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Effet du traitement de l’activateur de Sirt1 sur la pathologie CblG dans 2 lignées de souris ayant chacune une déficience en Méthionine synthase dans une organe cible (cerveau et cœur). EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
360 souris descendantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 36 d'entre elles étant conservées pour maintenir la lignée et les autres tuées, une partie dès le sevrage. Les mères gestantes sont gavées chaque jour de resvératrol ou d'un placebo, du huitième jour de gestation au sevrage, et leurs petits passent un test de suspension, un champ ouvert, un test d'acuité visuelle, une reconnaissance d'odeurs et un labyrinthe aquatique, l'ensemble étant qualifié de non douloureux. Ces souris portent une déficience génétique de la méthionine synthase limitée au cœur ou au cerveau, pour reproduire la maladie CblG, qui touche moins d'un enfant sur un million. Le porteur reconnaît que des études in vitro sur biopsies de peau de patients ont déjà montré l'effet des activateurs de SIRT1, et affirme qu'il est "indispensable" de tester les organes atteints chez l'animal.
Objectifs
La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.
Procédures
Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.
Impact sur les animaux
Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.
Devenir
Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).
Remplacement
tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.
Réduction
Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.
Effets de différents candidats médicaments sur l’électroencéphalogramme et le comportement du rongeur vigile et instrumenté
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2600
Opérés pour l'implantation d'un émetteur de télémétrie, deux heures de chirurgie, parfois d'un cathéter, puis isolés en cage individuelle de la fin de l'opération jusqu'à la fin des expériences, 1 150 souris et 2 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 600 d'entre eux seront tués, les 1 150 autres réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire. Le protocole mesure l'effet de candidats médicaments sur l'électroencéphalogramme d'animaux vigiles, avec des injections de phencyclidine qui provoquent des stéréotypies et des tests comportementaux dont la durée va de dix minutes à vingt-quatre heures, sans qu'aucun soit nommé. Parmi les bénéfices attendus, le porteur inscrit ceux qui reviendraient aux rats et aux souris eux-mêmes, sous la forme d'une "acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée".
Objectifs
Le développement de médicaments pour le traitement des maladies du cerveau constitue un défi majeur du fait du manque de prédictivité des modèles comportementaux. Cela pourrait être amélioré par l'utilisation de techniques plus prédictives comme l’enregistrement de l'électroencéphalographie (EEG). L’enregistrement de l’EEG permet d'évaluer l'activité cérébrale via des électrodes. De plus, différentes études publiées montrent que l'EEG est altéré dans différentes pathologies du cerveau chez l'homme. La possibilité d'évaluer l'EEG chez le rongeur confère une valeur predictive importante à cette technique dans le cadre du développement de médicaments pour les maladies du cerveau. La combinaison de mesures EEG avec des mesures comportementales représente donc un intérêt important pour la recherche en neuroscience. Le but de ce projet est d'évaluer l'effet pharmacologique de candidat-médicaments sur l'EEG de repos ou lors de stimulations (visuelles/auditives) chez le rongeur vigile. Elles pourront éventuellement être complétées par des tests de comportement permettant d'évaluer l'activité locomotrice, l'intéraction sociale ou encore la mémoire. Ces mesures auront des applications majeures telles que l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité du médicament.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter diverses pathologies neurologiques (par exemple la schizophrénie, une pathologie humaine touchant 1% de la population mondiale). En fonction de leur mécanisme d'action, certains composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les composés testés sont actifs ou d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat et souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.
Procédures
Les animaux seront sujets à une ou deux chirurgies pour implanter l'émetteur de télémétrie (2h) et le cathéter (20 minutes). Ces animaux seront isolés à partir de la fin de la chirurgie et ce jusqu'à la fin des expériences. Les animaux pourront être sujets à différentes administrations par voie intrapéritonéale (ip), sous-cutanée (sc) ou orale (po) (~1 min), intraveineuse (iv) (bolus: 1-2 min ou perfusion: 2min-4h) et également à des tests comportementaux (entre 10 min et 24h en fonction du test).
Impact sur les animaux
Les animaux seront susceptibles d'éprouver les nuisances suivantes : effets liés aux chirurgies d'implantation de l'émetteur ou du cathéter comme la perte de poids; stress ou douleurs liés aux injections par différentes voies (ip, po, sc, iv ...); effets indésirables (e.g. stéréotypies) liés à l'injection d'agents pharmacologiques de référence comme la phencyclidine (PCP), stress associé à la manipulation des animaux par les opérateurs; stress lié à l'isolement post-opératoire ou aux tests comportementaux.
Devenir
Les animaux pourront soit être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire, soit euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal, soit euthanasiés à la suite des effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ ou le modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat et/ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les ondes cérébrales par EEG. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité et la toxicité d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris représentent les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques pour tirer des conclusions pertinentes. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 8-12 / par groupe. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses • la formation du personnel • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux • le recours à des procédures les moins invasives possibles • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur l’électroencéphalogramme et ces animaux sont capables d’apprendre et de réaliser les tâches comportementales complexes utilisées dans ce projet. De plus, il existe ainsi une possibilité de confronter les résultats avec une littérature abondante. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l'EEG de l’animal à d’autres stades de développement.
Evaluation thérapeutique de l’électrostimulation du nerf splénique sur un modèle expérimentale de la maladie de Parkinson induit par une neurotoxine
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Choisies mâles, à dix semaines et 20 à 25 grammes pour permettre "une chirurgie aisée", 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Parmi elles, 480 reçoivent pendant cinq jours une neurotoxine qui détruit leurs neurones dopaminergiques et provoque un déficit moteur, et 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate, les connecteurs étant fixés au crâne. L'électrostimulation impose ensuite trente jours d'isolement, chaque souris étant séparée des autres à cause du fil qui la relie au stimulateur. Toutes sont tuées à l'issue, une mise à mort que le porteur présente comme un moyen de limiter les souffrances liées à l'évolution de la maladie qu'il a lui-même provoquée.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer, sur un modèle murin induit par une neurotoxine, l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique sur la maladie de Parkinson. L'injection de la neurotoxine provoque les symptômes de la maladie de Parkinson en détruisant certains neurones du cerveau. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse neuroinflammatoire médiée en partie par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs,des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable, obligeant à changer souvent de molécules. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à :1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique);2- puis induire la maladie de Parkinson par injection d’une neurotoxine s; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subi cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la maladie de Parkinson pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
Induction de la maladie de Parkinson: 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection de neurotoxine, tous les jours pendant 5 jours consécutifs afin d’induire la pathologie. Implantation électrode : 288 animaux Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale gazeuse pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain del'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire non stéroïdien ( maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la coordination motrice: 384 animaux la coordination motrice est mesurée avec un appareil automatisé à tige tournante (rotarod). Les souris sont testées séquentiellement sur la tige tournante à huit vitesses incrémentales pendant 150 s maximum par vitesse. Une période de repos de 5 minutes a été prévue entre les vitesses successives afin d'atténuer le stress et la fatigue des animaux. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection de neurotoxine : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections sous-cutanée d'une neurotoxine. La neurotoxine appelé MPTP induit la perte des neurones dopaminergiques de la substance noire, ainsi qu’une diminution des quantités de dopamine dès le 3ème jour. La perte des neurones dopaminergiques est en partie due à l’induction de neuroinflammation par le MPTP. A partir du 15ème jour après la première injection de MPTP, un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution progressive de la coordinatation motrice. 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe depuis 2017. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 30 jours (risques de rognage de fils).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique. Des grilles d’observation préétablies pour le suivi postopératoire et le suivi de l'évolution de la pathologie prévoient des mesures correctives et la mise en œuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique. Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection de MPTP a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 10 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20et 25 gr).
