Troubles nerveux

Confrontées chaque jour pendant dix jours à un mâle sélectionné pour son agressivité, des souris développent l'évitement social, l'anxiété, la perte de motivation et les troubles du sommeil recherchés par le protocole. 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Huit tests comportementaux, cinq semaines d'antidépresseur par voie orale et des séances d'imagerie TEP de soixante minutes sous anesthésie servent à caractériser les altérations du système dopaminergique dans ce modèle de dépression. Le porteur présente la TEP comme une méthode idéale, qui ne nécessite pas la mise à mort et permet la réutilisation des animaux, alors que le cerveau de toutes les souris est prélevé à l'issue.

Objectifs

Les troubles liés au stress tels que le trouble de stress post-traumatique et la dépression sont des maladies souvent chroniques et associées à de fortes incapacités et souffrances qui peuvent avoir un impact dramatique sur la santé, les relations sociales, les performances professionnelles et la vie quotidienne. Malgré ces résultats, les mécanismes cognitifs et biologiques qui sous-tendent leurs causes et leur physiopathologie restent mal compris. De plus, alors que les traitements actuels peuvent généralement être bénéfiques, une part importante des patients est résistante aux traitements actuels. Une explication peut venir du fait que ces troubles comprennent une multitude de profils potentiels et rassemblent donc des patients avec le même diagnostic mais avec une forte hétérogénéité de causes, de processus physiopathologiques et des manifestations cliniques. C’est dans ce cadre que ce projet a été développé et cherche a exploré l’implication de réseaux cérébraux qui ont par le passé été moins étudiés dans ces troubles mais qui pourraient être impliqués à différents niveaux : de la vulnérabilité au stress, à la sévérité des troubles et à la réponse au traitement. L’objectif sera ici de caractériser les altérations du système dopaminergique dans un protocole de stress social chez la souris capable de modéliser la vulnérabilité et la résilience au trouble dépressif et à sa réponse au traitement. En effet le système à la dopamine pourrait être impliqué dans la manifestation de profils cognitif et motivationnels qui sont engagé dans l’adaptation au stress, et des dysfonctions de ce système lors de conditions de stress pourrait potentiellement être à l’origine d’altérations cognitives favorisant ces troubles et la résistance aux traitements. Toutefois, très peu d’articles se sont concentrés sur des marqueurs du système dopaminergique dans ces modèles. A ces fins, nous emploierons une méthode de neuroimagerie non-invasive : la tomographie par émission de positons (TEP) avec des traceurs ciblant 2 composants différents du système dopaminergique : le [18F]LBT-999 et le [18F]-Fallypride. Ces études seront réalisées chez des souris témoins non stressés, et des souris stressées résilientes au stress, susceptibles au stress (= dépressives), la moitié de chaque groupe étant traitée avec un antidépresseur pendant 4 semaines à la suite du modèle de stress social et avant les tests et la séance d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet vont nous apporter des éléments précieux pour compléter et vérifier les hypothèses de l’implication du système dopaminergique et ses altérations dans la dépression, un aspect décisif dans la compréhension de ces troubles et dans l’émergence de nouvelles stratégies préventive, diagnostique ou thérapeutiques. Les résultats obtenus pour cette étude, vont également nous permettre de prendre des décisions sur les stratégies à suivre dans nos futurs projets de recherche. Par exemple, l’utilisation de nouvelles technologies d’imagerie calcique miniaturisée nous permettant d’enregistrer l’activité calcique mais également en parallèle l’activité de la dopamine. Le but sera de déterminer au niveau neuronal la précision de l’activation du signal dopaminergique dans l’adaptation comportementale et cognitive dans des tâches de mémoire et de stress. La finalité étant de comprendre comment le système dopaminergique et sa précision d’activité est altérée dans la dépression. Et enfin, cela nous permettra de voir si l’on est capable de rétablir un fonctionnement normal de ces processus dopaminergiques par différents traitements.

Procédures

Mise en contact de mâles et femelles pour la sélection de mâles agressifs pendant 5 à 10 minutes par jour pendant 10 jours ; 8 tests comportementaux seront réalisés 2 seule fois par animal et durent entre 5 ou 30 minutes suivant le test ; un traitement antidépresseur sera administré par voie orale 1 fois par jour pendant 5 semaines ; Les souris seront anesthésiées par voie respiratoire pour les imageries TEP qui durent environ 60 minutes ; Certaines souris seront ensuite perfusées sous anesthésie générale ce qui entrainera leur mort.

