées dans l’épilepsie entre l’Homme et les rongeurs (rats et souris). Cette similarité permettra de mieux extrapoler les résultats de notre étude aux mécanismes pathologiques chez l’Homme. Des souris d’au minimum 6 semaines seront utilisées, cet âge correspondant à la maturité sexuelle nécessaire pour la reproduction. Les portées générées seront conservées jusqu’au sevrage (21jours après la parturition) pour étudier leur croissance.
Thérapie génique chez des souris modèles de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour tester des outils de thérapie génique contre la myopathie de Duchenne, 2 640 souris porteuses de mutations du gène de la dystrophine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Les mâles reçoivent une injection intracérébrale au lendemain de leur naissance, sous anesthésie générale, d'autres une micropompe et un transpondeur posés le même jour. Suivent des tests comportementaux que le porteur nomme, exploration spontanée, conditionnement sur trois jours, apprentissage en groupe de stratégies de recherche de boisson pendant vingt-huit jours en continu. Sur l'effectif, il écrit lui-même que le nombre d'animaux prévu est "largement surestimé", plusieurs cohortes devant être abandonnées si les tests ne détectent pas de déficit ou si les traitements sont inefficaces.
Objectifs
La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique récessive liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 naissances, causée par des mutations dans le gène qui produit des protéines nommées dystrophines. En plus d’une dégradation progressive des muscles squelettiques, des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques touchent une grande partie des patients DMD. Les avancées récentes dans notre compréhension des mécanismes dépendants des dystrophines et responsables de la myopathie de Duchenne (DMD) ont conduit au développement d’outils innovants en thérapie moléculaire et en thérapie génique. Cependant, leur capacité à corriger toutes les altérations cognitives associées à cette maladie reste actuellement partielle. Il convient de tester de nouvelles molécules et de nouvelles voies d’administration, afin d’évaluer la possibilité de compenser ces troubles du neurodéveloppement tout comme les troubles musculaires. Le projet a pour but de tester de nouveaux outils de thérapie génique et de les administrer le plus tôt possible, avant qu’une partie des altérations cérébrales se développent dans la période postnatale. Ceci déterminera quels déficits peuvent être compensés, et quels sont ceux qui sont irréversibles du fait d’anomalies déjà induites pendant la vie fœtale. Les déficits cérébraux étant de nature différente en fonction de la position de la mutation, plusieurs souris modèles porteuses de différentes mutations seront testées. Ce projet est donc crucial pour le développement de nouvelles offres thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le cerveau chez les enfants atteints de DMD.
Bénéfices attendus
Les troubles cognitifs et comportementaux des patients atteints de myopathie de Duchenne sont variables en fonction de la position des mutations dans le gène responsable de la maladie. Les thérapies géniques sont donc développées à la carte et nécessitent de nombreuses évaluations précliniques chez la souris. Cibler le cerveau est particulièrement difficile, et il est actuellement considéré que des cocktails de molécules thérapeutiques seront nécessaires et que l’âge d’administration est un facteur déterminant. Ce projet permettra de déterminer un traitement optimal pour améliorer les fonctions comportementales affectées par la maladie, et identifiera également l'âge optimal d'administration d'un traitement. Nos comparaisons de plusieurs souris modèles permettront de préciser l’impact de différentes mutations dans l’apparition des déficits cérébraux, et d’identifier les traitements permettant de les compenser. Les découvertes issues de ces études ont un intérêt critique pour l’orientation du traitement d’un nombre important de patients atteints de DMD. L’objectif principal est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques.
Procédures
Une anesthésie gazeuse de courte durée (
Impact sur les animaux
Certaines interventions chirurgicales peuvent occasionner une douleur légère postopératoire, et certains tests comportementaux un stress de courte durée qui se traduira par une réduction de l’activité exploratoire.
Devenir
À la suite des tests comportementaux, les souris tests seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de leur cerveau.