Rôle des vésicules extracellulaires dérivées du microbiote intestinal d’individus avec des troubles du spectre de l’autisme sur l’axe intestin-cerveau dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vingt-cinq souris dites "inconnues", utilisées comme partenaires sociales dans un test de sociabilité, sont gardées vivantes et remises en circulation dans l'animalerie. Les 264 autres sont tuées, dans un projet où 289 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Gavées trois fois par semaine de vésicules issues du microbiote intestinal de personnes autistes, elles passent trois jours de tests de locomotion, d'interactions sociales, de gestes répétés et d'anxiété, puis une sonde introduite dans le rectum mesure leur sensibilité colique. Le porteur affirme que le lien entre intestin et cerveau ne peut s'étudier aujourd'hui que sur un modèle animal, alors qu'il décrit par ailleurs des travaux préalables menés sur cultures de neurones intestinaux et sur intestins isolés.
Objectifs
L’autisme regroupe un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans les interactions sociales et des centres d’intérêts restreints et répétitifs. Outre ces symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes autistes (environ 70%) souffrent de symptômes digestifs, diarrhée, constipation, ballonnement, douleur abdominale. La corrélation entre la sévérite des symptômes digestifs et des troubles comportementaux souligne l'importance de l'intestin dans l’autisme. Ceci suggère également des mécanismes communs dans les dysfonctions des neurones de l'intestin (système nerveux entérique) qui régulent les fonctions digestives et ceux du cerveau. Un cofacteur important dans l’autisme est le microbiote intestinal. En effet, des modifications de la composition du microbiote intestinal ont été décrites chez les patients autistes par rapport à des sujets témoins. Des études fonctionnelles visant à déterminer l’impact de ces modifications ont montré que le transfert de microbiote humain provenant de sujets autistes chez la souris induisait des symptômes digestifs et comportementaux de l’autisme. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ces effets sont encore inconnus, mais pourraient impliquer des vésicules extracellulaires. Les vésicules extracellulaires sont produites et libérées par tous types cellulaires, incluant les bactéries, et transportent des molécules signalétiques pouvant agir à la fois sur l’intestin et le cerveau. L’hypothèse du projet est que les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal altéré des autistes contribuent aux dysfonctions digestives et cérébrales. Le premier objectif est donc d’étudier la capacité des vésicules extracellulaires produites par le microbiote à induire chez la souris des symptômes digestifs et comportementaux pertinents de l’autisme. Nos données préliminaires obtenues in vitro montrent que les vésicules extracellulaires isolées à partir de selles de patients autistes augmentent l'expression d’une enzyme neuronale responsable de la libération du nitric oxide, un neurotransmetteur clé du système nerveux entérique et du cerveau, dont les voies de signalisation sont perturbées dans l’autisme. Ainsi, le 2e objectif sera d'explorer la contribution de cette voie de signalisation dans les effets induits chez la souris par les vésicules extracellulaires. Ce projet apportera des éléments novateurs dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’autisme.
Bénéfices attendus
L’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et est en constante augmentation. Un frein pour le développement d’approche thérapeutique résulte d’un manque de connaissances des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les troubles digestifs dans l’autisme. Bien que plusieurs éléments récents indiquent que des altérations du microbiote intestinal représentent un facteur important pouvant contribuer à l’autisme, les médiateurs impliqués dans les interactions entre le microbiote intestinal et les organes cibles de l’autisme, l’intestin et le cerveau, sont encore largement inconnus. En ciblant les vésicules extracellulaires, ce projet vise à mieux comprendre dans l’autisme les mécanismes d’interaction entre le microbiote intestinal d’une part, et l’intestin et le cerveau d’autre part. De plus, ce projet permettra d’identifier la voie nitrergique (neurotransmetteur nitric oxide) de l’hôte comme une cible potentielle des vésicules extracellulaires dérivées du microbiote de patients autiste. La voie nitrergique ayant été précédemment identifiée comme altérée dans l’autisme, ce projet permettra de proposer un mécanisme reliant l’altération du microbiote intestinal de patients autiste avec les dysfonctions digestives et cérébrales. Cette étude présente un intérêt non seulement pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’autisme, mais également dans la perspective d’un traitement thérapeutique basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques.
Procédures
Pour chaque procédure, lors des études comportementales et fonctionnelles digestives, nous réaliserons : - Un gavage sera réalisé 3 fois par semaine (un jour sur deux) avec une solution de vésicules extracellulaires (2min). - Injection d'un traitement visant à inhiber la signalisation nitrergique, une fois par jours pendant 7 jours (2min). - Des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : Jour 1: un test mesurant la locomotion des souris de 15min et un test mesurant les interactions sociales de 35min. Jour 2: un test mesurant les gestes répétés de 15min et un test mesurant l’anxiété de 15min. Jour 3: un prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue - un prélèvement des selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures. - un test permettant de mesurer la sensibilité colique par une petite sonde introduite dans le rectum (30min).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Par ailleurs, l’administration de vésicules extracellulaires et de métabolites bactériens de patients avec troubles digestifs sont susceptibles d’induire chez la souris des douleurs abdominales et des troubles gastro-intestinaux. Tous ces signes seront observés quotidiennement au cours du traitement.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, sauf les 25 souris dites « inconnues » utilisées pour le test des 3 chambres seront gardées en vie et réutilisées au sein de l'animalerie. Pour les souris mise à mort, les intestins et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires de biochimie (protéines, tissus et ADN pour mesurer des marqueurs de neurones) et des marquages immunohistochimiques
Remplacement
L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de neurodéveloppement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, notre étude sur l’autisme mettant en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, microbiote intestinal...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée seulement par une approche in vitro, justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer la complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.
Réduction
Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin et ex vivo sur des intestins isolés nous ont permis de mettre en évidence que les vésicules extracellulaires provenant de selles humaines ont une bioactivité sur les neurones entériques et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement sur le système nerveux entérique. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.
