Troubles nerveux

370 souris porteuses d'une mutation de la sclerose laterale amyotrophique vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. A deux jours de vie, les souriceaux recoivent une injection d'un virus dans le cerveau apres anesthesie sur glace, subissent une echographie sous anesthesie, puis sont tues pour analyse histologique du cerveau. Le porteur indique que les injections entrainent une perte d'animaux, liee a leur jeune age et au rejet par la mere, et affirme que le modele murin reste "indispensable" faute de pouvoir modeliser la distribution d'une therapie genique sans organisme vivant. Les retombees pour les patients sont presentees comme un prerequis a d'eventuels essais chez l'homme.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec Une échographie sera réalisée une fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris.

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections. L'échographie se déroule quant à elle sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

16 macaques a longue queue femelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal enchaine IRM, scanner et imagerie TEP sous anesthesie generale, plusieurs seances de neurostimulation par ultrasons en chaise de contention, puis un test de memoire ou l'animal doit choisir entre deux gobelets pour obtenir une friandise, avant d'etre tue par surdosage d'anesthesique pour analyser son cerveau. Le porteur decrit un stress a l'induction de l'anesthesie, des douleurs aux sites d'injection et une gene liee a l'intubation et a la contention. Il affirme que les modeles in silico et in vitro ne reproduisent pas la physiologie cerebrale, juge l'usage du singe "indispensable" en vue d'une transposition a l'homme, et prevoit de reutiliser des femelles deja presentes dans l'etablissement.

Objectifs

Actuellement de nombreux protocoles thérapeutiques visant les troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression, …) sont confrontés à l’apparition de pharmacorésistance chez de nombreux patients. Il semble essentiel de trouver des solutions innovantes pour parer à ces complications. Plusieurs techniques de neurostimulations sont proposées: la neurostimulation magnétique transcrânienne, utilisée en clinique, est non-invasive mais a une mauvaise discrimination spatiale, et la stimulation cérébrale profonde qui offre une meilleure résolution spatiale mais nécessite une chirurgie lourde. Nous proposons de pallier ces défauts et de garder ces points forts en utilisant la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés. La neurostimulation ultrasonore (US) se fera par application d’une sonde US sur le crâne, permettant la propagation intracrânienne d’ondes US focalisées et la stimulation précise de régions cérébrales. Nos résultats actuels ont montré que la stimulation US induit une activation neuronale, un mécanisme capital dans la thérapeutique des troubles neuropsychiatriques. Cette technique de neurostimulation offrirait une alternative ciblée et non-invasive pour les troubles neuropsychiatriques. Des études exploratoires chez les rongeurs ont démontré la faisabilité de cette technique. Cependant, leurs physiologies (épaisseur du crâne, orientation et forme du cerveau) freinent la transposition en clinique humaine. Des simulations numériques et expérimentales ont montré que les ultrasons pénètrent de façon similaire la boite crânienne chez l'homme et chez le primate. Des manipulations sur des singes cynomolgus sont en cours sans anesthésie pour la neurostimulation. Mais il y a des difficultés lors de la stimulation malgré l'habituation (tête non immobile). Dans la continuité de ce protocole, ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore aigüe et chronique sur le primate non humain (PNH) anesthésié. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation US aigüe (n=8) et la neurostimulation US chronique (n=8). Ce nombre est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Tous les individus seront euthanasiés à la fin du projet par une méthode réglementaire et les cerveaux seront prélevés pour évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation US (neuroinflammation, neurotransmission, mort cellulaire, microhémorragies, ...).

Bénéfices attendus

Actuellement, les cas de dépression chez l’homme sont traités à l’aide de divers protocoles thérapeutiques tels que la psychothérapie, les antidépresseurs et autres molécules pharmacologiques. Dans de nombreux cas, les patients développent une pharmacorésistance aux traitements médicamenteux. Cette pharmacorésistance nécessite l’orientation des patients vers d’autres techniques thérapeutiques. Parmi ces techniques, nous pouvons relever la méthode de neurostimulation magnétique transcrânienne ou la stimulation cérébrale profonde (stimulation par implantation d’électrode dans le cerveau) mais la première ne cible pas correctement la zone cérébrale impliquée dans la dépression et la deuxième est trop invasive. Pour pallier ces défauts, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité d’une nouvelle méthode non invasive et ciblée : la neurostimulation ultrasonore chez le singe. Ce projet permettra ainsi de progresser dans la possibilité de traduire cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques. La perspective directe de ce projet est une transposition de cette technique pour un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. Sont concernés tous les animaux (n=16) IRM cérébrale sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. Scanner CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. Adaptation du dispositif de neurostimulation : Sont concernés tous les animaux (n=16), jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min – 1 mois minimum Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16). Cette imagerie sera réalisée 2 fois sur 8 animaux et 3 fois sur 8 autres animaux; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique: Sont concernés tous les animaux (n=16), 8 animaux avec 2 séances de stimulation et 8 animaux avec 10 séances de stimulation; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation. Test de comportement et de mémorisation : Sont concernés uniquement les animaux ayant une neurostimulation US chronique (n=8); pour la mémorisation, l'animal est placé dans un sas et devra choisir entre deux gobelets pour trouver une récompense (friandise). Euthanasie : Sont concernés tous les animaux (n=16), surdosage d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore. Concernant l’application des ondes ultrasonores lors de la neurostimulation et d’après nos précédentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable. Les ondes ultrasonores auront une fréquence au-delà de celle de la gamme audible des primates, il n’y aura donc pas d’effets indésirable escomptés. Ceci a été validé chez les rongeurs dans nos études précédentes et dans la littérature.