Impact sur les animaux

Modèle de stress sociale : Le risque principal de ce modèle est un stress et dominance physique sur la souris lors de l’interaction avec une souris dominante (En cas de blessure, la souris est prise en charge par les expérimentateurs) Nous attendons également des répercussions psychiques et observables sur le comportement de la souris et permettant de modéliser la dépression : Augmentation des comportements de type évitement social et anxiété, persistance tout au long du protocole et quelques semaines après la fin. Perte de motivation ou plaisir, altération du poids et troubles du sommeil.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle. Si les résultats de l’imagerie TEP ne montrent pas d’effet du modèle alors la deuxième partie du projet utilisant un antidépresseur ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire (injection de sérum physiologique pour l’hydratation, nourriture appétente). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. La neuroimagerie TEP est une méthode de nécessitant pas de mise à mort des animaux, c’est une méthode idéale permettant un suivi longitudinal et une réutilisation des animaux dans une autre expérience. Cette procédure est intégralement réalisée sous anesthésie afin de diminuer le stress que pourrait engendrer le dispositif. De plus, cette procédure est réalisée en collaboration un personnel hautement spécialisé dans l’imagerie TEP sur petit animal.

Choix des espèces

Le choix de la souris est un modèle pertinent pour notre problématique. L’étude du cerveau de la souris s’avère être un modèle très puissant pour l’étude des fonctions cognitives, troubles mentaux du cerveau humain. En effet, il y a une grande homologie génétique dans le développement du cerveau, se traduisant également par une analogie des aires cérébrales et des mécanismes neurobiologiques. Dans cette étude nous utiliserons de souris adultes.

1 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, certaines suivies jusqu'à dix-huit mois. Les 1 048 souris incluses dans le protocole passent trois tests de comportement à quatre âges différents, dont un test de mémoire en piscine étalé sur cinq jours, et voient leurs fèces récoltées une fois par mois. 592 d'entre elles sont transportées vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales précédées d'une mise à jeun, tandis que 297 reproducteurs et surnuméraires sont tués après avoir été versés dans des études "hors champ". Le bénéfice espéré tient en une phrase du porteur : la production, à plus long terme, d'un complément alimentaire pour mieux vivre chez les personnes âgées.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.

Pour tester une molécule pro-coagulante destinée à limiter les hémorragies cérébrales humaines, 36 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une chirurgie d'une heure sous anesthésie générale leur provoque une hémorragie dans le cerveau, suivie d'IRM et de scanners à quatre, six et vingt-quatre heures, chaque examen exigeant une nouvelle anesthésie. Le porteur indique que les animaux se retrouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs. Il envisage de ne pas les réveiller après l'examen de six heures et conclut que, dans ce cas, "il n'y aurait pas de nuisance associée au réveil".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une atteinte neurologique soudaine, secondaire à une lésion vasculaire. On peut distinguer 2 types d’AVC : l’AVC ischémique ou infarctus cérébral (85% des cas), et l’AVC hémorragique (15% des cas). Les hémorragies cérébrales (HC) représentent 10 à 30 % des AVC, soit environ 25 000 nouveaux cas par an. Les HC sont à l’origine d’une très lourde morbi-mortalité, avec une mortalité précoce de plus de 40% à 30 jours dont la moitié des décès surviennent dans les 48 premières heures. Seuls 20% des patients seront autonomes à 6 mois. Le mauvais pronostic des hémorragies cérébrales est directement lié à la croissance de l’hématome ainsi qu’aux complications survenant à la phase aiguë (hypertension intracrânienne, hydrocéphalie aiguë et crises convulsives). L’objectif thérapeutique principal est de contrôler la croissance de l’hématome et ses complications neurologiques. Une grande proportion de patients atteint d’HC sont bien souvent sous traitement anticoagulant ce qui à pour conséquence d’augmenter considérablement la probabilité et la gravité de l'HC. L'une des principales raisons de ces mauvais résultats est que les patients sont tout simplement traités trop tard avec des agents d'inversion. Les thérapies actuelles nécessitent une prise d’information multifactorielle (identification de l'anticoagulant, calcul de la dose, poids du patient…), processus chronophage qui réduit les chances du patient. Ainsi, le projet propose d’évaluer une nouvelle molécule de première ligne ayant un mode d’action universel ne nécessitant pas d’identifier l’anticoagulant et dont la mise en œuvre est simple et rapide ce qui permettrait une prise en charge plus rapide du patient. Il est donc prévu d’utiliser cette molécule dans un modèle d’AVC hémorragique chez le porc en vue de passer ce nouveau traitement au plus vite en phase clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but de participer au développent d’une nouvelle molécule à visée clinique dans la prise en charge de l’hémorragie intracérébrale. Les travaux réalisés devraient permettre à l’industriel de valider le composé dans un modèle animal dont l'anatomie cérébro-vasculaire est proche de l’homme et ainsi augmenter le taux de succès des futures études cliniques.

