Troubles nerveux

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection du produit dans le cerveau ou la moelle épinière, par voie intracrânienne, intrathécale ou intraveineuse, puis sont mises à mort au plus tard soixante jours après pour prélever leurs tissus. Le porteur indique des douleurs post-opératoires possibles, un saignement lors de la descente de l'aiguille, une perte de poids ou un décès sous anesthésie, et décrit un protocole d'analgésie. Il conclut à l'irremplaçabilité de la souris, aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau, pour optimiser une thérapie génique visant les maladies neurodégénératives.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles stratégies sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches se trouve la thérapie génique. Elle utilise la génétique pour soigner ou prévenir la maladie. L’objectif est de délivrer aux cellules malades un gène à action thérapeutique (transgène) qui permet de remplacer la protéine défectueuse à l’origine de la maladie. Ce gène médicament est transporté dans les cellules grâce à un virus modifié (vecteur viral) dont les caractéristiques peuvent permettre de cibler plus ou moins spécifiquement les cellules malades. Le projet « Optimisation de l’expression d’un transgène sur modèle murin par modulation du sérotype du vecteur thérapeutique et du site d’injection en vue d’une application en thérapie génique pour les maladies neurodégénérative » a pour but de déterminer les conditions optimales d’administration (site d’injection et spécificité du vecteur médicament) pour permettre d’augmenter l’efficacité du traitement de thérapie génique en vue d’une application à l’homme. Nous testerons différents vecteurs médicaments ainsi que différents sites d’injection et testerons leur efficacité. Cette optimisation permettra d’ajuster au mieux la thérapie aux patients en ciblant de manière plus spécifique les cellules malades et en déterminant la meilleure voie. Les deux approches combinées (ciblage des cellules malades et choix de la voie d’administration) permettront d’améliorer considérablement l’efficacité de la thérapie tout en réduisant de manière significative les risques liés à l’utilisation de virus en diminuant la dose utilisée.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de : - déterminer la meilleure voie d'administration pour le traitement de maladie neurodégénérative, - déterminer la dose de virus utile pour un traitement avec pour objectif de réduire cette dose au maximum, - déterminer une stratégie thérapeutique qui réduirait le délai pour envisager une application à l’homme.

Procédures

Pour l’ensemble de ce projet aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Deux interventions seront effectuées sur chaque animal, l’une au moment de l’injection (IC - Intra cranienne, injection dans le cerveau), ICM - Intra Cisterna Magna, injection dans la grande citerne, cavité à l'arrière de la tête entre le crâne et la première vertèbre, IT - Intrathécale, injection au niveau de la moelle épinière par injection entre les vertèbres, ICV - IntraCérébroVentriculaire, injection dans les ventricules du cerveau, IV - Intraveineuse, injection dans le système veineux), l’autre au moment de l’euthanasie au maximum 60j post-injection. Pour les injections IC, ICM, IT, ICV une intervention inférieure à 30 minutes animal endormi, avec prise en charge analgésique 30 minutes avant la chirurgie sera effectuée. Afin d’éviter la douleur, post-chirurgie, les animaux reçoivent l’administration d’analgésique dans les 48 heures suivant la chirurgie. Pour l’injection IV une intervention de moins de 5 minutes par animal sera réalisée (5 minutes pour anesthésie et injection avec un temps d’injection de 20 secondes maximum). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les tissus pour analyses.

Impact sur les animaux

Cette étude ne devrait pas engendrer de nuisance ou d’effet indésirable pour les animaux (surexpression modérée des différentes protéines et un temps d’expression suffisamment court pour ne pas engendrer de toxicité à long terme). L'utilisation d'antalgique (buprénorphine) permettra de minorer les éventuelles douleurs post opératoire liées : (1) à la manipulation des animaux (placement sur appareil de stéréotaxie), (2) à l’injection (réalisation de trepan pour l'Intra Cranienne et l'Intra Cérébroventriculaire, chirurgie pour injection dans la Cisterna Magna et en Intra Thécale), (3) à un saignement suite à une lésion d’une artère ou d’une veine lors de la descente de l’aiguille au site d’injection, (4) à une perte de poids liée à l’intervention et/ou chirurgie ou un décès dû à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin procédure expérimentale pour les prélèvements et leurs analyses afin de pouvoir répondre a la question scientifique de ce projet.

