Troubles nerveux

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris diabétiques développant une neuropathie, elles subissent des anesthésies répétées pour des électromyographies, des traitements chroniques par gavage et injections pendant huit semaines, puis des tests comportementaux avant une perfusion intracardiaque mortelle. Le porteur développe des candidats médicaments et conditionne la suite du projet à des "résultats positifs". Il affirme que la complexité de la neuropathie ne peut être reproduite qu'avec un modèle animal.

Objectifs

La neuropathie périphérique est un trouble fonctionnel des nerfs périphériques comprenant de nombreux syndromes. Les patients atteints de cette pathologie peuvent avoir des troubles sensitifs, des modifications du seuil douleur, de faiblesse musculaire et d'amyotrophie. La neuropathie périphérique provoquée par le diabète est l’une des complications chroniques les plus fréquentes de la pathologie. L'objectif de ce projet est de développer et de caractériser un nouveau modèle de neuropathies périphériques au sein de notre établissement afin d'évaluer, par la suite, le potentiel de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les animaux seront soumis à des anesthésies répétées pour la réalisation des enregistrements électromyographiques (EMG). Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens) par gavage ainsi qu’en intra-peritonéal et en sous-cutanée pendant toute la durée de l'étude (8 semaines). Les capacités motrices ainsi que les changements de sensibilité seront étudiés avec des tests comportementaux. Ces tests seront rapides (maximum 15 minutes par jour), sur une durée maximale de 7 jours, non consécutifs, mais se répèteront sur plusieurs semaines. A la fin des études, les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs enregistrements electromyographiques (EMG) pouvant causer du stress et une légère souffrance. De plus, les tests comportementaux (filaments de von frey, test de l'echelle) peuvent induire une nuisance chez les souris (stress et inconfort liés aux stimuli appliqués).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

Les processus pathophysiologiques des neuropathies périphériques impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris (n par groupe) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 10 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=10 souris par groupe.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (4 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude des neuropathies. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris. Ce projet utilisera des souris agées 5 semaines à leur arrivée. En effet, la souche de souris db/db développe un diabète de type II à partir de 4-5 semaines d'âge. Comme les premiers signes de neuropathie apparaissent après 4 à 6 semaines de présence du diabète, nous recevrons ces animaux dès 5 semaine d'âge afin de suivre l'évolution des différents paramètres étudiés avant et après l'apparition des signes de neuropathie.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation d'électrodes dans le cerveau et des injections de virus, suivies d'enregistrements pendant l'éveil et le sommeil, avec douleur post-chirurgicale, risques anesthésiques et hébergement isolé. Le porteur mène une recherche fondamentale sur les récepteurs du glutamate et renvoie au long terme d'éventuelles stratégies contre les troubles anxieux. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que la modélisation informatique de ces réseaux reste hors de portée.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies puis soumises trois mois à un régime gras déséquilibré, elles subissent un test de tolérance au glucose puis une chirurgie d'accident vasculaire cérébral de dix à quarante minutes, qui provoque une douleur peropératoire, des pertes sensorimotrices et une perte de poids. Le porteur indique qu'une première étape sert surtout à choisir le meilleur modèle et à faire acquérir le geste chirurgical par deux personnes du laboratoire. Il écarte le remplacement en affirmant que l'étude ne peut s'envisager que dans un "organisme entier", et justifie la mise à mort par le prélèvement des tissus.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de déterminer le meilleur modèle d’étude de la maladie chez le sujet âgé. Dans un premier temps nous comparerons deux modèles classiquement utilisés et qui sont les plus proches de l’accident vasculaire cérébral chez l’homme. Dans un second temps, le modèle choisi fera l’objet d’une acquisition du geste chirurgical par deux personnes pour permettre la continuité de la compétence acquise au sein du laboratoire. Enfin, le modèle sélectionné et acquis par le personnel compétent sera appliqué dans le cadre d’une première étude dont le but est de prendre en compte le rôle de l’âge et des comorbidités associées dans l’accident vasculaire cérébral. En effet, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude permettra de choisir un modèle d'étude fiable et reproductible pour mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en place un modèle adapté et robuste pour comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Tout d’abord, nous testerons 2 différents modèles d’accident vasculaire cérébral ischémique chez des animaux de plus de 9+/- 2 mois. La chirurgie est de 40min pour le modèle semi permanent (procédure 1) et de 10 min pour le modèle permanent (procédure 2). Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo, préalablement retenu, d'ischémie cérébrale (chirurgie de 10 ou 40 min). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés à 72h après la mise en place du modèle d’accident vasculaire cérébral à l’aide de tests de comportement et de l’imagerie post mortem.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). Le test d'intolérance au glucose pourra induire une légère douleur de courte durée (1 injection intrapéritonéale de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie). Le modèle d’accident vasculaire cérébral induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire de l’imagerie

