Troubles nerveux

Hébergées seules pendant toute la durée des procédures, les souris reçoivent treize gavages de matière fécale et sont isolées une heure chaque matin pour qu'on récupère leurs crottes. 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau, de l'intestin et du foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit d'établir si le microbiote intestinal cause la perte de contrôle de la consommation d'alcool, l'anxiété du sevrage et la rechute, et le porteur reconnaît que le gavage peut provoquer une fausse route ou une lésion mécanique. Il annonce une heure de tests comportementaux au total par animal pour évaluer le comportement lié à l'alcool, sans préciser lesquels.

Objectifs

Le rôle causal du microbiote intestinal (MI) dans la maladie alcoolique du foie a été démontré et est actuellement une piste thérapeutique pour améliorer la prise en charge des patients. En revanche, il existe peu de données sur le rôle du MI dans l’addiction à l’alcool. Néanmoins quelques publications et données préliminaires permettent de poser l’hypothèse que le MI a un rôle dans l’addiction à l’alcool. En particulier, des données obtenues par les déposants ont montré qu’il y a un MI spécifique lié à l’addiction chez les souris. Notre objectif est donc de mieux comprendre le rôle de ce MI et statuer sur son rôle causal. L’addiction à l’alcool ou trouble de l’usage de l’alcool est un trouble chronique récidivant qui englobe : (1) une perte de contrôle de la consommation d’alcool, (2) la compulsion, caractérisée par une consommation d'alcool en dépit des conséquences néfastes et au détriment d'autres occupations, (3) la dépendance, caractérisée par le désir irrépressible de boire de l’alcool, (4) les symptômes du sevrage après l'abstinence mimant un syndrome d'anxiété, (5) la rechute après l’abstinence. Dans cette étude, nous allons nous focaliser sur le rôle causal du MI dans la consommation d’alcool (1) l’anxiété liée au sevrage (4) et la rechute (5).

Bénéfices attendus

Cette étude examinera le rôle causal du microbiote intestinal sur différents symptômes de l’addiction à l’alcool, la consommation d’alcool, le syndrome d’anxiété lié au sevrage et la rechute post-abstinence. Les résultats de cette étude permettront de définir le rôle causal du microbiote intestinal dans les différents symptômes liés au mésusage de la consommation d’alcool qui concernent pour ce projet son rôle dans la perte de contrôle vis-à-vis de la consommation d’alcool, l’anxiété qui est liée au manque d’alcool durant la période de sevrage et la rechute. Cela permettra de proposer pour des études ultérieures de moduler le microbiote intestinal, par exemple, par des prébiotiques ou probiotiques pour restreindre ces symptômes.

Procédures

Nous effectuerons des recueils fécaux (3 crottes) sur animal vigil sur toutes les souris. Le matin (9h) les animaux seront isolés durant 1h maximum, pour la récupération des fèces (3 crottes). Les souris sont ensuite remises dans leurs cages initiales. Les souris recevront des gavages récurrents, chaque gavage dure environ 20 secondes (contention comprise), au total 13 gavages seront effectués sur un même animal. Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux afin d’évaluer le comportement lié à la consommation d’alcool. Chacun des tests sera réalisé une fois sur chaque animal. L’ensemble des tests comportementaux sera au total de 1 heure maximum pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont modérées dans la mesure où les souris sont hébergées seules durant toutes les procédures. Le gavage pour la transplantation de microbiote fécal sera fait par des chercheurs expérimentés, réduisant le risque d’une fausse route ou de lésion mécanique. Néanmoins, bien que le geste technique soit maitrisé par les expérimentateurs, il peut y avoir exceptionnellement des lésions mécaniques. Les tests comportementaux, bien qu’indolores, entraînent une sortie du cadre familier, ce qui peut provoquer un inconfort passager (anxiété légère, agitation, baisse d’exploration ou d’appétit). Ces nuisances sont transitoires et limitées.