Remplacement

Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles.

Réduction

Des résultats précédents nous ont permis d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités. Le nombre d’animaux utilisés est donc optimisé pour obtenir des résultats statistiques. La composition des groupes d’étude a été faite pour utiliser un nombre minimal d’animaux (6 animaux, un seul sexe étudié car aucune variabilité liée au sexe n’est attendue permettant ainsi de ne pas injecter d’animaux supplémentaires pour homogénéiser le ratio sexe F/M). Leur nombre (338) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. Un groupe contrôle de 12 animaux servira pour l’ensemble de l’expérience. En cas de problème pour l’un des groupes injectés (tel qu’un décès lors de l’anesthésie par exemple), un animal du groupe contrôle sera utilisé en remplacement, ainsi aucun animal supplémentaire ne devrait être ajouté à celui indiqué précedemment pour finaliser le projet. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Un plan statistique complet a été rédigé et validé. L’analyse statistique sera réalisé à l’aide du logiciel statistique informatique.

Raffinement

Les animaux seront regroupés par groupes de 6. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué certifiant un contrôle régulier du bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection de lidocaïne (anesthésique local) et par protocole analgésique ratifié par le vétérinaire du service pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Toute manipulation de vecteurs thérapeutiques se fait dans les conditions optimales. Les animaux seront hébergés en zone confinée du moment de l’injection des vecteurs thérapeutiques jusqu’à leur euthanasie. Un environnement enrichi sera garanti aux animaux, : carré de coton ou des lamelles de kraft pour la nidification. Un igloo sera ajouté dans chaque cage. Tout au long de la vie des animaux un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris. Notre étude a pour but d’étudier la biodistribution, un modèle « complet » animal est donc indispensable. Le modèle murin est le modèle de référence pour des études préliminaires. Les animaux utilisés seront injectés à P50 et mis à mort 2 mois après injection. Ce projet a pour objectif de déterminer la voie d’administration optimale en fonction du sérotype et du transgène choisi. Il servira de référence en vue d’une application de cette stratégie sur l’humain adulte. Des animaux adultes sont donc utilisés. L’expression de nos vecteurs est optimale 4 à 6 semaines post injection, nous avons choisi de conserver les animaux 8 semaines post injection pour que chacun des animaux injectés exprime la protéine d’intérêt de manière optimale.

1 255 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation chirurgicale d'électrodes dans le cerveau, chaque rat reçoit des stimulations électriques répétées pendant plusieurs semaines pour provoquer des crises d'épilepsie partielles évoluant vers des crises généralisées, avec redressement et perte d'équilibre, afin de tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique qu'un état épileptique permanent peut apparaître dans de rares cas et que les rats opérés sont hébergés seuls, et signale l'existence de méthodes sur tranches cérébrales sans les présenter comme suffisantes. Il justifie la mise à mort de tous les animaux par les crises répétées qu'ils ont subies, qui ne permettent pas de garantir leur maintien en vie.

Objectifs

Le projet consiste à tester l'efficacité de substances pharmacologiques en développement préclinique pour lutter contre les épilepsies de type partielle, c'est-à-dire qui sont localisées dans une région spécifique du cerveau. Les épilepsies partielles sont à l'origine de décharges électriques anormales dans une région cérébrale spécifique et de symptômes qui peuvent se traduire par des contractions involontaires des membres supérieurs ou inférieurs, des hallucinations, des troubles du langage ou encore des troubles du rythme cardiaque et respiratoire. De plus, ce type d'épilepsie altère la qualité de vie des patients avec une perte progressive de contact avec l'extérieur et une perturbation de la mémoire. Dans certains cas, les épilepsies partielles peuvent progresser vers des épilepsies généralisées, avec l'apparition de symptômes convulsifs plus intenses et conduire à la mort. Il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". Dans ce projet, un modèle murin de crises épileptiques partielles évoluant vers des crises généralisées sera utilisé afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques en développement.

