Troubles nerveux

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de vecteurs viraux pour surproduire la neuromélanine, puis jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un essai de traitement par ultrasons, avant mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'injection peut provoquer douleur et perte de poids, et qu'un syndrome parkinsonien progressif peut mener à l'apathie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du cerveau nécessaire à l'étude de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie. Un essai thérapeutique par stimulation mécanique des tissus par ultrasons focalisés transcrâniens sera également réalisé dans l’objectif de réduire la concentration intracellulaire de neuromélanine et de ralentir le processus dégénératif.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.

Procédures

Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteur viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 86 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 86 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min. - Traitement par ultrasons focalisés : Pratiqué sous anesthésie générale en même temps qu'une session d'imagerie de 30 min sur 30 rats 1 fois par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la tyrosinase humaine. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie et de traitement ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats exprimant la tyrosinase humaine n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats exprimant la tyrosinase humaine, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de neuromélanine, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.

Réduction

Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. De plus, cette étude principale permettra d’identifier la fenêtre temporelle la plus pertinente pour l’évaluation d’une thérapie. Cela permet de réduire le nombre d’animaux qui auraient dû être utilisés pour tester le traitement à différents temps post injection. Au total un nombre de 86 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés et recevront une analgésie 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. De l’ocrygel sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique locale sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux, une prise en charge analgésique sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. L’utilisation d’ultrasons transcraniens est une mesure de raffinement en elle-même puisqu’elle permet une approche thérapeutique sans ouverture crânienne. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l’appareil d'imagerie. Une analgésie locale sera appliquée par gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique.

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.

1 010 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et deux cents réutilisées dans d'autres protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent un stress néonatal ou un régime obésogène, puis une chirurgie stéréotaxique injectant un virus dans le cerveau, des prises de sang à la queue et des tests comportementaux avec privation alimentaire. Le porteur attend un comportement anxieux ou dépressif chez les souris stressées ou rendues obèses, objet même de l'étude sur la dépression humaine. Il affirme que l'étude des facteurs environnementaux et du comportement ne peut se faire que sur animal vivant et rattache les retombées aux troubles de l'humeur.

Objectifs

La dépression représente un problème de santé publique majeur. Parmi les facteurs impliqués dans la vulnérabilité à la dépression, l’adversité dans l’enfance et l’obésité associée au mode de vie sédentaire et aux habitudes alimentaires occidentales sont des facteurs de risques importants. Cependant, les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la dépression restent mal connus. Des travaux récents suggèrent que des processus inflammatoires et des dysfonctions du système dopaminergique mesocorticolimbique contribuent à la physiopathologie de certains symptômes dépressifs. L’objectif de ce projet est d’examiner les effets du stress précoce et de l’inflammation liée à l’obésité dans l’apparition désordres émotionnels à l’âge adulte et de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents. Pour cela nous utiliserons des méthodes de transfert de gènes viraux chez des souris ayant subies un stress néonatal ou rendues obèses à l’âge adulte pour moduler la transmission dopaminergique. Un total de 1010 animaux est envisagé pour ce projet. L’étude de l’impact des facteurs environnementaux et du comportement ne peut être réalisée que sur animaux vivants, rendant impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l’inconfort des animaux.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la perte de motivation associée au stress précoce et à l’obésité, et plus précisément le rôle de la voie GTP-CH1. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte d’obésité.

Procédures

- Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue (7 prélèvements sur 2 heures représentant moins de 100uL de sang) sur une partie des animaux vigiles pour mesurer différents paramètres métaboliques. - Des injections intrapéritonéales seront réalisées pour évaluer la sensibilité des animaux à l'insuline. - L’ensemble des souris sera soumis à une chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un virus recombinant dans une région spécifique du cerveau. Cette procédure sera réalisée une seule fois sur chaque animal. - Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire.

Impact sur les animaux

- Un comportement anxieux et/ou de type dépressif est attendu chez les souris soumises au stress précoce et au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. - L’exposition chronique au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris. - La chirurgie peut être cause de douleur chez l’animal. Le stress thermique induit par l’anesthésie est contrôlé par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant un maintien de la température à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Les injections et prises de sang peuvent être cause de douleur pour l’animal. - Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère et un isolement en cage individuelle le temps de la procédure.

Devenir

Les mères, mâles reproducteurs et mâles C57Bl/6 utilisés pour le screening (200 animaux) seront préférentiellement réemployés dans d’autres protocoles. Le reste des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures.