Devenir

Au terme des procédures, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux, intestins, foie et le séquençage du microbiote.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico les mécanismes biologiques des troubles de l’usage d’alcool n’est pas possible. Dans le cadre de ce projet, il s’agit d’évaluer une consommation d’alcool dépendante du microbiote intestinal et d’analyser l’état de la barrière digestive dont le système nerveux intestinal et d’analyser l’impact de ce microbiote intestinal sur des dysfonctions d’organes tels que le foie et le cerveau. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier les interactions entre ces différents organes, le microbiote intestinal et le comportement lié à l’usage d’alcool.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique, en se basant sur la littérature précédente dans le même domaine. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux est d’étudier de manière séquentielle dans les procédures, le trouble de l’usage à l’alcool, le syndrome d’anxiété lié au sevrage et la rechute après abstinence.

Raffinement

Au cours des semaines une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien-être des animaux (quantité de boisson et de nourriture adéquats). Un suivi du poids des animaux, de la qualité de la fourrure des animaux seront pratiqués de façon hebdomadaire la quantité de boisson ingérée eau et alcool sera mesurée tous les jours. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans le trouble de l’usage d’alcool sont proches de ceux observés chez l’homme. Cette espèce est largement utilisé dans la littérature comme modèle de consommation d’alcool. L’évaluation pour l’addiction à l’alcool et les tests comportementaux seront effectués sur des souris adultes (à partir de 6 semaines), puisque nous nous intéressons à cette pathologie chez l’adulte.

4 320 rats vont être utilisés, chacun pouvant subir jusqu'à 32 tests comportementaux et 184 prélèvements sanguins sur seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à quatre administrations par jour, dont des perturbateurs de la mémoire provoquant désorientation et hyper-locomotion, et de la scopolamine qui peut déclencher des convulsions. Le porteur indique tester des molécules candidates contre les troubles cognitifs ainsi que des molécules déjà commercialisées, afin de mesurer la prédictivité de ses propres modèles. Tous sont tués à la fin, une partie pour prélèvement, l'autre parce que le porteur écrit ne pas pouvoir garantir les conditions de placement prévues par le code rural.

Objectifs

Le trouble cognitif est un trouble mental fréquent au cours du vieillissement normal puisqu'il touche jusqu'à 50 % des sujets âgés de plus de 55 ans. Les principaux types de troubles cognitifs marqués sont le délire, la démence, la perte d’attention et l'amnésie. Les cas les plus sévères sont associés aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, il y a seulement quatre médicaments (donepezil, rivastigmine, galantamine et memantine) reconnus officiellement pour le traitement des symptômes cognitifs. Les effets de ces molécules restent modestes et ne sont pas dénués d’effets secondaires dont les plus courants sont des troubles gastro-intestinaux. Ainsi, la recherche vise à trouver des médicaments plus efficaces sans effets secondaires majeurs et à disséquer les mécanismes conduisant aux troubles cognitifs. A l’heure actuelle, la recherche de nouvelles molécules améliorant la cognition peut se faire sur les modèles basés sur la capacité d’apprentissage et de mémoire chez le rat non transgénique ayant un dysfonctionnement lié au vieillissement ou induit pharmacologiquement; le recours au modèle pharmacologiquement induit permet de reproduire de façon contrôlée, réversible et reproductible des déficits ciblés, facilitant l’évaluation précise du potentiel thérapeutique des composés. En effet, en fonction de la situation considérée les troubles peuvent résulter de la modification de différents phénomènes. Dans ce projet, nous nous proposons de tester des traitements en développement pour leur efficacité à améliorer la cognition. Dans ce but, des rats seront soumis à un ou plusieurs tests mimant différentes situations pathologiques. Nous prévoyons la mise en œuvre de 15 études sur une période de 5 ans.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les troubles cognitifs. De plus, comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité des modèles, c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de leur utilisation chez l’Homme.

Procédures

Les animaux de ce projet inclus dans la procédure 1 peuvent être amenés à réaliser au maximum 12 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min). Ils auront un maximum de 4 administrations par jour et un maximum de 84 prélèvements sanguins sur la période de 6 semaines, en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les animaux de ce projet inclus dans la procédure 2 peuvent être amenés à réaliser au maximum 32 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min). Ils auront un maximum de 4 administrations par jour et un maximum de 184 prélèvements sanguins sur la période de 16 semaines en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os (passage accidentel d’aliments ou de liquide dans les voies respiratoires (au lieu de l’œsophage). Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaître. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun de courte durée, cela peut induire un stress chez l’animal. Dans le cas d’utilisation de perturbateur de la mémoire, une désorientation et une hyper-locomotion passagère des animaux peuvent être observées. Dans le cas de traitement avec de la scopolamine, il peut en plus y avoir de rares cas de convulsions.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou réutilisée car nous ne sommes pas en mesure de garantir les dispositions de l'article R214-112 du code rural et de la pêche maritime permettant le placement.

