Troubles nerveux

2 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès un à deux jours après la naissance, elles reçoivent une injection de virus dans le cerveau ou dans une veine, puis, adultes, subissent des tests de mémoire reposant sur des chocs électriques aux pattes et des tests d'anxiété, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Wolfram. Le porteur met à mort tous les animaux pour prélever le cerveau et divers organes. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" car il serait le seul mammifère non humain à reproduire les signes neurologiques de la maladie dans un délai court.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de la maladie n’existe et seul le traitement des symptômes (diabète principalement) permet d’améliorer l’espérance de vie des patients. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique d'une thérapie génique via l'injection de particules virales. Cette injection devrait restorer les déficits de mémoire et d'anxiété chez un modèle souris du syndrome de Wolfram. Cette étude permettra la validation de notre stratégie de thérapie génique chez le modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Touchant plusieurs organes, le syndrome de Wolfram est une maladie complexe qui nécessite des approches combinées. En développant une thérapie génique unique, qui sera délivrée de manière intra-cérébrale ou via la circulation sanguine, nous espérons arrêter la progression de la maladie. L'efficacité de notre thérapie génique dans notre modèle souris du syndrome de Wolfram permettra, à terme, le développement clinique de la thérapie génique chez les patients.

Procédures

Les nouveaux nés, 1 à 2 jours après la naissance, seront exposés à différentes procédures: anesthésie, administration cérébrale ou intraveineuse de vecteurs viraux. Cette injection sera unique, et n'excèdera pas 15 secondes. Suite à ce traitement, des analyses comportementales de la mémoire et de l'anxiété de ces animaux seront testées (6 à 8 tests de 30min maximum).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront soit "légers" soit "modérés" suivant les actes. Les animaux auront, 1 à 2 jours après la naissance, une chirurgie, associée à une anesthésie, permettant l'injection de virus dans le cerveau ou dans une veine de la tête. Cette intervention pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Afin de tester leur mémoire, les souris, à 3 mois, recevront un choc éléctrique de faible intensité et de courte durée au niveau des pattes pouvant engendrer un léger stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter les structures du cerveau ainsi que divers organes. Cela permettra des analyses approfondies pour comprendre l'efficacité de notre traitement.

Remplacement

L'utilisation de modèles souris du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes neurologiques du syndrome de Wolfram dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet, les animaux utilisés en comportement seront ensuite euthanasiés et leurs organes périphériques et centraux collectés, complétant ainsi les groupes de souris pour les analyses tissulaires. Les croisements entre males et femelles seront optimisés afin de limiter le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Au quotidien, nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Lors des tests comportementaux, les animaux ne seront pas séparés de leurs congénères et placés 20min avant le début du test dans la pièce d'expérimentation afin de leur permettre une habituation au nouvel environnement. Après les tests comportementaux, les animaux seront directement remis dans la cage d'origine à l'écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Durant les périodes de tests comportementaux, les animaux seront pesés avant chaque test afin de permettre un suivi du poids, toute perte de poids supérieure à 15% entrainant la sortie de l'animal de la procédure. Une grille de scorage définissant les points limites sera mise en place suite à l'injection des particules virales sur nouveau né. Un antalgique sera administré avant toute procédure afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie touchant de nombreux organes, pour laquelle les altérations auditives et visuelles s'accompagnent de signes neurologiques et cognitifs. Seul un modèle robuste qui mime la pathologie humaine permet de tester et caractériser, au niveau fonctionnel et biologique, l'efficacité de notre traitement par thérapie génique. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement. Les procédures d'injection de particules virales seront effectuées 1 à 2 jous après la naissance afin de garantir une dissémination efficace. Les tests comportementaux ainsi que l'euthanasie des animaux se feront à 1mois, 3 mois et 6 mois pour permettre une vision de l'évolution du traitement dans le temps.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle dès l'âge de 20 jours, elles subissent une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, un placement en obscurité constante pendant deux à trois semaines et des chirurgies cérébrales avec ou sans réveil, injection d'un traceur dans l'œil ou d'un virus dans le cerveau, pour étudier les effets d'une exposition lumineuse à l'adolescence. Le porteur nomme l'isolement, la privation de lumière et la chirurgie comme sources de stress et de douleur. Il affirme que ces tests ne peuvent pas être menés in vitro et exigent des expériences à l'échelle de l'animal entier.

Objectifs

Depuis un siècle, l'éclairage environnemental est passé d'un rythme solaire naturel à un cycle lumineux artificiel et souvent irrégulier. Les sources d'éclairage moderne (LED) sont de plus en plus répandues et sont utilisées dans de nombreux appareils électroniques de notre vie courante (smartphone, tablette, etc...). Selon la fondation nationale du sommeil, 75% des enfants laissent un appareil électronique dans leur chambre quand ils dorment, et 60% des adolescents déclarent interagir avec leur écran durant l’heure précédant leur coucher. L’exposition à la lumière le matin a un effet bénéfique en synchronisant le système circadien avec le cycle environnemental jour/nuit, en augmentant la vigilance et la cognition et dans le traitement de la dépression. A l’inverse, une exposition anormale à la lumière (ALE), la nuit, altère nos rythmes biologiques, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Cet effet est médié par une cellule photosensible spécifique de la rétine : la cellule ganglionnaire à mélanopsine. Les adolescents sont très sensibles à divers facteurs de l’environnement, y compris la lumière. Ils représentent donc une population particulièrement à risque car 1) l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et 2) ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Ce projet propose une analyse multidimensionnelle allant de la cellule au comportement de l’animal. Nous proposons d'étudier si l'exposition anormale à de la lumière, pendant la période de l'adolescence, contribue à l’altération des fonctions circadiennes (rythmiques), affectives et cognitives à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet aura des résultats déterminants tant au niveau fondamental que clinique. Il permettra tout d'abord de décortiquer la relation entre une exposition aberrante à la lumière à l’adolescence et le développement des troubles circadiens / affectifs / cognitifs à l’âge adulte. A plus long terme, de nouvelles stratégiespourront être élaborées et proposées pour limiter les effets négatifs d’une surexposition à la lumière chez les adolescents.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de 20 jours d’âge et jusqu’à la fin de l’expérimentation (P20 à l'âge adulte, procédures 1-4). 2) Ensuite, à l'âge adulte, les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests seront réalisés d'un degré de sévérité légère à sévère et séparés les uns des autres d'au moins 48 h (procédure 1). 3) Les animaux subiront une chirurgie avec (procédures 2 et 4) ou sans réveil (procédure 3) . Différents groupes d'animaux seront définis. Un groupe d'animaux recevra une injection intraoculaire d’un traceur antérograde (procédure 2) sous anesthésie générale et locale renforcée si besoin et l'expérimentation durera environ 30 min ). Un second groupe d'animaux recevra, sous anesthésie générale, l’injection d’un virus en intracérébral (30 à 45 min) pour activer spécifiquement les neurones d'intérêt (procédure 4). Enfin, un dernier groupe sera anesthésié par voie générale afin de mesurer l’activité neuronale par éléctrophysiologie dans les structures cérébrales d’intérêt. Cette intervention durera entre 2 à 2h30, et est sans réveil (procédure 3).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Stress lié à l'isolement des animaux en cage individuelle à partir de 20 jours d'âge et jusqu’à l'âge adulte afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Stress lié à la réalisation d'une batterie batterie de tests comportementaux permettant d'évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests, réalisés chez les souris adultes, seront espacés les uns des autres de 48 h minimum et réalisés d'un degré de sévérité moindre à élevé. 3) Stress lié au placement des animaux adulte à l’obscurité constante pendant 15-20 jours . Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental). 3) Douleur éventuelle liée à la réalisation d'une chirurgie avec ou sans réveil et qunatifiée à l'aide d'une grille de score de la douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements de tissus post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d'évaluer l'impact d'une exposition aberrante à la lumière durant l'adolescence sur le système circadien, la cognition et l'humeur. Ces études ne pouvant êre reproduites in vitro, le projet nécessite la réalisation d'expériences dans un environnement intégral, à l'échelle de l'animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins sauvages et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.

