Troubles nerveux
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- Troubles urogénitaux
Entretien, caractérisation et production d’un modèle neuro-musculaire à phénotype dommageable
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Atteintes d'une altération génétique qui provoque atrophie et faiblesse musculaires, jusqu'à ne plus pouvoir accéder à l'eau et à la nourriture, 4 930 souris vont être utilisées, dont 1 240 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La seule intervention décrite est une biopsie de deux millimètres sur animal vigile entre dix et vingt et un jours d'âge, répétée si le génotypage n'est pas concluant. Le projet consiste à produire ces animaux en lots et à les expédier à des équipes de recherche, la caractérisation du modèle passant par la mise à mort d'une partie d'entre eux pour prélèvement d'organes. Les souris au mauvais génotype et les géniteurs réformés sont tuées, 50 sont réutilisées pour l'entretien des compétences techniques du personnel, et les autres partent vers d'autres projets.
Objectifs
Création d’un modèle neuro-musculaire à partir de souris génétiquement altérées à phénotype dommageable en vue de produire des lots de les expédier aux différentes aires thérapeutiques pour permettre d’étudier la physiopathologie des maladies neuro-musculaires (comme la myopathie tubulaire) ou de tester des composés médicaments ciblant ces mêmes troubles). La vérification de la présence/absence du gène d’intérêt est réalisée par une méthode de génotypage par biopsie tissulaire permettant l’exploitation par PCR. L’étape de caractérisation du modèle est réalisée par prélèvements post mortem d’organes cibles afin d’évaluer le niveau d’expression des gènes altérés par des techniques de biologie moléculaire et de sélectionner les animaux étant cliniquement et phénotypiquement pertinents pour les besoins des aires thérapeutiques .
Bénéfices attendus
-Avantages à court terme : valider, caractériser et vérifier la présence/absence de la modification génétique, responsable de troubles neuro-musculaires, avant et pendant la production et l’utilisation des animaux -Avantages à long terme : les animaux génétiquement altérés utilisés dans ce projet permettront l’avancée dans la compréhension de la physiopathologie de certaines maladies neuro-musculaires, améliorer le diagnostic et tester des molécules pour traiter les patients. Les connaissances scientifiques obtenues feront l’objet de publications dans un délai de 2 à 5 ans et le bénéfice sur les patients est attendu par le biais des études cliniques dans un délai de 5 à 10 ans.
Procédures
-Biopsie tissulaire : prélèvement sur animal vigile de 2 mm maximum réalisée entre 10 et 21 jours d’âge, dure quelques secondes. -Une seconde biopsie peut être réalisée si et seulement le génotype est à confirmer. Elle sera réalisée dans les mêmes conditions
Impact sur les animaux
La modification génétique de la protéine d’intérêt peut entraîner un phénotype dommageable dont la gravité pourra potentiellement être sévère, tels qu’une atrophie et une faiblesse musculaire significatives. Cette maladie peut entrainer des difficultés à la souris d’accès à la nourriture et à la boisson pouvant entrainer faim, soif et malnutrition, associée à une perte de poids. Une insuffisance cardiorespiratoire potentiellement léthale est possible et décrite dans la littérature à partir de 18 semaines d’âge (âge médian 66 semaines), âge qu’il n’est pas prévu d’atteindre pour ces souris dans notre animalerie. -La biopsie tissulaire entraine un stress/douleur de courte durée .
Devenir
- Gestion spécifique de l’élevage : les animaux qui ne présentent pas le génotype demandé et les géniteurs réformés, ou ayant atteint un point limite seront euthanasiés. -Dans le cadre de la caractérisation, certains animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de tissus nécessaires à leur validation. Les animaux gardés en vie : -utilisation continue pour les expérimentations pour l’objectif scientifique des différentes aires thérapeutiques -gestion de l’élevage (reproducteurs si concernés par le phénotype dommageable) - Certains animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt pourront être réutilisés pour le maintien des compétences.
Remplacement
Nécessité d’utiliser des animaux pour l’objet du projet car pas de méthodes substitutives : Dans le cadre de l’étude de la myopathie tubulaire, des cultures cellulaires permettent un certain nombre d’investigations mais un modèle murin de la présente lignée, mimant la pathologie, reste nécessaire pour évaluer le potentiel candidat médicament. La validation, la caractérisation et la production de rongeurs répondent aux besoins de certains projets scientifiques de disposer d'animaux homogènes en poids et en âge selon des critères génétiques définis et en nombre suffisant. Les modèles génétiquement altérés permettent de reproduire le contexte physiologique d’un organisme entier, cette étape est difficilement substituable puisque seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Chaque fois que des méthodes in silico ou méthodes in vitro (cultures de cellules, organoïdes…) suffisent à couvrir les besoins des chercheurs celles-ci sont privilégiées sans recours ultérieur à l'animal.
Réduction
La caractérisation moléculaire vise à déterminer la viabilité du modèle selon la cible analysée. Ce phénotypage est réalisé en amont de l’élevage afin de réduire la production inutile d’animaux en cas d’obsolescence du modèle. Le nombre d’animaux produit est optimisé par les pratiques d’élevage et le relevé d’indicateurs de production propres à chaque lignée. Les objectifs de production seront réévalués si nécessaire en fonction des ratios de production. . Les demandes sont calculées sur la base des évaluations statistiques propres à chaque projet utilisateur, afin de limiter le nombre d’animaux produits aux stricts besoins des procédures en place dans chaque projet de recherche, selon les justifications statistiques de chaque type d’étude expérimentale. Les biopsies sont réalisées sur les animaux car le schéma d’accouplement de cette lignée ne permet pas 100% d’homozygotie. Une seconde biopsie est réalisée si et seulement si les résultats de génotypage ne sont pas concluants.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, un enrichissement sera placé dans les cages (cellulose de nidification, dômes en carton) et un enrichissement sonore est présent dans chaque pièce d’hébergement afin de couvrir les sons liés au travail zootechnique. L’observation des animaux est faite quotidiennement par du personnel formé et compétent. Le responsable de l’étude est informé de toute anomalie, de même que le vétérinaire désigné si des signes cliniques sont relevés. Chaque observation est consignée, permettant ainsi de suivre le bien-être de l’animal et d’ajuster au besoin les conditions environnementales telle que le remplacement de la litière conventionnelle par de la litière de cellulose en cas d’apparition d’une sensibilité au niveau des pattes et ajouter de l’ aliment enrichi à partir de 3 semaines d’âge (sevrage) au sol (recommandations scientifiques). Un suivi pondéral hebdomadaire sera également réalisé. Sur cette lignée, nous mettons en place les mesures nécessaires pour veiller à leur bien-être (contention douce avec « cupping »). En cas d’animaux stressés, les gestes des techniciens sont adaptés afin de ne pas en générer davantage. Afin de limiter la perte de poids et/ou en cas d’apparition des signes cliniques tels qu’une léthargie, la perte des fonctions motrices, une ataxie, de la nourriture enrichie ainsi qu’un hydrogel seront mis à disposition au sol de la cage, une observation et un suivi par le personnel qualifié et le suivi vétérinaire sera également mis en place. Des méthodes alternatives de génotypage non invasifs sont en phase d’expérimentation afin d’être intégrées au processus d’élevage dès que possible.