Raffinement
Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souriceaux une semaine avant le début du traitement. Les animaux seront hébergés collectivement (max 5) dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place
Choix des espèces
Une de nos études préliminaires a montré que l’administration du microbiote intestinal des patients autistes de cette même cohorte induisait des troubles gastro-intestinaux chez la souris. Le but ici est de déterminer si les effets observés impliquent les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal dans ce même modèle. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie juste après le sevrage (21/22 jours) et gardées une semaine en acclimatation avant le début des gavages. Ce stade correspond à un stage enfant/adolescent cohérant avec le fait que l’autisme est une pathologie du neurodéveloppement. Par ailleurs, le système nerveux entérique étant encore plastique pendant la période de l’enfance et adolescence, étudier l’impact des vésicules extracellulaires sur le remodelage du système nerveux entérique est plus pertinent à ce stade du développement.
Mise en place d’un modèle de stress infantile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Aspergées d'urine de mâle, séparées de leurs petits dix minutes par jour ou livrées six jours de suite à des mâles agressifs, des souris mères vont être utilisées pour provoquer un traumatisme précoce chez leurs souriceaux. Au total, 964 souris sont engagées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 510 d'entre elles et sévère pour 454. Les souriceaux passent ensuite des tests d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, à l'adolescence puis à l'âge adulte, avant que 454 souris soient tuées, les mères, les petits et trente mâles agressifs rejoignant l'élevage ou d'autres expériences. Le porteur écrit que l'analgésie et le renforcement positif ne peuvent être envisagés, puisque la douleur psychique visée forme la base même du modèle.
Objectifs
Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.
Bénéfices attendus
Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.
Procédures
- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à des comportements antagonistes (défaite sociale) durant 10 min et répétés sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.
Impact sur les animaux
Le modèle de défaite sociale (DS), qui consiste à être exposé à des comportements antagonistes de facon répetée induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.
Devenir
Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (400 souriceaux et 80 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Par ailleurs des souris non-OGM classiquement etudiées seront utilisées afin de s'assurer que le modèle est viable sur une lignée bien caracterisée, avant la mise en place du modele sur les souris transgeniques. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.
Elevage et maintien de lignées murines modèles pour l’étude de maladies liées au défaut de transport axonal
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Tuées à la fin de leur vie reproductive, 2 875 souris vont être élevées pendant cinq ans pour fournir des animaux à d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent des mutations qui provoquent en vieillissant une maladie neurodégénérative, que le porteur décrit comme se limitant à des symptômes légers, détectables seulement par des tests comportementaux qu'il ne nomme pas. Chaque souris subit un rasage à la tondeuse pour le génotypage, et les mâles reproducteurs sont isolés jusqu'à la fin de leur vie reproductive, vers huit mois. Le cerveau de tous les animaux générés sera prélevé, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction, sans détailler le calcul qui aboutit à 2 875 souris pour maintenir deux lignées.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien de deux modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de maladies neurodégénératives. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de ce type de maladies et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien-être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de ce type de maladies et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant une maladie neurodégénérative caractérisée par des symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Le génotype des animaux générés sera contrôlé au fur et à mesure par prélèvement pileux (rasage à la tondeuse – geste inférieur à 5 sec.).
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous une forme qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Nous pouvons identifier 2 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant le rasage destiné à prélever quelques poils pour analyses génétiques et 2) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Il a été précédemment démontré que les modèles murins actuels reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de maladies neurodégénératives, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de ces maladies et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de ces maladies en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2875 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 2 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et de matériaux prévus par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Pour réduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Si lors du monitoring quotidien des animaux une douleur est observée, une injection de Carprofen (5mg/kg) sera réalisée. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de maladies neurodégénératives. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la protéine responsable de ces maladies et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Relation entre les dysfonctionnements sérotoninergiques et les troubles respiratoires associés à l’épilepsie dans un modèle du syndrome de Dravet chez la souris (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées chaque jour pendant dix jours à un gaz convulsivant, le flurothyl, 418 souris porteuses de la mutation du syndrome de Dravet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Cent quarante d'entre elles subissent une chirurgie de quatre-vingt-dix minutes pour l'implantation d'électrodes cérébrales, d'un capteur nasal et d'électrodes musculaires, puis des enregistrements de six heures par jour un jour sur deux pendant quatre semaines. Le porteur écrit qu'en dehors de perturbations transitoires du comportement, "aucun autre effet nuisible n'a été rapporté", tout en précisant que chez 30 % des souris la crise se termine par un arrêt respiratoire fatal. Chaque animal subit de trois à quarante-cinq interventions entre sa naissance et sa mise à mort, au terme de laquelle le cerveau est prélevé.
Objectifs
La mort soudaine inattendue en épilepsie (SUDEP) est la cause majeure de mortalité précoce chez les patients souffrant d’un syndrome de Dravet (SD). La SUDEP est décrite comme faisant suite à la survenue d’une crise épileptique entrainant un arrêt respiratoire fatal. L’unique stratégie qui est proposée de nos jours pour prévenir la SUDEP consiste à contrôler la survenue des crises épileptiques chez le patient. Cette stratégie comporte certaines limites dès lors que l’on considère que le SD est une forme d’épilepsie qui répond mal aux médicaments anti-crises actuellement disponibles. Pour prévenir la SUDEP, il est essentiel de trouver une autre alternative thérapeutique en identifiant de nouveaux candidats pharmacologiques à cibler chez le patient souffrant de SD. La sérotonine cérébrale joue un rôle majeur dans la survenue des crises et dans le contrôle de la respiration. L’hypothèse sur laquelle repose ce projet est que l’arrêt respiratoire survenant à la suite d’une crise et à l’origine des SUDEP dans le SD est favorisé par l’installation progressive d’une vulnérabilité de la fonction respiratoire en lien avec la répétition des crises d’épilepsie. Les objectifs de ce projet sont ainsi : (1) de caractériser la chronologie d’installation de la vulnérabilité respiratoire dans le SD, (2) d’identifier le(s) marqueur(s) sérotoninergique(s) associés à la vulnérabilité respiratoire et au risque de SUDEP, (3) et de tester un candidat pharmacologique en lien avec la cible sérotoninergique identifiée pour prévenir cette vulnérabilité respiratoire. Pour répondre à ces objectifs, nous aurons recours à un modèle expérimental chez la souris R1648H, qui porte la mutation du gène SCN1A, à l’origine du SD chez l’humain.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, nous ne savons pas comment la répétition des crises chez les jeunes patients souffrant de SD peut aggraver la vulnérabilité cardio-respiratoire qui conduit à la SUDEP. La souris R1648H est un modèle qui mime la symptomatologie du SD décrite chez l’humain et l’utilisation de ce modèle dans ce projet devrait fournir des éléments précieux qui permettront une meilleure prise en charge des patients SD. En ciblant le système sérotoninergique qui est fortement impliqué dans le contrôle de la respiration et dans la genèse des crises, nous espérons mettre en évidence des éléments de ce système qui pourraient être (1) utilisés comme des marqueurs permettant l’identification des patients SD à risque de SUDEP, et (2) ciblés par des agents pharmacologiques visant à prévenir l’installation de la vulnérabilité ventilatoire et le décès qui lui est associé.