Remplacement
Nos molécules thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats, non toxiques, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation sur animaux vivants. Ensuite, les études précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine chez lesquelles les troubles comportementaux sont préalablement caractérisés, afin de servir de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique donc d’effectuer des tests fonctionnels (comportementaux) qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et pouvant se comporter librement.
Réduction
La sélection préalable des traitements in vitro, identifiant des molécules à fort potentiel thérapeutique et non toxiques, permet de limiter le nombre d’études sur animaux vivants. De plus, seules les molécules montrant des effets bénéfiques après injection dans le cerveau seront testées après injection intraveineuse. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet est donc largement surestimé, car si certains tests comportementaux n’ont pas permis de détecter de déficit en période postnatale, ou si certains traitements sont inefficaces, plusieurs cohortes seront abandonnées et certains traitements ne seront pas testés en injections intraveineuses. Après sélection pour nos études de comportement, le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base des publications utilisant des méthodes similaires d’analyse du comportement, la réussite des expériences nécessite 12-15 souris par groupe. Les groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles indispensables aux analyses statistiques. Nos études sont en grande partie longitudinales et les souris seront soumises à plusieurs tests, ce qui permet aussi de réduire le nombre total d’animaux. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, ils auront 5-7 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement à leur arrivée. Les tests comportementaux induisant de l’anxiété sont très courts (
Choix des espèces
D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les troubles émotionnels et sociaux ont uniquement été étudiés chez les souris modèles. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur des souris présentant cette maladie, chez lesquelles les déficits comportementaux identifiés servent de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Les traitements seront administrés soit le lendemain de la naissance, soit plus tard à l'âge de 3-4 semaines ou chez des jeunes adultes (6 semaines). Les tests fonctionnels (comportement) seront effectués pendant la période après sevrage (3-6 semaines) et/ou à l’âge adulte (2 à 5 mois), bien avant l'apparition des troubles musculaires (myopathie).
EMIPAL : Évaluation des Micro-ondes pour l’Imagerie des AVC chez le Lapin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour valider un appareil d'imagerie cérébrale à micro-ondes censé exclure un hématome avant une thrombolyse, 32 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse des tissus. Chaque animal passe deux anesthésies générales, la première d'environ une heure avec cinq expositions successives aux micro-ondes, la seconde d'une à deux heures pour qu'un hématome intracrânien lui soit provoqué par chirurgie. Le porteur mentionne une possible perturbation passagère de la nutrition, de la vision ou de l'équilibre, ainsi qu'un stress thermique superficiel de la peau qu'un thermomètre infrarouge permettra de vérifier. Le résumé ne dit ni à quel moment les animaux sont mis à mort après l'induction de l'hématome, ni quels points limites s'appliquent, la surveillance étant décrite comme "a minima quotidienne".
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est une urgence médicale nécessitant une prise en charge rapide et adaptée. Il existe deux formes principales : • L’AVC ischémique (80 % des cas), causé par l’obstruction d’un vaisseau, traité par thrombolyse ou thrombectomie. • L’AVC hémorragique (20 % des cas), dû à une rupture vasculaire avec saignement intra-parenchymateux, où la thrombolyse est contre-indiquée. En cas de déficit neurologique brutal persistant, les deux seuls diagnostics possibles sont un AVC ischémique ou un hématome. Actuellement, la différenciation repose sur l’imagerie (scanner cérébral, Imagerie par Résonance Magnétique), souvent indisponible en milieu préhospitalier. L'appareil testé, technologie d’imagerie cérébrale à micro-ondes, non invasive et portable, vise à exclure un hématome, permettant ainsi de diagnostiquer un AVC ischémique et d’initier rapidement la thrombolyse. Cette approche s’aligne sur les pratiques internationales, où seul le scanner est utilisé pour exclure un saignement avant le traitement. Ce projet a pour but de développer une technologie d'imagerie cérébrale portable utilisant des micro-ondes pour détecter de AVC. Il vise à valider la sécurité et l'efficacité de cette technologie dans un modèle animal préclinique (lapins).