Choix des espèces
La souris est un des modèles pharmacologiques de choix pour les études scientifiques dans les pathologies neuro-musculaires afin d’en comprendre l’origine et de tester des molécules thérapeutiques. Son génome facilement modifiable est à 90% similaire à celui de l’Homme. Sa rapidité de production et d’hébergement permettent de réaliser des modèles en un temps et un espace restreint. Dans le cadre de l’étude de la myopathie tubulaire, ce modèle murin, mimant la pathologie, reste le plus pertinent pour évaluer le candidat médicament. Les études comme les transferts pour utilisation continue seront réalisés avant l’atteinte des points limites. Les géniteurs commandés sont des adultes. Les animaux expédiés aux chercheurs sont le plus souvent des adultes (jeunes ou matures), permettant de garantir la pleine expression physiologique des cibles thérapeutiques visées. Le génotypage est effectué sur des animaux âgés de 10 à 21 jours afin de sélectionner les animaux d’intérêts aux études et aux renouvellements de géniteurs. Le phénotypage est effectué généralement sur des animaux âgés de 3 à 10 semaines.
Tests de nouvelles molécules afin de corriger les troubles cognitifs consécutifs à une opération chirurgicale chez la souris ou le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 300
Trois jours après le réveil, l'animal qui n'a pas repris de poids, dont le poil est hérissé, qui ne se toilette plus ou reste prostré est tué. 1 200 souris et 300 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie abdominale de quinze minutes sous anesthésie, puis jusqu'à quatre tests de mémoire pendant cinq semaines, dont un conditionnement de peur reposant sur un stimulus aversif, et un à trois prélèvements de sang. Il s'agit de tester des molécules du laboratoire contre le déclin cognitif que 10 à 13 % des patients de plus de 65 ans présentent trois mois après une opération, et aucun animal n'est gardé vivant, une réutilisation risquant de fausser les tests de mémoire suivants.
Objectifs
Chez la personne âgée, une des complications liée à un acte chirurgical se traduit par un déclin cognitif qui peut se prolonger au delà de 6 mois (mémoire, compréhension, sociabilité, problèmes d'attention...). Ces séquelles neurologiques postopératoires peuvent, 3 mois après l'opération, concerner 10 à 13% des patients âgés (+ de 65 ans). Elles sont liées au geste chirurgical en soi et non pas au type d'anesthésie qui peut être générale ou locale. Un des mécanismes probables à l'origine de ces troubles cognitifs est une propagation au système nerveux central de l'inflammation périphérique provoquée par la chirurgie. Le projet a pour but de reproduire les conditions d'une chirurgie chez l'animal et d'ensuite d'étudier les conséquences cognitives à l'aide de plusieurs tests comportementaux. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouvelles molécules ayant pour cible le système nerveux central. Ainsi au cours de ce projet l'objectif sera de tester les effets de nos nouvelles molécules sur les performances cognitives d'un modèle animal de déclin cognitif postopératoire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de fournir des données précliniques sur l’efficacité potentielle de nouvelles molécules pour réduire les troubles cognitifs postopératoires. A long terme, ce projet pourrait donc conduire à un bénéfice en clinique notamment chez les personnes âgées qui est une population présentant le plus de risques de développer des troubles cognitifs après une intervention chirurgicale.
Procédures
Les souris ou les rats vont subir sous anesthésie un geste chirurgical d'une durée maximale de 15 minutes et ensuite passer pendant 5 semaines une série de maximum quatre tests de mémoire. Ces tests de mémoires basés sur des phases apprentissage et d'oubli spontanné pourront durer entre 1 à 5 jours chacun. Un à trois prélèvements sanguins pourront être réalisés dans les 5 semaines qui suivent la chirurgie. Des molécules à tester pourront être administrées par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intramusculaire.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, même s'il y a administration d'analgésiques nous ne pouvons exclure à minima une gêne voire une douleur résultant du geste chirurgical au niveau de la paroi abdominale. Dans une moindre mesure on aura le stress de la courte contention liée à l'administration des composés à tester par voie orale, voie intrapéritonéale, voie intramusculaire ou voie sous-cutanée qui pourront également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, le passage dans les différents tests comportementaux peut être source de stress voire source de douleur passagère dans le cadre du test de conditionnement de peur au cours duquel les animaux reçoivent un stimulus aversif.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanismes de mémorisation, toutes réutilisations des animaux dans d'autres études comportementales pourraient être biaisées par les tests précédemment réalisés.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire suite à un geste chirurgical il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe que la mémoire mettant en jeu de multiples zones du cerveau ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De plus, les nouvelle molécules à tester peuvant aussi bien avoir une action périphérique qu'une action au niveau du système nerveux central devront être testées sur un animal entier.