Réduction

Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus sont réalisés chez le même animal, et certaines mises au point techniques seront réalisées en utilisant le même animal.

Raffinement

Durant toute la durée des procédures et afin de mesurer le rythme de l'activité locomotrice, les souris,à partir de 20 jours d'âge, seront placés individuellement dans des cages et mis dans une armoire avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent voir leurs congénères et ont aussi accès à leurs odeurs et bruits. De plus, pour palier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Un igloo ne peut être mis car il interfère avec le signal enregistré par les capteurs infrarouges pour mesurer l'activité. Les procédures utilisées sont de sévérité légère à sans réveil. Une grille de score de la douleur sera utilisée.

Choix des espèces

L’objectif du projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition aberrante à de la lumière bleue chez l’adolescence sur le système circadien, l’humeur et la cognition. Cette période de stimulation lumineuse aura lieu entre 20 à 40 jours d'âge (stades postnataux P20 à P40). L’impact de cette exposition sera ensuite évalué chez des animaux au stade adulte (entre 2 à 4 mois). Ce projet fait appel à un modèle murin sauvage et un modèle murin transgénique déficient en une opsine, la mélanopsine (Opn4-/-). Cette espèce a été sélectionnée car 1) elle est nocturne et sera comparée à une espèce de rongeur diurne et 2) elle permet d'accéder à un modèle transgénique déficient en mélanopsine, photorécepteur connu pour son implication dans le traitement de l'information lumineuse. Elle représente donc un modèle privilégié pour notre projet.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

130 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris âgées de 20 mois, choisies pour leur barrière hémato-encéphalique naturellement altérée, passent des examens d'IRM sous anesthésie, tandis que les rats subissent des examens de tomographie par émission de positons avec pose de cathéter, tous recevant cinq jours d'injections intrapéritonéales du peptide. Le porteur indique un stress lié aux anesthésies répétées et à la mise à jeun, et une surveillance accrue des animaux âgés plus sensibles. Il répète que l'expérimentation animale est "indispensable" et impossible à remplacer par des méthodes in silico ou in vitro, malgré des données in vitro déjà obtenues.

Objectifs

De nos jours, la maladie d’Alzheimer et le vieillissement cérébral sont des enjeux de santé publique majeurs. En effet, les maladies neurodégénératives et les pathologies entraînant une altération de la Barrière Hémato Encéphalique (BHE) ou une diminution de l’activité cérébrale peuvent entraîner de très importants déficits cognitifs. La spondine est une protéine spécifique du système nerveux central. Elle est active uniquement lors du développement cérébral et est impliquée dans la formation de nouveaux neurones. Dans ce contexte, un peptide dérivé de la spondine a été développé par le laboratoire comme nouvelle thérapie pour ces pathologies. Lors de tests préliminaires in vivo et in vitro, il a montré des effets bénéfiques, tels que l’augmentation de la résistance des couches de cellules des vaisseaux sanguins et l’amélioration de la transmission synaptique (amélioration de l’activité cérébrale). La présente étude vise désormais à évaluer l’effet de ce peptide in vivo sur : - l’intégrité de la BHE chez des souris âgées ayant une BHE altérée, par le biais de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec injection de produit de contraste. Le peptide devrait restaurer l’intégrité de la BHE et cela devrait être objectivé par le fait que le produit de contraste ne pénétrera plus dans le cerveau. - l’activité cérébrale métabolique de rats jeunes et âgés, par le biais de la micro-tomographie par émission de positons (TEP) avec injection d’un sucre radioactif. Le peptide devrait augmenter l’activité cérébrale et la transmission synaptique, ce qui entraînerait une augmentation de la capture de sucre marqué dans les régions cérébrales concernées.

Bénéfices attendus

Cette étude est nécessaire au développement préclinique du peptide médicament, et aura un impact majeur pour son développement clinique dans diverses maladies neurodégénératives et conditions qui présentent une altération de la BHE et une diminution de l’activité cérébrale qui mènent à des déficits cognitifs tels que dans la maladie d’Alzheimer ou le vieillissement. Récemment, le laboratoire a démontré in vitro que le peptide était capable (1) d’améliorer la transmission synaptique (i.e. la communication entre les neurones) et (2) de’renforcer l'intégrité de la BHE. Ce projet va alors permettre de vérifier que les propriétés du peptide qui ont été découvertes sur des modèles in vitro sont bien extrapolables à un modèle in vivo. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet auront donc un impact fondamental puisqu’ils pourront permettre de pousser plus avant le développement clinique du candidat médicament. À plus long terme, un des bénéfices majeurs de ce projet serait de pouvoir utiliser le peptide afin de traiter des patients présentant des déficits de la transmission synaptique et/ou un dysfonctionnement de la BHE. Ce type d’atteintes du système nerveux central ayant notamment été rapportées dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, ou encore du vieillissement normal et pathologique.

Procédures

Durée totale de la procédure 1 = 18 jours avec 4 examens d’imagerie (1h20 dont 40 minutes d’anesthésie par examen), et 5 jours d’injections quotidiennes d’un traitement en intra péritonéal. Durée totale de la procédure 2 = 18 jours avec 4 examens d’imagerie d’une durée de 30 minutes chacun, sous anesthésie générale, et 5 jours d’injections quotidiennes d’un traitement en intra péritonéal. Les animaux seront soumis à 4 examens d’imagerie sous anesthésie générale. Chaque examen TEP aura une durée totale de 1h20 dont 40 minutes sous anesthésie générale. Les rats seront mis à jeun 4h avant l’examen, puis ils seront soumis à une pose de cathéter veineux en condition vigile. Chaque examen IRM aura une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale. Les souris seront soumises à une pose de cathéter veineux. Dans les deux cas, les animaux (rats et souris) auront une administration quotidienne du traitement ou du véhicule en intra péritonéal pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