Devenir

A l’issu des 2 procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques des cerveaux.

Remplacement

Les modèles in silico, in vitro, (cellulaires) et/ou mathématiques ne permettent pas de reproduire la physiologie cérébrale et son environnement (vascularisation, perfusion, débit sanguin, etc…), l’utilisation d’animaux est donc indispensable. De plus, l’objectif final est de transposer cette technique en clinique humaine, en conséquence les études chez l’animal ne peuvent pas être substituées. Des études précédentes ont été menées sur les rongeurs (souris et rats). Les résultats obtenus sont encourageants mais ils ne permettent pas une transposition directe de la neurostimulation en clinique humaine, notamment à cause des différences physio-morphologiques des rongeurs avec l’homme. Pour pallier ces différences, nous proposons d’évaluer notre méthode sur un modèle animal plus proche de l’homme pour la morphologie cérébrale et crânienne, le singe cynomolgus.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. La réduction du nombre d’animaux se fera aussi par l’utilisation d’imagerie préclinique. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en volière disposant de plateformes surélevées avec les congénères et en présence d’objets d’enrichissement. L'alimentation couvrira les besoins journaliers et sera complétée par des friandises. Un programme d'enrichissement sera mis en place (recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Pour limiter le stress, nous recourrons à l’habituation (renforcement positif). Elle sera effectuée par le personnel en charge de l’étude et en collaboration avec le personnel d’animalerie. Les animaux seront habitués à recevoir des récompenses (friandises) après réalisation de tâches simples (ex : toucher un objet) afin d’obtenir la coopération de l’animal et instaurer une relation de confiance. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant et sous monitoring cardio-pulmonaire. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur et l’inconfort des animaux. Ces points limites seront des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence des animaux. Les animaux seront pesés à réception puis à chaque manipulation nécessitant une sortie de cage. Des mesures préventives seront prises : médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs, notamment après le retrait des cathéters, l’animal pourra recevoir une injection d'un antidouleur au site de pose du cathéter. Nous aurons recours le plus possible à la réutilisation d’animaux inclus dans d’autres projets sous condition qu’ils n’aient subi aucun dommage cérébral, ni locomoteur.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques femelles pubères seront utilisées pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubères. Pour cette étude, des macaques femelles seront utilisées. Actuellement des macaques femelles sont utilisées au sein de l’EU et seront disponibles à la réutilisation. Cela sera en accord avec les principes de réduction et de raffinement édictés par la règle des 3R. De plus, nos équipements d’imagerie actuels ne peuvent pas supporter la forte corpulence de macaques mâles adultes (poids et largeur d’épaule sont souvent trop importants pour le stade de développement souhaité).

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections d'alcool en fin de gestation, puis leurs souriceaux subissent des mesures cardio-respiratoires, des tests psychomoteurs et des séparations maternelles jusqu'au onzième jour de vie, avant d'être tués pour prélever leurs organes, les mères étant tuées après la mise bas. Le porteur indique que l'alcoolisation fait perdre aux femelles la coordination de la marche et que la séparation maternelle est une source de stress pour les souriceaux. Il affirme que l'étude des effets moteurs et cognitifs de l'alcoolisation foetale passe par un "organisme entier" et ne peut être évitée.

Objectifs

Dans l'altération de l’environnement fœtal, notre objectif est de caractériser l’impact d’une alcoolisation fœtale importante au dernier trimestre de la grossesse. L'alcoolisme foetale est la première cause d'handicap mental non génétique. Le placenta est perméable à l'alcool qui arrive alors au foetus dont le foie n'a pas l'efficacité pour l'éliminer. Il est ainsi exposé plus longtemps aux effets toxiques de l'alcool. Nous souhaitons évaluer et comprendre les fonctions du gène Hsf2, un gène important pour la réponse au stress dont le stress lié à l'alcool. Pour cela, nous utilisons un modèle génétique murin dépourvu de ce gène. Nous étudierons les conséquences physiologiques, motrices et cognitives dès la naissance des souriceaux issus de mères alcoolisées. Nous comparons les résultats obtenus avec les souriceaux issus de mères non alcoolisées. A ce jour, la France compte encore environ 15000 naissances avec des troubles causés par l'alcoolisation foetale. Les retombées de ce travail sont ainsi directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Résultats attendus : Les conséquences d’une alcoolisation fœtale pourraient être plus étendues avec des atteintes précoces motrices, cognitives et physiologiques. Nous préciserons les fonctions du gène Hsf2 dans ces atteintes. Les retombées de ce travail sont directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Procédures