Réduction
En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire pour la robustesse des tests statistiques. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant qu'un seul groupe recevant une molécule de référence. 5 groupes d'animaux seront nécessaires par expérimentation : 1 groupe non opéré et 4 groupes d'animaux opérés pouvant recevoir un véhicule, un traitement de référence, et 2 nouvelles molécules à tester ou une seule molécule à tester mais à 2 doses différentes. Nous prévoyons 4 expérimentations par an avec des souris soit un total de 240 souris par ans, 1200 sur 5 ans et 1 expérimentation par an avec des rats soit un total de 300 rats sur 5 ans.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu et avec accès libre à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu'aucune action puisse corriger ces déviations alors la mise à mort de l'animal sera envisagée. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec administration d'analgésiques en local (lidocaïne) et en systémique (buprénorphine). Dans le suivi postopératoire est prévue une administration de buprénorphine de manière systématique toutes les 10 à 12 heures, cependant si 3 jours après le réveil, l'animal présente des signes de mal-être (non reprise de poids, poil hérissé, absence de toilettage, prostration, absence de fèces....) alors il sera euthanasié. Si nous constatons une réouverture de la plaie dans les 3 jours qui suivent la fin de la chirurgie, des soins et des sutures pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisées et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, leur taille permet d'effectuer un geste chirurgical dans des conditions satisfaisantes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Les troubles cognitifs postopératoires concernant essentiellement des personnes âgées, les effets de nos nouveaux composés pourront être évalués sur des animaux plus âgés (maximum 18 mois).
Étude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
576 souris subiront une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'électrodes, puis six heures d'enregistrement électroencéphalographique par semaine pendant un mois, avec un hébergement individuel de sept jours après l'opération. 1 728 souris au total vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome humain rare, elles peuvent présenter déformations articulaires, faiblesse musculaire, difficultés respiratoires, crises d'épilepsie, troubles de l'équilibre et constipation sévère. 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif étalés sur six mois, sans que le résumé indique lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal sodique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.
Procédures
Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.
Devenir
L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal sodique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.
Raffinement
Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.
Evaluation et comparaison de l’efficacité de la surexpression d’un transgène par modulations du site d’injection dans deux modèles murins de la maladie d’Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les reproducteurs seront tués à six mois, les souris d'intérêt entre six semaines et dix mois après les injections, une fois les analyses moléculaires terminées. 671 souris vont ainsi être utilisées, dont 345 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui provoque perte de poids, déficits moteurs et cognitifs et baisse de l'activité spontanée, puis reçoivent sous anesthésie une injection intracérébrale ou intracérébroventriculaire de trente à cent quinze minutes, suivie d'une à deux heures d'imagerie. Le porteur affirme que la preuve de concept chez les rongeurs est exigée par l'agence nationale du médicament avant toute demande d'essai clinique.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Huntington sont une préoccupation croissante en sante publique. Malgré d’important effort de recherche, il n’existe pas encore de traitements efficaces contre la progression de ce type de maladie. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour progresser dans la prise en charge de patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène à action thérapeutique (transgène) qui surexprime la protéine déficitaire dans la maladie. Ces acides nucléiques sont le plus souvent transportés dans les cellules grâce à un vecteur viral dont l’enveloppe (sérotype) peut permettre de cibler plus ou moins spécifiquement une variété de cellules ou zone de l’organisme. Cette approche s’est révélée efficace dans des modèles murins de la maladie de Huntington, d’Alzheimer et des ataxies. La preuve de concept dans des modèles murins de la maladie d’Huntington a été réalisé par injections intracérébrales dans le striatum, zone la plus touchée dans la maladie. Cependant dans la maladie d’Huntington d’autres régions du cerveau sont également affectées (cortex, substance noire, thalamus, hippocampe). L’administration intracérébrale reste un acte invasif dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Il est donc important de pouvoir également cibler de manière moins invasive d’autres régions du cerveau. Ce projet a pour but de déterminer les conditions optimales d’administration (voie d’injection du vecteur thérapeutique). Cette optimisation permettra d’ajuster au mieux la thérapie aux patients en ciblant de manière plus spécifique les cellules d’intérêt d’une part et d’autre part les zones couvertes dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer d’optimiser les traitements de thérapie génique pour les maladies du systèmes nerveux central. Différentes méthodes d’administration seront comparés et les plus concluantes seront testéss conjointement. Des résultats concluants chez le rongeurs permettront de valider un nouveau protocole applicable à l’homme.
Procédures
Durant la phase d’élevage de notre projet, un prélèvement de l’extrémité distale de la queue sera réalisé sur des animaux d’environ 10 jours, une seule fois en moins de 2 minutes. Les souris utilisées miment les atteintes pathologiques de la maladie d’Huntington, c’est-à-dire qu’ils présentent une perte de poids, des défauts moteurs. Ils seront soumis à une injection intracérébrale ou une injection dans la région du cerveau appelée cisterna magna ou intracérébroventriculaire ou une combinaison de deux types d’injection, sous anesthésie générale (Durée 30-115 minutes ), avec prise en charge analgésique avant et après chirurgie. Une Imagerie par résonance magnétique ou une imagerie par sera pratiquée à 10 semaines d’âge ou 12 mois d’âge en fonction du model utilisé, sous anesthésie générale (minimum d’1 heure-et un maximum de 2 heures de sessions par souris). Les animaux seront euthanasiés 1 à 3 jours après la session d’imagerie. Une prise en charge analgésique sera administré 30 minutes avant l'euthanasie par injection d’euthanasiant.
Impact sur les animaux
La surexpression modérée de la protéine utilisée à des doses thérapeutiques, ne devrait pas engendrer de nuisance ou d’effet indésirable pour les animaux. Une douleur de courte durée liée à la biopsie pour le génotypage. - Phénotype dommageable : la mutation génétique peut générer une souffrance à partir de 6-8 semaines ou 6-8 mois en fonction de la lignée avec l’apparition des signes suivants : Une perte de poids est observée chez ces modèles ainsi que des défauts moteurs et cognitifs, ainsi qu’une diminution de l’activité spontanée. Chirurgie : douleur en post opératoire pendant quelques jours. Chirurgie sous anesthésie et analgésie avec les risques associés (dépression cardio-respiratoire, hypothermie, hémorragies, infections, cicatrisation). La sècheresse de l’œil et l’hypothermie peuvent avoir lieu à la suite de l’anesthésie pendant l’injection stéréotaxique et la session d’imagerie. Les sessions d’imagerie ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après le réveil. Un inconfort peut survenir lors de la pose de cathéter en intraveineux et de l’injection en intrapéritonéale du radiotraceur en vue de l’imagerie.