La dose du peptide médicament utilisée dans cette étude est très inférieure aux doses maximales ne présentant pas d’effet nocif observé dans des études toxicologiques réglementaires. Cependant, l’administration répétée du traitement en intrapéritonéal (IP), la mise à jeun pendant 4h lors des examens TEP, l’injection intraveineuse (IV) du radiotraceur chez l’animal éveillé (rat), l’injection IV de produit de contraste (souris), ainsi que l’induction de l’anesthésie peuvent entrainer un stress. D’autre part, les animaux âgés, pouvant être plus sensibles, feront l’objet d’un suivi plus étroit.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélever le cerveau en vue d'analyses immunohistochimiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Des études antérieures menées par le laboratoire ont permis de démontrer in vitro un effet bénéfique du peptide sur l'intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et sur la transmission synaptique. Bien que des brevets aient déjà été déposés pour chacune de ces propriétés, des résultats obtenus dans des modèles in vitro ne peuvent se substituer à une preuve de concept in vivo de l’effet de la molécule dans le cadre du développement d’un candidat médicament. L’expérimentation animale est donc indispensable si l’on veut pouvoir faire progresser le développement préclinique puis clinique de la molécule. Dans le cas de ce projet, il est donc impossible de remplacer les animaux par des méthodes in silico et/ou in vitro. Toutefois, la société a pris le soin de réaliser plusieurs études in vitro en amont afin de s’assurer de la robustesse de l’effet du peptide. Les principaux résultats de ces études sont les suivants : - le peptide promeut l'étanchéité et la résistance de monocouches de cellules endothéliales in-vitro. - le peptide améliore la transmission synaptique basale (activité cérébrale). Cela nous donne la garantie de réduire au maximum le risque que ce projet d’étude in vivo, bien qu’indispensable, soit effectué vainement.

Réduction

L’utilisation de méthodes d’imagerie permet un suivi longitudinal des animaux ce qui entraine une réduction notable des effectifs nécessaires à l’obtention de résultats significatifs, ceci augmenté par le fait que chaque animal inclus est son propre contrôle (diminution de la variabilité inter individuelle). Les inclusions des animaux seront faites séquentiellement et les résultats de chaque lot seront analysés avant de démarrer un nouveau lot. En TEP nous souhaitons avoir 5 rats jeunes traités avec le véhicule (qui serviront de groupe témoin et permettront de prendre en compte un potentiel effet du suivi longitudinal), et 10 rats jeunes traités avec le peptide. Ainsi que 5 rats âgés traités avec le véhicule, et 10 rats âgés traités avec le peptide. Nous prévoyons 5 rats âgés supplémentaires afin de prendre en compte les risques accrus liés à l’anesthésie. Cependant, la procédure sera finalisée dès que l’effectif de 15 rats âgés sera obtenu, ne nécessitant pas forcément de commander ces 5 rats supplémentaires. Toutes ces images seront analysées voxel à voxel et comparées à la baseline de chaque sujet. En IRM, nous souhaitons avoir 10 souris âgés traitées avec le véhicule, 10 souris âgées traitées avec le peptide et 5 souris jeunes traitées avec le véhicule. Nous choisissons un modèle d’altération de la BHE naturellement existant chez les souris âgées. Chez l’homme, 30% des individus présentent une BHE altérée à partir de 55 ans. Par analogie, nous estimons que 30% des souris testées pourraient être incluses dans le protocole. Cette étude étant prospective et n’ayant pas de certitude concernant le pourcentage d’animaux présentant une BHE altérée nous calculerons nos effectifs avec 20% des souris testées incluables. A nouveau, les inclusions des animaux seront faites séquentiellement et les résultats de chaque lot seront analysés avant de démarrer un nouveau lot. Si moins d’un tiers des souris testées présentaient une BHE altérée, le protocole serait immédiatement arrêté.

Raffinement

Les animaux arriveront à l’animalerie minimum une semaine avant le début du protocole pour une période d’acclimatation. Les souris seront hébergées par groupe de 6 et les rats par groupes de 5, ce qui leur permettra d’exprimer des comportements sociaux. Les mises à jeun nécessaires aux imageries TEP seront réalisées séquentiellement et dans une cage commune. De ce fait la mise à jeun sera précisément de 4h pour tous les rats sans stress supplémentaire lié à un isolement. Les imageries TEP et IRM seront réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec un monitorage continu du rythme respiratoire. Cette méthode d’anesthésie permet de régler finement et en temps réel la quantité nécessaire à la sédation de l’animal et limite les risques de surdose. Tout au long du protocole les animaux seront suivis quotidiennement avec une grille de score permettant de détecter précocement tout signe de mal être.

Choix des espèces

En IRM, la souris est choisie car sa taille est compatible avec les spécifications de la machine. Des souris de 20 mois seront incluses dans ce projet car elles présentent naturellement une rupture de la BHE, qui sera visible grâce à l’administration de produit de contraste. Les souris jeunes serviront de contrôle expérimental d’une activité cérébrale dite « normale » et d’une BHE intègre respectivement. Seuls les animaux âgés seront utilisés comme des modèles de « condition pathologique » chez lesquels l’efficacité de la molécule pourra être évaluée. Il est donc nécessaire d’utiliser un nombre d’animaux âgés suffisant pour pouvoir conclure quant à l’effet de la molécule d’intérêt. Le nombre d’animaux dits « contrôles » peut en revanche être réduit, ce qui explique le déséquilibre entre les effectifs d’animaux jeunes et âgés. En TEP, le recours au rat est indispensable. En effet, sur cette procédure on ne cherche pas à observer un effet global mais à identifier quelles zones cérébrales sont impactées par le traitement, il est donc plus favorable de faire l’étude sur un cerveau de plus grande taille. Des sujets jeunes (2 mois) et âgés (20 mois) seront inclus dans ce projet. Il est nécessaire de recourir à des rats jeunes et âgés pour évaluer l’activité cérébrale métabolique à l’état basal en fonction de l’âge et évaluer l’effet du peptide dans ces deux conditions. En effet, des études electrophysiologiques in vitro antérieures ont montré une augmentation de l’activité synaptique en présence du peptide.

1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé dans leur veine jugulaire pour qu'ils s'auto-administrent une drogue lors de dizaines de séances de six heures, certaines associant la prise à des chocs électriques sur les pattes pour mesurer jusqu'où ils la poursuivent. Le porteur qualifie ces chocs de "légers" et rappelle que l'animal peut à tout instant cesser de répondre, les rats étant tués pour analyses moléculaires. Il affirme que ce type d'étude de l'addiction ne peut être mené que sur un animal vivant aux réseaux neuronaux intacts.

