Troubles gastrointestinaux

Sensibilisées à des allergènes, exposées deux fois par semaine pendant six semaines par inhalation, prélevées chaque semaine, 5 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les modèles reproduisent l'asthme allergique, l'allergie alimentaire et la réaction anaphylactique, cette dernière pouvant faire chuter la température corporelle. Une trachéotomie terminale sous anesthésie clôt le protocole, sans réveil possible. Toutes les souris sont ensuite tuées pour prélever sang et organes.

Objectifs

Les maladies allergiques, qu’elles soient respiratoires (comme l’asthme allergique) ou alimentaires, sont en constante augmentation dans le monde, aussi bien dans les pays développés que dans les pays en développement. En France, on estime qu’environ un tiers de la population est concerné par au moins une forme d’allergie. Certaines de ces pathologies peuvent être graves, voire mettre en jeu le pronostic vital, comme certaines formes sévères d’asthme ou les réactions allergiques aiguës liées à l’ingestion de fruits à coque. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de prévenir efficacement les allergies ou d’en contrôler durablement les symptômes. Les mastocytes, qui sont des cellules du système immunitaire, jouent un rôle central dans les réactions allergiques. Leur activation, notamment via les immunoglobulines E (IgE), déclenche les phénomènes inflammatoires responsables des symptômes. Dans ce contexte, ce projet propose d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur l’utilisation d’anticorps humanisés ciblant les IgE. Ces stratégies seront étudiées dans différents modèles d’allergies majeures, incluant l’asthme allergique, l’allergie alimentaire et les réactions anaphylactiques. L’objectif est d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les allergies et d’identifier de potentielles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies allergiques, en particulier dans l’asthme allergique, les allergies alimentaires et les réactions anaphylactiques. Ces pathologies, fréquentes et parfois graves, représentent un enjeu important de santé publique. Le projet proposé permettra de mieux caractériser le rôle de certains acteurs clés du système immunitaire dans le déclenchement et l’amplification des réactions allergiques. Cette meilleure compréhension est indispensable pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À plus long terme, les connaissances acquises dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement d’approches thérapeutiques innovantes, visant à prévenir ou à mieux contrôler les réactions allergiques, et ainsi à réduire leur impact sur la qualité de vie et la santé des patients.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations (2x par semaine pendant 6 semaines) et les injections intra-dermiques (1x dans le modèle de PCA) se feront sous anesthésie gazeuse, (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation 20 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés en sub-mandibulaire sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine, avec alternance des joues de prélèvement (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec). Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale, après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale et sans réveil possible (procédure sans réveil).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures expérimentales et aux modèles d’allergie utilisés. Les administrations de traitements par injection peuvent entraîner une douleur aiguë de courte durée liée à la piqûre (quelques secondes) ainsi qu’un inconfort transitoire au point d’injection. Des nuisances spécifiques sont attendues en fonction des modèles d’allergie étudiés. Dans le modèle d’asthme allergique, l’exposition aux allergènes par voie respiratoire peut induire une gêne respiratoire transitoire. Dans le modèle d’allergie alimentaire, le gavage peut entraîner un stress de courte durée lié à la contention et à l’administration (environ 20 secondes). Ce modèle peut également provoquer des troubles digestifs (diarrhées, inconfort abdominal). L’induction d’une réaction anaphylactique peut entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Dans le modèle d’anaphylaxie cutanée, une inflammation locale (gonflement de l’oreille) est attendue, pouvant être associée à une sensibilité ou une douleur locale, difficilement quantifiable en l’absence de signes comportementaux marqués. Afin de limiter la douleur et le stress, plusieurs mesures seront mises en place. Les procédures potentiellement les plus invasives ou stressantes (notamment certains prélèvements sanguins et expositions par inhalation) seront réalisées sous anesthésie lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière permettant de détecter précocement tout signe de souffrance, et des critères d’arrêt seront appliqués si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci expériences in vitro ou méthodes alternitives ne permettent pas de reproduire la réponse systémique d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour certaines procédures, chaque souris sera son propre contrôle (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, un des tests statistiques suivants sera utilisé :1-way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et les conditions d'hébergement (enrichissement des cages avec des carrés de ouates, igloos...) seront également surveillées. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage de 500cm² en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Bien que des signes de douleur ne semblent pas apparaître dans nos modèles d’allergie, tout animal, présentant une douleur évidente (isolement, baisse importante de l’activité, perte de poids > 10%, pilo-érection et/ou grimace) sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Identifiées par un poinçon à l'oreille, traitées aux antibiotiques par quatorze gavages puis recevant des selles humaines par douze gavages supplémentaires, 60 souris vont être utilisées pour étudier l'effet du microbiote humain sur le foie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés, les pesées et le prélèvement sanguin à la queue provoquent stress et douleurs passagers. Toutes sont tuées à l'issue pour collecter leur sang et leurs tissus. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit les interactions entre microbiote transplanté et métabolisme du foie.