Procédures

Les animaux auront une intervention chirurgicale induisant une hémorragie cérérale sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure . Puis l'évolution de cette hémorragie sera suivi à l'aide d'outils d'imagerie médicale IRM (durée de 30 minurtes) et scanner (durée 15 minutes) à différents temps (+4h, +6h et +24h). Pour chaque examen d'imagerie l'animal est maintenu sous anesthésie générale . Ainsi il est prévu de réapliser les imagerie à +4h et +6h dans la continuité de la chirurige. L'animal ne sera donc pas révillé avant la fin des examens à +6h. Une seconde anesthésie sera alors nécessaire à +24h pour effectuer les examens d'imagerie sur une durée de 1 heure.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’induction de l’hémorragie intracérébrale ainsi que le suivi en imagerie post-AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur les 24h post AVC. Il est également probable que le choix du temps d’évaluation soit inférieur à 24h, soit à +6h post AVC. Dans ces conditions, les animaux ne seraient pas réveillés de l’anesthésie générale et seraient mis à mort suite à l’examen d’imagerie médicale. Ainsi, il n’y aurait pas de nuisance associée au réveil.

Devenir

L'induction d'une hélorragie cérébrale provoquant des troubles neurologiques, il n'est pas prévu de maintenir en vie des animaux dont la qualité de vie soit trop impactée. Ainsi, il est prévu une mise à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les études de développement de stratégies thérapeutiques nécessitent leur validation sur un modèle animal proche de l’homme avant un potentiel essai clinique. Cette étude se positionne dans la validation in vivo d’un nouveau traitement thérapeutique faisant suite à de nombreuses études in vitro. Il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce contexte

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin de pouvoir conclure à un effet de la molécule testée et ce à l'aide d'une analyse de puissance statistique. Il est prévu d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin de faire un suivi de l’évolution de la pathologie à différentes phases post-opératoires et ainsi cibler la meilleure approche stratégique. Le nombre d’animaux nécessaire est néanmoins réduit et l’étude prévoit maximum 36 animaux, 6 pour la phase pilote et 30 pour l’étude principale. En fonction des résultats de la phase pilote, il sera également possible d’inclure les 6 animaux dans l’étude principale permettant de réduire d’autant les animaux de l’étude principale.

Raffinement

Au cours de cette étude, toutes les dispositions seront prises afin de réduire au maximum la souffrance et le stress et l’angoisse des animaux en accord avec les points limites identifiés pour ce projet. L’étude est menée par du personnel formé et expérimenté, sensible au bien-être et soins spécifiques des animaux. Une acclimatation à l’arrivée après transport du fournisseur est prévue (minimum 7 jours). Les animaux seront hébergés 2 par 2 pour favoriser les interactions sociales dans des boxes contrôlés en hygrométrie et température. Enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…) avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique. Les paramètres physiologiques (température, hydratation) seront contrôlés.

Choix des espèces

Les modèles d’hémorragies cérébrales ont été développés chez les rongeurs mais l’anatomie et la physiologie vasculaire du porc est plus proche de celle de l’Homme. En effet, les résultats d’une étude chez le porc apportent des informations plus probantes pour une utilisation ultérieure en clinique chez l’Homme, notamment pour les pathologies cérébrovasculaires. Pour ces raisons, nous avons choisi le porc comme modèle d’étude. De plus, le laboratoire a de l’expérience dans les manipulations chez le porc, les séquences d’imagerie sont connues et les installations sont ad hoc pour le bon déroulé des expériences. Les animaux seront utilisés à un stade jeune (autour de 4 mois, 35 à 40 kg). A ce stade, le cerveau a terminé son développement. Ce poids permet de concilier ses animaux à la manipulation et aux études d’imagerie.