Sur les femelles gestantes : injection intrapéritonéale (au quart cadran inférieur de l'abdomen) d'alcool ou de solvant servant à diluer l'alcool au 15ème jour de gestation (deux fois espacés de 8h) et un fois au 16ème jour de gestation - Aucun prélèvement sur animaux vigiles - Aucune procédure chirurgicale, Sur les soucriceaux : des mesures cardio-respiratoires (30 min une fois à un jour de vie, 30 min une fois à deux jours de vie, 50 min une fois à 8 jours de vie), bilan psychomoteur de 7 à 11 jours de vie à l’aide de 3 tests distincts répétés 2 fois, chaque test dure 20 secondes, enregistrement des sons émis par l’animal (une fois à 8 jours de vie, pendant 3 min)

Impact sur les animaux

L'alcoolisation de la mère ne modifie pas la prise de poids ni la température corporelle au cours de la gestation. Ce que l'on peut constater est un retard de mise bas chez les femelles alcoolisées et dans ce cas les petits ne rentreront pas dans le protocole. La modification de ces deux variables (la modification corporelle (poids et température = variable 1) et le retard de mise bas (variable 2) constitue un signe de souffrance et/ou de modification inattendue dans la procédure et nous tenons à les prendre en compte. Titubation des femelles alcoolisées : les femelles alcoolisées perdent temporairement la coordination de la marche sous l’effet de l’alcool. Ces femelles retournent en pièce d'hébergement si et seulement si elles recouvrent une marche coordonnée normale. Nuisance post-natale : séparation maternelle (durée maximale de 50 min en condition de thermoneutralité pour les mesures physiologiques, 10 min pour le test de préférence maternelle, 3 min pour la mesure des vocalisations ultrasoniques), les souriceaux sont libres de se mouvoir pour toutes les mesures/observations effectuées.

Devenir

Les souriceaux sont maintenus en vie jusqu'à 11 jours, jour de la fin des expériences. IIs seront euthanasiés et les organses sont récupérés en post-mortem pour une étude histologique. Les mères traitées sont euthanasiées après la mise bas. Comme nous nous intéressons sur l'empreinte que peut laisser l'alcoolisation, les mères ne seront pas réutilisées, elles sont euthanasiées après la mise bas selon la methode règlementaire par un personnel qualifié.

Remplacement

L'étude préclinique concerne l'expérimentation animale et permet d'obtenir les informations de toxicité notamment dans l’alcoolisme maternel. Pour étudier les effets de l'alcoolisme foetale sur le plan physiologique, moteur et cognitif, l'utilisation d'un organisme entier est pertinente et ne peut être évitée.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Nous privilégions une étude longitudinale c'est à dire que nous suivons les souriceaux sur plusieurs jours ce qui réduit le nombre d'animaux utilisés. Un groupe expérimental nécessite 30 souriceaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif découle de nos expériences. Toutefois, cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.

Raffinement

Nous utilisons des techniques de mesures non invasives et contrôlées (mesure moins d'une heure, température 32-33°C dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. Les cages avec les portées sont enrichies en papier absorbant doux pour le nid. La séparation maternelle n'excède pas l'heure. Une surveillance quotidienne visuelle est assurée tous les jours. Un suivi clinique est assuré les jours avec protocole de test prévu (poids, température, mobilité des souriceaux, aspect des poils). En somme, nous avons établi une liste de points limites intermédiaires basées sur le comportement et l'aspect des animaux qui conduit à la mise en place d'action adaptée et précoce permettant de diminuer la souffrance.

Choix des espèces

Choix de l'espèce souris : largement utilisée dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique, souris transgénique disponible pour étudier le rôle d'un gène, organisme entier pour étudier les conséquences de l'alcoolisation sur les descendances Stades de développement : Pour l'alcoolisation foetale, il s'agit de cibler les conséquences d'une consommation excessive d'alcool en fin de gestation. Pour les souriceaux, il s'agit de déceler précocément les modifications induites par l'alcoolisme foetale. Tests psycho-moteurs et cognitifs choisis avant l'ouverture des yeux

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, chaque animal reçoit une injection lombaire et cérébrale de vecteurs de thérapie génique lors d'une chirurgie d'environ deux heures, puis un prélèvement sanguin et une imagerie avant d'être tué pour analyser les tissus nerveux. Le porteur signale un stress lié à la capture, à l'anesthésie et aux contentions répétées, et présente la chirurgie cérébrale comme peu douloureuse au motif que le cerveau est dépourvu de récepteurs à la douleur. Il affirme que la souris a un pouvoir prédictif faible voire nul pour cette question et retient le macaque pour la proximité de son système nerveux avec celui de l'humain.