Bénéfices attendus
- Diagnostic rapide et précis des AVC pour améliorer les soins et réduire les dommages cérébraux. - Développement d'une méthode non invasive, portable, et économique pour les centres médicaux. - Réduction des coûts des soins neurologiques et augmentation de la disponibilité d'outils diagnostiques dans les hôpitaux.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à deux anesthésies générales : 1ère phase 1. Pour les animaux du groupe témoin : o Tous seront soumis à une anesthésie générale. 2. Pour les animaux du groupe expérimental : o Tous seront soumis à une anesthésie générale, installés dans l’appareil et exposé aux mesures par micro-ondes 5 fois de suite. La durée de l’anesthésie générale sera d’environ 1 heure pour chacun. 2ème phase Tous les animaux seront à nouveau placés sous anesthésie générale et une induction d’un hématome intracranien sera réalisée par voie chirurgicale (modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) hémorragique) (durée 1 à 2 h environ).
Impact sur les animaux
Des effets indésirables temporaires pourraient-être être observés après la première phase (anesthésie générale +/- exposition aux mico-ondes), tels que : 1-Perturbation passagère de la nutrition, de la vision ou de l’équilibre de l’animal 2-Possible stress thermique superficiel à la peau. Cette possibilité peut être vérifiée en mesurant la température avec un thermomètre infrarouge afin de garantir la sécurité de l’appareil. 3-Moment de stress avant et après l’anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés conformément aux protocoles réglementaires pour permettre l'analyse post-mortem des tissus.
Remplacement
Des simulations numériques (in silico) ont été réalisées pour limiter le nombre d’animaux requis, ce qui reste néanmoins indispensable avant les essais chez l'homme. Cependant, bien que les tests in silico aient fourni des données utiles, ils ne permettent pas de modéliser de manière complète les effets directs des ondes électromagnétiques sur le système nerveux en conditions réelles. C’est pourquoi des tests sur des modèles animaux, notamment des lapins, sont indispensables pour valider les résultats in vivo, en particulier en ce qui concerne la détection des AVC.
Réduction
Étant donné que le processus de création d’un modèle d’AVC est invasif et complexe, le protocole a été optimisé afin de minimiser le nombre de lapins nécessaires, tout en garantissant la robustesse des résultats. Une première expérimentation sera effectuée sur une série de 16 lapins. Ces derniers sont utilisés dans deux phases successives correspondant respectivement à 1) vérifier l’innocuité de l’utilisation du dispositif puis 2) mesurer l’efficacité du dispositif à exclure un hématome, maximisant ainsi l’utilisation des mêmes sujets. Cette expérimentation pourra être renouvelée sur tout ou partie de la procédure afin de confirmer les résultats obtenus, portant à 32 le nombre maximum de lapins prévus.
Raffinement
Anesthésie pendant les procédures : Tous les lapins sont placés sous anesthésie générale et analgésie pour minimiser la douleur pendant les phases d’induction des modèles d’AVC et garantir leur immobilité lors des expériences, y compris les phases d’imagerie sur les lapins sains. Cette mesure permet non seulement de garantir leur immobilité, mais aussi de garantir leur confort tout au long de l'essai. Pour les lapins sains, cela aide également à éviter le stress et à maintenir leur calme, tout en permettant d'obtenir des résultats fiables sans mouvement. Enrichissement environnemental : Pour garantir le bien-être des lapins, l’environnement du lapin est enrichi (buchettes à ronger en particulier). Une surveillance a minima quotidiens des animaux est mise en place pour détecter tout signe de douleur, de stress.
Choix des espèces
Des lapins d’un poids minimum de 3 kg sont utilisés dans ces expériences, en concordance avec la taille du dispositif à l’étude. Les lapins de plus de 3 kg sont choisis en raison de la similarité de leur système cérébrovasculaire avec celui des humains, ce qui permet une modélisation pertinente des AVC.