Procédures
Le génotypage et le tatouage de l’ensemble des souris de la portée sera effectué à P7 (durée
Impact sur les animaux
En dehors des perturbations transitoires sur le comportement de la souris lors de la survenue de la crise par le flurothyl, aucun autre effet nuisible n’a été rapporté chez les animaux qui seront utilisés dans ce projet. Comme décrit dans l’annexe 3, la sévérité de la crise durant l’exposition au flurothyl est progressive et s’intensifie au cours du protocole d’ICF. Cela comprend 7 stades avec le stade 1 décrit comme celui qui est de plus faible sévérité comprenant des clonies de la face et des membres postérieurs ou antérieurs. Les caractéristiques des crises de stades plus sévères se traduisent par la présence de clonies plus intenses, des rebonds et/ou course de l’animal dans la cage et la présence d’une phase de tonus musculaire. A noter que la durée de la crise des stades 1-6 est de 15 à 60 sec ; toutefois, chez 30% des souris R1648H, la crise conduira dans les secondes qui suivent à un arrêt respiratoire fatal défini comme le stade 7.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélevé pour des investigations ex-vivo.
Remplacement
Le caractère inattendu de la SUDEP chez le patient SD rend les expériences prévues dans ce projet non envisageables chez le sujet humain. L’étude des rythmes cérébraux et cardio-respiratoires au cours ou en dehors d’une crise épileptique nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur des modèles in vitro. La souris R1648H modèle du SD est aujourd’hui la seule espèce qui présente une physiopathologie similaire à celle observée chez l’humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 418 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au maximum sans compromettre toutefois les objectifs scientifiques du projet, en nous basant sur les données bibliographiques antérieures et des outils statistiques.
Raffinement
Les conditions de stabulation sont conformes à la réglementation et prennent compte du bien-être animal. Le poids des animaux sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être (annexe 1), pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Les animaux qui auront été isolés pour leur confort seront manipulés quotidiennement pendant 5 minutes. Pour évaluer la respiration de façon non-invasive, nous utiliserons la pléthysmographie à corps entier qui permet d’obtenir des enregistrements chez un animal vigile et libre de se mouvoir. Le temps d’enregistrement est limité à son minimum durant la période inter-ictale avec 40 min par animal. Les enregistrements en imagerie cérébrale seront effectués sur un animal anesthésié pour réduire le stress de la contention. Toutes les mesures seront prises pour limiter la souffrance et la douleur. L’utilisation d’analgésiques par voie i.p. sera systématique avant la chirurgie (buprénorphine) puis quotidiennement et durant les 3 jours qui suivent le jour de l’implantation chirurgicale (Carprofène). L’expérience sera stoppée si les points limites définis dans la grille de score sont atteints. A la fin de chaque procédure expérimentale, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser trois aspects du SD : 1) la pathologie génétique sous-jacente (mutations SCN1A), 2) l'impact progressif de la répétition des crises observées chez les patients, et 3) un risque modéré de décès (environ 20-40%) qui permettrait facilement de dichotomiser un groupe de survivants et un groupe SUDEP. Le modèle que nous utiliserons sera la souche de souris Scn1aRH+ (R1648H) qui répond parfaitement à ces objectifs. Les animaux seront utilisés entre 7 jours et 72 jours. A l’âge de 7 jours, le génotypage et le tatouage des animaux sera réalisé durant un temps inférieur à 5min puis les souriceaux seront remis avec leur mère. Les crises d’épilepsie se manifestant dès le plus jeune âge dans le SD, nous avons choisi un modèle expérimental de SD permettant de contrôler le déclenchement des crises d’épilepsie aussi bien à 21 jours post-natal (sevrage), qu’à un stade plus avancé (P60).
Nouveau protocole thérapeutique pour la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une injection dans le cerveau sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes, un jeûne de vingt-quatre heures, un isolement de quarante-huit heures : 360 souris porteuses de la mutation responsable de la maladie de Huntington vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection intraveineuse du composé testé et deux injections quotidiennes de traceur cellulaire pendant trois jours, avant des tests comportementaux. Le porteur qualifie ces nuisances de "mineures" et n'attend ni point limite ni mort prématurée. Il écrit que les résultats obtenus sur cellules "nécessitent désormais une validation sur animal en vue de proposer la thérapie aux patients", pour une maladie qui touche cinq personnes sur 100 000 et reste sans traitement curatif.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (5 cas pour 100 000 individus) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de troubles moteurs et intellectuels conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès). La maladie de Huntington est dûe à une mutation sur le gène de la protéine nommée huntingtine, lui conférant une structure anormale. Cela entraîne un gain de fonctions toxiques mais aussi une perte des fonctions physiologiques de la huntingtine. La protéine ainsi mutée ne peut plus assurer son rôle dans le transport de molécules essentielles à la survie neuronale provoquant la mort des neurones. La mutation induit également le déclin des capacités des précurseurs neuronaux et donc la production de nouveaux neurones. En reproduisant des réseaux neuronaux en laboratoire, nous avons pu démontrer que l’expression d’une molécule thérapeutique couplée à l’utilisation d’un composé chimique destiné à réduire les niveaux de protéine mutée était capable de restaurer certaines fonctions de la huntingtine dans un modèle de la maladie de Huntington. Ce projet a donc pour but de tester cette approche thérapeutique, validée sur cellules, afin de restaurer les capacités des précurseurs neuronaux pour rétablir la production de neurones ainsi que les défauts dans les neurones qui conduisent à leur dégénérescence en présence de la mutation. L’objectif final est donc de soutenir la génération de neurones et de limiter la dégénérescence neuronale pour limiter voire abolir les symptômes de la maladie de Huntington.
Bénéfices attendus
Aucun traitement n’existe à ce jour pour soigner les patients atteints de la maladie de Huntington. Nous proposons donc d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les résultats prometteurs obtenus sur cellules nécessitent désormais une validation sur animal en vue de proposer la thérapie aux patients.