Remplacement

L’objectif du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur induits par un stress précoce ou une exposition chronique à un régime obésogène. L’emploi de modèles animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie par l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre total d’animaux est susceptible d’être revu à la baisse en fonction du succès des reproductions.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant certaines expériences, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de score. Si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. - La procédure de stress précoce sera réalisée sur des femelles lactantes. - Concernant la cohorte impliquant la mise en place d’un phénotype obèse, les souris seront mises sous régime obésogène ou contrôle à partir du sevrage, pour une durée de 15 semaines. Ce choix repose sur les données de la littérature, notamment issues de notre laboratoire, montrant qu’un début d’exposition au régime obésogène au stade de l’adolescence induit des perturbations métaboliques mais aussi de la sphère émotionnelle, majorées, comparativement à une exposition plus tardive (stade adulte). - La suite des expériences (études comportementales, évaluation de la transmission dopaminergique) sera réalisée à l’âge adulte, 15 semaines après le sevrage.

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un candidat médicament, puis sont soumises à des tests de mémoire dont un test d'évitement passif où un stimulus aversif est appliqué à leurs pattes, avant leur mise à mort pour analyser leur cerveau, afin de préciser l'action d'une molécule contre la maladie d'Alzheimer développée par une société. Le porteur situe les retombées avant un éventuel développement clinique. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable" pour ces réponses comportementales.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer est aujourd’hui une priorité, notamment parce que les médicaments disponibles s'avèrent d'effet limité et présentent de nombreux effets secondaires invalidants. Suite à au faible niveau de service rendu au patient, les 4 médicaments commercialisés dans la maladie d'Alzheimer ont fait l'objet d'un déremboursement par la sécurité sociale en France. Une société Montpelliéraine développe donc une nouvelle molécule, qui s'avère, dans les modèles animaux précliniques de la maladie, très efficace, plus anti-inflammatoire, sans effet secondaire sur la mémoire et de plus longue durée d'action que les médicaments actuels. Pour préciser la nature de son activité pharmacologique, deux expériences de comportement sont aujourd'hui nécessaires : l'une pour analyser ses effets directs sur la mémorisation, l'autre pour confirmer son action pharmacologique particulière sur un système neuronal particulier.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale (moins d'une minute) des molécules à tester pendant 6 jours lors de l'expérience 1 et pendant de 1 à 12 jours pendant l'expérience 2. Suite au traitement les capacités de mémorisation des animaux seront testées, avec des tests comportementaux qui dure 15 secondes pour le test d'évitement et pour la préférence de place, deux fois 30 minutes pour le conditionnement et 10 minutes pour l'analyse.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ces deux expériences subiront deux types de stress modéré : une ou deux injections intrapéritonéales quotidiennes. Pour l'expérience 1 reposant sur un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme, un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus. . Pour l'expérience 2, les animaux sont placés dans une boite à 2 compartiments pendant une session de 30 minutes par jour durant la phase de conditionnement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure et les cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.

Remplacement

La molécule est ici testée sur des réponses comportementales spécifiques (phases de mémorisation, dépendance d'état chimique pour le test de préférence de place) au moyen de tests standardisés et très prédictifs. Par exemple, l'ensemble des phases de la mémorisation (acquisition, consolidation, rappel, extinction, reactivation) sera examiné en une seule procédure comportementale au moyen du test d'évitement passif. Les gammes de doses testées seront réduites à 3-4 doses autour des effets anti-amnésiants déjà déterminés dans les études précédentes. L’utilisation du modèle murin reste par ailleurs indispensable car il permet de préciser des réponses comportementales très proches de celles observées chez l'homme.

Réduction

Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer (mémoire à long terme non-spatiale pour l'évitement passif et dépendance d'état chimique pour le conditionnement préférentiel de place). Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (15 souris/groupe). Ce nombre de 15 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.

Raffinement

Les animaux seront reçu une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Un examen quotidien sera fait et un formulaire de suivi du bien-être sera complété. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et utilisé dans les expériences antéreiures. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que les effets de la molécules ont été caractérisé dans les phase antérieures du projet.