Etude spatio-temporelle au long terme de l’implication de l’environnement neurochimique sur la régulation de l’excitabilité neuronale chez un modèle de souris épileptique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une à deux chirurgies du crâne sous anesthésie, puis des crises d'épilepsie généralisées provoquées ou une épilepsie du lobe temporal installée durablement : 300 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie d'entre elles est en outre privée de sommeil ou exposée à un stress, sous surveillance vidéo continue, pour mesurer l'effet de ces facteurs sur les crises. Le porteur décrit les crises comme source d'un "stress de courte durée", tout en signalant l'atonie fréquente qui les suit et une perte de poids par malnutrition pendant les 24 à 48 heures suivant l'induction. Toutes les souris sont tuées puis perfusées pour prélever leur cerveau.
Objectifs
L’épilepsie touche environ 1% de la population mondiale et, dans 30% des cas, aucun médicament ne permet le contrôle des crises. Cette forme de la maladie dite pharmaco-résistante est souvent associée à de nombreuses comorbidités et complications (ex. troubles cognitifs). Son coût pour la société est estimé à 14 milliards d'euros par an en Europe et, malgré l’accès à plus d’une quinzaine de nouveaux médicaments anti-crises, le taux d’épilepsie réfractaire n’a pas changé en 30 ans. Ce constat difficile est en partie dû au fait que nous ne comprenons pas bien les mécanismes de déclenchement des crises épileptiques dans le cerveau. De plus, la plupart des patients souffrent de crises présentant une certaine rythmicité, suggérant l’existence de mécanismes biologiques sous-jacents liés au temps, comme des fluctuations cycliques dans l’activité cérébrale. Ces observations soulèvent l’hypothèse que l’excitabilité neuronale pourrait être modulée par des variations lentes de certains neurotransmetteurs et neuromodulateurs. Notre étude vise précisément à explorer cette hypothèse, en étudiant comment le cerveau contrôle l’excitabilité neuronale à long terme à travers les fluctuations de ces molécules.
Bénéfices attendus
L’observation des fluctuations de l’environnement neurochimique survenant dans une multitude de zones cérébrales, que nous permet notre approche expérimentale, apportera un regard nouveau non seulement sur les mécanismes de genèse des crises d’épilepsie, mais aussi, plus largement, sur la manière dont le cerveau régule l’excitabilité neuronale. Ce projet ambitieux permettra d’établir une carte spatio-temporelle de l’environnement neurochimique lié aux états cérébraux physiologiques et épileptiques, et aura donc un impact important pour les communautés neuroscientifique et médicale et à plus long-terme pour le developpemnet de nouvelles cibles therapeutiques.
Procédures
Les animaux subiront une à deux chirurgies sous anesthésie générale et avec analgésie.. De plus, la plupart des animaux vont subir soit une ou plusieurs crises aiguës généralisées (une crise dure quelques secondes à une minute) soit développer une épilepsie du lobe temporal. Tous les animaux seront suivis de près après chirurgie et induction d’une crise, et le cas échéant traités avec des soins adaptés (ex : analgésique pour la douleur, anti-convulsant pour la crise). Un certain nombre de souris sera également soumis soit à une privation de sommeil courte soit à un stress de courte durée de faible intensité, accompagnés d’un monitoring vidéo continu pour analyser les comportements et comprendre la place du manque de sommeil ou d’un événement stressant dans l’influence des crises épileptiques.