Bénéfices attendus

Le modèle de kindling est recommandé pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.

Procédures

Le projet consiste à opérer l'animal pour placer des électrodes dans une structure cérébrale spécifique ainsi qu'à à la surface du cerveau. L'implant va permettre de stimuler l'animal dans une structure cérébrale spécifique pour le sensibiliser à l'induction de crises partielles. La phase de sensibilisation correspond à une période de 2 à 3 semaines, 1 à 2 stimulations de 2 secondes par jour ,5 jours par semaine. Dans certains cas, une phase de stabilisation à la stimulation est ajoutée et correspond à une série de 3 à 20 stimulations de 1 seconde, une fois par jour, 5 jours par semaine sur 2 semaines. Lors de la phase de test, l'électroencéphalogramme est enregistré sur 10 à 20 minutes avec une seule stimulation de 2 secondes ou une série de stimulation (entre 3 et 20) de 1 seconde sur 2 ou 3 jours consécutifs lors d'un traitement aigu. Dans le cadre d'un traitement chronique, 3 ou 4 enregistrements peuvent être réalisés sur une semaine (1 enregistrement par jour). Des prélèvements sanguins terminaux ou d'organes peuvent également être envisagés pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Concernant l'administration des candidats traitements, les administrations par bolus rapide (voies orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) durent quelques secondes; l'administration par perfusion lente (intraveineuse) peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Un traitement peut également être injecté par voie intracranienne, au moment de l'implantation des électrodes.

Impact sur les animaux

Le protocole décrit dans ce projet conduit à l'apparition d'une crise partielle (clignement des yeux, mastication, mouvements des vibrisses ou de tête, mouvements involontaires des pattes avant) qui est suivie d'une crise généralisée (redressement de l'animal et perte d'équilibre) suite à une stimulation éléctrique de faible intensité, puis ce dernier récupère très rapidement. Dans de rares cas, un état épileptique permanent peut apparaitre. L'animal sera euthanasié s'il ne récupère pas rapidement après une stimulation. Les animaux sont hébergés seuls pendant toute la durée de la procédure, dès lors que les animaux sont opérés afin de protéger l'implant de leurs congénères. Néanmoins, les animaux peuvent se voir, se sentir et s'entendre lorsqu'ils sont hébergés en animalerie conventionnelle. Pour les animaux ayant reçu un OGM, ils sont isolés pendant une semaine dans des cages ventilées où les animaux peuvent se voir. Ils sont ensuite replacés en animalerie conventionnelle.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque étude. Des crises épileptiques ont été induites de manière répétée chez les animaux soumis à une procédure de kindling, leur maintien en vie dans de bonnes conditions ne peut pas être garantie (même s’il n’est pas attendu de crises épileptiques spontanées chez ces animaux)

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou ex-vivo permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et l'activité cérébrale.