Objectifs

L’addiction est une maladie comportementale et psychiatrique chronique pour laquelle il n’existe pas de traitements efficaces et qui apparaît chez certains consommateurs de substances d’abus. Afin de trouver des stratégies thérapeutiques efficaces, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’apparition de cette pathologie. Pour cela, ont été développés chez les rongeurs, des modèles d’addiction, qui miment les critères de diagnostics de l’addiction chez l’Homme, comme, par exemple, leur incapacité à limiter la recherche ou la prise de drogue malgré des effets désagréables. Ce projet a pour but de mimer et caractériser cette difficulté à contrôler la consommation de drogues malgré les conséquences négatives associées à cette dernière. Dans un modèle d’addiction chez le rat, nous nous focaliserons sur la capacité individuelle des rats à contrôler leur prise de drogue quand celle-ci est associée à des effets désagréables. Pour étudier cette vulnérabilité individuelle, nous utiliserons une approche qui permet de déterminer l’effet désagréable maximal qu’un rat est prêt à recevoir pour obtenir des injections de drogue et ainsi déterminer un seuil de vulnérabilité à développer une addiction pour chaque rat. Ce modèle servira donc à distinguer les animaux développant une addiction des animaux capables de contrôler leurs prises de drogues. Ce projet pourrait apporter une explication au fait que parmi tous les utilisateurs de drogues, seule une proportion devient addict, et perd le contrôle de sa consommation et de rechercher les mécanismes neurobiologiques impliqués. Ce projet vise à caractériser la distribution du comportement compulsif vis à vis de la drogue au niveau d’une population de rats et les informations obtenues seront utilisées dans le futur pour raffiner les prochaines expériences utilisant le même modèle.

Bénéfices attendus

Cette approche a plusieurs bénéfices. Notre procédure présente 2 avantages par rapport aux procédures traditionnelles : 1) elle « s’auto-ajuste », c’est à dire que l’intensité des conséquences gênantes de la prise de drogue s’adapte au comportement individuel de l’animal avec la possibilité d'arrêter la prise de drogue à des niveaux de stress très faible et éviter ainsi des stress de durée plus importante. Au contraire, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui est souvent plus élevé de ce que les rats auraient supportés s’ils avaient le choix. 2) elle permet de mesurer finement la résistance à la sanction en une seule session en déterminant le niveau maximal de sanction qu’un animal est prêt à supporter pour recevoir de nouvelles doses de drogue. En effet, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui permet une distinction entre les rats résistants et vulnérables à la punition. D’un point de vue plus général, les 2 variations de paramètres proposées nous permettent de se rapprocher de ce que l’on peut observer dans l’addiction chez l’Homme. En effet, l’utilisation d’un délai entre la prise de drogue et la punition (paramètre 2) nous permet de mimer le fait que, chez l’Homme, la conséquence négative n’est pas instantanée et arrive plutôt de façon décalée temporellement après la prise de drogue. L’autre paramètre (1), donne la possibilité de distinguer la recherche et la prise de drogue et nous permettra de caractériser plus facilement les différents mécanismes motivationnels sous-jacents à la persistance de la recherche et de la prise malgré des conséquences désagréables. La découverte des mécanismes neurobiologiques impliqués dans nos effets pourrait aider à une meilleure prise en charge de ces pathologies, tenant compte de la vulnérabilité / résistance individuelle aux effets désagréables associées à la prise de drogues.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Ils suivront ensuite tous des sessions d’entrainement d’auto-administration sans sanction pour développer un comportement de prise de drogue stable (15 sessions, 1 session par jour), 6h/ jour. Une fois le comportement opérant de prise acquis et stable, tous les animaux suivront des sessions d’auto-administration sans et avec sanction (6h maximum / session, 1 session / jour), 50 sessions. Ils suivront également des sessions d’auto-administration pour déterminer le niveau individuel de motivation de l’animal qui est le niveau de réponse maximale fournit par l’animal pour obtenir la drogue (1 session par semaine, 6h maximum / session), 10 sessions.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. - sanction / stress : Les stress délivrés lors des phases de sanction sont de légers stress au niveau des pattes des rats (sur la grille du sol des cages). Les stress utilisés ne sont pas d’intensité et/ou durée telle d’induire des conséquences négatives durables, les animaux pourront à chaque instant éviter le stress induit (et diminuer son intensité) en renonçant à répondre pour obtenir la drogue.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration avec et sans sanction, seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'une maladie psychiatrique telle que l’addiction aux drogues, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude de cette pathologie comportementale et psychiatrique nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques de type ANOVA et un calcul de puissance qui permet de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaires par groupe sera de 12. Nous estimons un ajout de 2 animaux par groupe dus aux pertes liées à la compléxité du geste des procédures chirurgicales (lors de l’insertion du cathéter dans la veine, la veine peut céder) ou liées à la durée du projet avec le risque que le catheter se bouche sur la longueur de la période d’auto-administration. Ainsi 14 animaux par groupe, seront nécessaires à notre étude. Avec 18 lots (9 lots mâles et 9 lots femelles) soit 1008 animaux au maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré par l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick de bois (pour répondre à leur besoin naturel de ronger) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 5 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

1 820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fixation crânienne ou un dispositif optique implanté sous anesthésie, puis un entraînement de plusieurs semaines à des tâches de mémoire spatiale dans un environnement virtuel, crâne immobilisé, avec enregistrement des neurones. Le porteur indique que les souris peuvent être soumises à un contrôle de la consommation de liquide, l'entraînement s'arrêtant si la perte de poids dépasse 20 %, et que tous les animaux sont tués faute de pouvoir être réutilisés ou adoptés. Il revendique le recours à l'animal comme "nécessaire", la modélisation informatique ne suffisant pas à étudier les mécanismes de la mémoire.

Objectifs

Comment le cerveau peut-il distinguer entre des souvenirs qui se ressemblent ? L’hippocampe est censé servir cet objectif en générant des représentations de mémoire qui ne se chevauchent pas. Au cours de la vie adulte, l’hippocampe est constamment alimenté avec de nouveaux neurones, ajoutant de nouveaux éléments qui s’intègrent dans le réseau existant. Comment les activités des neurones nouvellement produits et matures sont reliées au stockage et au rappel des traces mémorielles distinctes n’est pas bien compris. Lors du stockage de traces mémorielles, l’hippocampe est activé par des entrées synaptiques qui sont induites par les événements et les objets de l’environnement actuel. Pour créer une trace mémorielle de cet environnement, l’hippocampe doit sauvegarder ce motif d’activité. La théorie prévalente suggère que ceci est accompli en renforçant la puissance des synapses entre les neurones hippocampiques qui font partie de ce motif d’activité, créant ainsi un ensemble de neurones fortement connectés. Par conséquence, quand la mémoire doit être ravivée, l’activation même d’une petite partie de cet ensemble entrainera tous les neurones de l’ensemble. Une mémoire complète peut être reconstituée même par une petite partie de l’environnement original. Plusieurs niveaux neuronaux sont engagés dans ce processus. Les neurones individuels doivent correctement sélectionner les entrées synaptiques auxquelles ils répondent. Ensuite, les populations de neurones qui répondent à différents motifs synaptiques ne doivent pas se chevaucher. Il n’est pas bien compris comment ces processus sont réalisés à ces niveaux différents. De plus, nous ne savons pas quel rôle est joué par les cellules nouvellement produites lors du stockage et du rappel de traces mémorielles. Pour répondre à ces questions, nous allons combiner des nouvelles méthodes qui nous permettront d’enregistrer et manipuler l’activité neuronale lors de tests comportementaux. Ces expériences ont pour objectifs scientifiques de répondre aux questions suivantes : 1. Quels sont les comportements et les entrées sensorielles qui activent les neurones nouvellement générés et matures ? 2. Comment les souvenirs distincts sont-ils représentés au niveau des entrées synaptiques des neurones ? 3. Peut-on manipuler sélectivement l'activité des neurones nouvellement générés et matures pour établir un lien de causalité avec la formation, la consolidation, et le rappel de souvenirs distincts ?