Impact sur les animaux
La procédure implique deux chirurgies sous anesthésie générale. Cette intervention entraîne une douleur modérée qui sera atténuée par un analgésique avant et pendant l’opération et des analgésiques pendant les 3 jours postopératoires. De plus, cela entraîne une déshydratation légère de courte durée qui sera prévenue par une dose de sérum physiologique durant la chirurgie. Crises épileptiques induites ou spontanées : les crises peuvent entraîner un stress de courte durée. Pendant la période post-crise, les animaux présentent très souvent une atonie et tout sera fait pour éviter de perturber les animaux pendant cette période critique. De plus, l’induction de l’épilepsie entraîne un stress métabolique/malnutrition chez beaucoup d’animaux avec une perte de poids durant les 24 à 48h post-induction que la plupart vont récupérer rapidement au cours de prochains jours. Nous avons mis en place un protocole de suivi spécifique post-induction pour suivre le bien-être de nos animaux durant cette période critique. Les animaux seront généralement hébergés avec leurs congénères mais séparés par des parois perforées, permettant un contact visuel, olfactif et auditif.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés puis perfusés, afin de collecter leurs cerveaux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative tangible pour ce projet. En effet, notre étude utilise des méthodologies impossibles à utiliser chez l’homme/patients. Des modèles de simulations informatiques compléteront notre étude mais nous devons d’abord avoir une compréhension plus claire du rôle du stress sur les crises épileptiques.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux requis pour ce projet, nous mettrons en place des contrôles internes (mesures répétées) chaque fois que cela sera possible. Cette approche présente un double avantage : elle permet de réduire le nombre de groupes expérimentaux nécessaires, tout en augmentant la puissance statistique (observations répétées sur le même animal) de l’étude grâce à une meilleure maîtrise de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Les animaux seront tous hébergés en groupe avec un suivi hebdomadaire renforcé sur l'état de chaque individu en termes de bien-être. Pour le modèle d’épilepsie utilisé, un protocole de suivi de la crise épileptique a été optimisé. En effet, comme pour les patients, si la crise dure moins de 5 minutes, l’animal n’est pas traité pour cette crise sauf être mis au calme. En revanche, si la crise dure plus de 5 minutes, l’animal se verra administrer un anti-convulsif. Pour toutes chirurgies, les animaux seront anesthésiés de manière générale avec l'administration d'analgésiques appropriés en amont, durant et après l'opération pendant plusieurs jours. De plus, tous les animaux seront suivis post-chirurgie induction d'épilepsie pendant plusieurs jours de manière renforcée pour limiter au maximum stress et douleur à l'aide de grille d'évaluation. Enfin, les points limites stricts propres au projet seront appliqués afin d'apporter des soins adaptés le cas échéant.
Choix des espèces
Ce projet utilise des modèles de souris adultes épileptiques pour étudier au mieux les épilepsies du lobe temporal chez les patients adultes. En effet, l’étude proposée ainsi que les méthodologies utilisées ne sont pas applicables aux patients. De tous les modèles expérimentaux, le cerveau de souris offre un grand nombre d'avantages : il est structurellement très proche du cerveau humain, et il est assez gros pour permettre l’utilisation de méthodes d’enregistrements précises. De plus, par rapport au rat ou au primate, la souris permet d’utiliser un éventail très large d’outils génétiques, développés dans cette espèce. Enfin, Il existe un très grand nombre de modèles d’épilepsie acquise et génétique qui reproduisent fidèlement différentes épilepsies qui pourraient être utilisés dans de futurs projets précliniques.
Étude de nouveaux traitements de l’alcoolodépendance dans un modèle pertinent de consommation excessive d’alcool et d’addiction à l’alcool.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués à l'issue, pour prélever leurs tissus ou vérifier l'emplacement des canules implantées dans leur crâne, 5 830 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie de trente à soixante minutes pour l'implantation de canules, de lentilles ou l'injection d'un vecteur viral, puis s'auto-administre de l'alcool quinze à trente minutes par jour, cinq jours par semaine, pendant trois à quatre mois. S'y ajoutent jusqu'à douze injections dans l'abdomen et des sessions destinées à mesurer la consommation compulsive, que le porteur reconnaît aversives. Le même porteur présente la cage d'auto-administration d'alcool comme un "enrichissement moteur" et un "enrichissement cognitif", l'appui sur le levier valant apprentissage d'une tâche.