Remplacement

Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse de la fonction cognitive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique interindividuelle et d'une éventuelle différence interindividuelle à l’exposition aux traitements. Des analyses statistiques finales sont réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu : un tunnel afin de permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de matériel de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Le prélèvement de sang trans-thoracique est réalisé sous anesthésie. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le choc électrique appliqué (phase d’acquisition du test d’évitement passif) a été calibré pour être le plus faible possible. De plus, nous avons établi des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre client, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera euthanasié. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation en interne sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les atteintes cognitives sont des phénomènes qui peuvent être liés à l’âge mais cela n’est pas systématiquement le cas. Ainsi, dans ce projet, nous utilisons des rats de 6 à 7 semaines au début du projet.

Les rats sont tués dès la première crise convulsive, ou à la fin de la perfusion si aucune crise n'apparaît. 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant une molécule qui déclenche des convulsions. S'y ajoutent jusqu'à deux administrations par jour sur 28 jours, jusqu'à cinq prélèvements sanguins par 24 heures, trois mises à jeun de vingt heures et un hébergement isolé pouvant durer deux semaines. Le test répond à une exigence du développement pharmaceutique, et le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que l'animal constitue un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

L’épilepsie est une maladie neurologique chronique caractérisée par des crises convulsives déclenchées par une hyperexcitation des neurones. Elle touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Bien que des traitements existent, environ 30 % des patients présentent une épilepsie résistante aux traitements, soulignant l’importance du développement de nouvelles molécules thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients. Parallèlement, dans le cadre du développement préclinique d’un médicament, il est indispensable d’identifier d’éventuels effets pro convulsivants indésirables. Selon les données disponibles, les autorités sanitaires peuvent ainsi exiger l’étude du profil convulsivant d’une molécule d’intérêt, afin de s’assurer de l’absence d’effets délétères susceptibles de compromettre ou d’interrompre son développement. Le projet consiste à évaluer l’effet d’un candidat médicament sur l’excitabilité neuronale à l’aide du test de convulsions induites par une molécule de référence pro-convulsivante. L’administration de cette molécule provoque chez le rat des convulsions de manière dose-dépendante, reproduisant certains mécanismes des crises épileptiques humaines. En coadministrant la molécule d'intérêt, il est alors possible de mesurer une augmentation (effet anticonvulsivant) ou une diminution (effet proconvulsivant) de la latence d’apparition visuelle des crises induites par la molécule de référence. Ce modèle largement décrit dans la littérature scientifique, est reconnu par les autorités de santé comme un outil pertinent pour la détection d’effets potentiels pro- ou anticonvulsivants des candidats-médicaments.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter l'épilepsie, une pathologie humaine touchant plus de 50 millions de personnes dans le monde. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rats) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.

Procédures

Les rats de ce projet subiront au moins une administration de molécule de référence pro-convulsivante (durée 5 min max). Ils pourront subir des administrations (max 2 administrations /24h, durée max 2 min, sur une période de 28 jours max) des prélèvements sanguins (maximum 5 prélèvements /24h, durée: moins de 30 sec/prélèvement), une anesthésie gazeuse (1 à 5 fois max, environ 10 min/prélevement). Ils subiront au moins 1 mise à jeun, pouvant être répétée, jusqu' à 3 mises à jeun maximum (durée maximum de la mise à jeun de 20h, avec un minimum de 72h d'intervalle entre 2 mises à jeun). Ils pourront être hébergés idividuellement (maximum une fois, avec une durée maximale de 2 semaines).

Impact sur les animaux

L’administration des composés à l'essai ou de référence pourra entrainer un stress mineur de courte durée et une douleur équivalente à la piqure d’une aiguille. Lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Dans le cas d’une anesthésie pour un prélèvement, celle-ci peut induire un stress à l’endormissement. De plus, les animaux de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture la veille de l'administration du composé d'intéret ou de la molécule pro convulsivante de référence, et un stress mineur en cas d'hébergement individuel. De par le modèle, ils subiront lors de l'administration de la molécule pro convulsivante de référence une douleur et stress modérés et brefs entrainés par l'apparition de crises convulsives.