Bénéfices attendus

Le rôle des circuits neuronaux dans le stockage et le rappel des souvenirs épisodiques a été largement étudié au cours des dernières décennies. Cependant, la manière dont l'activité des neurones et des circuits neuronaux assure une récupération robuste des souvenirs familiers tout en permettant un encodage flexible des informations nouvelles n'est toujours pas claire, en particulier lorsque les informations familières et nouvelles se ressemblent. Nous abordons ici cette question en utilisant une approche expérimentale et computationnelle combinée. L'originalité de notre proposition est que nous n'établirons pas seulement des corrélations entre l'activité neuronale et le comportement, mais que nous fournirons des liens de causalité en manipulant l'activité de populations neuronales fonctionnellement identifiées. Nos résultats fourniront également des prédictions vérifiables pour les études humaines et aideront à mieux comprendre comment le cerveau stocke les souvenirs épisodiques dans la santé et la maladie. La mémoire, élément fondamental de l'être humain, est tragiquement perturbée dans de nombreuses pathologies neurologiques, notamment dans la maladie d'Alzheimer. Les théories sur la façon dont les souvenirs sont formés et rappelés par les circuits neuronaux dans la santé et la maladie sont largement basées sur des preuves corrélatives. Notre projet fournira des preuves causales sur la façon dont l'activité neuronale dans les systèmes de mémoire du cerveau entraîne un comportement guidé par la mémoire. Ces données fondamentales sont essentielles pour comprendre comment ce processus est perturbé dans des états pathologiques tels que la maladie d'Alzheimer, où notre approche mécaniste peut aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Après publication, nos données seront mises à disposition dans un dépôt ouvert et publique afin que d'autres chercheurs puissent également bénéficier de nos résultats expérimentaux.

Procédures

Implantation d’une plaque crânienne ou d’un dispositif optique intracrânien d’une durée typique de 1h ; 1–2 gestes chirurgicaux par animal. Ces gestes chirurgicaux sont suivis d’une récupération de 1–2 semaines. Ensuite, entrainement des souris pendant 1—4 semaines dans un espace virtuel, composé de 5–10 séances d’enregistrement ou d’entrainement de typiquement 30–90 minutes (rarement jusqu’à 3 heures) par jour. Après l’entrainement, 1–3 séances d’enregistrement de l’activité neuronale jusqu’à 3 heures par jour pendant une période de 2–5 jours.

Impact sur les animaux

Ce projet peut rarement (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire car nous n’avons pas suffisamment d’informations pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la mémoire avec de la modélisation informatique. Pour obtenir ces informations, il nous faut donc employer des animaux qui effectuent des tâches de mémorisation. Les souris sont un modèle approprié pour ce projet, car elles peuvent être entrainées à des tâches de mémoire spatiale, elles produisent de nouvelles cellules nerveuses dans l'hippocampe, et elles sont accessibles à des techniques avancées d'enregistrement.

Réduction

Nous visons à utiliser le nombre minimal d'animaux qui sera suffisant pour obtenir des résultats expérimentaux valides. Les données d'une expérience peuvent être utilisées pour différents projets, par exemple, les données produites par des expériences d'intégration synaptique peuvent fournir des contraintes pour la construction d'un modèle informatique ; et les expériences électrophysiologiques in vivo peuvent à leur tour être suivies par des analyses morphologiques de la connectivité synaptique dans le même tissu in vitro. Nous allons utiliser des tests statistiques appropriés afin d'utiliser un nombre minimal de points de données pour fournir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux se justifie du fait de la faible taille des effets expérimentaux étudiés (nécessitant donc un nombre d’observations conséquent) et de la difficulté des manipulations réalisées (pertes techniques). L’environnement virtuel nous permet de finement et instantanément contrôler et adapter l’environnement suivant le comportement des animaux, ce qui n’est que difficilement possible dans des environnements réels. En plus, comme le crâne de l’animal est fixé, nous n’aurons pas besoin de miniaturiser les instruments d’enregistrement, ce qui nous permettra d’obtenir des enregistrements de haute définition avec peu de perturbations causées par le mouvement. Cela réduit la variabilité de nos données, nous permettant de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Les approches patch-clamp et l’imagerie calcique nécessitent une excellente stabilité et un mouvement minimal du cerveau pour pouvoir extraire des signaux qui sont près du seuil de bruit. Pour cette raison, la plupart des essais seront effectués sur les animaux à crâne fixé. Cela nous aidera également à réduire le nombre d’animaux, car nous augmenterons la fraction de données utilisables.

Raffinement

Nous avons mis au point des procédures de surveillance accrue, de soins post-opératoires, de mesures de gestion de la douleur, et d’entrainement des animaux qui ont été développées et raffinées pendant plusieurs années. Pendant les procédures chirurgicales, la profondeur de l’anesthésie sera surveillée en testant les réflexes et en enregistrant la fréquence de respiration. Un tapis chauffant sera utilisé tout au long de la chirurgie. Si possible, une chaufferette est positionnée en contact de sa cage d’hébergement pendant les premières 24 heures suivant la chirurgie. Des analgésiques pré-opératoires seront administrés. Du gel ophtalmique est appliqué. Des anti-inflammatoires oraux sont mélangés à du gel alimentaire et placés dans la cage de l’animal durant au moins 3 jours après la chirurgie. Pour les souris montrant des signes de douleur après la chirurgie, l’administration de l’analgésique sera renouvelée. Selon notre expérience, nous n’observons pas de douleurs au-delà de 3 jours après la chirurgie. Le comportement des animaux sera surveillé régulièrement après la chirurgie, en faisant attention à une activité réduite, une posture voûtée, une démarche anormale, ou une agressivité accrue. Les animaux seront observés durant les 48h qui suivent l’opération. Si les animaux sont soumis à un contrôle de la consommation de liquide, ils seront pesés régulièrement, et la restriction sera interrompue si la perte de poids dépasse 20% par rapport au poids pré-chirurgical. Les souris seront hébergées avec une litière appropriée et des matériaux de nidification dans un environnement enrichi avec des roues, des tunnels et des maisonnettes. Bien que les réponses sensorielles puissent être testées sous anesthésie, les médicaments d'anesthésie affectent l'activité dans les circuits neuronaux et peuvent fournir des résultats trompeurs. De plus, la majorité des expériences nécessite que l’animal effectue une tâche. Pour cette raison, les expériences se feront sur l’animal éveillé.

Choix des espèces

Les rongeurs sont probablement les espèces les plus éloignées phylogénétiquement pour lesquels une comparaison directe peut être faite avec la structure et le fonctionnement du cerveau humain. Notre modèle expérimental est la souris (C57B/6J wild type), qui est actuellement l'espèce de choix dans la plupart des domaines de la recherche biomédicale, car elle permet l'utilisation de techniques moléculaires puissantes. Cela a permis l'expression sélective de molécules, telles que des protéines fluorescentes, pour identifier des populations de neurones spécifiques au lieu d’enregistrer l’activité de neurones choisis au hasard. Ceci est un raffinement de nos méthodes qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Souris adultes, parce que nous nous intéressons à la neurogenèse dans l’organisme adulte, et au comportement dans l’organisme adulte. La croissance du crâne est alors largement terminée.