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit 25 prélèvements sanguins, cinq chirurgies d'implantation et de retrait et seize ponctions lombaires sous anesthésie, avant sa mise à mort pour des analyses de tissus, dans une étude de faisabilité d'une thérapie contre une leucodystrophie infantile. Le porteur présente ces étapes comme requises par les agences réglementaires avant un essai clinique. Il affirme que l'implantation chez le primate est "indispensable" pour préparer ce dossier.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité́ de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très (approche confidentielle) encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH) afin d’évaluer la quantité d’enzyme sécrétée. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique chez les patients déjà symptomatiques pour la MLD.

Procédures

- prelevement sanguin, durée d'environ 5min (25 au total) - une chirurgie d'implantation et de retrait répétée 5 fois par animal d'une durée maximale de 30 min et -16 ponctions lombaires d'une durée de 5min Tous ces actes sont faits sur animaux anesthésiés. Tous ces actes sont fait sous analgésie et l'animal sera euthanasié en fin de procédure pour réaliser les prélèvements

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux/inflammatoire (type rejet) lors de la mise en place des implants - un risque de fuite de LCR lors des prélèvements - la formation d'hématomes lors des prises de sang - un stress lors de la contention pour anesthésie

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=4) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants et la preuve de concept établiet dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution de la protéine d'interet, toxicité, etc) chez le gros animal (PNH). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique

Réduction

4 animaux au total avec plusieurs implantations par animal afin de tester plusieurs conditions et de selectionner la meilleure avant l’euthanasie pour etude de l’efficacité en post mortem. L'etude statistique etant assez limitée en terme de toxicité. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Enfin, le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation d'analgésique pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suivi, il sera euthanasié avec avis vétérinaire Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris

Choix des espèces

La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le NHPPNH est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique. PNH : macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau completement développé

1780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injections stéréotaxiques et pose de fibres optiques ou de lentilles, une restriction d'eau pouvant leur faire perdre jusqu'à 20 % de leur poids sur quatre semaines et un isolement pouvant durer deux mois, pour étudier des circuits neuronaux de l'apprentissage olfactif. Les retombées thérapeutiques évoquées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo.

Objectifs

Ces dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence l’existence d’un phénomène de production de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, dont la déficience semble être liée à des maladies neurodégénératives ou à certaines formes de dépression. De plus, il a été mis en évidence que ces cellules étaient impliquées dans des phénomènes d’apprentissage et de mémoire. Ces découvertes ont suscité un grand espoir dans la communauté biomédicale, celui de pouvoir un jour développer des thérapies basées sur cette capacité du cerveau à produire de nouveaux neurones fonctionnels à tout âge. En particulier, le bulbe olfactif, premier relai central du système olfactif et le gyrus denté de l’hippocampe sont des structures où la neurogenèse à l’âge adulte peut être identifiée dans les conditions constitutives du cerveau sain chez la plupart des mammifères. En conséquence, parmi tous les systèmes sensoriels, le système olfactif se distingue par sa grande plasticité, comprenant entre autres la capacité de renouvellement de ses constituants cellulaires, et ceci y compris à l’âge adulte. Chez les rongeurs, des dizaines de milliers de nouveaux neurones sont intégrés chaque jour dans le bulbe olfactif. Ces cellules sont générées à partir d’une région précise, la Zone Sous Ventriculaire, puis acheminées vers le bulbe olfactif par un Courant de Migration Rostral, pour se connecter avec les circuits bulbaires. De nombreuses études ont décrit les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Nous cherchons donc à déterminer pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment ils permettent de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée.

Bénéfices attendus

De nombreuses études expérimentales ont étudié les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, le plus souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Dans notre équipe de recherche, nous nous intéressons à un aspect particulièrement inexploré de ces mécanismes : Pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent-ils un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment permettent-ils de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée ? Pour cela, nous souhaitons étudier une sous-population de neurones inhibiteurs du cortex olfactif innervant les neurones nouvellement générés du bulbe olfactif et leur potentielle modification à la suite d’un apprentissage associatif. En effet, un contrôle à distance de l’activité des nouveaux neurones pourrait être le substrat permettant de définir une nouvelle forme de perception subjective, propre à chaque individu et découlant des expériences personnelles antérieures de chacun. Finalement, une meilleure connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients accidentés ou atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques. Dans le domaine complexe des neurosciences modernes, un défi majeur des chercheurs est alors de comprendre précisément les mécanismes qui assurent l’intégration fonctionnelle de ces nouvelles cellules dans un réseau neuronal actif, et de déterminer les conséquences physiologiques de cette production neuronale permanente.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques, implantations de fibres optiques ou de lentilles à visée micro-endoscopiques dans le cerveau). Ces interventions ne durent pas plus de 2hs et chaque animal sera soumis à un maximum de deux interversions séparées par un minimum de 30 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif. Ce type d’apprentissage a une durée maximal de 1 mois, avec une session de 30 à 60 minutes par jour, chaque jour.