Procédures
4 actes expérimentaux impliqueront d’éventuelles nuisances mineures à l’animal: 1/ Lors de l’injection dans le système sanguin de la molécule d’intérêt (anesthésie de 5 minutes) 2/ Lors de l’injection dans le cerveau de la molécule thérapeutique complémentaire (anesthésie de 30-45 minutes) 3/ Lors de l’injection dans le système sanguin de molécules permettant de marquer les cellules (2 fois par jour pendant 3 jours). 4/ Lors des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
1) Nous ne nous attendons pas à observer de points limites ni de mort prématurée chez ces animaux dus à la mutation car chez la souris, la pathologie ne se développe pas de manière aussi sévère que chez l'Homme. En effet, chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales bien précises. 2) Un léger stress peut être induit lors des tests de comportements impliquant une mise à jeun de 24h ou un isolement de 48h. 3) Une légère douleur peut survenir lors des injections dans le système sanguin et dans le cerveau. 4) Un stress modéré peut également survenir lors de la contention des souris pour la réalisation des injections du traceur cellulaire.
Devenir
L’approche thérapeutique proposée consiste en l’injection dans le système sanguin d’un premier composé suivi d’une injection d’une molécule complémentaire dans le cerveau dans le but d’empêcher les effets toxiques de la protéine mutée dans la maladie de Huntington. Pour attester de l’efficacité de ce protocole , ces souris seront ensuite soumises à des tests comportementaux dont les résultats seront confirmés à l’issue de leur euthanasie, nécessaire pour prélever le cerveau à étudier et réaliser divers marquages.
Remplacement
Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet thérapeutique de notre protocole pour traiter les symptômes de la maladie de Huntington et d’évaluer son mécanisme d’action dans le cerveau. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de mimer les modèles comportementaux et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et de matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de l'anatomie de son cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris transgéniques (knock-in). Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptomes de la maladie de Huntington apparaissant à l'âge adulte, nous souhaitons tester notre approche thérapeutique à un stade pré-symptomatique et à un stade symptomatique. Les souris modèles de la maladie de Huntington développent des troubles moteurs et cognifits observables en étude de comportement à 6 mois. Ainsi, en étudiant des souris âgées de 1 et 6 mois, nous pourrons voir l'efficacité du protocole thérapeutique sur l'apparition des symptomes. Le but de ce projet est donc de voir le ralentissement de la progression de la maladie voire d'empêcher l'apparition des symptomes.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin pour l’étude des déficits catécholaminergiques dans le Syndrome de Rett
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
550 souris génétiquement modifiées pour n'exprimer Mecp2 que dans les neurones catécholaminergiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles peuvent développer des apnées, de l'hyperventilation, des crises d'épilepsie, une perte importante de poids et une mobilité réduite, et passent par un protocole d'induction de stress de deux fois trente minutes, le test de Barnes, le rotarod, l'open field, le labyrinthe surélevé et la boîte clair-obscur, un petit étant retiré du nid pour éprouver la réponse de la mère. L'ampleur réelle de ces atteintes reste inconnue, puisque caractériser le phénotype de la lignée est précisément l'objet du projet. Le porteur affirme que ce modèle, couplé à un modèle de surexpression ciblée, est "indispensable" pour développer de nouvelles approches thérapeutiques.
Objectifs
Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie neurodéveloppementale rare d’origine génétique. Dans la majorité des cas, la maladie est liée à une mutation du gène Mecp2 qui code pour un facteur de transcription possédant un rôle majeur dans le développement du système nerveux central. La pathologie touche majoritairement les filles et entraîne un polyhandicap sévère qui affecte considérablement la qualité de vie des patientes. Parmi les symptômes, on retrouve notamment une perte/non acquisition des fonctions motrices volontaire (marche/préhension) s’accompagnant de stéréotypies manuelles. On retrouve également des troubles des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation. Les patientes souffrent aussi d’une déficience intellectuelle, de crises d’épilepsie et de troubles variés affectant le sommeil et l’alimentation. De précédentes études réalisées chez des patientes et des modèles murins de la pathologie ont mis en évidence l’existence d’un déficit en certains neurotransmetteurs (dopamine, noradrénaline, sérotonie) largement impliqués dans les processus d’apprentissage et de réponse au stress. Afin d’identifier la part de des symptômes du RTT imputables aux déficits catécholaminergiques, nous souhaitons faire exprimer la protéine Mecp2 dans les neurones catécholaminergiques (exprimant la dopamine, l’adrénaline et la noradrénaline) des souris déficientes en Mecp2. Les animaux de cette étude seront analysés d’un point de vue phénotypique (survie, poids corporel, fonctions respiratoires/motrices/cognitives, anxiété, réponse au stress), histologique et moléculaire (prélèvements d’organes).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’apporter une meilleure compréhension des relations entre Mecp2, le système catécholaminergique et l’état pathologique des animaux modèles du syndrome de Rett. Cela devrait nous permettre de déterminer la part des symptômes du RTT imputable à ces déficits catécholaminergique. Cette étude devrait par la suite permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le système catécholaminergique et pouvant avoir un intérêt pour le traitement du RTT.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions: - phénotype neurologique dommageable (sur la durée de vie de l'animal), - retrait d'un petit du nid (stress pour la femelle et son petit): moins de 30s, - protocole d'induction de stress (deux fois 30 minutes), anesthésie gazeuse (deux fois 10 minutes), test de Barnes (2 minutes), Rotarod (5 minutes), open field, elevated plus maze, dark-light box (10 minutes), anesthésie profonde par injection (30 se pour l'injection) puis perfusion intracardiaque terminale
Impact sur les animaux
Nos souris Mecp2y/- pTh-Mecp2 présentent une absence d’expression de Mecp2 dans toutes les cellules à l’exception des neurones catécholaminergiques. Étant donné que la déficience totale de Mecp2 entraîne l’apparition d’un phénotype dommageable mimant le RTT, nous nous attendons à observer chez notre modèle d’intérêt un phénotype moins sévère mais restant pathologique en comparaison à des souris sauvages. Les potentiels effets indésirables attendus chez ces souris comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress - une perturbation du comportement maternel chez les femelles - une perte importante de poids corporel - des crises d’épilepsies. La détermination précise du phénotype de notre modèle est un des objectifs de ce projet de recherche. En parallèle, les tests phénotypiques réalisés pour caractériser nos lignées sont susceptibles de générer une douleur ou un stress chez nos animaux. Certains animaux seront également anesthésiés pour la réalisation de prélèvements sanguins.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Nous ne pouvons pas expérimenter chez l'être humain malade atteint d'un syndrome de Rett. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle d'étude de la pathologie. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal, car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le seul modèle de mammifère disponible à l'heure actuelle pour nos travaux est le modèle souris transgénique dans lequel Mecp2 est manipulé. Ce modèle est utilisé pour mieux comprendre la pathologie et comme modèle pré-clinique afin de développer de nouveaux traitements.