Devenir
L’ensemble des animaux reproducteurs seront euthanasiés à 6 mois d’âge. Les animaux d’intérêt produits dans la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour réaliser les études de détermination de l’efficacité thérapeutique de différentes méthodes d’injection du vecteur puis seront euthanasiées de 6 semaines à 10 mois après les injections décrites, pour continuer les différentes études moléculaires et cellulaires.
Remplacement
A ce jour, seuls les modèles murins de la Maladie d’Huntington permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l’agence national du médicament pour toute demande d’autorisation d’étude clinique
Réduction
Leur nombre (671) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter. La procédure d’élevage est adapté aux nombres d’animaux pour le strict nécessaire. Dans ce projet, une première étude pilote nous permettra d’ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre plus important d’animaux. Cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés dans l’étude principale, car 1 groupe en moins ne sera pas utilisé soit une 50 aine d'animaux si l’étude pilote est concluante.
Raffinement
Conditions d’hébergement agréées, accès à l’eau et à une nourriture adaptée à leur stade physiologique ad libitum. Conditions de température et d’hygrométrie contrôlées et monitorées. Les enrichissements correspondant aux besoins des animaux : matériel de nidification, maison, bâtonnet de bois à ronger. Un suivi quotidien des animaux sera effectué certifiant un contrôle régulier du bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. En per-opératoires, l’anesthésie et l’analgésie sont systématiques pour les chirurgies. - Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. sonde rectale pendant toute la durée de la chirurgie. - Suivi post-opératoire : Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé à 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites. En post-opératoire, le suivi du poids est réalisé de façon hebdomadaire ou tous les mois en fonction de la lignée, une ration de croquettes humidifiés est ajoutée dans la cage.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèles. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie de Huntington permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie pour être utilisées dans des études d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme dans ce projet, pour l’évaluation de notre vecteur viral exprimant une protéine thérapeutique. Nous avons choisi ces stades car ils correspondent au moment où la pathologie est très développée et pour lequel la mortalité due au phénotype est très faible, nous permettant de voir un effet potentiel du traitement et en limitant la mortalité.
Evaluation de l’efficacité d’un composé dans un modèle de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
900 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à 33 tests de comportement, 112 administrations du composé et 108 prélèvements de sang sur neuf semaines. Le modèle d'Alzheimer est installé par une intervention chirurgicale de vingt à trente minutes, et l'un des tests, dit d'évitement passif, repose sur l'application de chocs électriques. Ces quinze études réparties sur cinq ans doivent servir à trier des molécules et à mesurer la capacité du modèle à prédire ce qui se passera chez l'être humain. Aucun rat ne sortira vivant, une partie étant tuée pour les prélèvements, l'autre parce qu'elle a reçu des substances dont les effets à long terme sont inconnus.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative qui entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions cognitives et notamment de la mémoire. Elle conduit à un état de démence qui est extrêmement destructeur pour les patients et leurs familles et qui représente un coût très élevé pour la société. Il n’existe à ce jour aucun traitement qui stoppe la progression de la maladie. Seuls 4 médicaments sont indiqués dans la maladie d’Alzheimer et ils traitent principalement les troubles de la mémoire. Les causes de la maladie demeurent mal connues et plusieurs hypothèses sont avancées par la communauté scientifique. La recherche actuelle vise à améliorer les connaissances fondamentales sur les désordres moléculaires et cellulaires conduisant à la maladie et aux démences apparentées, sur les causes et déterminants possibles de cette maladie, et sur cibles potentielles pour une intervention thérapeutique. Plusieurs modèles d’animaux transgéniques ou non sont actuellement à la disposition de la communauté scientifique, chacun présentant des avantages et des inconvénients. L’objectif de ce projet est de mettre en œuvre un de ces modèles pour tester des nouvelles molécules en développement.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter la maladie d’Alzheimer. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale (20-30 min) sous anesthésie, l’administration du composé à tester se fera sur animal vigile (sauf dans certains cas qui est faite sous anesthésie) pour une durée maximale de 9 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 33 tests de comportement (moins de 10 min chacun) sur animaux vigiles. En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 112 fois, la durée est de moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement mnésique, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 108 prélèvements sanguins sur la période de 9 semaines en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, l’intervention chirurgicale peut induire une douleur transitoire, des signes d’inflammation, d’infection et une perte de poids. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Lors du test d’évitement passif, l’application de chocs électriques induit une réaction aversive et un stress. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des capacités cognitives nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 12 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 15 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en groupe pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous enrichissons leur milieu avec un tunnel en carton afin de leur permettre de se cacher et des boules de bois permettant les comportements de jeu et de grignotage. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Lors de l’opération la prise en charge de la douleur commence 30 minutes avant l’opération par l’administration d’un analgésique, puis les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse et ils auront un anesthésique local. Les animaux seront placés sur des tapis chauffés durant toute la chirurgie et pendant la phase de réveille. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques à nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 6 semaines et 200-250g au moment de la chirurgie). Ce choix est basé sur le fait que la pathologie est induite par chirurgie et ne dépend donc pas de l’âge des animaux. De plus les jeunes adultes supportent mieux les interventions chirurgicales, ce qui nous permet de réduire les risques liés à la chirurgie, de leur assurer une récupération plus rapide et de meilleure qualité.
Etude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
576 souris sont opérées pendant une demi-heure pour se faire implanter des électrodes, puis enregistrées six heures par semaine pendant un mois afin de détecter leurs crises d'épilepsie. 1 728 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal ionique humain, elles peuvent présenter des déformations articulaires, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires, des troubles du sommeil, une constipation sévère et une léthargie qui gêne leur alimentation. Le porteur annonce que 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif pendant six mois, sans dire lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal calcique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.
Procédures
Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.
Devenir
L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal calcique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.
Raffinement
Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.
Etude de la physiologie cellulaire de l’hippocampe chez le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes finissent sur la table d'opération, dans une chirurgie terminale de moins de vingt minutes à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever le cerveau. 2 944 souris vont être utilisées, 1 206 opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller, 1 738 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit d'abord une injection de vecteur viral dans le cerveau, qui peut provoquer une douleur pendant 24 à 48 heures et une perte de poids, pour étudier la physiologie des neurones de l'hippocampe et son rôle dans la mémoire sociale. Le porteur affirme par ailleurs que trois semaines d'environnement enrichi transforment les connexions entre ces neurones et souligne "les effets néfastes de l'appauvrissement environnemental", constat qu'il tire d'animaux élevés en cage puis tués.
