Troubles nerveux

2520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un sepsis leur est provoqué par chirurgie, certaines subissent en plus une section du nerf vague, puis des tests comportementaux d'anxiété et de mémoire que le porteur ne nomme pas précisément et des prélèvements sanguins, avant la mise à mort et le prélèvement de plusieurs organes. Le porteur décrit un "comportement maladie" avec baisse d'activité, poil hérissé et diarrhées, et un suivi longitudinal sur neuf mois. Il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et renvoie à des immunothérapies et biomarqueurs seulement espérés.

Objectifs

Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30-50% des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétal majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la gestion et le pronostic des patients atteints de sepsis. Le vieillissement de la population et la prise en charge fréquente en réanimation de patients ayant des critères de fragilité, en particulier neurocognitif, rendent pertinent et nécessaire la réalisation d’une telle recherche.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle des interactions neuro-immunes dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigües et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la gestion et le pronostic des patients atteints de sepsis. Le vieillissement de la population et la prise en charge fréquente en réanimation de patients ayant des critères de fragilité, en particulier neurocognitif, rendent pertinent et nécessaire la réalisation d’une telle recherche.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Induction chirurgicale d’un sepsis sous anesthésie et analgésie avec traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) + Tests de comportement sur animal vigile pour évaluer le degré d'axiété, la mémoire spatiale à court terme et à long terme (3 tests, durée environ 2h par animal sur 2 jours, 1 à 3 fois sur une période de 9 mois) + Prélèvement sanguin sous anesthésie (2-3 minutes/animal, 1 à 3 prélèvements selon les groupes) et euthanasie selon une méthode réglementaire pour analyse. 2-Modulation de la réponse immunitaire (par injection intraveineuse ou intrapéritonéale soit d’anticorps soit de petite molécules diminuant spécifiquement des populations de cellule immunitaire) + Induction chirurgicale d’un sepsis sous anesthésie et analgésie avec traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) + Tests de comportement sur animal vigile pour évaluer le degré d'axiété, la mémoire spatiale à court terme et à long terme (3 tests, durée environ 2h par animal sur 2 jours, 1 à 3 fois sur une période de 9 mois) + Prélèvement sanguin sous anesthésie (2-3 minutes/animal, 1 à 3 prélèvements selon les groupes) et euthanasie selon une méthode réglementaire pour analyse. 3-Section chirurgicale du nerf vague (vagotomie) sous anesthésie et analgésie (durée 20-30mn/ animal 1 fois) + Induction chirurgicale d’un sepsis sous anesthésie et analgésie avec traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) + Tests de comportement sur animal vigile pour évaluer le degré d'axiété, la mémoire spatiale à court terme et à long terme (3 tests, durée environ 2h par animal sur 2 jours, 1 à 3 fois sur une période de 9 mois s) + Prélèvement sanguin sous anesthésie (2-3 minutes/animal, 1 à 3 prélèvements selon les groupes) et euthanasie selon une méthode réglementaire pour analyse. Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Concernant les modèles de sepsis, ils peuvent potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associées à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 heures. Concernant les procédures chirurgicales, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Les tests comportementaux et prélèvement sanguin pourront également entrainer un léger stress/inconfort lors de leur réalisation.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales pour prélèvement multi-organes et analyses afin de répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Un système vivant intégré est nécessaire pour étudier l’interaction physiopathologique entre les acteurs mis en jeu dans le développement des troubles cognitifs associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico. Pour répondre à des questions mécanistiques et pour extrapoler nous résultats à d’autres conditions inflammatoires nous utiliserons des expériences in vitro à partir de culture de cellules primaires afin de ne pas avoir recours à un nombre excessif d’animaux.