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale à la naissance puis, à l'âge adulte, une seconde intervention et une mesure par voltamétrie sous anesthésie, avant de recevoir du THC pour modéliser l'effet du cannabis sur la schizophrénie. Les rates nouveau-nées sont tuées dès le sevrage à 21 jours, les mâles gardés pour la suite puis tués pour contrôle histologique. Le porteur affirme que l'étude de la maladie chez des patients non traités est difficile sur les plans éthique et pratique, ce qui rendrait la modélisation chez le rat "irremplaçable".

Objectifs

La schizophrénie est une maladie neuropsychiatrique complexe qui apparaît à l'adolescence et au début de l'âge adulte, avec un risque plus élevé d'apparition chez les individus de sexe masculin. La schizophrénie est une maladie mentale très invalidante (1ère source de handicap et de suicide des 25-35 ans) touchant environ 1% de la population, évoluant dans +60% des cas vers un état chronique. Son coût global pour la société est considérable. Les causes et les mécanismes biologiques mis en jeu dans la schizophrénie ne sont pas entièrement compris. Actuellement, on considère que la schizophrénie résulterait de connexions défaillantes entre différentes régions cérébrales ayant pour origine une perturbation du développement cérébral, notamment au niveau du cortex antérieur. Ces connexions défaillantes pourraient contribuer au dysfonctionnement des neurones dopaminergiques ; il s’agit d’un groupe de neurones dont l’implication dans l’expression des symptômes schizophréniques est communément acceptée. Récemment, un certain nombre de travaux laissent penser que l’usage du cannabis peut précipiter l’apparition de la schizophrénie ou aggraver les symptômes caractéristiques de cette maladie aussi bien lors d’une consommation chronique, qu’aigüe. Il s’agit non seulement d’un problème de société actuel de première importance, mais aussi d’un problème de santé majeur en raison de la consommation croissante du cannabis dans la population des adolescents et jeunes adultes. L’abord de cette question chez les malades atteints de schizophrénie non-traités par des antipsychotiques, est très difficile à mettre en œuvre, tant sur le plan éthique que pratique, en raison même de la nature de la pathologie, ce qui rend la modélisation chez l’animal tout à fait irremplaçable. Le projet proposé a pour but de mieux comprendre l’impact de l’inactivation néonatale de la partie antérieure du cortex cérébral sur les réponses comportementales et dopaminergiques lors de l’administration du principal composé du cannabis pouvant induire des troubles psychotiques, le delta-9 tétrahydrocannabinol (THC), chez l'animal (rat mâle) jeune adulte.

Bénéfices attendus

Le projet proposé se situe dans le cadre d’une modélisation chez l’animal de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait permettre de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait contribuer in fine au développement de nouvelles approches thérapeutiques ; les traitements existants n’étant pas totalement satisfaisants.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 1)Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né (intervention unique ~15 min); 2) Intervention chirurgicale chez l’animal adulte (intervention unique 1h30 à 2h00); 3) Etude pharmacologique à l’aide de la voltamétrie in vivo (intervention unique~3h).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, les animaux sont soumis à deux interventions chirurgicales à l’issue desquelles ils peuvent ressentir de la douleur. Pour ce qui est de la chirurgie réalisée chez l’adulte, les animaux peuvent présenter une légère perte de poids variable selon les animaux. Pour la majorité d’entre eux le retour vers des valeurs normales s’observe au bout de 7jours. Lors de l’étude pharmacologique les animaux peuvent ressentir une légère douleur transitoire au niveau du site d’injection, due à l’aiguille, lors de l’administration de THC. Par contre, le THC lui-même n’est pas décrit comme induisant de douleur, ni de détresse. Les réponses comportementales mesurées sont les réponses spontanées de l’animal. Il n’y a donc aucun effort à fournir par l’animal lors de cette étude.

Devenir

Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né : Les nouveaux-nés femelles sont mis à mort lors du sevrage au 21ème jour, puis soumis à un contrôle histologique. Lors du sevrage, tous les animaux mâles sont gardés en vie pour être soumis à l’Intervention chirurgicale chez l’animal adulte, puis à l’étude pharmacologique. A l'issue de cette étude, tous les animaux adultes implantés sont mis à mort, puis soumis à un contrôle histologique.

Remplacement

La schizophrénie étant une maladie mentale se traduisant notamment par des troubles comportementaux, il n’y a pas de méthodes alternatives permettant de remplacer les protocoles mis en œuvre chez l’animal vivant, en situation comportementale, et en interaction avec l'environnement. En particulier, l’étude de l’apparition ou l’aggravation de symptômes schizophréniques suite à la consommation de cannabis (notamment de THC) sont très difficiles à étudier chez des malades non-traités, pour des raisons non seulement pratiques, mais surtout éthiques.

Réduction

Dans ce projet, le nombre total d’animaux, maintenu aussi faible que possible, est contraint par le nombre des animaux mâles nécessaires pour réaliser l’étude pharmacologique à l’âge adulte. En effet, pour des raisons de reproductibilité de l’expérience, et d’application du principe de réduction chez les animaux adultes, seuls les animaux mâles sont utilisés. L'utilisation des femelles nécessiterait l'utilisation d'un nombre d'animaux beaucoup plus important que celui proposé. Un nombre de 12 rats mâles par groupe a été déterminé à partir de travaux publiés concernant des études pharmacologiques du même type. Ce nombre apparaît nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment robustes d’un point de vue statistique. L’analyse statistique des résultats sera réalisée en prenant en compte la répétition des mesures dans le temps pour un même animal. Cette stratégie de mesures répétées, conduit grandement à réduire le nombre d’animaux mâles utilisés et, en déterminant le décours temporel des réponses, permet de raffiner l’analyse de celles-ci.

Raffinement

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre. Ainsi, les interventions chirurgicales chez le rat nouveau-né et chez le rat adulte sont réalisées à l’aide d’une anesthésie gazeuse ce qui permet de contrôler au mieux la profondeur de l’anesthésie. Des analgésiques sont aussi utilisés pendant la phase chirurgicale. Pendant la phase post-opératoire, chez le nouveau-né, la bonne cicatrisation de l’incision est suivie quotidiennement en même temps que la pesée des animaux. Chez l’animal adulte, pendant la phase post-opératoire d'au moins 7j, l'eau et la nourriture sont placés dans des récipients adaptés situés directement sur le fond de la cage afin de faciliter la récupération des animaux. Pendant cette phase de récupération post-opératoire les animaux recoivent un traitement analgésique. Les animaux sont aussi habitués à être manipulés. Des points-limites permettant de soustraire les animaux à une éventuelle souffrance ont été établis et feront l’objet d’une attention quotidienne (voire 2 à 3 fois par jour). Un suivi régulier de la littérature sera effectuée tout au long de ce projet pour identifier l’émergence de nouvelles procédures permettant de raffiner celles mises en œuvre dans le projet.