Objectifs
Bien que la capacité de former et de rappeler des souvenirs soit essentielle à la survie, elle est également cruciale pour établir des relations avec autrui et définir notre sens de soi. L'hippocampe est depuis longtemps reconnu comme une structure fondamentale pour l'apprentissage et la formation de la mémoire. De nombreuses études de lésions chez des patients humains ont révélé que l'hippocampe est nécessaire à la formation de souvenirs épisodiques à long terme. Le projet se concentre sur une région du cerveau : l'hippocampe, qui est essentielle pour la mémoire sociale et est un site de génération de l'activité cruciale pour la cognition. De plus, cette région présente une vulnérabilité unique et marquée dans de nombreuses maladies psychiatriques et neurodégénératives. Des preuves indiquent que lors du déclenchement d'une psychose, l'hippocampe est l'un des premiers à présenter une diminution de la fonction, car l'incapacité à reconnaître correctement sa famille et ses connaissances est fréquemment un symptôme précoce et un fort prédicteur du pronostic du patient. Contrairement à d'autres régions du cerveau qui ont fait l'objet de recherches depuis de nombreuses décennies, la neurophysiologie des neurones pyramidaux de l’hippocampe est largement méconnue. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les cellules hippocampiques, avec des implications considérables pour plusieurs maladies neurodégénératives et troubles psychiatriques.
Bénéfices attendus
Les objectifs de ce projet sont de mieux comprendre comment l'environnement et l'expérience influent sur la formation de la mémoire. Nous cherchons à découvrir comment les mécanismes moléculaires contrôlent l'activité des cellules nerveuses dans une partie peu étudiée du cerveau appelée l'hippocampe. Nos recherches ont montré que trois semaines d'enrichissement environnemental chez des souris adultes ont un impact significatif sur les caractéristiques et la plasticité des connexions entre ces neurones. En considérant que cet environnement enrichi représente une simulation plus réaliste de la vie pour une souris, nos résultats soulignent les effets néfastes de l'appauvrissement environnemental, tant dans des contextes sains que pathologiques. Ainsi, notre étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition de la psychose et, nous l'espérons, ouvrira des perspectives pour inverser ces altérations. Les troubles neurologiques ont un coût social élevé, estimé à 798 milliards d'euros en 2010, et touchent environ un Européen sur trois, directement ou indirectement, chaque année. Les perturbations de la cognition sociale sont des symptômes centraux de maladies comme la schizophrénie, et les altérations dans ce domaine sont souvent parmi les premiers signes de ces troubles, étant fortement liées à un mauvais fonctionnement global. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre les circuits cérébraux impliqués dans la cognition sociale pour les troubles neuropsychiatriques. Des recherches post- mortem ont révélé que l'hippocampe est particulièrement vulnérable et souvent affectée précocement au début de diverses maladies. Ce projet vise à approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires qui régulent l'activité des neurones en réponse à l'expérience. L'hippocampe joue un rôle crucial dans plusieurs fonctions, notamment l'émotion et la mémoire, et nous nous concentrons spécifiquement sur la région qui est importante pour la mémoire sociale. Cette région est affectée de manière unique dans des pathologies telles que la schizophrénie, la démence et la maladie d'Alzheimer. Malgré l'intérêt croissant pour l’hippocampe, les conséquences de ses altérations lors d'expériences ou dans des contextes pathologiques ne sont pas encore entièrement comprises.
Procédures
Une partie des animaux subissent une injection cérébrale de vecteur viral sous analgésie et anesthésie générale permettant d’exprimer des marqueurs fluorescents. Cette procédure dure moins de 30 minutes et elle est réalisée une seule fois. Tous les animaux seront impliqués dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie à l’issue de laquelle ils seront euthanasiés en vue des prélèvements pour analyses. Cette procédure dure moins de 20 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie injection cérébrale peut entraîner une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48 heures. L’anesthésie au cours de l’acte terminal pourrait également provoquer des nuisances très courtes et temporaires, notamment l'hypothermie, l'hypertension, et des risques cardiorespiratoires. Néanmoins, ces interventions sont indispensables à notre projet, car seules ces procédures permettent d'exprimer les protéines requises pour la manipulation de la transmission synaptique chez les animaux adultes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques fonctionnelles du tissu cérébral soit afin de prélever le cerveau pour analyse histologique.
Remplacement
Le cerveau est un organe d'une extrême complexité, composé de milliards de neurones de centaines de types différents, chacun établissant des milliers de connexions avec d'autres neurones. Ces éléments sont regroupés en structures fortement interconnectées, que ce soit entre elles ou avec d'autres organes. En raison de cette complexité, il n'existe actuellement aucune alternative non animale pour étudier les propriétés physiologiques et cellulaires de l'hippocampe, en particulier dans le contexte des modifications induites par l'expérience. De plus, étant donné que l'on sait si peu de choses sur l'hippocampe et sur son rôle dans la formation de la mémoire, les modèles computationnels sont totalement insuffisants.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en tenant compte de l'expertise de l'équipe en chirurgie, électrophysiologie et histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire, ainsi que des données de la littérature. Nous avons mis au point une méthode de préparation de tissu à partir d'un seul cerveau, ce qui permet d'obtenir entre 16 et 20 tranches utilisables pour la physiologie. Cette méthode permet à plusieurs expérimentateurs de partager une seule préparation, réduisant ainsi l'utilisation globale d'animaux. Compte tenu de l'expertise de l'équipe et des taux de succès obtenus au laboratoire au cours des 12 dernières années, le nombre de souris transgéniques a été réduit. La taille des effectifs a été établie par un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés afin d’avoir une interprétation fiable des résultats. Au total, nous estimons que pour réaliser ce projet, 2944 souris sont nécessaires pour obtenir des résultats scientifiques significatifs.