Réduction

La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée, considérés comme le standard dans le domaine de recherche. - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes (plutôt que stratégie de comparaison multi-groupe) de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les souris seront utilisées pour différents types d’analyses pour exploiter au maximum chaque individu afin de répondre à la question scientifique. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer (les différents types de tests comportementaux donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé pour limiter les variations du au fond génétique. Cependant, de nombreux facteurs influencent les résultats des expériences individuelles, notamment les micro-organismes colonisateurs (microbiome intestinal), le sexe, etc. En répétant les expériences, nous réduirons la possibilité de publier des résultats erronés. De plus, comme les humains atteints de sepsis sont très variables, nous pensons que pour être pleinement pertinents sur le plan clinique, nos résultats doivent être capables de résister à certaines des légères variations de conditions qui peuvent survenir entre les expériences individuelles. Nous utiliserons un maximum de 2520 animaux sur la durée du projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, traitement antibiotique, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (suivi longitudinal de score de sévérité clinique pour les expériences de sepsis, point limite justifiant euthanasie) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, traitement antibiotique, etc.) assurés par un personnel qualifié et formé en continue. Les animaux sont hébergés dans les conditions conformes à la réglementation avec alimentation et abreuvement à volonté. Un enrichissement de l’environnement est assuré en continue.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris Mus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons: - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Disponibilité des éléments d’exploration cognitifs (plateforme d’exploration comportemental et cognitive) - Large disponibilité des réactifs adaptés dans le commerce - Expérience des investigateurs sur ce modèle. Nous utiliserons des souris commerciales et plusieurs modèles transgéniques disponibles en interne développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu entre 6 à 12 semaines. En effet, avant l’âge adulte le système immunitaire est considéré comme immature et la validité des résultats obtenus. Au-delà de 20 semaines, les souches génétiquement modifiées que nous utilisons peuvent déjà présenter spontanément des signes de déclin cognitif. Aussi souhaitant étudier l’impact de la réponse immuno-inflammatoire d’un sepsis chez l’adulte à la phase préclinique de troubles cognitifs le sepsis sera induit chez des animaux jeunes adultes (6-12 semaines). En fonction de la question scientifique, nous analyserons les animaux à 3 temps : 3 jours après l’induction du sepsis, à 6 mois ou 9 mois d’âge. Ces 3 temps sont nécessaires car ils explorent différents stades de la maladie, correspondant à des profils d’activation immunitaires potentiellement distincts. Justification du sexe : Nous suivrons également les recommandations internationales d'utiliser des mâles et des femelles pour les études sur les animaux. Pour les études dans lesquelles nous n'observons pas de différences de résultats entre les souris mâles et femelles, nous effectuerons un total de 2 analyses. Pour les études dans lesquelles il existe des différences substantielles entre les résultats des souris mâles et femelles, nous effectuerons l'expérience deux fois dans chaque sexe.

1430 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Durant leurs cinq premiers jours de vie, les souriceaux reçoivent deux fois par jour des injections d'une molécule inflammatoire, ce qui provoque déshydratation, retard de croissance et, dans 5 à 10 % des cas, une hémorragie interne ou la mort, pour modéliser les lésions cérébrales de la grande prématurité. Le porteur reconnaît un stress lié à la séparation d'avec la mère et une mortalité intégrée au calcul des effectifs. Il justifie l'euthanasie des animaux à divers âges par le prélèvement du cerveau et du sang, et affirme que l'étude "n'est envisageable qu'in vivo".

Objectifs

La prématurité définit les naissances ayant lieu avant 37 semaines d'aménorrhée et est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection materno-foetale (par exemple, les infections urinaires ou vaginales) et naissance prématurée a été mis en évidence, avec une incidence 2 à 4 fois plus élevée d’infections materno-fœtale liées à une naissance prématurée. L’infection induit une inflammation systémique pouvant se transmettre au fœtus, atteindre sa circulation sanguine puis son cerveau et entraîner des lésions cérébrales. Ces lésions chez le prématuré peuvent mener à des troubles du développement, en particulier les troubles autistiques. La compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de ces lésions est nécessaire pour développer des traitements qui pourraient protéger le cerveau. Le but de ce projet est de comprendre le rôle des astrocytes, des cellules du cerveau, et leurs liens avec le système immunitaire, dans les lésions du cerveau observées chez les nouveau-nés prématurés. Comme la naissance prématurée est fréquemment causée par une infection entraînant l'inflammation, nous injecterons une molécule inflammatoire chez des souriceaux, et analyserons leur cerveau et les cellules immunitaires dans le sang.

