Troubles nerveux

Les expériences menées sur ces macaques doivent démontrer l'efficacité d'un logiciel de traitement d'images IRM développé avec l'entreprise Olea Medical, et la chaîne de biomarqueurs IRM du projet est intégrée à une plateforme commerciale. 12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués par injection létale 45 jours après un AVC provoqué. Après la pose d'un collier sous anesthésie et quatre mois et demi d'entraînement sous restriction hydrique, ils subissent une occlusion de l'artère cérébrale moyenne, avec un risque de mortalité estimé à 18 %, ainsi que des séances d'imagerie et des prises de sang répétées sous anesthésie. Le porteur écrit que le recours au primate non-humain "apparait donc essentiel" et justifie le choix d'adolescents parce qu'ils "n'ont jamais été utilisés dans d'autres études".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain, causé par un caillot dans une artère cérébrale (accident dit ischémique) ou une hémorragie cérébrale (accident dit hémorragique). Le traitement le plus récent de l’accident ischémique est la thrombectomie, qui vise à traiter le caillot responsable de l’occlusion par une action endovasculaire mécanique et ainsi restaurer l’apport sanguin de la région cérébrale irriguée. L’étendue de la pénombre ischémique, la partie du cerveau affectée par l’infarctus mais encore viable, est un indicateur important de l’issue de l’AVC. Sauver la pénombre est une priorité pour diminuer la mortalité et limiter les séquelles lourdes. Notre projet a pour principal objectif de vérifier la sécurité de la procédure qui consiste à incliner de 15° vers l’arrière le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, permettant ainsi d’augmenter l’apport sanguin vers le cerveau. Cette approche a déjà fait ses preuves chez le rongeur et son innocuité doit être validée chez le primate, pour rendre l’essai clinique possible. Cette approche d'inclinaison permettrait de sauver des patients dans la phase critique d’urgence qui risquent de décéder ou d’être lourdement handicapés. La mesure du métabolisme de l'oxygène (CMRO2 : Cerebral metabolic rate of oxygen) représente donc une mesure complémentaire reflétant l’atteinte ou la survie de cette zone de pénombre pour définir avec précision le tissu cérébral à risque lésionnel, et peut donc être un biomarqueur des déficits post-AVC. Après la phase aiguë, il pourrait également servir pour prédire la récupération de ces déficits à long terme. Cette mesure CMRO2 via l’IRM n’ayant jamais été validée à la phase aiguë, notre projet prévoit d’utiliser l’approche d'inclinaison afin d’en évaluer la valeur prédictive. Nos données rétrospectives sont utilisées pour développer un logiciel de post-traitement clinique de la CMRO2 avec Olea Medical. Son efficacité pour suivre un traitement comme l'inclinaison sera démontrée grâce aux nouvelles expériences. Des analyses corrélatives seront réalisées entre les mesures de déficits moteurs observés chez l'animal via une tâche de prise alimentaire nécessitant une dextérité motrice qui sera affecté par l’AVC et mettra en jeu des mécanismes d’adaptation comportementale que l’on pourra corréler avec nos marqueurs d’activité cérébrale dans les régions corticales et sous-corticales associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion cérébrale dans les mécanismes de récupération fonctionnelle post-AVC. Grâce à l’étape d’habituation et d’entraînement des animaux à la réalisation de la tâche de prise alimentaire et à la manipulation pour le test de la motricité, le stress des animaux sera réduit, car ceux-ci participeront d’eux même à leur mise en chaise et seront habitués aux sorties quotidiennes. La restriction hydrique augmentera leur motivation pour réaliser la tâche. Notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la reperfusion cérébrale et limiter les processus lésionnels, tout en favorisant la récupération fonctionnelle de nombreux patients atteints d’AVC. Nous pourrons ainsi avoir une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans les phases précoces post-AVC, grâce aux nouveaux outils IRM pour mesurer la consommation d’oxygène cérébrale. En déterminant cette mesure de la CMRO2 au sein des structures cérébrales corticales et sous-corticales participant à la compensation fonctionnelle cela ouvrira certainement une meilleure prise en charge et un meilleur suivi thérapeutique des patients atteints d’AVC, avec une approche de plus en plus personnalisée. En combinant l’imagerie TEP avec l’IRM de diffusion à haute définition, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation sous-jacent aux processus lésionnels et de compensation et ainsi de mieux comprendre comment les zones cérébrales non-lésées peuvent compenser pour pallier la perte de fonction d’une région cérébrale ayant subi une lésion ischémique. L’IRM étant largement plus répandue et accessible en urgence que l’imagerie TEP, les marqueurs IRM pourront avoir un impact clinique très important. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, le pipeline de biomarqueurs IRM est implémenté dans une plateforme commerciale et sera optimisé pour une utilisation à la phase aiguë.