Objectifs

Des travaux précédents ont mis en évidence que : -chez l’Homme, plus l’accumulation de graisse dans le foie est sévère, plus le taux sanguin d’un métabolite, appelé ici X, est élevé ; -chez la souris, le métabolite X, lorsqu’il est administré par gavage, peut à lui seul provoquer l’accumulation de graisse dans le foie. Comme ce métabolite X est produit par le microbiote intestinal, nous souhaitons comprendre si le microbiote humain est directement responsable de sa production et donc de l’accumulation de graisse dans le foie. Pour répondre à cette question, nous allons réaliser des transplantations fécales chez la souris. Cela consiste à transférer le microbiote de donneurs humains (personnes en bonne santé ou patients atteints de foie gras, présentant soit de faibles soit de forts taux de métabolite X dans le sang) dans des souris dépourvues de leur propre microbiote. L’objectif est de vérifier si le microbiote humain suffit à reproduire chez la souris des taux sanguins similaires de métabolite X (faibles ou élevés) et s’il peut entraîner, selon l’origine des selles, une accumulation plus ou moins importante de graisse dans le foie. L’expérience comportera plusieurs étapes : 1. une phase d’acclimatation des animaux ; 2. une élimination du microbiote intestinal des souris grâce à un traitement antibiotique d’une semaine ; 3. la transplantation fécale, 4. un prélèvement de sang sous anesthésie pour mesurer les concentrations du métabolite X, suivi de la collecte des tissus nécessaires aux analyses.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de déterminer si le microbiote de patients avec la maladie du foie gras ayant des taux élevés de métabolite X peut, à lui seul, augmenter ce métabolite et provoquer une accumulation de graisse dans le foie chez la souris, comparé à des microbiotes de sujets sains ou de patients présentant de faibles taux. Cela établira un lien direct entre certaines bactéries, le métabolite X et les atteintes du foie. À plus long terme, ces résultats pourront guider le développement de stratégies visant à réduire les bactéries responsables de la surproduction du métabolite X, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour prévenir ou traiter la maladie du foie gras.

Procédures

Identification : les 60 souris recevront un unique petit poinçon au niveau de l’oreille pour permettre leur identification (durée : < 30 s, contention comprise). Traitement antibiotique : les 60 souris seront traitées pendant 7 jours consécutifs par un cocktail d’antibiotiques administré deux fois par jour (à 8 h d’intervalle). Chaque animal recevra donc 14 gavages (durée : ~30 s par gavage, contention comprise). Transplantation fécale : les 60 souris recevront des suspensions de selles humaines par gavage 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs (lundi, mardi, mercredi), et ce durant 4 semaines, soit 12 gavages par animal (durée : ~30 s par gavage). Pesées : les 60 souris seront pesées 2 fois par semaine sur toute la durée de l’étude, soit 10 pesées par animal (durée : ~30 s par manipulation). Analgésie et anesthésie : les 60 souris recevront une injection d’antidouleur (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie), suivie 30 minutes plus tard d’une injection d’anesthésiant (durée : ~30 s, 1 seule fois avant euthanasie). Jeûne : les 60 souris seront soumises à un jeûne nocturne avant la mise à mort afin de stabiliser les paramètres métaboliques et permettre au mécanisme identifié par lequel le métabolite induit un stockage de lipides de se mettre en place. Prélèvement sanguin : les 60 souris subiront une petite incision (< 1 mm) au bout de la queue permettant de recueillir quelques gouttes de sang (durée : ~1 min pour l’incision et le prélèvement).