Bénéfices attendus

Ce projet peut permettre de mieux comprendre comment l’inflammation dans le cerveau et dans le sang peut entraîner un développement cérébral anormal. La cause la plus fréquente de prématurité est l’infection maternelle (25 à 40% des cas) qui peut induire un syndrome inflammatoire fœtal ou néonatal pouvant causer des lésions cérébrales. L'infection maternelle peut avoir différentes causes (infections uro-génitales pendant la grossesse par exemple) et être associée à différentes situations à l'origine d'une inflammation périnatale (ventilation mécanique, dispositifs médicaux invasifs, effets indésirables liés à la prise de médicaments...). Le modèle murin utilisé reproduit les lésions cérébrales observées chez les prématurés. L’induction de l’inflammation pendant la première semaine de vie des souriceaux mime le syndrome inflammatoire sans intervention in utero chez la mère. La première semaine correspond à une période critique car elle est équivalente d’un point de vue neurodéveloppemental au 3ème trimestre de grossesse chez l’humain. D’où la pertinence de ce modèle dans l’étude des lésions des nouveaux nés prématurés. Les résultats obtenus pourraient donner des pistes sur de nouveaux traitements visant à protéger le cerveau immature des nouveau-nés prématurés, par exemple en agissant sur les cellules immunitaires dans le sang.

Procédures

Nous injecterons de l’Interleukine-1 beta (IL-1β qui est une molécule qui induit l’inflammation) ou un liquide contrôle (sans conséquences) à des souriceaux pendant leurs 5 premiers jours de vie. Il s’agira d’une injection intrapéritonéale (dans le péritoine, membrane qui recouvre la cavité abdominale). L'injection est rapide (quelques secondes) et effectuée par une personne compétente. Cela va induire une réaction inflammatoire qui mime celle des nouveaux nés prématurés. Ces injections auront lieu matin et après-midi les 4 premiers jours et une fois le matin le 5ème jour. Les animaux seront surveillés quotidiennement et utilisés aux stades d’intérêt pour les analyses, les animaux seront gardés au maximum pendant 2 mois. Les analyses seront effectuées au 3ème et 5ème jour après la naissance, lors du pic d'inflammation. Puis au 8ème et 15ème jour, correspondant à des phases importantes de maturation du cerveau. Enfin, à 60 jours après la naissance, correspondant au stade jeune adulte, pour des analyses sur le long-terme.

Impact sur les animaux

Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 3, 5, 8, 15 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvement de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie un type cellulaire particulier dans le cerveau appelé, les astrocytes, crucial dans les mécanismes liés à l’inflammation et au développement du cerveau. Les prélèvemets de sang permettront d'étudier les cellules immunitaires, impliquées dans la défense de l'organisme lors des infections. Les résultats des analyses cérébrales et sanguines seront mis en lien afin de comprendre les interactions cerveau/cellules immunitaires et de trouver des pistes thérapeutiques pour la protection du cerveau en développement.

Remplacement

L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral et sanguin requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance de l’activité cellulaire, comme la synthèse ou la dégradation de protéines. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle à plusieurs stades de développement. Ainsi, nous pourrions comprendre les dysfonctionnements dans un contexte anormal ou morbide suite à une perturbation, comme l'inflammation par exemple. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.

Réduction

Un nombre minimum d’animaux est nécessaire pour réaliser des tests statistiques fiables. Dans ce projet, il y a 4 groupes expérimentaux. Pour chaque groupe expérimental, 6 souris sont prévues avec 10% d’animaux supplémentaires compte-tenu de la mortalité probable induite par l’inflammation.