Impact sur les animaux

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal. Cependant, au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables comme le stress hydrique, la perte de poids associée (< a 20% du poids original pendant un maximum 4 semaines) et le stress dû à l’isolement (maximum 2 mois). Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les animaux. La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (maximum 2 mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans l’apprentissage olfactif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes avec un risque de p=0.05 et une puissance statistique >80. L’électrophysiologie sur tranche de cerveau permet de changer rapidement le milieu dans lequel baignent les cellules. Il est donc possible d’appliquer successivement et/ou de rincer plusieurs molécules au cours de l’enregistrement d’une cellule donnée. Ceci permet de réaliser des tests statistiques appariés et de réduire le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet d’un agent pharmacologique. Pour cette partie, deux personnes travailleront en parallèle sur deux postes d’électrophysiologie, ce qui permettra d’optimiser l’utilisation des tissus, de doubler le nombre de cellules enregistrées, et de réduire d’autant le nombre d’animaux nécessaires. Dans la même optique, les expériences d'imagerie permettent d’analyser l'activité des neurones avant et après l’apprentissage, permettant l’utilisation des tests statistiques appariés et le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet, et ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. La durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour notre projet qui est principalement basé sur le comportement : il est nécessaire que l’animal puisse effectuer une tâche de comportement sans biais. Les animaux seront donc observés minimum deux fois par semaine, et tous les jours en post-opératoire. Cette surveillance sera coordonnée entre l’expérimentateur et le personnel de l’animalerie. Pour les souris montrant des signes de douleur (absence de toilettage, posture anormale, défaut de nidification, défaut dans le comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage, accompagnée ou non d’une perte de poids >20%), l’administration de l’antalgique sera renouvelée 12 et 24h après la chirurgie. Ces animaux seront l’objet d’une surveillance quotidienne accrue. En cas de détresse après l’administration des antalgiques les animaux seront mis à mort (événement très rare). Pour réduire le stress associé à l'isolement (parfois nécessaire lors de combats entre les individus ou en présence d’implants), les cages d’hébergement seront enrichies (igloo, coton extra). Dans le cas des souriceaux, après la chirurgie, le poids de chaque animal sera mesuré deux fois par semaine pour vérifier la bonne croissance des animaux. Le comportement maternel vis-à-vis des souriceaux après la chirurgie sera aussi évaluée (allaitement, toilettage, nidification, signes d’agressivité).

Choix des espèces

On étudie le phénomène de contrôle afférent chez l’adulte dans le système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps des expériences. Notre objet d’étude étant les fibres afférentes qui contrôlent l’activité des cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de ces fibres sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.

Une partie des 30 souris de ce projet porte, par transgenèse, le gène humain muté responsable de la dystrophie myotonique de type 1, une maladie qui touche les muscles, le cœur et le cerveau. Les souris transgéniques comme les témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : des électrodes leur sont implantées sous anesthésie générale pour enregistrer l'activité du cerveau et des muscles, puis chacune passe deux sessions d'enregistrement d'une semaine, seule dans un baril individuel, une semaine puis un mois après l'opération. Le porteur affirme que la chirurgie "ne devrait pas induire d'effets indésirables", et prévoit de gérer la douleur "avant, pendant et après la chirurgie". À l'issue, toutes sont mises à mort pour revérifier leur génotype, et leur cerveau est prélevé pour des analyses de biologie moléculaire qui ne seront choisies qu'après l'étude du sommeil.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1, prévalence : 1/8000) est une maladie génétique qui affecte presque tous les organes, comme le cœur et les autres muscles, mais aussi le cerveau. Il en résulte des troubles neurologiques qui ont un impact délétère sur les patients DM1 et leurs familles. Outre des symptômes cognitifs handicapants tels qu'une déficience intellectuelle sévère dans la forme congénitale, on retrouve chez les patients DM1 des altérations motrices, des changements de la perception de l’espace, un déficit attentionnel, de la fatigue intellectuelle et quelques cas d'épilepsies. Une somnolence excessive pendant la journée est également un symptôme fréquent. Initialement focalisée sur le muscle, la recherche sur DM1 dispose de peu de données sur la pathologie cérébrale et les mécanismes à l'origine des troubles neurologiques, comme l'altération de la qualité du sommeil, ont été très peu ou pas étudiés à ce jour. Notre but est de caractériser, dans le modèle murin de la pathologie, les modifications du sommeil.