Devenir

Euthanasie des animaux dès l'apparition de la première crise convulsive ou dès la fin de la perfusion de la molécule pro convulsivante de référence si aucune convulsion n'est détectée, afin d’éviter une douleur ou une détresse prolongée, non maitrisables, liées aux convulsions.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les convulsions. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament ou d'un dispositif. A ce jour, le rat est l'espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 8 / par groupe.

Raffinement

Le raffinement de la procédure expérimentale sera obtenu par : - Avant expérimentation, habituation des rats à la chambre expérimentale afin de réduire le stress lié à un nouvel environnement. - La mise à jeun sera limitée à la durée minimale nécessaire, sans cumul des périodes de jeûne, et respectera un intervalle minimal entre deux mises à jeun afin d’éviter tout effet indésirable et stress supplémentaire pour l’animal. - En cas de mise à jeun nécessaire pour l’administration des composés d’intérêt, et si celle-ci n’est pas simultanément requise avant l’administration de la molécule pro convulsive de référence, une supplémentation en glucose sera ajoutée dans l’eau du biberon. - En cas d’hébergement individuel, l’animal restera en contact olfactif et visuel avec ses congénères (cages transparentes et ouvertes). En plus de l’enrichissement classique, un sur-enrichissement sera spécifiquement mis en place (lanières de papier Kraft pour accentuer son besoin de cachette). - L’état des animaux sera évalué quotidiennement lors du suivi sanitaire. - Les boîtes expérimentales sont dimensionnées pour permettre à l’animal de se mouvoir librement et de se retourner, réduisant ainsi le stress lié à la contention. - Les animaux seront observés dans des boîtes transparentes, permettant une intervention rapide dès l’apparition de signes cliniques. - Limitation des effets indésirables induits par la molécule pro convulsive de référence : la perfusion sera interrompue immédiatement après la première crise, et l’euthanasie sera pratiquée sans délai afin de limiter la sévérité et la durée des convulsions et d’éviter le retour à la conscience après celles-ci. - Les prélèvements sanguins et tissulaires seront réalisés selon la méthode la moins invasive compatible avec les exigences scientifiques, et optimisés afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires.- Mise en place de points limites adaptés et spécifiques au modèle expérimental.

Choix des espèces

La structure et l’organisation des régions cérébrales chez le rat présentent de fortes similitudes avec celles de l’homme, notamment celle des circuits impliqués dans l’excitabilité neuronale. Cette homologie permet de transposer les résultats expérimentaux obtenus chez le rat à des pathologies humaines, notamment les crises d’épilepsie. L’administration d'une molécule pro convulsive de référence chez le rat est un modèle robuste et largement validé et reproduit dans la littérature scientifique pour induire des convulsions comparables aux crises d’épilepsie humaines et refléter la réponse pharmacologique aux traitements anticonvulsivants chez l’homme. De plus, son utilisation historique dans la recherche sur l’épilepsie et les effets des médicaments sur les convulsions a généré une base de données importante sur cette espèce, facilitant l’interprétation des effets observés et la comparaison avec d’autres études. Animaux adultes : ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. Le choix d'animaux adultes est justifié par la nécessité d'un cerveau pleinement développé afin d'obtenir des résultats pertinents concernant l'effet des substances testées sur les fonctions neuronales.

Douze semaines sans aucun enrichissement physique dans la cage, pour installer un état d'anxiété-dépression : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 924 subissent quatre semaines de stress chronique léger, 564 reçoivent quatre séances d'ultrasons crâniens sous anesthésie, et chacune passe deux séances d'imagerie pouvant durer deux heures. Six tests comportementaux mesurent ensuite la motricité, la dépression et l'anxiété ainsi induites. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier que les signaux vus en imagerie correspondent bien à des altérations réelles de la barrière hémato-encéphalique.