Réduction

Les animaux peuvent être utilisés pour l'évaluation de 2 candidats médicaments (2 études) sur plusieurs semaines (maximum 10 semaines), une fois sensibilisés et stabilisés, le cas échéant. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux pour une même étude (différentes doses ou traitements comparables) ou pour deux études (deuxs candidats médicaments). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Une analyse de puissance réalisée sur les paramètres mesurés dans le test du kindling avec stimulation constante indique qu'un minimum de 10-12 rats est nécessaire par groupe.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Lors de la procédure chirurgicale, une analgésie est assurée par l’administration de Carprofene à 5 mg/kg ou équivalent avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures après l'opération. De la lidocaïne est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Une attention particulière sera portée sur la récupération des animaux à la suite de la chirurgie. Ces derniers seront pesés 24 et 48 heures suite à la chirurgie. L’implant sera désinfecté, le cas échéant et une antibiothérapie sera réalisée en cas de suspicion d’infection. L’administration d’huile naturelle peut être préconisée dans le cas d’un ralentissement du transit intestinal. Au cours du test, l'enregistrement de l'électroencéphalogramme permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. L'ajout d'une phase pour déterminer le seuil de stimulation pour induire une crise partielle et une crise généralisée permet de réduire le seuil de stimulation pour chaque animal testé, et par conséquent, limiter la douleur chez ce dernier. Le seuil de stimulation minimum pour une crise partielle correspond à l'apparition d'une crise de quelques secondes sur l'électroencéphalogramme, en présence ou non de symptômes comportementaux mesurés d'après l'échelle de Racine. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure. Notamment, dans de rares cas, un état épileptique peut apparaître. L’animal sera euthanasié s’il ne récupère pas dans les 10 minutes suite à la stimulation électrique. Les animaux isolés sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. Il est envisagé de placer un animal compagnon dans chaque cage, une fois que les plaies autour de l'implant seront bien cicatrisées afin d'améliorer le bien-être des animaux dans ces procédures. Un essai sera réalisé pour évaluer la faisabilité et sera généralisé si l’implant n’est pas endommagé.

Choix des espèces

Le modèle du kindling par stimulation électrique d'une structure cérébrale est utilisé principalement chez le rat, en raison de la taille de l'animal (implantation chirurgicale d'électrodes de stimulation et d'électrodes pour enregistrer l'électroencéphalogramme). Les rats sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. La procédure décrite dans ce projet peut être utilisée de façon longitudinale sur des rongeurs sevrés jusqu'à l'âge adulte.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'injection de vecteurs dans le cerveau d'environ trois heures, puis six prélèvements de sang, six ponctions de liquide céphalorachidien et trois IRM sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la maladie de Parkinson déjà évaluée chez la souris. Le porteur indique que les ponctions peuvent provoquer fuites de liquide, maux de tête, vomissements et hématomes, et que le modèle ne produit pas de symptômes parkinsoniens visibles. Il présente le recours au primate comme une étape réglementaire exigée avant l'essai clinique, et euthanasie les six animaux pour les analyses histologiques.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones dopaminergiques d’une partie du cerveau. De nos jours, les patients parkinsoniens sont majoritairement sous traitements médicamenteux de L-Dopa, efficaces pour une durée dépendante de chaque patient, mais qui ne permet qu’un effet transitoire et évoluant ensuite vers une paralysie progressive et une perte importante de qualité de vie. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la pathologie. Grace à la thérapie génique, nous injectons dans le cerveau un vecteur-médicament qui va entrainer la surexpression de l’enzyme impliquée dans la transformation du cholestérol dans le cerveau, pour tenter de corriger la perte neuronale responsable des symptômes parkinsoniens. Nous avons déjà démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 3 modèles murins de la maladie de parkinson Les objectifs du projet sont d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intracérébrale de ce vecteur-médicament chez le primate non humain (PNH) pour permettre ensuite de réaliser ce traitement chez l’Homme. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec la mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est de proposer un essai clinique pour un nouveau traitement de thérapie génique (nouveau médicament-vecteur d’intérêt) pour des patients atteints de maladie de Parkinson

Procédures

- Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : injection intracérébrale de vecteurs (durée environ 3h) - 6 prélèvements sanguins, 6 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang + LCR maximum 30min), sous anesthésie générale et analgésie. - 3 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale Dans ce projet, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien et/ou IRM selon les temps d’intérêt de l'étude). Enfin l'euthanasie en fin de protocole est réalisé par une méthode réglementaire

Impact sur les animaux

Une chirurgie sous anesthésie générale avec un risque anesthésique et infectieux Plusieurs prélèvements de sang et de LCR avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes Le modèle de parkinson, n’a pas de symptômes physiques attendus suite à l’administration intracérébrale de ces vecteurs d’intérêts. Le stress lié à l'anesthésie en cage de l'animal.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études histologiques et de biodistribution afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de ce médicament-vecteur comme nouvelle cible thérapeutique dans la maladie de Parkinson. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille, le plus pertinent pour reproduire le modèle de la maladie de Parkinson est le PNH. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme).