Raffinement
Pour l'hébergement, toutes les directives sont respectées. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pendant la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les yeux sont également protégés de la forte lumière chirurgicale. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline en sous-cutané afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la structure locale de bien-être animale et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle animal pour ce projet en raison de la similitude de son système nerveux central avec celui des humains et de la disponibilité de lignées génétiquement modifiées. De plus, la souris est le modèle animal le plus couramment utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permet des comparaisons avec d'autres études et l'utilisation des résultats d'autres recherches pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le réseau hippocampique continue de se développer et subit des changements dans la transmission synaptique et la plasticité jusqu'au jour postnatal 35. Pour cette raison, nous effectuerons toutes les injections cérébrales ainsi que les expériences de physiologie et d'histologie chez des souris âgées d'au moins 6 semaines.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 828
4 140 souris et 828 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie injecte un vecteur viral directement dans le nerf sciatique ou le nerf trijumeau, une deuxième comprime le trijumeau, une troisième serre le nerf facial, une quatrième provoque une neuropathie traumatique, et tous les animaux passent ensuite une électrophysiologie sous anesthésie puis des tests comportementaux tous les quinze jours. Le porteur annonce des douleurs post-opératoires de quatre jours, des douleurs neuropathiques et une baisse de mobilité de six à dix semaines, ainsi qu'une obésité et une hyperglycémie chez les animaux rendus diabétiques. Les bénéfices, eux, sont datés : premiers essais cliniques entre 2027 et 2029, mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé dans les patte arrières permettant à la fois de les faire bouger et de ressentir des sensations perçues au niveau des pattes (toucher, douleur, température...). Le nerf trijumeau va permettre de faire bouger le visage (mordre, mâcher, ...) et de recevoir les informations proprioceptives (toucher, douleur...). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une membrane autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP a pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. La dégradation des axones et la démyélinisation sont réversibles. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire), comme les maladies de Charcot-Marie-Tooth ou l’hypersensibilité à la pression ou bien acquises, comme les neuropathies (maladie des nerfs) traumatique (causée par une blessure) ou diabétique (causée par le diabète). Il n’existe aucun traitement. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L'objectif du projet est de valider notre approche thérapeutique, basée sur une thérapie génique qui utilise des vecteurs viraux, pour introduire dans les cellules des nerfs des patients, des candidats médicaments au potentiel anti-démyélinisant pendant plusieurs années lors desquelles les troubles moteurs existants et la progression de la maladie seront diminués. Ces vecteurs viraux sont les plus utilisés et ont été cliniquement et commercialement validés. Afin de savoir si nos traitements seront efficaces aux stades précoces et tardifs de la maladie, nous administrerons les traitements soit en amont, soit après l'apparition des premiers symptômes dans des modèles de rongeurs de ces maladies. D'autre part, nous analyserons les nerfs prélevés sur les animaux à la fin de chaque procédure afin d'évaluer l'effet des candidiats médicaments sur l'état de myélinisation des nerfs malades.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - sélectionner les produits efficaces pour de futurs essais cliniques. - créer une banque de tissu. - publication des résultats. Avantages à long terme : - Administration chez l’homme d’un traitement stable (>10 ans d’après la durée d’efficacité des vecteurs viraux selon les études précédentes) et non toxique. L’injection locale envisagée n’abîme pas le nerf et évite une dissémination des vecteurs dans tout l’organisme. - diminution des symptômes existants - arrêt de l’évolution et possible réversion de la maladie. Premiers essais cliniques chez l'homme entre 2027 et 2029 et l'approbation pour une mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Procédures
- Quatre types de chirurgies o La première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent et consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques ou le nerf trijumeau. Elle durera 15-30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisé. o La deuxième chirurgie de compression unilatérale du nerf trijumeau sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris et 184 rats au maximum. Elle durera 10 à 15 minutes. o La troisième chirurgie de constriction unilatérale du nerf facial sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 1504 souris et 184 rats au maximum. Elle durera 10 à 15 minutes. o La quatrième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 20 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances :Chirurgies d’après les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours) traitées par des analgésiques puissants - Maladies : douleurs neuropathiques, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines) qui ne sera mise en évidence que dans les tests comportementaux-Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour). Nuisances associées au diabète: obésité et hyperglycémie (6 à 10 semaines, évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons leurs nerfs pour étudier l’effet du traitement sur leur pathologie.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude, qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent, rend difficile la modélisation in silico et la reproduction complète du système in vitro. Il existe des méthodes pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il a été montré que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
En nous basant sur la littérature et nos données internes, nous avons réalisé des tests statistiques afin de déterminer le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental et limiter ainsi le nombre d’animaux aux stricts besoins des procédures en place. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Afin de réduire le nombre d’animaux, ils proviendront de fournisseurs ou si possible générés par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d'acclimatation d'une semaine lors de laquelle une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée tous les jours durant une minute par les expérimentateurs en vue de diminuer le stress. - Les conditions d'hébergement des rats et souris respecteront les bonnes pratiques en matière d'hébergement (matériel de nidification, copeaux, frisottis et cello dome). Pour les femelles gestantes isolées : ajout de matériel de nidification à leur arrivée, une séparation (portée non entière) avec les nouveau-nés limitée au strict minimum. - De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons des souris diabétiques. - La méthode d'injection locale des vecteurs viraux est un raffinement par rapport à l'injection systémique (diminution de leur dissémination et des effets secondaires). - Observations quotidiennes des animaux par du personnel formé et compétent. - Fiche individuelle de suivi de pré- per et post-chirurgie - Evaluation post opératoire de l'état clinique des animaux (un scoring corrélé à l'intensité de la souffrance), à l'aide de plusieurs fiches adaptées aux besoins spécifiques des lignées, aux nouveau-nés et au suivi post-opératoire. Selon les scores des animaux, il y aura une discussion avec le vétérinaire et/ou la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) pour décider des soins à apporter. Si le score cumulé atteint 10, ou si un paramètre scoré à 5 est observé, une euthanasie de l'animal sera faite immédiatement. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple en cas de déshydratation : apport d'eau gélifiée ou injections sous-cutanées d'une solution isotonique d'électrolytes. o En cas de perte de poids ou d'état affaibli : nourriture humide et d'eau gélifiée sur le sol de la cage - Sédation préalable des souris et des rats avant leur euthanasie.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de rongeurs, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements soit au début de l’apparition des symptômes pour prévenir la démyélinisation pathologique ou la dégénération axonale (stade précoce), soit une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin bloquer la progression de la maladie ou de favoriser la régénération. Rat/souris : mâle et femelle juvéniles et adultes Nouveau-nés : J1 à J4 pour les souris, J6 à J7 pour les rats Femelles gestantes pour fournir les nouveau-nés: elles arrivent pendant le dernier tiers de gestation et sont gardées jusqu’au sevrage de leur portée.