Objectifs

Les dysfonctions qui affectent le système nerveux, et en particulier le système nerveux central (SNC), sont une cause majeure de maladies, de handicaps et de décès. Elles sont également parmi les plus difficiles à traiter en raison de la complexité des types de cellules, des circuits neuronaux, et de la barrière hémato-encéphalique qui limite ce qui peut passer de la circulation sanguine au cerveau , y compris les produits thérapeutiques. En outre, les traitements actuels de nombreuses maladies neurodégénératives se limitent à prévenir ou à ralentir leur progression, sans les guérir définitivement. En revanche, la thérapie génique peut s'attaquer à la cause sous-jacente d'une maladie génétique et la corriger de façon permanente ou délivrer des protéines thérapeutiques qui soulagent durablement les symptômes de la maladie. Les troubles génétiques neurodégénératifs sont l'une des nombreuses maladies qui pourraient bénéficier des avantages uniques de la thérapie génique. Toutefois, les maladies génétiques sont souvent associées à une petite fraction de types de cellules dans un tissu. Par conséquent, pour être efficace, la thérapie génique doit être précise et délivrer des doses thérapeutiques de matériel génétique aux bon types cellulaires et aux bons tissus d’intérêt, tout en évitant une expression hors cible qui pourrait entraîner des effets secondaires indésirables. C’est pourquoi, ce projet vise donc à évaluer chez les primates non -humains (PNH) le bon ciblage d’outils de thérapie génique nouvellement conçus dans des types cellulaires et des tissus neuraux pertinents sur le plan thérapeutique. A termes la validation de ce ciblage comme efficace permettra le développement ultérieur d’une thérapie génique précise pour le traitement des maladies génétiques neurodégénératives.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de ce projet fera progresser les connaissances scientifiques concernant l'étude et l'identification de nouveaux outils génétiques permettant le traitement de maladies touchant le système nerveux central. À long terme, les découvertes apportées par ce projet serviront de base à la création de thérapies géniques efficaces permettant de guérir des maladies neurodégénératives qui à l’heure d’aujourd’hui sont incurables.

Procédures

Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation de l’injection lombaire et cérébrale de la solution contenant les vecteurs de thérapie génique (une seule chirurgie d’une durée d’environ 2h) ; (2) un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie générale ; (3) Imagerie au niveau des sites d’injection au niveau cérébral et mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, l’injection de l’anesthésique, les contentions répétées (pendant 5-7 jours post injection) pour d’éventuels soins consécutifs à la chirurgie, une légère perte de poids liée à l’opération et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections. Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un léger inconfort au niveau de la zone d’incision les jours suivant l'injection et provoquer dans de très rares cas une légère réaction inflammatoire. L’absence de récepteurs à la douleur dans le cerveau fait que les interventions sur ces tissus ne sont pas considérées comme douloureuses.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses de tissus du système nerveux afin de vérifier le bon ciblage de l’outil de thérapie génique.

Remplacement

Pour pouvoir utiliser la thérapie génique efficacement, il est crucial que le vecteur viral qui délivre le gene thérapeutique cible les bonnes cellules ou groupes de cellules chez l'homme. Dans le cas contraire, les thérapies géniques pourraient avoir un effet indésirable dans des types de cellules non ciblées, ce qui pourrait entraîner le dysfonctionnement ou la mort de cellules auparavant saines. Les promoteurs (séquences d’ADN qui contrôlent l’expression des genes) doivent être testés dans des cellules dont l'expression génique est aussi proche que possible de celle des cellules correspondantes chez l'humain. Or des études antérieures dans le système nerveux ont révélé que les résultats obtenus chez le primate non-humain pouvaient prédire les résultats obtenus avec des tissus humains primaires, mais que les résultats obtenus avec des souris avaient un pouvoir prédictif faible, voire nul. Par conséquent, des tests de fonctionnalité des vecteurs de thérapie génique sera faite in vivo chez la souris avant d’évaluer la capacité de ces vecteurs à cibler les bonnes cellules chez le primate non-humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Six macaques seront ainsi utilisés sur 5 ans.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L’ensemble des méthodes expérimentales a été pensé et choisi pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, socialisation).

Choix des espèces

Les études réalisées in vitro ou in vivo chez la souris ne peuvent être transposées à l'Homme en toute sécurité sans être menées, dans une étape intermédiaire, chez une espèce dont l'organisation du système nerveux central est similaire à celle de l'Homme. En effet, il a été montré précédemment que le criblage de promoteurs dans le système nerveux central de la souris avait un faible pouvoir prédictif de leur activité dans le même tissu humain. Le choix du macaque est donc justifié par le fait qu'il présente des caractéristiques anatomiques, cellulaires et génétiques du système nerveux central comparables à celles de l'Homme. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés de plus de 3 ans de manière à ce que les structures cérébrales soient développées.