Objectifs
L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la perte de contrôle sur la consommation d’alcool sont encore mal connus et trop peu de médicaments sont actuellement disponibles pour le traitement de l’alcoolodépendance et des troubles de la consommation d'alcool. Certaines structures cérébrales ont tout de même été identifiés comme étant des acteurs clefs des addictions en général et de l’alcoolo- dépendance en particulier. Dans ce contexte de recherche de nouveaux traitements, nous proposons de réaliser un projet qui permettra d’évaluer l’efficacité d’une dizaine de molécules dans différents aspects de la pathologie des troubles de la consommation d’alcool. Dans un second temps d'étude des bases neurobiologiques nous nous concentrerons sur 5 molécules au maximim. Ces aspects (consommation, motivation, rechute, compulsion, bases neurobiologiques…) seront donc étudiés grâce à la mise en œuvre des différentes procédures qui sont donc complémentaires. Nous allons de plus réaliser ce projet en utilisant des rats, aussi bien mâles que femelles car nous savons que les effets de l'alcool peuvent être différents entre les 2 sexes, mais aussi les effets des médicaments.
Bénéfices attendus
Au cours de ce projet nous nous attendons à identifer certaines molécules avec un réel potentiel dans le traitement des troubles de l'usage d'alcool. Nous pourrons grâce aux différentes procédures comportementales identifier précisemment les différentes dimensions du trouble de l'usage d'alcool (motivation, recherche, rechute...). Ensuite, nous allons clarifier la problématique de l'efficacité des traitement en fonction du sexe. Et enfin, nous identifierons des mécanimes neurobiologiques responsable du trouble de l'usage d'alcool et des mécanismes d'action des molécules efficaces à réduire ce trouble.
Procédures
1- Chirurgies (Implantation de canules, injection de vecteur viral, implantation de lentilles) : 1 seule chirurgie par rat - Durée de la chirurgie : 30 à 60 minutes. 2- Deux prélèvements de sang par rat au maximum sous anesthésie générale : durée de l'intervention : 3 minutes. 3- Auto-administration d'alcool : protocole de 15-30 minutes par jour, 5 jours par semaine pendant 3-4 mois. 4- Injection intra-péritonéales : chaque animal recevra plusieurs injections sur toute la durée des mois d'auto-administration - Maximum de 10-12 injections mais en moyenne 6 injections.
Impact sur les animaux
1- Douleurs au moment de l'injection intrapéritonéale; 2- douleurs post-opératoires prises en charge par un traitement analgésique; 3- perte de poids transitoire potentiel suite aux chirurgie; 4- Risque infectieux au niveau de la plaie situé sur le crâne; 5- Effet aversif lors des sessions d'évaluation de la compulsion.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour soit permettre le prélèvement de tissu en post-mortem en vue d'analyses complémentaires sur tissu, soit pour vérifier les sites d'implantation des canules guide ou des lentilles.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Les modèles que nous avons choisis font partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature. L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes (comportementaux et chirurgicaux) utilisés. Aucun test statistique a priori n’a été utilisé pour déterminer la taille des groupes étant donné que nous ne pouvons pas anticiper la taille de l'effet des molécules que nous allons tester. Dans l’optique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés, nous ne sélectionnerons que les molécules qui auront montrés un effet statistiquement significatif sur au moins un des comportements évalués. Nous en prévoyons 5 au maximum mais ce nombre pourra être plus faible et réduira donc d’autant le nombre d’animaux utilisés au total sur le projet. Nous évaluerons donc les effets de nos molécules testées sur les 2 sexes. Puis en fonction des résultats obtenus, effet sur un seul des 2 sexes ou un effet identique sur les deux sexes ou effets différent chez les deux sexes, nous ajusterons le design expérimental nous permettant de réduire potentiellement le nombre total de rats utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à un tube en carton et une buchette en bois. Les animaux seront manipulés 5 jours par semaine avec une intensification de l'habituation à la manipulation et un conditionnement positif à ces manipulations durant les jours suivant l'arrivée des animaux au sein de la plateforme, permettant ainsi une forte réduction du stress. Les rats seront placés 5 jours par semaine dans une cage d'auto-administration permettant un enrichissement moteur (appui sur les leviers) et un enrichissement cognitif (apprentissage d'une tâche d'auto-administration nécessitant une planification de l'action). Nous utiliserons la Rat Grimace Scale (RGS) tout au long de ce projet pour l'évaluation du niveau de souffrance/douleur ressentie par les animaux. De plus, nous ajouterons des points de surveillance spécifiques à cet acte, à savoir, aspect de la plaie, suintement, hémorragie, problème de suture jusqu'à la cicatrisation de la plaie avec une prise en charge analgésique adéquate.