Les femelles de cette lignée transgénique peuvent mourir subitement à quinze mois sans signe annonciateur, seule nuisance du modèle que le porteur reconnaisse. 1 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après une biopsie de la queue au sevrage, elles passent trois tests comportementaux à trois, six, douze et dix-huit mois, dont un test de mémoire en piscine étalé sur cinq jours, et une partie est transportée une à deux heures vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales sous anesthésie. Le porteur détaille la répartition des mises à mort : 456 pour prélever le cerveau et l'intestin, 592 après les imageries, 297 couples reproducteurs ou animaux surnuméraires tués après avoir été inclus dans des études hors champ, le tout pour un futur complément alimentaire à base de polyphénols.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les souris sont identifiées en posant une boucle d'oreille numérotée et les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.

Tuées pour des prélèvements d'organes ou de fluides à un volume qui ne permet pas la survie, ou réutilisées dans un autre projet après accord du vétérinaire : sur 780 souris, 450 passeront dans d'autres protocoles. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, suspendues par la queue pendant sept minutes, le temps qu'elles passent immobiles étant retenu comme mesure du comportement dépressif. Une partie reçoit vingt-quatre heures avant un agent pro-inflammatoire qui fait baisser leur activité, leur fréquence respiratoire et leur température, puis des candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant sept jours. Le porteur qualifie le stress de la suspension de transitoire puisque le test ne dure pas plus de sept minutes, et indique que les effets indésirables des produits seront anticipés avec le sponsor avant chaque étude.

Objectifs

La dépression, ou épisode dépressif caractérisé, est un trouble psychiatrique sévère touchant jusqu'à 20% de la population générale. Cette pathologie se caractérise par l'apparition de plusieurs symptômes comme la tristesse ou la perte de plaisir et de motivation. La dépression peut entraîner le décès du patient, notamment par suicide (jusqu'à 20% des patients atteints de dépression décèdent par suicide) (INSERM, 2019). Bien que la recherche a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes causant la ce trouble psychiatrique (comme l'inflammation ou des déficits en neurotransmetteurs), la majorité des traitements se limite aujourd'hui aux antidépresseurs. Malheureusement, ces traitements manquent d'efficacité et leur consommation s'accompagne de nombreux effets secondaires. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements pour combattre la dépression. Pour ce faire, plusieurs modèles et tests comportementaux chez l'animal existent afin de mettre en lumière des effets antidépresseurs avant caractérisation chez l'homme lors des essais cliniques. C'est par exemple le cas du test de suspension par la queue chez la souris ("tail suspension test": TST). Le test de suspension par la queue chez la souris permet de mesurer un comportement dépressif. Ce test repose sur le fait que les animaux soumis au stress inéluctable et de courte durée d'être suspendus par la queue développent une posture immobile. Ce comportement peut être exacerbé par des agents chimiques pro-inflammatoires puisque l'inflammation à un rôle dans la dépression. Divers médicaments antidépresseurs inversent l'immobilité et favorisent l'apparition d'un comportement de fuite. Le but du projet est donc de tester plusieurs candidat-médicaments indiqués pour la dépression dans le test de suspension par la queue chez la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter la dépression, une pathologie humaine touchant 20% de la population globale (INSERM, 2019). Du fait de leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer l'efficacité de nouveaux traitements antidépresseur dans un modèle expérimental de dépression mais également, d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant leur passage en phases cliniques. Ainsi, ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les animauxpourront reçevoir une administration d'un agent chimique pro-inflammatoire 24h avant le test (1 administration, env. 30sec l'administration) et reçevont des administrations de candidats-médicaments (généralement 1 administration aigue jusqu'à maximum 2 administrations par jour pendant maximum 7 jours, avec environ 2 minutes par administration) et des prélèvements (environ 3 minutes par prélèvement) et éventuellement une anesthésie en fin d’expérience pour des prélèvements. Les animaux passeront dans le test où ils seront suspendu par la queue pendant 7 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances associées au test sont l'inconfort/ douleur légère et brève et le stress induits par les administrations et la suspension de l'animal par la queue lors du test, un stress qui restera transitoire puisque le test ne durera pas plus de 7 minutes. Des effets connus et transitoires de l'agent chimique pro-inflammatoire sont également attendus à la dose max de 1mg/kg utilisée dans ce projet: baisse d'activité, de la fréquence respiratoire, et de la température. Ces effets sont transitoires et ne durent pas plus de 24h. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude avec le Sponsor afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux et/ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptomes de la dépression. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe (10 animaux par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur la depression du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Trois séances d'imagerie d'environ une heure chacune, anesthésie comprise, et quatre prises de sang dans la veine de la queue avec un risque de saignement, d'infection ou de nécrose des tissus : 63 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever organes et sang. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Une injection unique de lipopolysaccharide dans l'abdomen déclenche une inflammation généralisée qui reproduit un sepsis, avec perte de poids, baisse de mobilité et réduction des interactions sociales, pour tester si une protéine protège la barrière entre le sang et le cerveau. Le porteur retient le rat parce que c'est l'espèce déjà utilisée sur ce modèle et parce que sa taille donne de meilleures images que la souris, et situe un éventuel premier essai chez l'être humain dans les cinq prochaines années.