200 primates non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 150 macaques à longue queue, 25 macaques rhésus et 25 singes vervets. Chaque animal reçoit une administration de virus AAV par voie intraveineuse ou intrathécale, suivie de prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, certains protocoles retirant jusqu'à 20 % du volume sanguin, avant une mise à mort pour analyser la répartition du virus dans les organes. Le porteur juge peu probables les effets secondaires des AAV rendus non réplicatifs et signale surtout un stress lié aux contentions et aux gestes. Il affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" et retient le primate pour sa proximité immunitaire avec l'humain, au service du développement de thérapies géniques.

Objectifs

Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution dans les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Les virus adéno-associés (AAV) sont un vecteur viable de transfert de gènes. Ils peuvent être conçus pour transporter des séquences d’ADN thérapeutiques dans le noyau de différents types de cellules (hépatiques, musculaires, ou nerveuses par exemple). Leur nature réplicative-déficiente et l'inactivation des outils moléculaires liés à l'inclusion de ces virus dans le génome humain leur donnent un profil de sécurité particulièrement intéressant pour leur utilisation clinique chez l'homme. Selon les types d'AAV, naturels ou chimériques, leur tropisme et leur profil d'infection dans divers organes va être complètement différent. Les phases de développement d'un AAV thérapeutiques passent donc par une phase de "screening" de candidats virus, dont le but est d'évaluer la biodistribution de ceux-ci dans diverses structures biologiques d'intérêts. La proximité immunitaire des singes avec l'humain fait de ces espèces un modèle intéressant et prédictif de la biodistribution attendue chez les patients.

Bénéfices attendus

Les AAV sont utilisés en thérapie génique comme "moyen de transport" pour amener du matériel génétique dans les cellules cibles. Cette étude permettra de sélectionner les « constructions » d'AAV pour traiter des maladies spécifiques, grâce à la distribution d'un transgène thérapeutique dans un tissu particulier.

Procédures

Après une période d’acclimatation de 15 jours minimum, les animaux recevront une unique administration de l’AAV par voie intraveineuse ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre et en accord avec les procédures de l’entreprise. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur selon la voie d’administration utilisée (iv bolus : 5mL/kg maximum et IT bolus : 1mL/animal maximum). Les administrations étant des bolus, elles seront de courte durée (< 5 minutes). Les administrations intraveineuses seront réalisées dans la mesure du possible sur animal vigile, les administrations intrathécales seront réalisées sous anesthésie. Suite à chaque administration, des prélèvements (principalement de sang ou LCR) seront effectués afin d’analyser les biomarqueurs liés à l’infection par l’AAV dans le sang. Les recommandations suivantes seront suivis pour la récolte de sang (7,50 % du VSC suivi d’un repos de 7 jours ; 10% du VSC suivi d’un repos de 2 semaines; 15% du VSC suivi d’un repos de 3 semaines; 20% du VSC suivi d’un repos de 4 semaines ou suivi d'une euthanasie dans les 24h). Les prélèvements de sang sont de courte durée (

Impact sur les animaux

Les AAV injectés étant des espèces non pathogènes, il est peu probable d’avoir des effets secondaires. En effet, les possibles transgènes inclus dans ces virus sont soit des séquences "rapporteuses" permettant l'identification ou la localisation du virus, ou bien des gènes codant pour des protéines humaines. En termes de contamination et multiplication, ces virus sont rendus inoffensifs et n'ont pas la possibilité de se reproduire ou de s'intégrer au génome de l'hôte. Mise à part des réactions locales au niveau des sites d'administrations et éventuellement une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations. De plus, la procédure d'injection elle-même peut potentiellement induire des effets secondaires en cas de mauvaise manipulation. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude dans le but de récolter les organes et analyser la biodistribution des AAV dans les différents tissus.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapie. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique.

Réduction

Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables. Une sérologie sera réalisée sur plus d'animaux que necessaire à l'étude. Au jour de l'infection, seul le nombre d'animaux necessaire à l'étude seront injectés. Au vu du faible nombre d'animaux par groupe, aucun test statistique ne sera réalisé.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètres hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides pour le suivi du viscérotropisme et du neurotropisme permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations (notamment en cas d'utilisation de la chaise à contention pour habituer l'animal à être dans cette chaise avant le jour de l'administration). Pour certains actes (LCR, administration intratécal,...), les animaux seront anesthésiés (ex: kétamine / midazolam) et recevront un analagésique (type buprénorphine) afin de palier toute douleur lié à l'acte. Les points limites décrits dans le projet permettront de décider l'euthanasie anticipé d'un animal en cas de souffrance.

Choix des espèces

Le primate non humain est un modèle de choix dans l'évaluation préclinique pour évaluer le tropisme des virus recombinants, car les AAV sont connus pour infecter largement les primates non humains et les humains (la preuve en est qu'une forte proportion des singes est séropositives pour certains types d'AAV). Nous devons utiliser des animaux qui sont évolutivement plus proches de l'homme et donc plus susceptibles de représenter fidèlement la machinerie cellulaire impliquée dans la transduction et d'autres aspects de la biologie du virus/vecteur et de l'hôte. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. De juvéniles à adultes matures selon les questionnement scientifique de l'étude.