Procédures

Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tâche alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajusté pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensée dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, où l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou l’imagerie (1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion. Finalement un dernier prélèvement sanguin ainsi qu’un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal. A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation à la kétamine, après prélèvement du LCR sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérées légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux.

Devenir

A l’issu de la procédure, 45 jours après l’intervention, les animaux seront euthanasiés. Cette sortie de la procédure par une euthanasie sur tous les animaux est principalement justifiée par le fait qu’elle nous sera indispensable, pour valider les mécanismes au niveau cellulaire, des outils d’imagerie développés dans ce projet. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.

Choix des espèces

L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgées de dix-sept mois, elles subissent une chirurgie stéréotaxique de cinquante minutes pour injecter dans le cerveau une protéine toxique, puis des traitements chroniques par gavage ou injections deux fois par jour, des tests de coordination motrice et un prélèvement intracardiaque. Le porteur inscrit ce projet dans le développement préclinique de candidats-médicaments pour ses partenaires. Il affirme que la complexité des interactions cellulaires dans le cerveau ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal.

Objectifs

La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée par des troubles de la coordination motrice, de la rigidité musculaire, des tremblements et une lenteur d’exécution des mouvements. La maladie de Parkinson frappe aujourd’hui 200,000 personnes en France. Le manque de médicaments efficaces contre la maladie représente un défi majeur pour la santé humaine. La neurodégénérescence est causée notamment par la toxicité de l’alpha-synucléine mal-conformée et est amplifiée par des dysfonctions lysosomales. En effet, la fonction lysosomale est fortement perturbée dans la maladie de Parkinson. Des mutations sur le gène codant pour la protéine lysosomale GBA ont été identifiées comme un facteur de risque important pour le développement de la maladie. Notre modèle animal est basé sur: 1/ l’injection d’oligomères/fibrilles de l’alpha-synucléine dans la substance noire, 2/l’inhibition chronique de l’activité GBA et 3/ sur l’âge avancé des souris (17 mois), la maladie de Parkinson étant associée à l’âge. La finalité de ce projet est de déterminer le potentiel neuroprotecteur de plusieurs candidats-médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Il s'intègre dans des projets de développement précliniques de nos partenaires.

Bénéfices attendus

Le projet s'intègre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie stéréotaxique (50 minutes), sous anesthésie générale et une analgésie systémique. Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours post-opératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure inclue des traitements chroniques (deux fois par jour maximum, d'une durée de 30 secondes maximum) par gavage ou injections sous-cutanées ou intra-nasale ou intra-péritonéales. Les fonctions motrices seront évaluées avec des tests de coordination motrice (3 différents tests par 3 sessions de 1minute maximum espacées de 10 min). Ces tests seront rapides (maximum 5 minutes par jour). Les animaux subiront un prélèvement intra-cardiaque sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Les traitements quotidiens des souris (par gavage, par injections sous-cutanées, intra-nasales ou intra-péritonéales) peuvent induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests de motricités peuvent également induire un stress chez les souris puisqu'elles seront placées dans des environnements inhabituels.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des échantillons biologiques au plus tard 6 semaines après la chirurgie.

Remplacement

Les rongeurs sont un excellent modèle pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices) pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurodégénératives humaines, en l'occurrence la maladie de Parkinson. Les processus pathophysiologiques de cette pathologie impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales (striatum, substance noire). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris (n par groupe) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Ceci permet donc de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. La motricité fine des souris sera évaluée, des études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuels effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie de Parkinson.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnel en carton), (ii) des approches d'analgésies avant, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort. Si un point limite est atteint, durant l'étude, les souris seront euthanasiées en utilisant les méthodes d’euthanasie autorisées.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie de Parkinson. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris.