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale dans un contexte de vieillissement vasculaire et comorbidités liées à l’âge, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’accident vasculaire cérébral. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.

Procédures

Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).

Impact sur les animaux

Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.

Devenir

Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.

Raffinement

Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.

Choix des espèces

La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Pelizaeus-Merzbacher, elles reçoivent une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, une IRM d'environ deux heures et quatre tests comportementaux dont le contenu n'est pas précisé, tout en développant tremblements et paralysie progressive liés à la maladie. Le porteur mentionne un risque d'arrêt cardiaque et d'hémorragie lors de l'injection ainsi qu'une hypothermie sous IRM. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour cette maladie et que la souris "reste le modèle de choix".

Objectifs

La maladie de Pelizeus Merzbacher (PMD) est un défaut héréditaire de formation de la myéline (membrane isolante permettant le transport du message nerveux dans les neurones) du système nerveux central (SNC). Cette forme est causée par des mutations du gène de la protéine appelée proteolipide protein 1 (PLP1) indispensable à la bonne formation des gaines de myeline. La PMD se caractérise chez les patients de sexe masculin par une altération précoce du développement psychomoteur (inférieur à 6 mois de vie). Au cours des premières années de myélinisation active, le manque de force musculaire est associé à des signes neurologiques progressivement modifiés par la maturation du système nerveux. Il existe un modèle murin de la pathologie présentant une bonne similitude avec la maladie rencontrée chez l’Homme pour nous permettre de tester nos thérapies géniques. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. Notre objectif est de tester différentes stratégies thérapeutiques basées sur une approche de thérapie génique au moyen d’une construction d’ADN appelée vecteur adeno-associé (AAV) conduisant à la surexpression d’un gène médicament (confidentiel). Nous avons d’ores et déjà démontré l’efficacité de notre gène médicament dans d’autres modèles de maladies neurologiques avec des atteintes similaires. L’objectif du projet étant d’établir la preuve de concept de l’approche thérapeutique afin ensuite de mener les étapes précliniques pour une application chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Des bénéfices pour les animaux ayant reçus la thérapie qui doit s’apprécier dans les tests comportementaux Le bénéfice du projet est d’etablir la preuve de concept de l’efficacité de nos approches de thérapie génique dans le modèle murin de Pelizeus Merzbacher pour pouvoir le transposer chez l’Homme afin de prendre en charge des patients aujourd’hui démunis et leur proposer un traitement.

Procédures

- Une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5 min au total) - Une Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h)) sous anesthésie générale Des tests comportementaux basés sur une appréciation de comportements spontanés (4 tests réalisés à 1 et 2 mois d’âges d'une durée de 2 à 20 min chacun). - phenotype dommageable des animaux avec un tremblement et une paralysie progressive

Impact sur les animaux

- Une injection intraveineuse avec un risque d’arrêt cardiaque et un risque d’hémorragie - Une Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h) avec un risque anesthésique et une hypothermie - Des tremblements et des signes de paralysie liés au modèle de la maladie - pas d'effets secondaires du traitement attendu - stress et angoisse et fatigue lié aux tests comportementaux