Réduction

Il y a 6 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et la chirurgie d’injection virale, pour éviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet poru le suivi des points limites ainsi que le respect des mesures de raffinement. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du primate en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). L'injection de vecteurs adéno-associé chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par notre approche

331 animaux non-humains vont être utilisés, 200 souris et 125 rats tués à l'issue pour prélèvement d'organes, et six macaques à longue queue réaffectés à d'autres projets d'imagerie. Ils reçoivent par voie nasale et intraveineuse un candidat médicament contre un déficit congénital en créatine, les macaques subissant en plus une immobilisation en cadre stéréotaxique pour une IRM de trois heures et demie sous anesthésie. Le porteur reconnaît des douleurs au point d'injection, une perte de poids et une toxicité possible par voie nasale, et situe l'application chez l'humain et les essais cliniques à venir. Il affirme que les tests d'innocuité "ne peuvent être faits que chez l'animal" et les juge "plus que nécessaires".

Objectifs

Le contexte du projet est le développement d’un candidat médicament pour le traitement du déficit congéntial en créatine, maladie pour laquelle il n’y a à ce jour aucun traitement. L’objectif de ce projet est de: (i) - développer une méthodologie IRM pour évaluer la biodistribution et l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament après son administration in vivo par la voie nasale. -(ii) tester et valider le traitement et la méthode d’imagerie par IRM du deutérium chez le primate sur un IRM. -(iii) valider l’innocuité du candidat médicament et de deux autres molécules chez le rat.

Bénéfices attendus

La démonstration de la présence de créatine chez le primate après une administration intranasale du DCE (Dodecyl Creatine Ester) marqué au déteurium permet d’envisager cette voie d’administration chez l’homme. De même l’évaluation de l’innocuité du traitement DCE chez le rat permet d’envisager les études de toxicologie réglementaire et à terme des études cliniques de phase I ou phase de tolérance chez le volontaire sain et une phase clinique d’efficacité pharmacologique du candidat médicament DCE.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration pendant quelques minutes du candidat médicament DCE par voie nasale et intraveineuse. La durée de traitement est de 30 jours chez le primate et la souris pour le transporteur de la créatine. Cette durée de l’intervention est de quelques minutes et le de traitement est réduite à 15 jours chez le rat. Pour les études chez la souris et le rat, à la fin de chaque traitement les animaux seront mis à mort.. Une seule imagerie sera effectuée chez le macque sous anesthésie d’une durée de 3h30..

Impact sur les animaux

Douleur au site d’injection, stress lié à la durée du traitement, perte de poids, effets indésirables liés à l’inoculation et toxicité voie nasale

Devenir

Les souris et les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes. Les primates seront affectés à d’autres projets d’imagerie avec l’accord du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes permettant d’évaluer le passage cérébral de candidats par voie nasale en utilisant l’imagerie IRM. De plus, les tests d’innocuité du traitement DCE ne peuvent être faites que chez l’animal. Ces tests sont plus que nécessaires pour valider le mode d’administration du médicament qui sera administré chez le patient et garantir la non toxicité du médicament qui sera administré plus tard chez l’homme.