1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique injectant du peptide amyloïde dans le cerveau, puis des traitements quotidiens par gavage et injections, et des tests de mémoire dont la piscine de Morris, avant d'être tuées pour analyse des tissus. Le porteur indique que la chirurgie peut causer une souffrance post-opératoire et que les traitements et le test de la piscine de Morris peuvent générer un stress. Il affirme que la complexité de la maladie d'Alzheimer ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal et retient la souris de douze mois comme le modèle le plus proche de l'humain, d'éventuels essais cliniques restant conditionnels.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée par des troubles de la mémoire et du comportement, ainsi que par une désorientation dans le temps et dans l'espace et touche aujourd’hui 50 millions de personnes dans le monde, dont plus de 1 000 000 en France. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie de Alzheimer. Les effets des composés seront étudiés par l’analyse des capacités mnésiques des animaux et par analyse histologique. Un composé prometteur devra améliorer la mémoire à court et/ou à long terme des souris, diminuer la perte des neurones dans une région clé pour la formation de la mémoire. En cas de résultats positifs, le développement préclinique des composés pourra se poursuivre.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments pourront à terme entrer dans des études cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale. Les souris récupèrent bien de la chirurgie. Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens) par gavage ainsi qu’en intra-peritonéal et en sous-cutanée. La mémoire à court et long terme sera étudiée avec des tests comportementaux. Ces tests seront rapides (maximum 15 minutes par jour), sur une durée maximale de 7 jours, non consécutifs.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Le traitement quotidien des souris peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests comportementaux peuvent également induire une nuisance chez les souris, notamment avec le test de la piscine de Morris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

Notre but est d'évaluer les effets neuroprotecteurs de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Les processus physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal. La souris est le modèle intégré le plus proche de l’humain pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris (n par expérience) sera optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. À cette fin, des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en termes de (i) détérioration des fonctions cognitives se traduisant par une perte de mémoire spatiale, et (ii) % de neurones morts (neurodégénérescence); deux caractéristiques essentielles et déterminantes dans la pathophysiologie de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie d’Alzheimer.

Raffinement

La stratégie de raffinement sera basée sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (tube en carton, feuille de papier), (ii) des approches d'analgésies pré, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiées aux études impliquant des souris. Comme dans la plupart des cas les symptômes de la maladie d'Alzheimer apparaissent à un âge avancé, nous utiliserons des souris âgées de 12 mois. Ainsi, nous pourrons reproduire plus fidèlement et plus précisément la physiopathologie humaine de la maladie d'Alzheimer dans notre modèle de souris.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux d'un jour sont anesthésiés pour recevoir de l'ADN par électroporation dans les neurones du bulbe olfactif, puis tués entre deux et vingt-huit jours plus tard par perfusion intracardiaque après surdose d'anesthésique. Le porteur affirme pratiquer cette électroporation en routine depuis une douzaine d'années sans jamais avoir observé d'effet nuisible conséquent, et juge très limité le stress de l'injection intrapéritonéale. Il indique que la culture in vitro ne convient pas et retient la souris comme seul mammifère permettant les tests génétiques recherchés, pour éclairer le rôle de mutations du gène Ago2 identifiées chez des patients.

Objectifs

Certaines mutations du gène Ago2 chez des patients humains provoquent dans l’embryon des anomalies de formation des neurones (neurogenèse) conduisant ultérieurement à l’apparition de déficits cognitifs. Le présent projet cherche à comprendre les mécanismes qui conduisent les mutations du gène Ago2 à provoquer ces anomalies. Pour mener cette étude, nous utiliserons un modèle de neurogenèse (formation de nouveaux neurones) particulier chez la souris : la formation de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif. Ce modèle de neurogenèse, qui perdure tout au long de la vie de l’animal, autorise la modification de l’expression des gènes au cours du processus. Ainsi, en utilisant ce modèle nous pourrons étudier les conséquences de l’expression induite des formes mutantes du gène Ago2 au cours de la neurogenèse sur les propriétés des jeunes neurones qui en sont issus.

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux anomalies de formation des neurones liés aux mutations du gène Ago2 est susceptible d’aboutir au développement de nouveaux traitements permettant d’atténuer les effets de ces mutations. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre la fonction du gène Ago2 dans les neurones en développement.

Procédures

Pour l'étape d'électroporation, les 300 animaux de ce projet seront traités avec le même protocole: les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés et de l'ADN sera introduit par électroporation dans les jeunes neurones du bulbe olfactif en développement. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Les souriceaux seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation par perfusion intracardiaque après injection d'une surdose d'anesthésique. De plus, les animaux du lot 1 recevront une injection intrapéritonéale d'une solution non dommageable 2 heures avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 28 jours après électroporation. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’années et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser au niveau histologique le devenir des jeunes neurones modifiées génétiquement.