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires post-mortem

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la maladie de Pelizeus Merzbacher (PMD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de nos approches de thérapie génique. Le modèle souris reste le modèle de choix car il reproduit les atteintes cliniques présentent chez les patients.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 20 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 300 souris sera nécessaire pour ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. La procédure fait l’objet de raffinement : la lutte contre l’hypothermie lors des anesthésies, la surveillance des anesthésies notamment lors de l’IRM. Pour les souris étant en evaluation de survie, une surveillance quotidienne sera mise en place ainsi qu’un acces à la nourriture facilitée avec croquettes et nourriture gélifiée mise en place dans la cage mais aussi de l’eau gélifiée avec la mise en place de points limites. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions protégées avec la couverture de tous leurs besoins physiologiques. La température, l'hygrométrie sont surveillées. un cycle nycthéméral est mis en place, l'alimentation et l'abreuvement sont à disposition sans restriction. Le changement des cages est assuré toutes les 1 à 2 semaines en fonction de la densité d'animaux (avec une litière faite de copeaux de bois) De l'enrichissement adapté aux besoins des rongeurs est disponible : coton et kraft pour fabriquer un nid, des maisonnettes pour être dissimulés, des bâtonnets à ronger voire des barrières visuelles pour complexifier la circulation dans la cage et permette là aussi la dissmulation, si besoin.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour évaluer l’efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique de la maladie de Pelizeus. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu qui reproduit la pathologie développée chez les enfants Les souris seront utilisées juste après leur sevrage et analysées jusqu’à l’âge de 2 mois pour la majorité avant l’apparition des symptômes invalidants. Seul un groupe de souris permettant d’apprécier la survie sur le meilleur de nos traitements sera gardé au-delà de l’âge des 2 mois avec suivi attentif.

120 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau pour implanter des électrodes de stimulation profonde, avec une IRM sous anesthésie de deux à quatre heures, une injection de vecteurs viraux ou de cellules souches et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, pour valider ces dispositifs avant un usage chez l'humain. Le porteur indique des risques de douleur post-opératoire, d'infection et de fibrillation, un défibrillateur restant disponible en salle. Il affirme que le recours au cochon est "nécessaire" pour la proximité de son anatomie cérébrale avec celle de l'humain, aucun modèle in silico valide n'existant selon lui.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale souvent pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement. La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans la structure cible pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de la maladie de Parkinson (MP). Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée pour d'autres troubles, comme l'épilepsie et la dépression. Le développement de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique ou cellulaire pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés atténués ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. D'autres approches thérapeutiques par injection de cellules souches "réparatrices" pourront également être évaluées. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces candidats thérapeutiques, tout comme la DBS, reste l’approche chirurgicale suivie de différentes mesures et prélèvements. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou vecteurs viraux ou cellules souches) chez le porc. Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs viraux qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique, ou des cellules souches, et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le porc. Les deux approches pouvant être combinées en conditions proches de la clinique avant leur utilisation chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament ou d’un nouveau dispositif médical (électrode), indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles électrodes sur les animaux visant à améliorer l’impact de la DBS dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique ou cellulaire chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de maladies neurodégénératives ou neurologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes, sous anesthésie générale (nécessitant une injection intramusculaire de quelques secondes) : examens d’imagerie non-invasifs par IRM (durée 2-4 heures), une chirurgie stéréotaxique (identique à celle réalisée chez le patient humain) pour l'implantaton, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administraation d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). En fonction du test réalisé, certains animaux pourront avoir une phase de récupération et de répétition, d’une à deux semaines après la chirurgie, de l’imagerie et enregistrements electrophysiologiques afin d’évaluer les résultats chroniques de l’intervention réalisée (durée 4-6 heures). Des prélèvements pourront être réalisés (sang et liquide cephalo-rachidien), le plus souvent lors de l'anesthésie pour d'autres actes: chirurgie ou imagerie. Cependant, en cas d'immunosupression, un suivi est nécessaire, et des prises de sang pourront être effectuées 1 fois par semaine (durée env. 2 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie: stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l'imagerie: stress de la contention et de l'administration d'anesthésique. Une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter ces complications inattendues.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo, des organes pourront également être proposés à des équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet concerne exclusivement une utilisation du porc. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le porc (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale) apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 6 animaux par étude, soit un total de 120 animaux sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 6 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les candidats thérapeutiques auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire ne concerne qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec maintien en groupe social et enrichissement adapté (jeux à macher, tapis de repos, système encourageant le fouissage...) Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le porc a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du porc est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure thérapeutique. Porc : jeune de 35-40kg environ (environ de 3-4 mois) ou miniporc de taille similaire Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.