Réduction

Les procédures d’imagerie utilisées sont non-invasives. Ceci permet des mesures longitudinales, réduisant le nombre total d’animaux. Le nombre total de séances sera limité à 7, avec un minimum de 7 jours séparant les séances. Le nombre de souris (n=20/groupe) a été établi selon notre expérience de la sensibilité des mesures IRM pour détecter un effet sur de faibles concentrations de créatine. Le nombre de primates (n=6) est standard dans la littérature pour mettre en évidence un biomarqueur en mesurant une moyenne et un écart-type pertinent. Le nombre de rats par groupe (n=5) pour l’évaluation de l’innocuité du traitement par voie nasale est le nombre minimal utilisé pour l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Celui de 25 rats par ester de créatine (3 molécules) pour l’étude vie la voie iv est aussi un nombre minimum pour 5 groupes d’animaux.

Raffinement

L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU : environnement enrichi selon nos procédures standards, hébergement en groupe social dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h, eau/nourriture ad libitum. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. Un suivi des paramètres physiologiques est assuré durant les anesthésies afin d’adapter les mesures compensatrices (soutien thermique, perfusion, anesthésique). Pour l’administration du traitement en spray ou en solution dans les narines, les animaux seront soit habitués à la contention vigile (souris), soit soumis à une anesthésie courte (primates, ~15 min). Des données préliminaires montrent qu’il n’y a pas de signe de gêne chez le rongeur suite à l’application quotidienne du produit

Choix des espèces

La maladie d’intérêt est une maladie grave avec des conséquences cognitives importantes chez l’enfant. Seul un modèle transgénique rongeur déficitaire en transporteur de la créatine existe à l’heure actuelle pour évaluer la distribution cérébrale et l’effet thérapeutique de l’apport en créatine exogène. La transposition de l’étude rongeur chez le primate permet de s’assurer et de valider le passage cérébral par voie nasale du candidat médicament l’ester dodécylique de créatine et donc de valider la stratégie thérapeutique qui sera utilisée chez l’homme, étant donné la similitude anatomique de la muqueuse nasale entre le primate non humain et l’homme. De plus, le modèle macaque permettra à terme d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelles, de comportement et de signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Le rat est l’animal utilisée dans l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Ce sera ensuite une des 2 espèces utilisées dans les études réglementaires. Les animaux adultes seront utilisés car le développement cérébral est achevé à ce stade. La maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine

116 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant recevoir jusqu'à six injections intrathécales, dans le canal rachidien, sous anesthésie générale, et subir jusqu'à dix prises de sang par semaine sans anesthésie. S'y ajoutent des prélèvements de liquide céphalo-rachidien, une collecte d'urine de 24 heures en module d'hébergement, un examen des yeux de 30 à 40 minutes sous anesthésie et un gilet d'enregistrement porté 12 heures. Après chaque injection, le porteur envisage une baisse des réponses des membres inférieurs jusqu'à 48 heures, une démarche et une posture perturbées jusqu'à quatre heures après le réveil, des contractions musculaires et, plus rarement, des fuites urinaires. Tous sont tués pour l'analyse de leurs tissus, sauf 28 témoins qui pourront être réutilisés dans d'autres études. Ces travaux préliminaires servent à régler les doses des études réglementaires qui suivront, menées sur la même espèce.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement l’efficacité et la toxicité éventuelle de candidats-médicaments administrés par voie intrathécale afin de pouvoir proposer le meilleur traitement aux patients atteints de troubles neurologiques graves tels que par exemple les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson…) ou des atteintes neuropsychiatriques (épilepsie, …). Les études dans ce projet permettront d’ajuster au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal).

Bénéfices attendus

Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients. Ce projet nous permettra également de comprendre l’impact du geste de l’administration spinale (voie intrathécale) répétée d’un traitement et à terme d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour rendre plus sûre l’administration du traitement chez les patients et améliorer ainsi leur prise en charge.