Bénéfices attendus

La description très détaillée du cycle veille-sommeil au travers du modèle murin DMSXL apporteront des informations inédites sur la pathologie DM1. Nous pensons que les résultats obtenus aideront à la prise en charge de la maladie afin d'améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les 30 souris auront une implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes pour les mesures de l'activité électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG), chaque implantation durera au maximum une heure (en moyenne 45 minutes). Les souris seront placées en chambres d’enregistrement pour deux sessions d’une semaine d’enregistrement : une semaine après l’implantation chirurgicale et un mois après.

Impact sur les animaux

Outre l’injection intrapéritonéale de l’anesthésique qui pourra générer un léger stress, la chirurgie pratiquée ne devrait pas induire d’effets indésirables. L’effet indésirable attendu durant les phases d’enregistrement sera uniquement dû à l’isolement des animaux dans des barils individuels (les souris seront isolées deux fois 7 jours).

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de revérifier leur génotype. De plus, les cerveaux seront également prélevés pour des études ex vivo de biologie moléculaire, qui seront déterminées après l'analyse des résultats sur la qualité du sommeil.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. L’étude du cycle veille-sommeil n'est possible que sur un animal entier, vigile et se comportant normalement.

Réduction

30 animaux au maximum devraient être utilisés. Nous prévoyons d’utiliser 12 animaux par groupe (souris transgéniques et contrôles). L’obtention des données qualitatives et quantitatives sera analysée par des tests classiquement utilisés dans l’étude du sommeil sur ces effectifs. Si les 12 premières souris donnent des résultats de qualité, on n’utilisera pas les 6 souris supplémentaires.

Raffinement

Des mesures appropriées seront prises pour suivre la pathologie (surveillance de la pousse des dents qui seront coupées si elles deviennent trop longues), pour minimiser le stress et mal-être individuel (hébergement enrichi et en groupe avant la chirurgie pour éviter un isolement social), pour gérer la douleur avant, pendant et après la chirurgie (médications par un anti-inflammatoire, surveillance de la cicatrisation au niveau de l’implant d’électrodes), et pour limiter l’isolement pendant les phases d’enregistrement électroencéphalographique avec des cages individuelles en espace ouvert pour empêcher que les congénères ne dégradent les implants et permettre aux animaux de se voir et sentir leurs odeurs.

Choix des espèces

Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie permettent d'étudier les mécanismes physiopathologiques. De plus, chez la souris adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer le sommeil dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle souris possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les souris ont une taille cérébrale qui permet d’étudier les oscillations locales de l'hippocampe ciblé dans notre projet. L'étude sera réalisée sur des souris âgées de 2 mois (plus précisément 8 semaines) afin d'être à un âge 1/ où le phénotype DM1 est bien établi et 2/ compatible avec l'implantation aisée des électrodes pour la mesure du sommeil.

76 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des injections, l'insertion d'électrodes à aiguille sous la peau avec stimulation électrique, et sont contenues dans un cylindre fermé pendant qu'on leur diffuse des sons jusqu'à 110 décibels. Le porteur décrit plusieurs tests comportementaux, dont un test des capacités de filtrage sensoriel et un test cognitif avec eau acidifiée sur quatre semaines, pour modéliser un syndrome humain rare. Il indique que le comportement des patients ne peut pas être reproduit in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = moins d'une minute) (deux fois). -Etude de la structure de l'oeil par histologie in vivo (durée = 10 minutes). - Mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = moins d'une minute). -Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend une implantationd'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.

1 499 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois craniotomies sous anesthésie, avec injection de vecteurs viraux ou implantation, une restriction alimentaire et des tests comportementaux, pour visualiser et moduler les circuits de la mémoire. Le porteur qualifie la chirurgie de douloureuse et limite la perte de poids à 10 %. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne modélise la mémoire et renvoie les thérapies contre Alzheimer ou le stress post-traumatique au long terme.