Objectifs

Les traitements actuels contre la dépression restent insuffisants pour une partie des patients, et les rechutes sont fréquentes. Pour développer de nouvelles approches plus efficaces, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette maladie. Notre projet de recherche s’intéresse à un élément encore peu exploré dans ce contexte : la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une structure qui agit comme un filtre protecteur, en contrôlant les échanges entre le sang et le cerveau. Des études récentes suggèrent qu’elle pourrait être altérée dans certaines maladies psychiatriques, comme la dépression, et ainsi contribuer à certains symptômes. De plus, des travaux montrent qu’il est possible de moduler temporairement la perméabilité de cette barrière, ce qui permettrait de faire passer dans le cerveau des substances actives susceptibles d’agir sur les symptômes dépressifs. Ces découvertes ouvrent des perspectives nouvelles, à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour envisager de nouvelles voies d’administration de traitements ciblés. Notre projet repose donc sur deux grands objectifs complémentaires : 1. Étudier l’état de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle animal (des souris) présentant des caractéristiques proches de la dépression humaine. Pour cela, nous utilisons des techniques d’imagerie non invasives permettant d’observer le cerveau (IRM) et son fonctionnement (TEP). 2. Tester la possibilité d’agir sur la barrière, en modifiant transitoirement sa perméabilité. Cela permettra d’évaluer si des composés potentiellement utiles contre la dépression peuvent franchir cette barrière et avoir un effet thérapeutique. Cette modulation sera testée par deux méthodes : l’utilisation d’ultrasons ciblés (FUS) et l’administration de substances spécifiques. L’ensemble de ces investigations vise à mieux comprendre le rôle de la BHE dans la dépression et à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques en s’appuyant sur l’imagerie et la modulation ciblée de cette barrière.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression afin d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces et mieux ciblés. À court terme, il s’agit : • d’évaluer l’état de la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre naturel du cerveau, chez des animaux présentant des comportements similaires à la dépression, pour identifier d’éventuelles altérations ; • d’étudier comment des ultrasons ciblés ou certaines substances influencent la perméabilité de cette barrière et le passage de composés vers le cerveau, afin d’optimiser l’administration de médicaments ; • d’analyser les effets cellulaires de ces modulations pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ; • d’explorer un éventuel effet bénéfique des ultrasons sur le comportement de ces animaux ; • et de renforcer l’usage de l’imagerie TEP pour étudier, de manière non invasive, la BHE et les processus cérébraux associés à la dépression. À long terme, ces recherches devraient permettre : • une meilleure compréhension des mécanismes complexes de la dépression, essentielle au développement de traitements plus performants et durables ; • l’évaluation d’une approche innovante reposant sur les ultrasons ciblés, potentiellement capable d’agir à la fois sur la BHE et sur les symptômes dépressifs ; • des avancées vers des stratégies thérapeutiques non invasives, précises et personnalisables ; • une meilleure connaissance des effets des ultrasons sur le cerveau, nécessaire à leur future utilisation clinique ; • et des retombées méthodologiques utiles à la recherche en imagerie et en neuropharmacologie. En résumé, ce projet combine neurosciences, imagerie et technologies innovantes pour explorer de nouvelles voies thérapeutiques dans la dépression, avec l’ambition d’améliorer à terme la prise en charge des patients.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie (2 imageries par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; 1224 animaux) • Induction du modèle dépressif : la dépression sera induite par un protocole standardisé de stress chronique léger, réalisé sur une période de 4 semaines (924 animaux) • Réalisation de sessions d’ultrasons (4 sessions d’ultrasons par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes au maximum ; 564 animaux) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux (6 tests par animal) afin de mesurer l'activité motrice (durée = 30 minutes), la dépression (durée = 5 minutes) et l’anxiété (durée = 5 minutes). • Administration 2 fois par semaine d’un candidat médicament par injection i (réalisée en 10 secondes ; 528 animaux) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes, d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique. Cette étape est essentielle pour confirmer la pertinence de l’imagerie comme outil fiable d’investigation de la BHE.