Raffinement

Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies avec de l'essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles gestantes proviennent d’une souche possédant d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux lors des injections. Pour les souris conservées jusqu’à 2 mois, le sevrage est effectué à la 3ème semaine de vie avec un maximum de 6 animaux par cage. Des grilles de scoring adaptées à l’âge des animaux permettent la surveillance, et l’atteinte de points limites : pendant le pic d'inflammation, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Ce modèle de souris a été choisi car il présente des lésions du cerveau et des troubles du comportement similaires à ceux observés chez les enfants prématurés atteints de troubles du développement cérébral. Il a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré de moins de 28 semaines, car un souriceau à 1 jour de vie correspond à un prématuré de 28 jours, par ailleurs, cette correspondance a l’avantage de ne pas impliquer d’intervention in utero. L’inflammation sera provoquée chez le souriceau entre le 1er et le 5ème jour de vie, stade correspondant au 3ème trimestre de grossesse chez l’homme. Cette stimulation mime ainsi le syndrome inflammatoire des nouveaux nés prématurés lors de cette période de développement critique. Pour les analyses, les animaux seront utilisés pour des prélèvements post-mortem au 3ème et 5ème jour de vie, qui correspondent au pic de l’inflammation dans le cerveau. Puis, une autre partie des animaux sera utilisée au 8ème et 15ème jour, qui correspondent à une phase importante de maturation du cerveau. Enfin, une partie des animaux sera utilisée au bout de deux mois (60 jours après la naissance) qui correspond au stade jeune adulte.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modèles d'une forme avancée de la maladie de Huntington, elles reçoivent des injections sous-cutanées quotidiennes puis des mini-pompes implantées chirurgicalement, et subissent des tests moteurs dont un test de "clasping", tandis que la maladie leur fait perdre jusqu'à 30 % de leur poids et raccourcit leur vie à quinze semaines. Le porteur justifie leur mise à mort par le "besoin" de prélever les tissus cérébraux pour l'analyse histologique. Il retient la souris pour l'étude de la huntingtine dans un "organisme entier" et présente le projet comme répondant à un "besoin médical non pourvu".

Objectifs

A la suite d’une étude sur un système cellulaire permettant l’analyse du trafic intracellulaire des neurones, une molécule s’est révélée capable de restaurer la dynamique intracellulaire déficiente dans la maladie de Huntington, révélant également un fort intérêt thérapeutique dans un modèle souris de la maladie. L’objectif de ce projet est maintenant de confirmer l’efficacité du traitement dans un modèle de souris avec des symptômes moteurs sévères, classiquement utilisé dans le monde pharmaceutique, afin de se rapprocher de la réalité des patients. Ces nouveaux résultats permettront ainsi de comparer l’efficacité du candidat médicament et de ses dérivés actifs avec les molécules concurrentes actuellement en phases cliniques et atteindre ainsi un niveau de preuve supplémentaire pour aboutir à son développement préclinique.

Bénéfices attendus

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs, mentaux et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès. La maladie est causée par une mutation du gène de la huntingtine, elle-même à l’origine d’un défaut d’un facteur de survie neuronal essentiel. Le projet présenté a pour objectif de confirmer l’intérêt thérapeutique du candidat médicament identifié et de ses dérivés actifs par des approches comportementales. Très concrètement, les résultats du projet permettront de, premièrement, valider que l’administration du médicament possède un intérêt thérapeutique dans un modèle de souris aux symptômes moteurs sévères et deuxièmement, d’évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes, ou les ralentir. Ces résultats permettront le développement clinique de la première molécule ciblant les causes de la maladie de Huntington avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.