Procédures

•Injections intrathécales réalisées sous anesthésie générale : jusqu’à 6 injections maximum avec un délai minimum de 7 jours entre les 2 injections (durée acte : 15min maximum) •Prélèvements de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale juste avant les injections intrathécales et plus rarement entre 2 injections intrathécales. (durée : 2 à 3 min en fonction de la vitesse d’écoulement) •Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (au maximum 10 par semaine ou dans la limite de 7,5% du volume total circulant ; quelques secondes •Prélèvements urinaires en hébergeant l’animal dans un module d’hébergement adapté pendant 24 heures maximum pour collecter les urines. •Examen des yeux sous anesthésie générale (utilisation d’une lampe à fente) : 30 à 40 min •Examen du système cardiovasculaire (port gilet pour monitoring sur 12h) par électroencéphalogramme et prise de la tension artérielle (2min max).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les effets indésirables anticipés concernent ceux inhérents à la voie d’administration intrathécale et pourrait inclure : une diminution transitoire (jusqu’à 24-48 heures après injection) des réponses des membres inférieurs pouvant induire ou non une perturbation de la démarche et la posture de 30 minutes à 4 heures après le réveil, contractions musculaires durant la procédure ou juste après injection, de rare troubles neurologiques tel que des fuites urinaires (jusque 4 heures après injection). Ces effets potentiels seront gérés par l’utilisation de points limites adaptés afin de limiter au maximum l’apparition et la durée des effets décrits ci-dessus. La douleur et la souffrance potentiellement présentes sont liées aux administrations et aux prélèvements de sang et de liquide cérébrospinal. Ces désagréments sont gérés sous anesthésie générale excepté dans le cas des prélèvements de sang où l’anesthésie provoquerait plus de souffrance et de stress que l’acte en lui-même pour lesquels les animaux sont habitué par renforcement positif.

Devenir

Tous les animaux dans ce projet seront euthanasiés pour procéder à l’analyse post-mortem des tissus (immunohistochimie/biochimie) à l’exception de certains animaux témoins (n=28 sur l’ensemble du projet) qui pourront être ré-utilisés dans d’autres études après accord vétérinaire.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative validée scientifiquement, éthiquement et règlementairement à l’utilisation des animaux dans le cadre du développement clinique de tout nouveau médicament. Les progrès scientifiques ont permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés en privilégiant les tests in silico et in vitro pour la sélection précoce des molécules. Cependant, les progrès réalisés n’ont pas permis la substitution complète des tests in vivo qui demeurent un requis réglementaire. Comme ces études permettent de choisir les doses des études réglementaires obligatoires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires, elles doivent être réalisées sur le même modèle animal que celui des études réglementaires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son minimum afin d’atteindre l’objectif du projet. Pour ces études, en tenant compte de la disponibilité de données historiques pour de nombreux paramètres étudiés et de leur variabilité, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Ces études préliminaires permettront de limiter le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques dans les études réglementaires.

Raffinement

Une procédure d’analgésie et d’anesthésie sera appliquée au moment des administrations intrathécales. Une observation accrue et adaptée du comportement de l’animal sera faite suite à l’administration afin de s’assurer qu’il ne présente pas de signe défavorable ou que l’apparition d’éventuels signes liés à la procédure ne soit que transitoire (ex : démarche anormale). Concernant le reste des examens pratiqués, afin de ne pas interférer sur les paramètres étudiés, les animaux ne seront pas anesthésiés mais ils seront habitués par renforcement positif. Une grille de point limite adaptée est mise en place pour prise de décision rapide (arrêt de la dose, décalage d’examen prévu, euthanasie de l’animal). En cas de nécessité, le vétérinaire pourra intervenir et décider de la mise en place de soin spécifique. Tous les animaux sont mis en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie ou signes nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.