Réduction
La variabilité interindividuelle est réduite par l'utilisation de souches de souris fixées génétiquement. Une analyse de puissance statistique est réalisée en amont de chaque procédure afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Une fois les expérimentations achevées, des test statistiques appropriés permettront de valider ou non les résultats obtenus. Les expérimentations seront initalement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenus feront l’objet d’analyse statistique préliminaire en fonction du résultats desquelles : - les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes - le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble existée mais ne ressort pas suffisament pour atteindre la significativité
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage (afin de réduire la douleur et le stress des animaux). Les animaux sont hébergés, en groupes, dans des cages avec enrichissements (dôme et bandelettes de carton), eau et nourriture ad libitum. La température (21°C-23°C), la luminosité (cycle 12h jour / nuit), l'environnement sonore et l'hygrométrie sont contrôlés. Cet hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Nos souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Dans le but de limiter le stress des animaux lors des expérimentations, ceux-ci seront préalablement habitués à l’expérimentateur lors de session de « handling ». Une période d’habituation aux dispositifs de tests sera également prévue. Lors des expérimentations – qui seront réalisées par des personnels formés - le nombre de personnes présentes dans la pièce sera limité au maximum pour ne pas perturber les animaux. De plus, afin de limiter le stress des animaux, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie. En parallèle, l'état général de nos animaux sera surveillé quotidiennement de manière à pouvoir intervenir dans les plus brefs délais en cas d'atteinte des points limites définis.
Choix des espèces
Seule la souris permet actuellement de disposer facilement, rapidement et à moindre coût, d'un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle déficient en Mecp2 est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche sur le syndrome de Rett, et est largement caractérisé dans la littérature. L'utilisation de ce modèle, couplé au modèle de surexpression ciblée de Mecp2 est indispensable pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nos animaux seront inclus dans la procédure de caractérisation phénotypique à partir de 30 jours de vie (P30), stade auquel les premiers symptômes de la pathologie apparaissent chez la souris Mecp2-déficiente.
Etudes de gènes impliqués dans l’hétérotopie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle de gènes responsables chez l'humain d'une malformation cérébrale appelée hétérotopie, 4 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 171 d'entre elles et modéré pour 1 981. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes sous anesthésie pour une électroporation in utero, des juvéniles et des adultes subissent une chirurgie de dix minutes sans jamais se réveiller, et des femelles gestantes éveillées reçoivent des injections intrapéritonéales. Le porteur présente l'électroporation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport à la création de lignées transgéniques, tout en portant l'effectif du projet à 4 152 individus. Aucune de ces souris ne peut entrer dans un autre protocole après les injections reçues, et toutes sont tuées pour les analyses histologiques.
Objectifs
Le développement du système nerveux comprend des phases de prolifération et de migration cellulaires et des phases de différenciation au cours desquelles les neurones établissent des connexions entre eux. Il est important d'identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent ces processus pour améliorer notre compréhension du développement normal et physiopathologique du cerveau. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les rôles de gènes dont les mutations sont responsables chez l’homme de malformation d’une région du cerveau appelée « hétérotopie ». Notre stratégie repose sur l’étude de souris génétiquement modifiées. Nous avons d’abord étudié une lignée porteuse d’une mutation spontanée responsable d’hétérotopie comme celle observée chez l’homme. Nous avons plus récemment créé d'autres lignées permettant de contrôler l’inactivation du gène spécifiquement dans le temps et l’espace. Ainsi, nous pouvons générer des souris dont la mutation n’est exprimée que pendant la phase de prolifération, alors que chez d’autres souris, la mutation ne sera exprimée que pendant la phase de différenciation des neurones excitateurs. Ces inactivations spécifiques vont nous permettre de décortiquer les mécanismes responsables de l’hétérotopie. En analysant les capacités de prolifération et de différenciation de neurones par des études d'injection de produits et d’immunohistochimie, nous identifierons le défaut primaire lié à une perturbation de ces gènes. L’utilisation de protéines fluorescentes spécifiques de certaines structures subcellulaires nous permettra de préciser et de localiser les anomalies par des techniques dynamiques de videomicroscopie. Nous testerons l’action d’agents pharmacologiques pour pallier les défauts de prolifération, de différentiation et de migration observés aux stades embryonnaires. Nous ferons ensuite des essais de thérapie génique par une approche de chirurgie par électroporation in utero visant à traiter les souris mutantes et donc à mieux comprendre les fonctions des gènes électroporés pendant le développement cortical.
Bénéfices attendus
Les malformations corticales sont des maladies rares (incidence 1: 100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Femelles gestantes vigiles : une injection d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale (1 minute). Juvéniles et adultes : chirurgie sous anesthésie et analgésie, sans réveil (durée : 10 minutes). Femelles gestantes: chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur) pré et post opératoire.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale implique une douleur légère au point de piqûre ainsi qu’une contention et donc un stress momentané. Un risque mineur de péritonite est possible. Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Le niveau de douleur sera estimé par rapport à une échelle de grimace et l’observation des difficultés de mouvements. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.
Remplacement
Une partie de notre projet est réalisé in vitro (biochimie et biologie cellulaire). Nous utilisons également la culture cellulaire : transfections de lignées cellulaires, afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Nous comparerons également des souris de type sauvage et mutantes issues de la même portée, avec une répartition mendélienne. De même, tous les animaux générés (femelles et mâles) sont étudiés. Nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les lignées de souris mutantes représentent des modèles de déficits intellectuels, pour lesquels il est important de continuer la caractérisation afin d’éclaircir la physiopathologie. Pour cela, nous analyserons l’anatomie et la morphologie du système nerveux centrale de ces souris, par des méthodes d’histologie, d’immunohistochimie et de microscopie. L’objectif est d’identifier et d’étudier les anomalies associées aux inactivations de gènes d’intérêt. Des travaux précédents nous ont permis de valider l’analyse des régions cérébrales considérées avec une excellente reproductibilité et donc de réduire le nombre d’animaux requis. L’inactivation de gènes ou l'expression de protéines (par exemple, protéines fluorescentes rapportrices) de manière locale et aigüe chez la souris, in utero ou dans le cerveau postnatal, a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaire par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris transgéniques. Cette approche est donc la méthode de choix quand nous testons la fonction de nouveaux gènes de pathologies humaines. Grâce à cette méthode nous éclaircirons les voies biochimiques et les mécanismes subcellulaires essentielles pour le développement cortical. L’étude des mécanismes physiopathologiques liés aux déficits des différents gènes d'intérêt, et réalisée par les approches ci-dessus, est nécessaire à la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques. Des approches par chirurgie seront aussi réalisées afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à l'étude. Le projet impliquera l'utilisation de 4152 animaux.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les souris sont stabulées en portoir ventilés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température, de l’hygrométrie et des pressions, un cycle nycthéméral de 12 :12 et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, un autoclave et un sas chimique comme barrière, comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d'une maison. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois/jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. Les souris sont placées dans les cages avec la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, avec une anesthésie générale par ventilation et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré et post-opératoire, ainsi qu’une analgésie locale sur le site. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (surveillance et traitement des plaies). En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture...), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 12,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles 1 et 10 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype.