Procédures

Un acte expérimental impliquera d’éventuelles nuisances mineures à l'animal : lors de notre étude de l'efficacité du traitement sur les animaux modèles de la maladie de Huntington, le traitement des animaux sera réalisé par voie sous-cutanée. Durant les 3 premières semaines du traitement, la molécule sera quotidiennement administrée par injection sous cutanée dans l’espace interscapulaire de l’animal vigile. Puis, durant les 4 semaines suivantes, les injections quotidiennes prendront fin et la molécule sera délivrée grâce à des petites pompes implantées sous la peau de l’animal. Ces pompes sont spécialement fabriquées pour l’usage animal et permettent de perfuser le médicament de façon continu . Les animaux seront opérés sous anesthésie générale (procédure courte de 15-20 minutes par animal). Du fait du caractère superficiel de cette chirurgie cutanée, une douleur légère de courte durée sans incidence sur le bien-être ou l’état général de l’animal est attendue. Cette douleur sera prise en charge par injection d’analgésique (Carprofène, 5mg/kg, sous-cutané) en post-opératoire, associée à une surveillance accrue de l’animal sur 24h. Une reprise du traitement par injection sous-cutanée, une fois la mini-pompe vide, sera conditionnée au bon état général des animaux alors. Enfin, des tests comportementaux destinés à apprécier les fonctions corticospinales, neuromusculaires et locomotrices des animaux seront réalisés à 10 semaines d’âge (soit 5 semaines après le début du traitement). A ces fins, trois tests comportementaux sont envisagés, deux se feront sur une journée chacun, un sur trois jours. Au total, l’ensemble de ces tests comportementaux s’étalera sur dix jours. De plus, un test de clasping sera réalisé en complément des tests comportementaux toutes les 2 semaines à partir de 7 semaines d’âge, en raison de la nature non invasive de la manipulation, et ceci afin d'évaluer l'évolution des symptômes cognitifs.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans la procédure est un modèle largement utilisé dans lequel les manifestations de la maladie (= phénotype) sont cliniquement observables. Le phénotype de ces souris s’accentue progressivement avec l’âge et est considéré comme dommageable entre 9 et 11 semaines d’âge. Les premiers symptômes moteurs apparaissent à l’âge de 5-6 semaines et les symptômes mentaux dès 3 semaines. Ces souris récapitulent les caractéristiques de la maladie humaine avec des mouvements désynchronisés, involontaires et répétés (stéréotypie), des tremblements et une démarche irrégulière. Tout comme chez les patients Huntington, l’histoire naturelle de la maladie dans ce modèle entraine une perte de poids constante, progressive – et indépendante de la prise alimentaire – entre 9 semaines d’âge et jusqu’à la mort de l’animal attendue entre 12 et 15, pouvant aller jusqu’à 30%. Hormis ce phénotype, nous pouvons attendre une gêne supplémentaire de nature interventionnelle : induction d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études histologiques approfondies et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Il a précédemment été démontré sur un modèle cellulaire que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie de Huntington. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. La seconde étape consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie de Huntington. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de la maladie de Huntington.

Réduction

Pour notre procédure, afin de caractériser le candidat médicament, nous utilisons le minimum d'animaux nécessaire pour assurer des analyses quantifiables et reproductibles.

Raffinement

Lors de la pose de mini-pompes sous-cutanées, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue pendant et après l’opération. Un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fourni par l'animalerie sera ajouté lors du temps de récupération. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude et particulièrement dans les heures suivant la chirurgie ou le traitement par le personnel compétent, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la huntingtine au sein d’un organisme. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Ce modèle de souris de la maladie de Huntington mime les formes avancées de maladie qui présentent de graves symptômes. En effet, les animaux se développent normalement mais ont une espérance de vie drastiquement raccourcie par rapport à des souris non malades (de l’ordre de 15 semaines pour le modèle Huntington contre 96 semaines pour des souris non malades) en raison de l’apparition de symptômes dès l’âge de 5 semaines . Les troubles sont d’ordres mentaux et moteurs et s’intensifient progressivement au fur et à mesure que la maladie progresse. Par conséquent, afin d’observer des effets bénéfiques de nos médicaments, les animaux seront traités dès l’âge de 5 semaines, âge auxquels les atteintes pathologiques sont peu importantes et réversibles.

840 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un gavage quotidien d'antibiotiques pendant vingt-huit à cinquante-six jours pour détruire leur microbiote intestinal, un hébergement individuel, des prises de sang mensuelles et un test d'activité, avant une ponction du cœur sous anesthésie. Le porteur décrit une dysbiose provoquant constipation, perte de poids, troubles cognitifs et anxiété, aggravée par un isolement qu'il reconnaît lui-même comme source d'anxiété. Il teste pour un partenaire privé un composé à base de Queuine contre les maladies neurodégénératives, et affirme le modèle in vivo nécessaire là où l'in vitro ne suffit pas.