Choix des espèces

Les études de ce projet ont pour but de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicaments chez l’Homme ainsi que son efficacité sur l’engagement de la cible associée à la distribution du médicament dans l’organisme humain. Dans ce contexte, le modèle primate non-humain peut être sélectionné à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proches de l’humain notamment sur la totalité des paramètres suivants : • Sur le plan pharmacologique et toxicocinétique : exposition au médicament, élimination, fraction libre du médicament… • D’un point de vue du métabolisme : type et quantité relative de métabolites produits suite à l’administration d’un médicament • D’un point de vue physiologique : réactions physiologiques similaires (engagement de la cible) et pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme • Sur le plan expérimental : évaluation des formulations et excipients tolérés, voies d’administration possibles Données historiques : expérience avec des médicaments compétiteurs de la même catégorie Ces études étant préliminaires aux études réglementaires qui utilisent principalement des adultes et de jeunes adultes, il est donc prévu d’utiliser des animaux du même stade de développement.

124 souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une photobiomodulation par la lumière trente minutes par jour pendant onze à douze mois, subissent des prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux (labyrinthe radial, labyrinthe de Barnes, rotarod, open field), avant une ponction de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie létale et une perfusion intracardiaque. Le porteur cherche à déterminer l'heure de la journée la plus favorable à ce traitement. Les retombées annoncées, un passage chez le singe puis un traitement humain, restent renvoyées à la suite, tandis que le porteur affirme le modèle animal "indispensable" et "seul moyen" de répondre à la question.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux avec un fond génétique hybride 129/C57BL6, en prenant en compte des connaissances du modèle 3xTgAD par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en s'appuyant sur une approche statistique, nous avons déterminés que nous aurions besoin de 60 souris 3xTgAD soit 15 souris par groupe (femelles), de 18 souris contrôles femelles avec le même fond génétique et de 22 souris pour l’expérience pilote (22 souris WT). Le total de souris sera de 100 individus. Les modèles murins utilisés seront les 3xTg-AD et les WT femelles exclusivement car les stigmates anatomiques et cognitifs de la MA sont beaucoup prononcés. L’expérience pilote permettra d’affiner les paramètres de la photobiomodulation (PBM), de mettre au point parfaitement les techniques mis en œuvre pour répondre à l’hypothèse du projet et d’obtenir des résultats exploitables. Une modification du nombre de souris WT est actuellement demandé. Selon la première hypothèse et les connaissances sur le sujet, nous avions diminué le nombre de groupe de souris WT pour suivre la stratégie de réduction des 3Rs et car le cycle circadien et la photobiomodulation n’aurait pas dû avoir une influence sur ces souris. Nous avions également expliqué que le groupe WT-PBM sera illuminé série 1 le matin, série 2 l’après-midi et série 3 la nuit pour répondre aux futurs reviewers des journaux scientifiques. Cependant aux vues des premiers résultats, nous devons effectuer la photobiomodulation sur l’ensemble du cycle circadien. Passant de 2 à 4 le nombre de groupe de souris WT et pour obtenir des résultats statistiquement corrects (avec l’aide du logiciel G*Power), le nombre de souris supplémentaire est de 24, soit 124 souris au lieu de 100 auparavant. Ces groupes seront divisés en 4 séries avec pour les 3 premières séries un n=3 pour les WT/ WT-PBM-N et un n=5 pour les 3xTg-AD (au total n=18 pour les WTs et n=60 pour les ADs). Pour la 4ème série, il y aura seulement des souris WTs avec un n=3 pour les WT, n=9 WT-PBM-AM, n=9 WT-PBM-PM et n=3 WT-PBM-N (au total n=24 pour les WTs). Pour respecter les 3Rs, nous avons effectué un test statistique pour limiter le nombre d’animaux tout en ayant des résultats exploitables pour le projet.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse. Selon la dynamique évolutive de la maladie d’Alzheimer dans ce modèle, les marqueurs pathologiques (plaques amyloïdes et Tau) sont observables scientifiquement entre l’âge de 12 et 14 mois d’où la procédure sans réveil à cet âge et les déficits cognitifs sont, quant à eux, visibles à partir du 12ème mois. La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative sur des personnes âgées. Dans le cas des souris, cela correspond aux stades adultes/âgés entre 12 et 14 mois.