Remplacement

Les jeunes neurones peuvent être cultivés in vitro. Cependant nous savons que in vivo leur prolifération et leur développement en neurones matures sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux que nous ne savons pas reproduire in vitro. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. D'autre part nous ne sommes pas capables de cultiver suffisamment longtemps les progéniteurs neuronaux et les jeunes neurones qui en découlent pour leur faire atteindre un niveau de maturité suffisant pour qu'ils puissent entrer en communication avec d'autres neurones. Or il est fortement suggéré que les anomalies chez les patients causées par des mutations du gène Ago2 soient dues, au moins en partie, à un défaut de connectivité entre neurones. Pour ces raisons, le modèle de la culture in vitro n'est pas approprié à ce projet.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des jeunes neurones directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et la variabilité entre échantillons réduite au minimum. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés aux petits échantillons (tests non paramétriques) que nous maitrisons grace aux formations en biostatistique que nous avons suivies. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ces expériences.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Six personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin des animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation postexpérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

Le projet vise à reproduire et à étudier le mécanisme d'apparition de défauts de développement et/ou de fonctionnement des neurones exprimant une forme mutante d’Ago2. Nous privilégions donc un modèle de mammifère pour ce projet. Chez les mammifères, seule l’espèce souris permet de réaliser des tests génétiques sophistiqués tels que ceux décrits dans ce projet. Les animaux seront électroporés à 1 jour après leur naissance (stade P1) car c'est à ce stade que l'efficacité d'électroporation est optimale. Les animaux ayant subi l'électroporation seront euthanasiés pour analyse aux stades P3 (jour 3 après la naissance, les jeunes neurones électroporés sont en pleine phase de prolifération), P15 (jour 15 après la naissance, à ce stade la majorité des neurones électroporé ont atteint le bulbe olfactif mais restent immatures) ou P29 (29 jours après la naissance, les neurones électroporés sont complètement matures).

20 primates non-humains, dix macaques à longue queue et dix macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort à l'issue. Chaque animal subit neuf examens d'imagerie sous anesthésie générale pouvant durer jusqu'à cinq heures, avec pose d'une voie artérielle et prélèvements sanguins, pour suivre la distribution de radiotraceurs et de candidats médicaments. Le porteur reconnaît que ces anesthésies répétées et longues peuvent être fatigantes et prévoit la réutilisation des animaux sur décision du vétérinaire. Il retient le primate non-humain pour la proximité de sa physiologie avec celle de l'humain, afin d'extrapoler les résultats.

Objectifs

L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments pour traiter des maladies telles que le diabète, certains cancers et des pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Pour y parvenir, nous synthétiserons des composés radiomarqués que nous injecterons à des primates non humains. La distribution tissulaire sera suivie grâce à une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes à demi-vie courte utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant à chacun des isotopes utilisés. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés ciblent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Il peut s’agir également de candidats médicaments neuroprotecteurs. Trois séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqués dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations indispensables sur l’exposition tissulaire aux doses de radiotraceurs et sur les spécificités de la distribution tissulaire et de l’élimination des candidats médicaments étudiés. Ces résultats peuvent être extrapolés chez l’Homme.

Procédures

Les animaux auront une séance d’imagerie anatomique (IRM) puis trois séances d’imagerie dynamique (TEP) par radiotraceur. Toutes les imageries (IRM et TEP) se dérouleront sous anesthésie générale (durée 300 minutes maximum) pour une acquisition d’une durée de 240 minutes maximum. Il n’y aura pas de prélèvements sanguins pendant l’imagerie IRM, par contre il y aura des prélèvements sanguins à chaque imagerie TEP qui seront séparés de 15 jours au minimum. Une voie artérielle sera positionnée en début d’anesthésie (durée de la pose inférieure à 5 minutes) afin de faire les prélèvements sanguins (durée inférieure à 5 secondes) durant l’examen. Cette voie artérielle sera retirée à la fin de l’examen. Pour 1 des 3 imageries TEP, les animaux recevront une dose pharmacologique du candidat médicament par injection intraveineuse sur 1 minute.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable prévu est un stress associé à la contention physique (durée inférieure à 2 minutes) qui précède l’injection de l’anesthésique par voie intra-musculaire ainsi qu’un stress pendant la phase de réveil (durée inférieure à 1 heure). La réalisation d’anesthésies répétées et relativement longues avec injections des médicaments et prélèvements sanguins, peut être fatigante pour l’animal. La mise à jeun la veille au soir pour le lendemain matin et le contrôle hydrique 2 heures avant l’induction de l’anesthésie, peuvent constituer des stress modérés.

Devenir

Le protocole expérimental ne nécessite pas d’euthanasier les animaux. Les animaux pourront être réutilisés sur décision du vétérinaire à la fin de l’étude.