Remplacement

En amont de ce projet, des études ont été menées en laboratoire, notamment en utilisant des matériaux simulant le cerveau (des "fantômes") et des cultures de cellules. Ces travaux préliminaires ont servi à tester et à ajuster les paramètres techniques, en particulier ceux liés à l'utilisation des ultrasons et à l'effet de certaines substances sur la barrière qui protège le cerveau (la Barrière Hémato-Encéphalique ou BHE). L'objectif était précisément de limiter le recours aux animaux. Cependant, ses recherches portent sur des pathologies complexes comme la dépression et sur les interactions fines entre le cerveau, sa barrière protectrice, et des interventions comme les ultrasons ou l'administration de substances. Actuellement, la complexité d'un organisme vivant, avec son environnement cérébral unique et l'interaction de ses différents systèmes, ne peut pas être reproduite fidèlement par des études en laboratoire sur des cellules isolées, des organoïdes ou par des simulations informatiques. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces maladies complexes et pour évaluer la variabilité de la réponse à des approches potentielles de traitement.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétique au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 4 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de cette étude, il a été décidé d'utiliser des souris. Ce choix repose sur des raisons scientifiques importantes. Premièrement, le modèle de dépression utilisé dans ce projet, qui est induit en donnant une substance (la corticostérone) dans l'eau de boisson pendant une certaine période, a été spécifiquement développé et validé chez la souris. L'utilisation de cette espèce nous permet donc de travailler avec un modèle dont les caractéristiques liées à la dépression sont bien établies. De plus, un type particulier de souris présente des avantages techniques pour les méthodes d'imagerie non invasives que nous allons utiliser, comme une meilleure transmission des ultrasons à travers le crâne. Ces souris sont également très similaires les unes aux autres, ce qui rend les résultats plus fiables et reproductibles. Concernant le stade de développement, nous utiliserons uniquement des animaux adultes. Ce choix est essentiel car la dépression est une maladie qui se manifeste principalement chez l'adulte. En travaillant sur des souris adultes, nous nous assurons que les mécanismes biologiques et les comportements que nous étudions sont pertinents par rapport à la maladie chez l'homme. Enfin, certaines des techniques d'imagerie non invasives employées nécessitent que le crâne soit complètement développé pour obtenir des données précises et comparables. Cela est généralement atteint à l'âge adulte chez la souris. En résumé, l'utilisation de souris adultes est la plus appropriée et la plus pertinente pour étudier les mécanismes de la dépression et évaluer de nouvelles approches dans ce projet.

12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. Huit reçoivent des traceurs injectés dans le cerveau au cours d'opérations de quatre à six heures, suivies de trois jours de traitement antidouleur, quatre portent un implant crânien et une barre de tête, et quatre vivent sous restriction d'eau pendant sept à seize mois. Le but est fondamental, comprendre comment les voies descendantes du cortex fabriquent des prédictions, question posée en parallèle chez des humains par IRM fonctionnelle. Sur le remplacement, le porteur écarte l'informatique en affirmant qu'il n'existera pas de modèle assez précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

Tués à l'issue pour que leur cerveau soit découpé et analysé, 12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des IRM de trois à cinq heures, des injections de traceurs directement dans le cerveau lors d'opérations de quatre à six heures, la pose d'un implant crânien et d'une barre de tête, puis l'insertion d'électrodes. Quatre d'entre eux vivent sous contrôle hydrique pendant vingt-huit à soixante-quatre semaines, avec un risque de déshydratation dont le porteur détaille les signes, muqueuses sèches, peau qui perd son élasticité, urine concentrée. Le choix du macaque tient à ce que le rongeur ne convient pas pour l'IRM des fibres cérébrales et que l'homologie du carnivore avec l'humain est jugée trop pauvre.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

Jusqu'à huit chocs à la tête et vingt séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures étalées sur quatre-vingt-dix jours : 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles reçoivent aussi un radiotraceur et passent trois tests comportementaux répétés à cinq dates, coordination motrice, mémoire spatiale et anxiété, pour suivre l'état de la barrière hémato-encéphalique après une commotion cérébrale. Le porteur décrit des signes passagers de désorientation et de baisse d'activité après le traumatisme, et compte sur ces travaux pour mieux diagnostiquer les séquelles chez les sportifs et les militaires. Il retient la souris parce que son cerveau ressemblerait au nôtre sur ces points, et choisit des animaux de quatre à huit semaines, jeunes adultes encore capables de récupérer d'un stress.