Objectifs

Le sepsis est une réaction inflammatoire exagérée qui force le corps à s’attaquer à ses propres tissus et organes. Il peut se produire en réponse de n’importe quelle infection, que ce soit par la présence d’une bactérie, d’un virus ou d’un parasite dans le corps. La forme la plus grave est le choc septique qui est une cause fréquente de décès. Cette inflammation entraîne des problèmes dans tout le corps, jusqu’à la baisse de la pression sanguine qui peut causer des défaillances d'organes. Si cette défaillance atteint le cerveau et les vaisseaux sanguins qui l’alimentent il peut y avoir des conséquences graves pour les patients, en accélérant l'apparition de problèmes de mémoire à long terme. Si l’inflammation reste excessive et continue dans le temps, elle va endommager la barrière qui sépare le sang et le cerveau entraînant un gonflement du cerveau et l'activation de certaines cellules immunitaires qui vont accentuer l'inflammation au niveau du cerveau. De plus, il peut y avoir des problèmes avec la circulation sanguine et provoquer des saignements dans le cerveau. Pour traiter le choc septique, on utilise des antibiotiques et on traite l'infection initiale. On s'assure aussi que la pression sanguine reste normale pour que les organes fonctionnent de manière normale. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour traiter les problèmes qui touchent les vaisseaux altérés par cette maladie, ni l'inflammation du cerveau. Notre équipe de recherche étudie une protéine qui pourrait aider à conserver la fonction des vaisseaux pendant l'inflammation et empêcher les problèmes qu’elle provoque. Pour cela, nous utilisons un modèle chez le rat chez qui nous allons injecter une substance appelée Lipopolysaccharide (LPS) pour provoquer l'inflammation au niveau du cerveau. Nous allons faire des images IRM du cerveau de ces animaux pour voir si la protéine d’intérêt peut empêcher les problèmes liés à l'inflammation dans le cerveau, en mesurant la diminution du gonflement du cerveau et de la circulation sanguine cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à examiner comment la protéine agit dans la réponse de la barrière entre le sang et le cerveau en cas d'inflammation dans tout le corps. Avant de pouvoir envisager de tester cette protéine chez l'homme, il est important de vérifier son efficacité dans le traitement de l'infection grave chez le rat. Les résultats attendus aideront à mieux comprendre comment traiter ce genre d'inflammation chez les humains et à réduire le risque de développer des troubles de la mémoire graves. Il est possible qu'une première phase d'essais chez l'homme puisse être envisagée dans les cinq prochaines années.

Procédures

L’ensemble des gestes réalisés sur les animaux, le seront par des personnes formés à la manipulation expérimentale du petit animal. Dans cette étude, nous avons besoin d'endormir les animaux pour les examens d'imagerie. Les animaux seront imagés 3 fois au cours de ce projet. Un protocole d’imagerie dure environ 1h de l’anesthésie au placement de l’animal dans sa cage de réveil. Pour induire l’anesthésie générale, nous injecterons au niveau abdominal un produit dont on ajustera la concentration en fonction du poids de l’animal. Après 5 minutes et confirmation de l'anesthésie générale, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la veine de la queue, ce geste expérimental prend 2 à 3 minutes. Nous allons mesurer dans ce prélèvement les différentes protéines impactées par la protéine d’intérêt pour voir si elle a bien effet. Ce prélèvement sera réalisé 3 fois au cours de ce projet. Un 4ème prélèvement sera effectué, lors de la dernière étape du projet, toujours sous anesthésie générale. La mise en place du modèle expérimental est réalisée par une injection unique de Lipopolysaccharide au niveau abdominal.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des injections dans la cavité abdominale pour administrer la protéine d’intérêt, le produit pour déclencher la maladie inflammatoire ainsi que pour le mélange pour l’anesthésie. Lors de ces injections l’animal est tenu dans les mains de l’opérateur avec les gestes préconisés pour limiter le stress et la douleur de l’animal lors de l’injection. L'injection du produit d'anesthésie peut être répétée avec une concentration plus faible pendant l'examen d'imagerie dans le cas où l'animal commence à se réveiller. Le LPS est une substance qui provoque une réaction inflammatoire généralisée semblable à celle observée dans le sepsis et peut entraîner à court terme une perte de poids, une réduction de la mobilité et des interactions sociales chez les animaux. Le fait de répéter les prélèvements sanguins au niveau de la queue peut entrainer soit des saignements, soit une infection qui peut aller jusqu’à la nécrose c’est-à-dire à la mort des tissus.