Choix des espèces

Une grande part, pour ne pas dire la majorité des études visant à modéliser chez l'animal la physiopathologie de la schizophrénie ont été réalisées chez le rat, notamment en raison de la grande homologie qui existe entre les réponses comportementales et pharmacologiques observées chez le rat et chez l'homme. L'ensemble des données acquises chez le rat constitue donc un cadre de référence justifiant le choix de cette espèce pour conduire notre projet. Les animaux (rats) nouveau-nés subiront une première intervention chirurgicale au 8ème jour postnatal qui représente un moment crucial du développement cérébral chez le rat, comparable à la fin du second trimestre de gestation chez l’homme, période qui est considérée comme une période de grande vulnérabilité au développement de la schizophrénie. Dans la mesure où la modélisation animale proposée concerne une pathologie (la schizophrénie) ayant une origine neurodéveloppementale, s’exprimant chez le jeune adulte, les animaux mâles ayant subi l'intervention néonatale seront ensuite utilisés à l'âge adulte (11 semaines) pour tester leur réactivité au THC.

1 632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un vecteur viral portant une forme humaine mutée de l'APP, la pose d'une fenêtre crânienne et une imagerie sous microscope tête fixée à l'état éveillé, avec des tests comportementaux nommés, reconnaissance d'objet et boîte clair-obscur. Le porteur décrit une douleur de trois à cinq jours après la chirurgie et un inconfort lié à la contention de la tête, et met au point ce modèle pour étudier le récepteur nicotinique dans la maladie d'Alzheimer. Il affirme que la souris est "irremplaçable pour l'instant" pour étudier ces circuits neuronaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neuro-dégénérative qui affecte principalement les personnes âgées et représente un problème majeur de santé publique, surtout dans les populations vieillissantes. Afin de pouvoir étudier les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à cette pathologie, différents modèles ont été développés chez la souris. Cependant, ces modèles présentent de nombreuses limitations, notamment pour l’étude des différentes étapes du développement de la maladie. Le but de ce projet est de mettre au point une nouvelle approche innovante pour étudier le stade précoce de la maladie dans le cerveau des souris, ainsi que pour explorer l’implication de structures cérébrales spécifiques dans son étiologie et enfin étudier le rôle du récepteur nicotinique dans la MA L’une des caractéristiques majeures de la MA consiste en l’accumulation du peptide beta-amyloïde (Aβ) qui est obtenu par clivage séquentiel de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein). Pour cette étude, nous avons construit un vecteur viral adéno-associé (AAV) qui exprime la séquence humaine de l’APP contenant des mutations pathogènes identifiées chez les patients ( « Swedish », « London » et « Austrian »). Il s’agit de mutations ponctuelles qui changent un seul acide aminé de l’APP humaine et augmentent la quantité du peptide Aβ produite. Au sein du cerveau des mammifères, les récepteurs nicotiniques sont constitués de 5 sous-unités protéiques α(2-7) et β(2-4) qui s’assemblent selon différentes combinaisons et donnent lieu à des récepteurs fonctionnels aux propriétés pharmacologiques et cinétiques diverses. Au cours de la MA, le nombre des récepteurs nicotiniques se trouve diminué et leur activité altérée. De plus, des données bibliographiques suggèrent une interaction entre certains récepteurs nicotiniques, notamment les sous-types contenant α7 ou β2, et l’Aβ. Tout d'abord, nous allons caractériser l’activité neuronale dans le cortex de la souris en présence et en absence de l'APP, chez les souris wild-type et chez des lignées de souris exprimant la protéine cre recombinase dans des populations spécifiques de neurones pyramidaux, et d'interneurones. Ensuite, pour identifier l’implication des différents sous-types de récepteur dans le développement de la MA, nous allons appliquer la même technologie des vecteurs AAV à des lignées de souris transgéniques .

Bénéfices attendus

L’utilisation de ces nouveaux modèles animaux devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes biologiques qui sous-tendent la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ils devraient faciliter l’étude de l’implication des récepteurs nicotiniques, plus particulièrement au cours de la phase précoce du développement de la maladie. Ceci pourrait permettre à plus long terme de développer et tester des médicaments pour lutter de façon précoce contre le développement de la pathologie..

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’injection du vecteur AAV contenant le gène de la protéine d’intérêt (durée estimée : 2 heures). Pour les animaux qui seront imagés sous le microscope à deux photons, l’indicateur calcique sera également injecté et une fenêtre crânienne pour l'imagerie chronique du cortex sera implantée au moment des injections (durée maximale de toute la chirurgie : 3 heures). Des tests comportementaux seront menés pour évaluer la mémoire (test de reconnaissance d’objet) et l’anxiété (boite claire obscure). En ce qui concerne le test de reconnaissance d’objet (RO), la préférence pour un nouvel objet nous permet d’estimer si la mémoire à court-terme est altérée et aussi de vérifier les capacités exploratoires et motrices des animaux ; la souris est placée dans une boîte pendant 30 minutes en présence d’objets. En ce qui concerne le test d’anxiété « clair-obscur » (CO), le dispositif expérimental se compose d'un petit compartiment noir et d'un grand compartiment blanc, connectés par un passage ; la souris est alors mise dans cet appareil pendant 30 minutes en libre exploration.

Impact sur les animaux

Nous estimons que les souris sont susceptibles de ressentir une douleur pendant les 3-5 jours après la chirurgie, pour laquelle nous administrerons des analgésiques. Habituellement, aucune perte de poids significative n'est enregistrée - les souris peuvent perdre jusqu’à 5% de leur poids initial dans les 24 heures suivant la chirurgie, mais ce poids est repris le lendemain. Pendant les premières 24 heures, des périodes de mobilité réduite peuvent aussi être repérées. Dans ces 3-5 jours qui suivent, nous remarquons que quelques animaux peuvent gratter un peu la zone immédiatement autour du ciment dentaire, mais ce comportement disparaît durant la première semaine de récupération. À part cela, nous prévoyons que la barre métallique qui est utilisée pour fixer la tête de la souris à la structure de support du microscope est une source supplémentaire d'inconfort. Néanmoins, après quelques jours (jusqu’à 2 semaines) la souris s’habitue et l’implant ne la gêne plus visiblement. Cette période de récupération après les craniotomies est cruciale et quelques problèmes peuvent être détectés, mais après 2 semaines, les souris ne manifestent plus de signes de stress, douleur ou altération d’activité. L'entraînement des animaux pour l’imagerie in vivo éveillée et leur habituation au microscope biphotonique est aussi susceptible de provoquer des nuisances. Après les premières séances d’entraînement, quelques souris sont plus stressées et leurs comportements sociaux peuvent devenir plus agressifs (pendant l’heure suivante). La préhension de la pièce métallique de la tête et la fixation de l'animal sont les étapes les plus stressantes et les plus inconfortables pour la souris, ce qui exige toujours la mise en place d'un protocole d'habituation minutieux.