Choix des espèces
L’espèce rat est choisie pour ce projet en raison de sa pertinence biologique et comportementale en particulier dans les protocoles d’auto-administration volontaire d’éthanol. De nombreuses données scientifiques validées démontrent que le rat est sensible aux effets renforçants de l’alcool, ce qui en fait une espèce pertinente pour modéliser l’initiation, l’escalade et la perte de contrôle de la consommation. Le rat accepte spontanément de consommer des solutions d’éthanol en accès libre ou en réponse à des contingences opérantes, ce qui permet de reproduire des comportements analogues à l’usage volontaire observé chez l’humain. L'utilisation du rat permet la mise en œuvre de protocoles plus complexes qui sont difficilement réalisables chez la souris en raison de différences comportementales et motivationnelles. L’utilisation du rat constitue le meilleur compromis entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect des principes des 3R. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.
Recherche de l’efficacité du CBT101 dans le modèle de souris SOD1-G93A de Sclérose Latérale Amyotrophique (ALS)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation qui leur fait développer une sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent deux administrations nasales par jour pendant 98 jours, soit 196 gestes par animal, plus une pesée quotidienne, quatorze prélèvements sanguins sous anesthésie et des tests neuromoteurs répétés. Le porteur indique que la maladie leur fera perdre 20 % de leur poids initial puis les paralysera, la mise à mort intervenant à ce stade. Il écarte le poisson zèbre, pourtant disponible comme modèle de la maladie, au motif que la voie nasale et la durée du traitement ne s'y prêtent pas, et conclut que la souris transgénique est le choix "le plus rationnel".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de rechercher si la molécule étudiée est efficace dans un modèle animal de Sclérose Latérale Amyotrophique, ou maladie de Charcot. La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des neurones qui permettent aux muscles de fonctionner et qui malheureusement conduit, à terme, au décès du patient. A ce jour, malgré plusieurs médicaments disponibles sur le marché, aucun n’est réellement efficace pour, ne serait-ce que, ralentir la progression de la maladie. Un modèle de souris transgénique est disponible pour étudier la pathologie et tester de nouveaux médicaments. La molécule étudiée est administrée par la voie nasale et va cibler spécifiquement les neurones pour y délivrer une molécule endogène permettant de restaurant l’équilibre énergétique des neurones. L'administration par le nez permet une mise en contact direct avec les neurones (dans un premier temps ceux liés à l'odorat et à la sensibilité de la face puis par diffusion de proches en proches aux autres neurones du cerveau). Cette distribution a déjà été démontré chez la souris et le primate non-humain. De plus, son efficacité a été objectivée dans d’autres modèles précliniques de maladies neurologiques comme une maladie rare appelée le Déficit en Transporteur de la Créatine et la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est donc de tester l’efficacité de cette nouvelle molécule donnée par la voie nasale pendant plusieurs semaines chez des souris transgéniques. L'efficacité sera mesurée par des tests de neuropharmacologie ainsi que par la mesure de biomarqueurs principalement dans le sang. Les atteintes neuronales des souris seront aussi étudiées. Cette étude permettra d'orienter les futures études de ce nouveau médicament chez les patients.