Devenir

L'ensemble des animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés pour effectuer des prélèvements d'organes et de sang. Ces prélèvements seront utilisés pour une analyse tissulaire au niveau microscopique afin d'évaluer le rôle protecteur de la protéine. Plus particulièrement pour les prélèvements de cerveau, nous allons les comparer aux données obtenues par imagerie.

Remplacement

L'inflammation du cerveau est un phénomène complexe résultant de l'interaction de différents types cellulaires et la barrière qui sépare le sang du cerveau. Cette interaction est encore partiellement connue. L'approche avec des modèles théoriques ou de remplacement ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions. Le modèle animal utilisé sera celui le plus validé à l'heure actuelle pour l'étude de l'inflammation du cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet été déterminé à l’aide d’outils mathématiques spécialisés pour permettre une analyse cohérente et juste des données obtenues. De plus, comme nous allons utiliser les animaux dans les différentes conditions expérimentales, les données obtenues chez les animaux en bonne santé seront comparées à celles récoltés sur ces mêmes animaux mais après le déclenchement de l’inflammation par le LPS. Ceci va nous permettre d’obtenir des résultats dans les différentes conditions expérimentales avec moins d’animaux en plus de la réutilisation des animaux utilisés pour l'étude pilote. L’étude pilote va permettre d'ajuster le nombre d'animaux en fonction de la variabilité qui peut exister entre les animaux. En effet, s’il existe des différences ou non dans les mesures réalisées dans le groupe d’animaux sains, nous saurons s’il est nécessaire d’ajuster le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats cohérents et fiables. De plus, les données d'imagerie seront analysées au fur et à mesure, si les résultats sont satisfaisants avec moins d'animaux que prévu, les protocoles d'imagerie seront arrêtés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sur la totalité du projet.

Raffinement

Une période minimale d'acclimation de 7 jours à la réception des animaux du fournisseur sera respectée. Le milieu des cages sera enrichi et le nombre d'individus par cage sera adapté à leur taille mais aucun animal ne sera laissé seul en cage. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de mouvement par pression sur la patte. Une évaluation en temps réel de l'anesthésie sera réalisée pendant les protocoles d’imagerie. Si la fonction respiratoire se dégrade et se maintient dégradée, le protocole d'imagerie sera interrompu pour permettre une surveillance accrue de l'animal dans une cage de réveil dédiée placée sous une lampe chauffante. Pour garantir un maintien de la température corporelle pendant le protocole d'imagerie, l’animal est réchauffé pendant tout le protocole d’imagerie. Pour les animaux qui ne sont pas euthanasiés à l'issue du protocole d'imagerie, la phase de réveil sera réalisée sous lampe chauffante puis remplacement dans leur cage d'origine. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et les points limites seront étudiés par les responsables de projet 2 fois par semaine pour s’assurer du bien-être des animaux et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Si la mise en place d’un traitement anti-douleur ne permet de pas d’améliorer le bien-être animal, le protocole d’euthanasié sera réalisé.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats pour cette étude car c'est l'espèce utilisée dans les études sur ce modèle pathologique. Le rat est une espèce couramment utilisée pour les travaux d'expertise par imagerie chez le petit animal et les outils utilisés sont dédiés à cette espèce. De plus, c’est une espèce de plus grande taille par rapport à la souris ce qui permet d’avoir une qualité d’image supérieure avec plus de détails et précision pour les expérimentations d’imagerie préclinique. Nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 12 semaines pesant entre 400 et 600g. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions pathologiques retrouvées chez l'Homme.