Devenir

Toutes les procédures sont basées sur une injection de vecteur AAV localement dans le cortex pré-frontal (PFC). Il est essentiel pour l'analyse des données en imagerie et comportement de pouvoir confirmer la bonne qualité de l'injection, sa localisation précise, le volume du cortex couvert, et la quantité d'amyloide bêta produit. Les souris seront donc mises à mort, perfusées, le PFC coupé et analysé par histochimie.

Remplacement

Dans le cadre de cette étude il n’est pas possible de remplacer la souris par aucun autre modèle. Pour atteindre notre objectif d’identifier l’interaction entre l’amyloïde-beta et les récepteurs nicotiniques et son impact dans l’activité des neurones, il n'est pas possible d'utiliser des modèles mathématiques et bio-informatiques. Ces approches in silico peuvent seulement être utilisées à posteriori pour complémenter et modéliser les résultats in vivo. Il n’est pas non plus possible d'utiliser des lignées cellulaires ou des cultures de tissus, car celles-ci ne présentent pas la connectivité fonctionnelle requise pour ce projet. Concernant les organoïdes cérébraux, bien qu’ils commencent à être explorés pour analyser l’activité neuronale, les populations de neurones et l’organisation ne ressemblent pas à ceux du cerveau des mammifères en conditions physiologiques. Principalement pour étudier des circuits neuronaux axées sur le vieillissement et la neurodégénérescence, les modèles mammifères (comme la souris ou le rat) apportent des avantages significatifs et sont ainsi irremplaçables pour l'instant. De plus, notre étude implique des tests comportementaux s’intéressant à la mémoire, autre aspect critique de cette pathologie, qui ne peut pas être investigué par des études in vitro.

Réduction

L'estimation du nombre d'animaux à utiliser a été basée sur les résultats précédents obtenus avec ce modèle. Nous avons eu recours à des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir des résultats significatifs. Le projet inclut 3 procédures d'imagerie chez la souris éveillée. L'estimation des individus à utiliser a été réalisée sur la base du précédent projet et d'autres articles publiés, et adaptée selon les effets attendus dans chaque procédure. En outre, nos articles d'imagerie in vivo dans le cortex et des études comportementales précédentes ont confirmé notre calcul. Afin de garantir l'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, toutes les analyses post-mortem sur la caractérisation des lignées ou l’expression et distribution des protéines spécifiques, seront réalisées sur des animaux injectés et imagés précédemment. Sans compromettre l’obtention de résultats exploitables et fiables, seulement les expériences considérées comme indispensables seront réalisées et toutes répétitions inutiles seront éliminées. Pour utiliser moins d’animaux en expérimentation, nous allons aussi rédiger nos protocoles à l’avance et les optimiser. Chaque manipulation expérimentale sera planifiée dans le but de prévenir des problèmes éventuels, de décider des stratégies et de définir des critères d’interruption (« humane endpoints »).

Raffinement

Pour garantir que les animaux ne soient pas blessés et souffrent le moins possible, différentes mesures seront appliquées. Uniquement des souris adultes (8 semaines) seront soumises à des procédures chirurgicales et autant que possible les frères et sœurs resteront ensemble dans les cages, en groupe de 2 à 6. Les animaux seront injectés avec Buprenorphine 0.1mg/kg 30 min avant et l’analgésique local Lidocaïne (6mg/kg) 10 min avant la craniotomie. Durant les 30 min qui précèdent la chirurgie, les souris resteront sur un tapis chauffant. Pour une anesthésie profonde, on utilisera l’isoflurane. L’induction sera faite dans une chambre ventilée par un mélange d’isoflurane 4% et O2 2L/min. Pendant la procédure, les souris resteront anesthésiées sous un mélange d’isoflurane 1.5-2% et O2 0.6L/min. Leur température corporelle sera surveillée et maintenue à l’aide d’un tapis chauffant équipé d’une sonde rectale et la respiration et l’absence de réflexe de retrait de la patte seront également surveillées. Une solution saline isotonique (0.9%NaCl) sera chauffée et injectée à la fin – le volume dépend du poids de l’animal et de la chirurgie (lors de saignement nous injecterons plus). L’anti-inflammatoire Meloxicam 1mg/kg sera injecté 30 min avant la chirurgie pour prévenir la « soupe inflammatoire », et le jour suivant. Pour les 3 jours, la forme orale de Meloxicam 0.1mg/mL sera diluée dans une boite de complément alimentaire purifié Dietgel (7.5mL/souris/jour) et donnée aux souris. Pendant les 24 heures la souris restera dans sa cage sur un tapis chauffant pour empêcher une diminution brusque de sa température corporelle, garantir une meilleure récupération. Pendant les 5 jours, le poids, mouvement et comportement social des animaux seront surveillés de près, ainsi que la cicatrisation de la suture ou de la fenêtre crânienne. (Si la procédure chirurgicale a été correctement réalisée dans des conditions d'asepsie, aucune infection ne devrait se produire). Si aucun changement n'est remarqué ou si il y a une évidence de douleur ou un comportement anormal, des niveaux de surveillance seront mis en place. Si une souris souffre visiblement et reste en position prostrée, si elle a complètement cessé de manger ou s’il y a une perte considérable de poids (20% de son poids initial) la souris sera mise à mort. Chaque cage sera enrichie avec des petits cylindres de coton/morceaux de papier et un igloo en carton.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle rongeur disponible actuellement, car elle nous permet d’étudier plus profondément les circuits neuronaux. Elle est petite et relativement facile à gérer dans le contexte d’un laboratoire, par rapport à d'autres modèles mammifères plus complexes. Un autre atout de l'utilisation des souris est la vaste liste de boîtes à outils disponibles, ce qui permet d'optimiser les pipelines expérimentaux plus rapidement, réduire l’utilisation de ressources et identifier plus facilement des problèmes possibles (comme la douleur post-chirurgie). En effet, elle est classiquement utilisée pour des études de modification de l’expression des gènes (modèles transgéniques ou expression induite par un vecteur viral). De plus, la plupart des tests comportementaux utiles dans le cadre d’un projet étudiant la MA (comportements liés à une perte de mémoire ou à une dégénérescence des synapses due à l’accumulation de plaques amyloïdes dans le cerveau) ont été développés chez la souris. Les injections intracérébrales seront faites sur des animaux adultes, d’au moins 8 semaines, afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des injections. Les analyses fonctionnelles débuteront un mois après les injections, pour garantir que l’expression des vecteurs est assez élevée, et s’étendent jusqu’à 12 mois. Pour l’étude à long terme, les animaux seront également injectés à l'âge de 8 semaines, mais la fenêtre crânienne ne sera implantée qu'un an après l'injection de la protéine APP. Cela évitera que l'indicateur de calcium ne forme des agrégats et que la fluorescence ne s'estompe. Les études de comportement seront menées après vieillissement, à partir de 5 mois d’âge des souris, c’est à dire 2 mois après injection. Les mises à mort pour prélèvement des cerveaux seront effectuées après vieillissement, dans le cas du modèle AAV, qui nécessite un certain temps d’expression, jusqu'à 16 mois, procédure 2.