Objectifs

L'étude de la mémoire et de ses bases neuronales est essentielle pour comprendre ses mécanismes et pouvoir, à partir de ces analyses, traiter les troubles qui y sont liés, comme la maladie d'Alzheimer, le syndrome de stress post- traumatique et d'autres types d'amnésie. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser un modèle animal pour étudier comment la mémoire est stockée et rappelée à court et long terme. Cela nous permettra de comprendre les modalités d’activation des régions impliquées, et, en visualisant et en modifiant leur activité, de comprendre dans quelle mesure ces régions influencent le maintien de souvenirs spécifiques. En particulier, nous utiliserons une tâche de conditionnement classique pour former et étudier des souvenirs émotionnels, positifs et négatifs. Par ce projet, nous souhaitons répondre à quatre questions principales : quels sont les changements d'activité observés au niveau des cellules individuelles (1) ou du cerveau entier (2) lorsqu'un animal apprend et se souvient d'un événement passé ? La manipulation artificielle de ces régions identifiées peut-elle influencer le comportement de l'animal (3) et l'activité des régions cérébrales qui leur sont liées (4) ?

Bénéfices attendus

Le modèle souris est un excellent modèle translationnel, qui nous permet d’étudier la complexité des fonctions cognitives telles que la mémoire. Il nous permet, grâce à des techniques invasives, de tester par la manipulation et la visualisation in vivo les dynamiques neuronales qui sous-tendent la formation et le rappel de la mémoire, et ce à différentes échelles. A court terme, le projet permettra d’élucider le fonctionnement de la formation et du rappel des souvenirs à court et long termes, chez la souris mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire à la découverte et au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles de la mémoire, et donc avoir un impact clinique concret. Nous utilisons le modèle souris en particulier car la reproduction est rapide et mène à un grand nombre d’animaux dans chaque portée, ce qui facilite l’obtention rapide de résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, l’ensemble de l’équipe est formé sur ce modèle, ce qui permet la réduction maximale du nombre d’animaux utilisés, et la littérature sur la mémoire est très riche pour cette espèce (par comparaison, par exemple, au modèle rat).

Procédures

Au cours de chaque phase de ce projet, les animaux peuvent passer par : - Un régime alimentaire de maximum 5 jours (et de maximum 2 fois par animal, à plusieurs semaines d'intervalle) pendant lequel l'animal reçoit une quantité restreinte de nourriture. Chaque jour, les animaux sont surveillés et si leur poids diminue trop, les quantités de nourriture mises à disposition sont modifiées en conséquence ; - Des tests comportementaux pour étudier leur mémoire et leur niveau de stress. Ces tests sont très courts et durent entre 5 et 10 minutes. - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 et 50 minutes. Si un animal subit plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. - Dans certains cas spécifiques, les animaux seront maintenus en isolement depuis l'intervention chirurgicale jusqu'à la fin des expériences comportementales, qui dureront au maximum deux mois à compter de la date de l'opération.

Impact sur les animaux

Pour ces études, la technologie de pointe utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Les animaux subiront donc une ou deux craniotomies, suivies d’une injection d’un vecteur viral ou d’une implantation. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera un peu moins d’une heure. Les implants n'affectent toutefois pas le comportement normal et le bien-être de l'animal une fois implantés. Certains animaux devront subir une privation de nourriture partielle, procédure indispensable à leur motivation pour certaines tâches comportementales. La quantité de nourriture qu'ils ingèrent chaque jour sera limitée, mais de manière à ne pas dépasser une perte supérieure à 10% de leur poids normal afin d’éviter tout stress superflu ou malnutrition, ce qui serait non seulement préjudiciable à l'animal mais aussi contre-productif pour nos expériences, qui exigent que l'animal soit en parfaite santé et non stressé ou même malade, car cela fausserait les résultats de nos recherches. Pour les expériences employant l’électrophysiologie, la fragilité des implants ne permet pas de replacer les souris dans la même cage que leurs congénères, et ceci cause un stress émotionnel modéré à fort. Néanmoins, cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, en réduisant au maximum les risques que l’implant ne tienne pas dans la durée. Par ailleurs, cet isolement n’est pas le cas pour tous les autres implants utilisés. Par ailleurs, ce projet étudiant les souvenirs émotionnels, certains animaux devront subir un conditionnement aversif, induisant une douleur moyenne brève, ainsi qu’un stress passager d’intensité modérée.

Devenir

Tous les animaux subiront l’euthanasie. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d'expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : - Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs.

Choix des espèces

Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons: - La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. - Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Les souris étudiées seront adultes (plus de 7 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.