Exploration du métabolisme du fer dans les maladies neurodégénératives en statut sanitaire SOPF.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
1 360 souris subissent un prélèvement de sang à la veine caudale, 1 280 reçoivent une injection intrapéritonéale de chélateurs de fer ou d'antagonistes de l'hepcidine, 560 sont gavées. Les 2 720 souris utilisées le sont dans des procédures que le porteur classe toutes en souffrance légère, y compris l'anesthésie terminale. Le projet porte sur l'accumulation de fer dans le cerveau au cours d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, la piste explorée étant une mort cellulaire déclenchée par le fer. Une perte de poids supérieure à 20 % en une semaine déclenche la mise à mort, et toutes les souris sont de toute façon tuées pour la nécropsie.
Objectifs
Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des sucres provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de cahines de sucres partiellement dégradés dans un compartiment de la cellule appelé lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux ayant un effet délétaire dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris mutante. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose et identifier les populations cellulaires touchées dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la maladie étudiée. A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précisions aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. L’étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
1360 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 1360 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. 1280 souris vont avoir une injection non douloureuse de chélateurs de fer ou d’antagonistes de l’hepcidine ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire de 100 µl maximum/souris. C’est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes. 560 souris seront gavéess avec un volume maximal de 10ml/kg avec un geste durant 5 secondes. Toutes les 2720 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanasie réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture).
Impact sur les animaux
Les injections en intrapéritonéale ou le gavage avec une solution tamponnée peuvent générer une gêne transitoire. Il n'est pas attendu d'effets néfastes aux doses administrées. Les modèles de souris à générer ne présentent aucun phénotype dommageable et sera surveillé et notifié si cas contraire observé. Les interventions sur l’animal sont traduites dans les 3 procédures par des actes induisant une douleur ou une gêne classée comme « légère ». L’injection du fer est une injection unique générant chez la souris une douleur classée « légère ». Les traitements de chélation de fer ou d’inhibition d’hepcidine se font par gavage ou injection intrapéritonéale induisent chez la souris une douleur ou une gène classée « légère ». En fin d’expérimentation, les souris seront anesthésiées avec un mélange de kétamine 400mg/kg) et de Xylazine (10 mg/kg) -intrapéritonéal avec un matériel approprié est un acte induisant une douleur ou une gêne classée légère.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir etre exploiter et permettre la démonstration de nos hypothèses expérimentales.
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui restent issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentielles. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un personnel compétent et habitué. Le gavage des animaux est un geste difficile qui est réalisé par un personnel formé et entrainé. Le comportement des souris sera évalué quotidiennement par un personnel compétent. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animal. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra la mise à mort de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborées sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche muté d’intéret est adaptée pour étudier la pathologie et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des âges assez précoces qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie avec ou sans apport en fer. A 2 mois ces animaux ont les 1ers influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation sur les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Evaluation de sondes ultrasonores pour la stimulation ultrasonore transcrânienne chez la souris et le rat mâle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Rats : 320
Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.
Objectifs
Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.
Bénéfices attendus
Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.
Devenir
Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.
Choix des espèces
Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).
Etude de l’activité cérébrale par imagerie par résonance magnétique chez la souris atteinte de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Une lésion du nerf sciatique ou une injection d'agent inflammatoire installe chez 180 souris une douleur persistant plus de six semaines, avec allodynie mécanique, hyperalgésie au chaud et au froid et douleur spontanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant envisageable après la chirurgie. Chaque animal passe trois séances d'IRM d'une heure sous anesthésie et des tests comportementaux de deux heures, deux jours par semaine, pour cartographier les régions du cerveau activées selon le type de douleur. Le porteur écrit qu'en dehors de la douleur induite aucune procédure n'entraîne d'effet indésirable majeur, et présente la mise à mort finale comme un moyen d'éviter aux souris "toute souffrance inutile".
Objectifs
Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.
Procédures
Tous les animaux subiront une analyse par IRM de leur activité cérébrale. Les animaux seront analysés par IRM fonctionnelle pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 6 à 12 semaines, chaque séance durant environ 1h. Chaque animal subira 3 sessions d'IRM, espacées de 10 jours chacune, afin d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. Ces tests comportementaux permettront d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. Chaque session de comportement dure environ 2h. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Aucune des procédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeurs. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio- dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistantes. La douleur induite par les modèles de douleurs inclut : -une allodynie mécanique statique et dynamique persistante -une hyperalgésie thermique au chaud et au froid persistante -une douleur spontanée persistante. L'expérience du laboratoire avec ces modèles reporte que ces douleurs persistent environ 1 semaine dans le modèle CFA, et plus de 6 semaines dans le modèle SNI.