Remplacement

Compte-tenu de la complexité des phénomènes étudiés, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les effets d’un candidat médicament sur un organisme entier et permettre ainsi d’extrapoler les résultats à l’Homme. Afin d’obtenir des données convaincantes d’un point de vue clinique, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier dont l’anatomie et la physiologie se rapprochent au maximum de celles de l’Homme. Cette étude ne peut être envisagée qu’in-vivo chez des primates non-humains dont les déterminants pharmacocinétiques et la physiologie sont plus proches de ceux de l’Homme que ceux des rongeurs.

Réduction

L’approche statistique envisagée permet la comparaison des trois conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable, global ou régional. Cette estimation prend en compte la variabilité des mesures observées lors d’études précédentes réalisées chez les primates non-humains. Dans une perspective de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude, seulement 20 primates non-humain seront inclus. Chaque animal participera à 9 examens afin d’obtenir des données répétables et représentatives des phénomènes étudiés.

Raffinement

Pendant toute la durée de cette étude, il y aura la mise en place d’un renforcement positif avec un remplacement hebdomadaire (physique) et journalier (alimentaire, sensoriel) des enrichissements de l’environnement. Les primates non-humains seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs. Toutes les procédures expérimentales se réalisent sous anesthésie générale. Juste avant le début de la procédure, un examen clinique de l’animal sera systématiquement réalisé. Durant les examens d’imagerie, la température corporelle est monitorée et maintenue à l'aide d'une couverture chauffante à air, suppléée par une perfusion de liquide à 37°C. Les paramètres physiologiques et de ventilation sont suivis et sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Durant ces examens la surveillance des animaux est renforcée jusqu’au réveil complet de l’animal (animal debout). Certains animaux possèdent une sensibilité accrue aux agents anesthésiants. Des protocoles ont été mis en place afin d’identifier et de prévenir cette susceptibilité.

Choix des espèces

La physiologie des barrières biologiques des primates non-humains est plus proche de celle des primates humains que de celle des rongeurs. Les niveaux d’expression de nombreux transporteurs de radiotraceurs sont très différents entre les Hommes et les rongeurs. Il a été montré que les primates non-humains constituent un modèle plus prédictif de l’activité de ces transporteurs lors des études de pharmacocinétique. Aussi, afin d’étudier les effets de ces transporteurs sur la pharmacocinétique des médicaments et extrapoler les résultats chez l’Homme, l’utilisation de primates non-humains est particulièrement pertinente. Le projet sera conduit sur des individus adultes, car nous avons besoin que l’ensemble des tissus d’intérêts soit pleinement développés (mature).

120 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une IRM puis une chirurgie du cerveau par stéréotaxie de deux à quatre heures pour implanter des électrodes de stimulation profonde ou injecter des vecteurs viraux, avant d'être mis à mort pour des analyses. Le porteur justifie le recours au porc en invoquant l'"éthique spéciste actuelle" qui interdit ces approches invasives chez l'humain, et conclut à la nécessité de l'animal. Il retient le porc pour la proximité de son cerveau avec celui de l'humain en taille et en structure.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde est une procédure neurochirurgicale souvent pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement. La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans la structure cible (dont le mécanisme n'est pas entièrement compris) pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la maladie et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Toutefois le développement de nouvelles sondes de stimulation cérébrale capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter après modification de leur génome, dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs viraux tout comme la stimulation cérébrale reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Des études précliniques sont nécessaires pour valider ces outils (sondes de stimulation ou vecteurs viraux) avant de puvoir les utiliser chez les patients. Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs viraux dans le cadre de la thérapie génique et d’autre part de nouvelles sondes de stimulation cérébrale chez le porc. Les deux approches pouvant être combinées en conditions proches de la clinique avant leur utilisation chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un médicament ou d’un nouveau dispositif médical, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles techniques sur les animaux visant à améliorer l’impact de la stimulation cérébrale dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, épilepsie...).

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : examens d’imagerie non-invasifs par IRM (durée 2-4 heures), une chirurgie stéréotaxique (identique à celle réalisée chez le patient) pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration de vecteurs viraus de thérapie génique sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). Des prélèvements pourront être réalisés (sang) lors de l'opération sous anesthésie générale (30 secondes). En fonction du test réaliser, certains animaux pourront avoir une phase de récupération et de répétition, d’une à deux semaines après la chirurgie, de l’imagerie et d'enregistrements electrophysiologiques afin d’évaluer les résultats chroniques de l’intervention réalisée (durée 4-6 heures).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. L’ensemble de ces complications sera pris en charge par une prophylaxie adaptée. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Bien que les vesteurs viraux pour la thérapie génique soient connus pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter d'éventuels effets inattendus.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo, des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet concerne exclusivement une utilisation du porc. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le porc (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale) apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 6 animaux par étude en moyenne, soit un total de 120 animaux sur 5 ans maximum. Les vecteurs viraux pour la thérapie génique auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical, la chirurgie implantatoire ne concerne qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des mâles comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors de l'opération, l'hydratation ou la fourniture d'antiarythmiques est assurée en permanence. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le porc a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du porc est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Le stade de développement de l'animal est Porc, jeune de 35-40kg environ (environ de 3-4 mois). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.