Une occlusion de l'artère cérébrale moyenne provoque chez les macaques une lésion du cerveau, avec perte des capacités motrices et cognitives, et un risque de mortalité estimé à 18 % d'après une étude antérieure. 12 macaques à longue queue adolescents vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour vérifier la sécurité d'une inclinaison du corps et de la tête de 15° vers l'arrière pendant l'occlusion. Avant l'AVC, ils passent quatre mois et demi d'entraînement à une tâche de prise alimentaire sous contrôle hydrique. Le porteur écrit qu'ils seront "toujours maintenus en hébergement par paire" même après l'AVC, et décrit ailleurs un "isolement et un confinement de l'animal durant quelques jours" après l'opération. Tous sont tués par injection létale 45 jours après l'intervention, pour des analyses du tissu cérébral qui doivent valider les mesures d'IRM.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain, causé par un caillot dans une artère cérébrale (accident dit ischémique) ou une hémorragie cérébrale (accident dit hémorragique). Le traitement le plus récent de l’accident ischémique est la thrombectomie, qui vise à traiter le caillot responsable de l’occlusion par une action endovasculaire mécanique et ainsi restaurer l’apport sanguin de la région cérébrale irriguée. L’étendue de la pénombre ischémique, la partie du cerveau affectée par l’infarctus mais encore viable, est un indicateur important de l’issue de l’AVC. Sauver la pénombre est une priorité pour diminuer la mortalité et limiter les séquelles lourdes. Notre projet a pour principal objectif de vérifier la sécurité de la procédure qui consiste à incliner de 15° vers l’arrière le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, permettant ainsi d’augmenter l’apport sanguin vers le cerveau. Cette approche a déjà fait ses preuves chez le rongeur et son innocuité doit être validée chez le primate, pour rendre l’essai clinique possible. Cette approche d'inclinaison permettrait de sauver des patients dans la phase critique d’urgence qui risquent de décéder ou d’être lourdement handicapés. La mesure du métabolisme de l'oxygène (CMRO2 : Cerebral metabolic rate of oxygen) représente donc une mesure complémentaire reflétant l’atteinte ou la survie de cette zone de pénombre pour définir avec précision le tissu cérébral à risque lésionnel, et peut donc être un biomarqueur des déficits post-AVC. Après la phase aiguë, il pourrait également servir pour prédire la récupération de ces déficits à long terme. Cette mesure CMRO2 via l’IRM n’ayant jamais été validée à la phase aiguë, notre projet prévoit d’utiliser l’approche d'inclinaison afin d’en évaluer la valeur prédictive. Nos données rétrospectives sont utilisées pour développer un logiciel de post-traitement clinique de la CMRO2 avec Olea Medical. Son efficacité pour suivre un traitement comme l'inclinaison sera démontrée grâce aux nouvelles expériences. Des analyses corrélatives seront réalisées entre les mesures de déficits moteurs observés chez l'animal via une tâche de prise alimentaire nécessitant une dextérité motrice qui sera affecté par l’AVC et mettra en jeu des mécanismes d’adaptation comportementale que l’on pourra corréler avec nos marqueurs d’activité cérébrale dans les régions corticales et sous-corticales associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion cérébrale dans les mécanismes de récupération fonctionnelle post-AVC. Grâce à l’étape d’habituation et d’entraînement des animaux à la réalisation de la tâche de prise alimentaire et à la manipulation pour le test de la motricité, le stress des animaux sera réduit, car ceux-ci participeront d’eux même à leur mise en chaise et seront habitués aux sorties quotidiennes. La restriction hydrique augmentera leur motivation pour réaliser la tâche. Notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la reperfusion cérébrale et limiter les processus lésionnels, tout en favorisant la récupération fonctionnelle de nombreux patients atteints d’AVC. Nous pourrons ainsi avoir une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans les phases précoces post-AVC, grâce aux nouveaux outils IRM pour mesurer la consommation d’oxygène cérébrale. En déterminant cette mesure de la CMRO2 au sein des structures cérébrales corticales et sous-corticales participant à la compensation fonctionnelle cela ouvrira certainement une meilleure prise en charge et un meilleur suivi thérapeutique des patients atteints d’AVC, avec une approche de plus en plus personnalisée. En combinant l’imagerie TEP avec l’IRM de diffusion à haute définition, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation sous-jacent aux processus lésionnels et de compensation et ainsi de mieux comprendre comment les zones cérébrales non-lésées peuvent compenser pour pallier la perte de fonction d’une région cérébrale ayant subi une lésion ischémique. L’IRM étant largement plus répandue et accessible en urgence que l’imagerie TEP, les marqueurs IRM pourront avoir un impact clinique très important. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, le pipeline de biomarqueurs IRM est implémenté dans une plateforme commerciale et sera optimisé pour une utilisation à la phase aiguë.

Procédures

Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tâche alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajusté pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensée dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, où l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou l’imagerie (1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion. Finalement un dernier prélèvement sanguin ainsi qu’un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal. A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation à la kétamine, après prélèvement du LCR sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérées légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux.

Devenir

A l’issu de la procédure, 45 jours après l’intervention, les animaux seront euthanasiés. Cette sortie de la procédure par une euthanasie sur tous les animaux est principalement justifiée par le fait qu’elle nous sera indispensable, pour valider les mécanismes au niveau cellulaire, des outils d’imagerie développés dans ce projet. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.

Choix des espèces

L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.