Evaluation de la privation de sommeil sur l’activité cérébrale par mesures électrophysiologiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 552
Les souris et les rats sont tués en fin d'étude parce qu'ils s'habitueraient à l'expérience, leur niveau de stress baissant avec le temps et faussant les mesures. 552 souris et 552 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie d'environ deux heures pour implanter des électrodes cérébrales, puis jusqu'à quatre privations de sommeil de douze heures sur un tapis roulant ou sur une plateforme entourée d'eau, certains étant hébergés seuls pendant tout ou partie de l'étude. Le porteur prévoit d'évaluer s'il peut utiliser les mêmes animaux sur trois à quatre semaines, ce qui réduirait les effectifs des études suivantes.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer l'efficacité de nouvelles substances anxiolytiques sur les troubles du sommeil et de manière plus générale sur le cycle circadien. Des personnes souffrant d'anxiété peuvent développer des troubles physiques associés à leur pathologie tels que des troubles digestifs, des douleurs et tensions musculaires ou encore des insomnies, qui sont la cause de somnolence dans la journée ou d'un état de fatigue global. Un état d'anxiété et/ou des crises d'angoisses retardent l'endormissement d'un sujet mais aussi modifie l'architecture globale du sommeil. Les phases de sommeil lent et de sommeil paradoxal peuvent être allongées pendant les périodes de récupération d'un sujet alors qu'elles sont inexistantes lors d'insomnies. La mesure de l'activité cérébrale et motrice permet de déterminer l'état de vigilance de l'animal et d'évaluer l'effet pharmacologique de substances.
Bénéfices attendus
Il existe différents traitements pour lutter contre les troubles de l'anxiété en plus de la prise en charge des patients par psychothérapie. Néanmoins, pour certains patients, les troubles de l'anxiété ne diminuent que faiblement avec les traitements médicamenteux ou réapparaissent dans le temps. La recherche de nouveaux traitements reste donc indispensable pour améliorer les conditions de vie des patients, en limitant l'apparition de symptômes secondaires indésirables. La mise en place de modèles précliniques translationnels reste également une priorité dans ce domaine pour pouvoir tester de nouvelles thérapeutiques. Les tests décrits dans ce projet sont utilisés dans la littérature pour modifier l'architecture du sommeil et évaluer de nouveaux candidats médicaments.
Procédures
Les animaux seront opérés sur une durée d'environ 2 heures pour implanter des électrodes cérébrales (chez la souris et le rat). Le cas échéant, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Après une période de récupération, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées par télémétrie sur plusieurs heures (12 à 24 heures) et sur plusieurs jours consécutifs (minimum de 3 jours). Les animaux seront placés sur un tapis roulant à faible vitesse ou sur une petite plate-forme entourée d'eau (entre 2 et 5 cm d'eau en fonction de la taille du rongeur) pendant 12 heures. Les mesures électroencéphalographiques et la privation de sommeil seront répétées un maximum de 4 fois par animal. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés (maximum de 3 fois sur une durée de quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. A la suite des chirurgies, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte. Les animaux sont parfois hébergés seuls pendant toute ou partie de l'étude ce qui peut causer un stress bien qu'ils conservent un contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères. La privation transitoire de sommeil peut conduire à un stress modéré, en raison de l'environnement dans lequel est placé l'animal. Un état de fatigue peut également être observé lorsque les animaux sont obligés de bouger sur le tapis roulant.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin des expériences car ils auront subi 2 à 3 procédures de privation de sommeil, considérées comme des conditions stressantes. Il ne sera pas possible de les utiliser à nouveau car ils seront déjà familiarisés avec cet environnement et leur niveau de stress va diminuer dans le temps, impactant les données.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro à notre connaissance. Néanmoins, les molécules testées sont préalablement sélectionnées dans des modèles in vitro permettant de déterminer leurs potentiels effets sur une cible.
Réduction
Le nombre d'animaux a été ajusté en fonction des données de la littérature et a été déterminé selon une approche statistique. Il sera également évalué, lors de la première procédure, l'impact de la réutilisation des animaux sur les résultats électroencéphalographiques afin de déterminer si les animaux peuvent être réutilisés sur 3 à 4 semaines et ainsi diminuer le nombre d'animaux par étude.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour les phases chirurgicales, une anesthésie et une analgésie seront réalisées. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire et une couverture chauffante est placée sous l'animal anesthésié pour maintenir sa température corporelle pendant la chirurgie.Les animaux isolés (minimum de 7 jours pour la période de récupération post-chirurgie) sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger et en présence de coton ou de frisure. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. A la fin de la période de récupération, les souris sont regroupées par deux. Des points limites stricts ont été définis. Pendant les périodes de privation de sommeil (animaux placés sur un tapis roulant ou sur une plate-forme, placée dans de l'eau), les animaux sont surveillés par un technicien, permettant l'intervention de ce dernier immédiatement si un animal montre des signes de fatigue en se retrouvant dans une position inconfortable. Les rongeurs seront également séchés avant d'être remis sur la plate-forme pour éviter tout risque d'hypothermie.
Choix des espèces
Les études sur le cycle circadien sont effectuées chez le rongeur (rat et souris) car ces modèles, basés sur la mesure de l'activité cérébrale, sont translationnels. Les substances mises sur le marché pour traiter les troubles psychiatriques ou du sommeil ont été découverts en utilisant des modèles chez le rongeur. Dans ce projet, le rat sera utilisé de préférence car le laboratoire a plus d'expérience avec cette espèce pour évaluer le rythme circadien mais la souris pourra être utilisé au besoin. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 4 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique
Régénération axonale sous un champ électrique après une transsection du nerf sciatique chez la souris adulte
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le nerf sciatique de 136 souris est sectionné sous une anesthésie de trente minutes, puis un implant à électrodes en or est posé pour tester si un champ électrique accélère la repousse nerveuse. Toutes seront tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 72 d'entre elles subissant en plus une étude électrophysiologique à dix semaines. Le porteur reconnaît que la lésion peut causer des douleurs intenses, une restriction de la mobilité, une déshydratation et des comportements d'automutilation, avant que toutes les souris soient fixées pour prélever moelle épinière, nerf et muscle. Il annonce des tests comportementaux hebdomadaires qu'il qualifie de non invasifs et non douloureux, sans préciser lesquels.