Objectifs

Actuellement, de nombreuses preuves tendent à indiquer qu’une défaillance du microbiome intestinal altérerait le fonctionnement du système nerveux central et pourrait être liée à l’origine de pathologies neurodégénératives les plus répandues dans le monde telles que les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Les bactéries présentes dans la flore intestinale jouent un rôle important dans la production de plusieurs molécules essentielles dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme. En effet, une fois synthétisées au sein du microbiote, ces molécules sont ensuite distribuées vers plusieurs organes tels que le cerveau. Ces observations ont donc mis en évidence des voies de communication entre les intestins et le cerveau. Parmi ces molécules, la Queuine, une base azotée uniquement synthétisée par le microbiote intestinal et/ou fournie par l’alimentation, jouerait un rôle prépondérant dans l’apparition de pathologies du système nerveux central (SNC). Afin d’étudier l’effet de molécules telles que la Queuine sur le SNC, ce projet a pour objectif de tester l’efficacité d’un composé à base de Queuine ou d'autres molécules similaires sur un modèle in vivo de dysbiose chez la souris C57Bl6 également soumises à une alimentation spécifique. Pour cela, les souris suivront une antibiothérapie quotidienne, par voie orale, visant à détruire le microbiote intestinal qui sera associé à un régime alimentaire spécifique sur une durée de 1 ou 2 mois. Une partie de ces souris seront administrée par voie orale avec un composée supplémenté en Queuine ou autres molécules. Les souris subiront une analyse comportementale à partir du test de l’open field (OFT) mesurant l’activité locomotrice spontanée et estimant indirectement les comportements associés à l’anxiété. Des prélèvements de sang mensuels et terminaux seront effectués pour mesurer la biodisponibilité des molécules d'intérêts libérées par le microbiote intestinal et/ou des candidats médicaments dans le plasma. De même, la présence de bactéries sera contrôlée suite à des prélèvements mensuels de fèces afin d’évaluer l’efficacité de l’antibiothérapie sur la destruction du microbiote intestinal. À la fin du protocole, après une ponction intracardiaque de sang, ces mêmes souris subiront un prélèvement de l’intestin, du foie et de l'encéphale afin de comparer les effets du candidat médicament sur les caractéristiques histologiques et moléculaires principales de la dysbiose et de certaines pathologies neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de la dysbiose sur le SNC et notamment le rôle joué par la Queuine, molécule issue du microbiote intestinal et/ou de l’alimentation, sur 1) les troubles de la locomation et des troubles associés à l'anxiété 2) sur les caractéristiques cérébrales histologiques et moléculaires associées à certaines maladies neurodégénératives. Ce projet permet également de tester l’efficacité d’un candidat médicament sur les troubles du comportement associés à la dysbiose, et sur les caractérisques histologiques et moléculaires de plusieurs organes.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des souris mâles (âge : 15 semaines) sont soumises à une administration quotidienne sur 28 ou 56 jours, par gavage oral, d’un mix de 4 antibiotiques et d’1 antifongique solubilisés dans l’eau stérile afin d’induire une dysbiose intestinale (durée de l’acte de gavage : 1min/souris). Pour certains de ces animaux, le composé médicament, mélangé avec la solution contenant l’antibiothérapie, est également administré quotidiennement par gavage durant 28 jours. Après le début de l'antibiotérapie, les souris sont disposées de manière individuelle par cage pour la reste du protocole (i.e., 28 ou 56 jours). La seconde intervention consiste à des prélèvements de sang (50-100 μl) mensuels (environs 1-2min/souris) sur souris vigiles au niveau de la veine submandibulaire (à J0 uniquement et/ou à J28 selon le groupe expérimental) ainsi qu’à des prélèvements de fèces mensuels (à J0, J28 et J56 selon le groupe expérimental) pour lequel les souris sont placées dans une cage propre durant une courte durée (environs 20 min). La 3ème intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris, mesurant l'activité locomotrice spontanée et les comportements associés à de l’anxiété à partir du test de l'open field à J28 et J56 (durée d’intervention : 20min environ). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 4% mix air et oxygène) avant la mise à mort des animaux (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 10min).

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’antibiothérapie permettant d’induire la destruction de la flore intestinale ainsi que l’administration quotidienne du composé se réalisent par gavage oral et peuvent générer du stress et des dommages au niveau du tube digestif. Par ailleurs, la dysbiose provoque un ralentissement de la prise de poids mais également ralentis les mécanismes moteurs de la digestion induisant ainsi de la constipation. L’antibiothérapie prolongée est également associée à des troubles cognitifs et de l’humeur et est source d’anxiété. L'isolement des souris est également une source importante d'anxiété. La perte de poids s’occasionne surtout durant les 4-5 premiers jours après le début de l’antibiothérapie. Cette dernière peut également conduire à la diminution de l’efficacité du système immunitaire augmentant les risques d’infections. Tout au long du protocole, les animaux sont mensuellement soumis à des prélèvements sanguins par ponction au niveau de la veine submandibulaire pouvant provoquer un écoulement sanguin persistant après le prélèvement. De plus, à la suite du prélèvement sanguin, les animaux sont isolés dans une cage propre durant 15 à 20 min afin de pouvoir récolter les fèces ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress. En fin de protocole, l'animal est de nouveau anesthésié afin de subir un prélèvement sanguin intracardiaque avant d'être mise à mort pour récupérer le cerveau, les intestins et le foie.