Bénéfices attendus
L’étude fait partie d’un projet plus large visant à développer une nouvelle molécule dans des maladies neurologiques. Cette molécule aide à réguler l'énergie des cellules en fournissant de la créatine aux neurones. Elle pourrait avoir de grands bénéfices pour les patients atteints de maladies neurologiques, notamment dégénératives, comme la maladie de Charcot ou SLA. A l’issue de la présente étude pré-clinique courant 2025, et en fonction des résultats, notamment de l'efficacité du produit à l’étude, une étude clinique pourrait être envisagée chez des patients atteints de SLA.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées sur toutes les souris: - L’administration se fera par voie nasale deux fois par jour du médicament ou du placebo à toutes les souris de l’étude dans la cavité nasale. Ce geste sera réalisé sur animal vigile tous les jours pendant toute la durée de l’étude (soit 98 jours donc réalisé 196 fois) et durera 1 minute. - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 minutes. - Le test neuromoteur Neuroscore sera réalisé 2 fois par semaine sur souris vigile et durera 4 minutes. - Le test motricité sera réalisé 5 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 minutes. - Le test de tonus musculaire sera réalisé 5 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 14 fois), sous anesthésie générale et durera une minute.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées sont des souris qui par nature ont un fond génétique qui va les conduire à développer une Sclérose Latérale Amyotrophique murine (Maladie de Charcot chez l’homme). Ainsi, elles verront l’apparition de symptômes neuromusculaires conduisant à la baisse de leur poids qui atteindra 20% de leur poids initial pendant plus de 24 h puis à une paralysie. L’euthanasie de l'animal sera alors réalisée. Un prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine, en sous-mandibulaire, ce qui pourraient engendrer des nuisances, telles que des hématomes et une légère douleur au point de piqure. L'anesthésie, la contention, les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger.
Devenir
Les animaux sont mis à mort car ils sont porteurs d’une maladie génétique qui va conduire à leur mort.
Remplacement
La maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative extrêmement complexe des motoneurones (les neurones qui partent du cerveau pour régir les activités périphériques, comme la respiration, la déglutition ou la préhension). Les études in vitro ne sont pas représentatives de la complexité de la maladie. C’est d’ailleurs le cas des maladies neurodégénératives pour lesquelles seuls des modèles animaux sont capable d’apporter des informations utiles pour ensuite pouvoir se projeter chez le patient. Parmi les modèle animaux, les modèles de souris génétiquement modifiées sont les plus représentatives de la maladie. Il existe aussi des modèles de poisson zèbre, mais ils sont plus largement utilisés pour étudier la physiopathologie de la maladie. Ce modèle de poisson est moins représentatif pour étudier l’effet d’un médicament qui, comme le nôtre, agit sur la mitochondrie et l’énergie apportée dans les neurones. De plus l’administration nasale de la molécule étudiées est limitante pour utiliser ce modèle. Le choix des souris transgéniques est donc le plus rationnel et le plus efficace pour atteindre l’objectif de tester la molécule administrée par la voie nasale dans un modèle de la Sclérose latérale Amyotrophique.
Réduction
L’étude s’appuie sur la bibliographie déjà existante sur les effets de la créatine dans des modèles de cette maladie et de la distribution efficace de la molécule vers les neurones pour ne concevoir qu’une seule étude, là où il est souvent nécessaire d’en réaliser plusieurs ou alors de plus grande ampleur (avec plusieurs doses par exemple). Ainsi le nombre de bras a été réduit, puisque 1 seule dose sera testée. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum (16 par groupes avec 8 males et 8 femelles par groupe), considérant que les 2 sexes seront étudiés dans cette étude et que les tests neuromoteurs demandent statistiquement plus d’animaux que d’autres type de mesures (comme des études de pharmacocinétique, par exemple).
Raffinement
Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal au moment des administrations de la molécule par une surveillance et une pesée. Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.
Choix des espèces
Les souris transgéniques utilisées sont le modèle de référence de la maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique. Les souris devront commencer le traitement avant l’arrivée des premiers symptômes autour de 12-14 semaines. Elles arriveront au laboratoire à 6 semaines, après 2 semaines d'acclimatation et d'entrainement elles recevront le traitement à 8 semaines. Il existe un modèle de poisson Zebra Fish (oui poisson zèbre) de la maladie, mais la voie d’administration (voie nasale), la fréquence (quotidienne) et la durée du traitement (plusieurs semaines voire mois) avec la molécule étudiée ne permettent d’utiliser ce modèle. De plus, la recherche de biomarqueurs sanguins et cérébraux ne serait pas possible, limitant une transposition ultérieure chez le patient.