Objectifs
Notre approche est novatrice et consiste à mettre au point un dispositif électrique implantable pour réparer des nerfs périphériques sectionnés ou écrasés. Un protocole expérimental a été validé in vitro pour optimiser l'effet d’un champ électrique local exogène sur les processus de régénération nerveuse in vivo. Le dispositif expérimental est constitué d’un tube sur lequel des électrodes en or sont imprimés. Il offre des possibilités polyvalentes pour des études physiques, biochimiques et biologiques approfondies. L'application potentielle de ce neuro-implant sur une lésion du nerf sciatique (modèle biologique) semble prometteuse pour améliorer la régénération nerveuse, en particulier dans le cas des lésions à gap important (au-delà de 3 cm chez l’homme) du nerf sectionné pour lequel la réparation est problématique.
Bénéfices attendus
La priorité de ce projet est de mettre au point un dispositif non invasif qui permette la repousse d’un nerf après traumatisme. Ce projet repose sur le développement d'une interface entre les neurosciences, la biophysique, la science des biomatériaux et les techniques d’imagerie appliquées aux systèmes biologiques. Les développements seront à la fois fondamentaux et techniques, y compris l’étude de nos hypothèses sur la capacité du champ électrique à modifier l’activité cellulaire, ce qui constituerait de grandes avancées en neurosciences, et la compréhension de l’interaction champ électrique-protéine, qui peut apporter de nouvelles perspectives en biophysique et en biomatériaux. Notre objectif à terme, est de proposer un traitement dans le cadre de la prise en charge de ce type de traumatisme chez l’Homme et d’étendre cette méthode thérapeutique à d’autres types de pathologies nerveuses.
Procédures
136 souris seront utilisées dans ce projet. La transsection du nerf sciatique et l’implantation du neuro-implant seront réalisées sous anesthésie générale d’une durée totale de 30 min. Toutes les souris réaliseront des tests comportementaux, ces expériences sont non-invasives et non douloureuses et se feront sur animal vigile. Ces expériences commencent à J7 post-lésionnelle et elles seront effectuées de manière hebdomadaire. L’étude électrophysiologique ne concernera que les souris de la deuxième procédure (n=72), elle sera réalisée sous anesthésié générale à J(10 semaines). L’ensemble des animaux (136 souris) seront fixés. Pour la première procédure, la fixation sera réalisée à deux stades post-lésionnels (J(5 semaines) et J(10 semaines)) afin de récupérer la moelle épinière. Pour la deuxième procédure, la fixation se réalisera à J(10 semaines) afin de prélever le nerf sciatique et le muscle gastrocnémien.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie. - La lésion du nerf sciatique, peut causer des douleurs intenses avec restriction de la mobilité, diminution marquée de la prise de nourriture, déshydrations ou comportement d’automutilation. Les animaux seront surveillés et la prise en charge de la douleur sera adaptée en fonction des indices révélant la douleur ressentie par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour les prélèvements de tissus.
Remplacement
Il est important de noter que nous avons étudié in-vitro l’effet de cette approche thérapeutique sur la repousse axonale sous forme d’étude préliminaire qui a abouti à la création d’un neuro-implant électroactif. Ce travail démontre la potentialité d’utiliser un champ électrique sans contact pour accélérer et orienter la pousse des axones. Cette étude nous permet aussi de comprendre l’impact du champ électrique sur les cellules et le substrat d’adhésion. Notre objectif est d’optimiser l’effet d’un champ électrique exogène et local sur les processus de neuritogenèse et de régénération, via la conception d’un dispositif expérimental original utilisant des électrodes en or. Des tests in-vivo utilisant des modèles de dénervation chez des souris adultes fourniront une preuve de concept de la capacité de réparation nerveuse de ces nouveaux implants électroactifs. Nous avons choisi de nous concentrer, pour cette étude, sur la réparation axonale après un trauma / axotomie. Nous avons donc besoin d'une approche intégrée allant du comportement au cellulaire pour à terme pouvoir juger de l'efficacité de cette approche chez l'Homme et développer des projets de recherche clinique.
Réduction
- Le groupe d’animaux contrôle sera utilisé dans le cadre des différents traitements. Pour chaque protocole, le nombre de souris par groupe est suffisant pour obtenir des données statistiquement valides, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 animaux selon des études antérieures. - 12 souris/groupe seront utilisées pour l’histologie de la moelle épinière (n=6 à J(5semaines) et n=6 à J(10semaines)). 12 souris/groupe seront utilisées à la fois pour l’histologie des nerfs sciatiques et des muscles gastrocnémiens. Il est à noter que 40 souris sont utilisées dans les tests préliminaires (pour rappel les tests préliminaires portent sur la taille du gap (1, 2 ou 3mm) et la sur durée de pré-stimulation (4, 8 ou 24h)). - Une veille bibliographique sera effectuée dans ce contexte scientifique afin d'éviter tout emploi injustifié des procédures expérimentales.
Raffinement
- Les interventions douloureuses ou angoissantes sont réalisées sous anesthésie et un monitoring de l’analgésie pré, per et postopératoire sera envisagé. Avant et pendant l’intervention chirurgicale, dès l’apparition d’un ou des premiers signes d’allègement de l’anesthésie (réflexes, accélération du pouls et de la respiration, mouvements des vibrisses, réaction à un stimulus douloureux), l’animal reçoit immédiatement une dose supplémentaire d’anesthésique équivalent au quart de la dose initiale. L’intervention ne reprend que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio-respiratoire régulier, pas de réaction à un stimulus douloureux comme le pincement d’une patte). Une injection SC d’antalgique sera effectuée 20 minutes avant le début de la chirurgie et deux injections en post-chirurgie avec un intervalle de 4h durant les premiers 24h post-lésionnelles, de façon à réduire la gêne fonctionnelle et les douleurs. Un antalgique sera mis dans le biberon durant la première journée post-opératoire.- Des gouttes du gel oculaire seront appliquées sur les yeux des souris durant la procédure chirurgicale pour éviter toute lésion cornéenne. - Un score de douleur sera établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines et selon le résultat une analgésie sera mise en place ou l’animal sera exclu ou sacrifié. Pour réduire le stress éventuel engendré par les procédures, un enrichissement de l'environnement est essentiel, les cages seront pourvues d’un rouleau en carton ainsi que du coton et des bâtonnets de bois et isolées des vibrations grâce à un tapis en mousse. Les souris seront placées dans une pièce au calme et manipulées de façon journalière.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est d'étudier les effets d'un champ électrique sur le processus de régénération nerveuse après lésion. Nous travaillons sur la souris pour deux raisons : (i) facilités des observations : évaluation comportementale des sorties motrices et sensitives et accessibilité aux motoneurones. (ii) possibilité d'avoir des souris mutantes dans certaines pathologies inflammatoires et démyélinisantes. Ce travail sera réalisé sur des souris adultes de 8 semaines parce qu’elles présentent un degré de myélinisation optimal. De plus, l’objectif à terme est de réparer des nerfs chez des patients essentiellement adultes.