Objectifs

Le traumatisme crânien léger, aussi appelé commotion cérébrale, est une blessure du cerveau souvent considérée comme bénigne, mais qui peut avoir des effets à long terme, notamment sur la mémoire, l’humeur ou le comportement. Certaines études montrent qu’il pourrait être lié à des maladies neurodégénératives comme Alzheimer. Ce projet vise à mieux comprendre les effets du traumatisme crânien léger sur une structure protectrice du cerveau appelée la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette barrière empêche les substances indésirables de pénétrer dans le cerveau. Après un choc, elle pourrait devenir plus perméable, favorisant des réactions inflammatoires durables. Grâce à des techniques d’imagerie avancées (notamment la tomographie par émission de positons, TEP) et à un modèle expérimental chez la souris, nous allons observer comment la BHE est modifiée après un choc à la tête, et pendant plusieurs semaines. Ces recherches permettront de mieux évaluer les risques, améliorer le diagnostic et, à terme, aider à mieux prendre en charge les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet a avant tout pour but d’améliorer la compréhension des effets à court et long terme d’une commotion cérébrale (ou traumatisme crânien léger) sur le cerveau et sur sa barrière naturelle, la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui pourrait être fragilisée après un choc. Les résultats pourront servir à identifier de nouveaux outils pour diagnostiquer plus tôt les complications liées aux traumatismes crâniens, mieux évaluer les risques à long terme, et adapter la prise en charge des personnes exposées de manière répétée, comme les sportifs ou les militaires. Ce projet pourrait donc contribuer à mieux prévenir les séquelles neurologiques liées aux commotions cérébrales.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : • Réalisation sous anesthésie gazeuse d’un traumatisme crânien léger (ou commotion cérébrale) (durée 1 seconde répétable 8 fois au maximum, 1078 animaux) • Réalisation au maximum de 20 sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, espacé sur 90 jours, 1232 animaux) • Injection d’un radiotraceur, sous anesthésie générale (durée 1 min ; 1232 animaux) • Des tests comportementaux seront réalisés chez 1232 souris. Chaque animal réalisera trois types de tests évaluant la coordination motrice (10 min), la mémoire spatiale (15 min) et l’anxiété (10 min). Ces tests seront conduits à J3, J15, J30, J60 et J90 selon un calendrier alterné pour limiter la fatigue. La durée cumulée n’excédera 30 minutes par session et par animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans la cage de l’animal. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important. • Après le traumatisme crânien les souris peuvent montrer des signes passagers de désorientation, de baisse d'activité ou de modifications légères de leur comportement..

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique.

Remplacement

Ce projet utilise un modèle animal (la souris) car il n'existe pas, à ce jour, de méthode alternative permettant d'étudier de manière fiable et complète les effets d’un traumatisme crânien léger (comme une commotion) sur le cerveau vivant. En particulier, il s’agit ici d’observer la barrière hémato-encéphalique (BHE), une structure essentielle qui protège le cerveau, et de suivre dans le temps ses éventuelles altérations à l’aide d’imagerie cérébrale et de tests comportementaux. Aucun modèle informatique ou sur cellules ne permet aujourd’hui de reproduire toutes les réactions complexes du cerveau après un choc : inflammation, circulation sanguine, comportements, etc. Les souris sont donc utilisées pour observer ces effets dans un organisme entier, en conditions réelles. Cependant, afin de réduire le recours aux animaux, les étapes de préparation du projet (comme les tests sur les doses ou les images de référence) sont réalisées autant que possible à partir de données déjà existantes ou sur cellules.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétiques au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 2 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utilisons des souris car elles sont l’un des modèles les plus couramment employés en recherche biomédicale. Elles présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne la barrière hémato-encéphalique (BHE), les processus inflammatoires et les réactions au traumatisme crânien. Leur petite taille, leur génétique bien connue et la possibilité de suivre leur comportement en détail en font un modèle adapté pour ce type d’étude. Les souris utilisées ont entre 4 et 8 semaines au début des expériences. Cet âge correspond à un stade jeune adulte, c’est-à-dire à un moment où le cerveau est complètement formé, mais où l’animal est encore en bonne santé et capable de récupérer d’un stress. Ce choix permet de mieux modéliser les effets du traumatisme crânien léger (TCL) chez l’humain adulte, tout en garantissant que les résultats soient pertinents et reproductibles.