Devenir
L'ensemble des animaux ayant subi une procédure chirurgicale, il n'est pas envisageable de les réutiliser dans un autre projet. Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par MEMRI.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont stabulés dans des cages contenant au maximum 4 males ou 5 femelles dans une pièce thermorégulée (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein d'une plateforme d'imagerie ayant une expérience reconnue dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation du manganèse est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modèle souris en lien avec les données préliminaires obtenues au laboratoire. Nous utiliserons des souris adultes pour comparaison avec les autres données de la littérature
Étude de la dysfonction du système lymphatique chez le Rat modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une substance destinée à léser le cerveau est injectée dans le crâne de rats anesthésiés pendant une heure et demie, suivie de séances d'IRM allant jusqu'à quatre heures, répétées jusqu'à cinq fois par animal. 82 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 76 tués pour prélèvement et 6 gardés vivants en vue d'autres projets. Le but déclaré est de mesurer par imagerie si le système lymphatique du cerveau se dérègle dans un modèle de maladie de Parkinson que le porteur qualifie de récent, sans donnée antérieure sur laquelle s'appuyer. Quatre tests comportementaux répétés quatre fois par rat sont annoncés pour évaluer les symptômes moteurs et cognitifs, sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus répandue en Europe. Des études ont suggéré qu'un fonctionnement anormal de la barrière entre le sang et le liquide cérébral et le système lymphatique (vaisseaux où circule le liquide cérébral) pourrait contribuer à la maladie de Parkinson par l’accumulation anormal dans une structure du cerveau d’une molécule dans une certaine forme, cette dernière étant un composant toxique pour les cellules. Une étude récente sur un modèle animal humanisé de la maladie de Parkinson a suggéré que l'accumulation d’une autre molécule pourrait être un autre contributeur potentiel de la maladie de Parkinson. Récemment, un des partenaires du projet a mis en évidence un rôle de cette molécule dans le développement de la maladie. Elle est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet de mesurer dans le vivant le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, mais également de mesurer la présence de cette molécule. Dans ce projet, nos objectifs sont de déterminer, à l'aide de techniques d'IRM avancées, si les marqueurs du système lymphatique cérébral (volume et perfusion) sont altérés du fait d’une accumulation de cette molécule, dans un modèle rat de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet participera à la recherche sur la maladie de Parkinson. Nos résultats devraient permettre de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux d’une certaine molécule dans une structure du cerveau, le fonctionnement du système lymphatique (par lesquelles les flux de liquide cérébral passent), les symptômes moteurs et les caractéristiques de certains neurones spécifiques. Selon notre hypothèse, notre projet permettra de définir un seuil de cette molécule pathologique dans notre modèle, qui pourrait potentiellement être relié à un dysfonctionnement du système lymphatique. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. De plus, de nouvelles pistes thérapeutiques pourrait être envisagé au niveau de l’évacuation des déchets moléculaire notamment au niveau du système lymphatique ou de la barrière cerveau-sang. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets utilisant le même modèle, induisant une réduction de l’utilisation future des animaux.
Procédures
Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale d’une substance permettant d’induire le modèle de la pathologie : Sera pratiquée une seule fois par animal, sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique pour une durée de 1h30. Imagerie par résonance magnétique: Sera pratiquée sous anesthésie générale pour une durée de 4h maximum, entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 semaine entre deux sessions. 4 tests comportementaux pour évaluer les symptômes moteurs et cognitifs seront pratiqués 4 fois par rat, sur animaux vigiles pour une durée de 5-10 minutes (selon le test). Pour chaque session d’évaluation comportementale, ces 4 tests seront répartis sur 5 jours avec 24h de repos minimum entre chaque test. Une injection dans des vaisseaux du cerveau d’une molécule qui marque son passage sera réalisée sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique pour une durée de 1h, une seule fois par animal. Une partie des animaux qui ne seront impliqués que dans des séances d’imagerie seront gardés seront maintenus à l’animalerie et pourront être réutilisés dans d’autres projets. En revanche, les animaux subissant l’ensemble des actes (chirurgie, administrations, tests de comportement) seront euthanasiés par une méthode règlementaire en vue des prélèvements et analyses nécessaires pour répondre aux objectifs du projet.
Impact sur les animaux
Les rats recevront, à l’age de 2 mois, une injection intracérébrale d’une substance permettant d’induire le modèle de la pathologie sous anesthésie lors d’un acte chirurgical. Suite à l’acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie. L’anesthésie pourrait impliquer un stress thermique pour les animaux (hypothermie), des difficultés cardio-respiratoires et une non-récupération de la vigilance suite à la l’anesthésie. Enfin, les tests comportementaux prévus seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress. Le développement du syndrome Parkinsonien chez ce modèle, très progressif, pourrait mener à terme (environ à 4 mois soit 2 mois après injection) à une perte de poids due à une lenteur et inactivité des rats.
Devenir
Une partie des animaux (n=6) qui ne seront impliqués que dans des séances d’imagerie seront gardés seront maintenus à l’animalerie et pourront être réutilisés dans d’autres projets. En revanche, les animaux (n=76) subissant l’ensemble des actes (chirurgie, administrations, tests de comportement) seront euthanasiés par une méthode règlementaire en vue des prélèvements et analyses nécessaires pour répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun moyen de reproduire artificiellement la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson. Notre recherche porte sur la suraccumulation d’une molécule dans le cerveau qui a été corrélé avec la maladie de parkinson chez l’humain. C’est pourquoi un modèle animal sera nécessaire pour observer la réaction de l’organisme à cette molécule. Ce modèle étant récent, nous ne pouvons pas nous baser sur des données ou des articles antérieurs.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans les procédures expérimentales (n= 82 rats) pour chaque condition a été établi sur la base de calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats, en limitant au maximum le nombre d’animaux tout en s’assurant des résultats statistiquement robustes et reproductibles. 6 animaux qui n’auront pas été soumis à une procédure invasive pourront être réutilisés dans un autre projet.
Raffinement
Les rats seront hébergés en groupe selon les normes réglementaires sur portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne progressif de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un tunnel renouvelé lors du change bimensuel sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Ils seront ensuite observés quotidiennement par un responsable du projet ou la zootechnie. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite nécessitant une euthanasie, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales et des examens IRM, les rats seront sous anesthésies générale avec une prise en charge analgésique adaptée. Les suivis post opératoire et post IRM seront assurés par le responsable du projet pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Le temps de repos entre chaque test comportemental sera d’au moins 24h et entre chaque session IRM d’au moins une semaine. Des points limites seront mis en place et respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par IRM, car leur taille permet de les examiner dans des scanners IRM à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. Ces tests permettant une meilleure caractérisation des symptômes du modèle, ce dernier étant récent. La caractérisation symptomatique du modèle pouvant être mise en lien avec la possible dysfonction d’une partie ciblée du cerveau. L’objectif de ce projet est l’étude du traitement des déchets dans une structure, ce modèle avec accumulation d’une molécule y est adapté. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des produits permettant d’induire la maladie chez le rat et pour le passage à l’IRM car le cerveau est bien développé. Ils seront suivis jusqu’à 10 mois maximum afin de réaliser un suivi de l’évolution de la pathologie.