Devenir

Pour tous les animaux de la procédure, le protocole se termine par un prélèvement de sang terminal par ponction intracardiaque (1ml) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (4% induction et maintien) soit à J28 soit à J56 entrainant la mort par exsanguination suivi par une dislocation cervicale pour confirmer la mort afin de prélever les organes.

Remplacement

Des études précédentes ont montré que l’effet de la Queuine synthétique augmentait la survie de neurones dopaminergiques et corticaux dans des modèles in vitro des maladies de Parkinson et d’Alzheimer. Il est nécessaire maintenant de confirmer ces effets sur un modèle in vivo. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de maladies neurodégénératives dont l’origine provient d’une altération du microbiote intestinal, ainsi que d’en étudier les répercussions histologiques et comportementales associées. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes. De plus, le modèle in vivo de rongeur permet de moduler différentes variables impliquées dans l’altération du microbiote intestinal, à savoir le régime ou les compléments alimentaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (n=12) pour le projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8-10) utilisant un protocole d’antibiothérapie similaire au notre à l’exception de la fréquence de gavage qui est plus faible dans ce projet (1 par jour contre 2 par jour) sur demande du sponsor. Or un seul gavage quotidien d’antibiotiques semble diminuer l’efficacité de l’antibiothérapie pour détruire le microbiote ce qui pourrait augmenter l’hétérogénéité du modèle entre les souris. Par ailleurs, le taux de mortalité de ce modèle étant très peu reporté dans la littérature, il est difficile d’estimer réellement la mortalité de ce modèle. Ainsi, le faible recul de ce modèle au sein de l'entreprise nous pousse donc à choisir un N = 12 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux pour les groupes ne subissant pas d’antibiothérapie pourrait être réduit car la variabilité attendue sur les différentes analyses pourrait être plus faible. Ainsi cela représente 12 animaux par groupe expérimental (7 au maximum) avec 2 lots par an sur 5 ans, cela donne un total de 840 animaux au total (12 x 7 x 2 x 5).

Raffinement

Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures ainsi qu'aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Les administrations et prélèvements sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Pour l'administration de l’antibiothérapie : - les administrations se font par gavage pour limiter la déshydration des animaux liée à une aversion pour le goût des antibiotiques. Ce type d’administration permet de limiter la perte de poids. Afin de monitorer la perte de poids des animaux, les souris sont pesées toutes les semaines. Au cours de l’administration, le comportement et la déglutition de la souris sont surveillés avant que celle-ci ne soit remise dans sa cage et à nouveau surveillée. L’amphotéricine B est administrée pour prévenir de l’apparition d’infections opportunistes. Pour les prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire, le site de prélèvement est alterné entre la gauche et droite pour limiter la souffrance et le saignement est estompé par une pression sur la joue avec une compresse pour limite la perte de sang. Les prélèvements sanguins intracardiaques sont effectués sous anesthésie gazeuse et analgésie (30min avant l'acte). Si un des points limites et/ou d’arrêts sont atteints, les animaux sont soumis à une prise en charge adaptée ou mis à mort respectivement. Par ailleurs, trois sortes d'enrichissement seront mises en place dans les cages afin de limiter le mal être de la souris lié à l'isolement. De plus, les souris seront disposées dans des cages transparentes mises côtes à côtes pour qu'elles puissent se sentir et s'observer.

Choix des espèces

La souris, et particulièrement la souche C57Bl6, est l’espèce de référence dans l’étude des maladies du microbiote intestinal et permet d’établir de nombreux points de comparaison dans la littérature sur ce sujet. En effet, la souris est un mammifère omnivore possédant de grandes similarités avec l’Homme en termes d’anatomie et de physiologie du système digestif et intestinal. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la suite du projet pour le sponsor. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes souris adultes (15 semaines) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les pathologies liées à la dysbiose intestinale sont obtenus chez des souris jeunes adultes (>3-6 mois).