Impact sur les animaux

L’identification par poinçonnement de l’oreille peut provoquer une douleur légère et transitoire. Le traitement antibiotique d’une semaine est susceptible d’entraîner une légère perte de poids. Les gavages induisent un stress et un inconfort temporaires. Les pesées génèrent un stress léger. Les injections nécessaires à l’anesthésie et à l’analgésie provoquent une légère douleur momentanée. La période de jeûne nocturne peut entraîner un inconfort supplémentaire, et le prélèvement sanguin à la pointe de la queue s’accompagne d’une douleur passagère. Aucun effet indésirable n’a été observé lors de protocoles similaires menés dans notre laboratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter le sang et les tissus nécessaires aux analyses.

Remplacement

L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’un microbiote humain à induire la production du métabolite X et à déclencher l’accumulation de graisse dans le foie. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre le microbiote transplanté, l’absorption intestinale, le métabolisme du foie et la régulation du métabolite X. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser le transfert des métabolites, la dynamique hôte–microbiote ni les conséquences. Le modèle souris reste donc le seul modèle pertinent pour établir un lien causal entre composition du microbiote, production du métabolite X et altérations du foie.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, en utilisant des données issues de protocoles antérieurs menés chez des patients atteints de la maladie du foie gras pour lesquels le métabolite X a été mesuré en circulant. Ce calcul indique qu’un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour détecter une différence significative entre groupes. Par ailleurs, un maximum de tissus sera prélevé et conservé lors de la mise à mort, afin d’être utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés dans le cadre de collaborations, permettant ainsi d’éviter la répétition inutile d’expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront surveillés cinq fois par semaine, avec un suivi individuel du poids à J0 et deux fois par semaine et une mesure de la consommation alimentaire deux fois par semaine par cage. Ces suivis réguliers permettront d’identifier précocement tout signe de perte de poids excessive. Les gavages seront réalisés exclusivement par du personnel expérimenté, afin de garantir un geste précis et rapide minimisant stress et inconfort. Une sonde souple sera utilisée pour les gavages pour réduire le risque d’irritation ou de lésion de l’œsophage. Après chaque gavage, chaque animal sera observé durant au moins 5 minutes pour vérifier l’absence de douleur ou de détresse. Les volumes administrés par gavages seront strictement limités au minimum compatible avec la procédure pour réduire l’inconfort. Un enrichissement supplémentaire des cages sera mis en place durant la semaine de traitement antibiotique, ainsi que pendant la nuit de jeûne, afin d’atténuer le stress et maintenir un comportement normal. Les antibiotiques seront administrés par gavage plutôt que dans l’eau de boisson, afin de préserver une prise alimentaire et hydrique optimale et d’éviter une perte de poids excessive durant la phase d’antibiothérapie. Une seule incision de moins de 1 mm à l’extrémité de la queue sera réalisée pour recueillir les quelques gouttes nécessaires à l’évaluation du métabolisme du sucre. Les volumes injectés pour l’anesthésie et l’analgésie seront réduits au strict minimum efficace. Avant le prélèvement sanguin final, les animaux seront anesthésiés par injection avec analgésie complémentaire. La mise à mort sera ensuite réalisée par dislocation cervicale. Enfin, des points limites prédéfinis et adaptés au modèle seront appliqués afin d’interrompre la procédure dès l’apparition de signes précoces de souffrance ou de détérioration de l’état général.

Choix des espèces

La souris constitue l’espèce la plus appropriée pour répondre à la question scientifique posée. En effet, elle permet de réaliser des transplantations fécales dans des conditions contrôlées et reproductibles, tout en offrant une physiologie de l’intestin et du foie bien caractérisée et comparable à celle de l’Homme. Les modèles souris sont de référence pour étudier les interactions hôte–microbiote, la production de métabolites d’origine bactérienne et leurs conséquences. De plus, les procédures de traitements avec les antibiotiques et de transplantation de selles humaines sont validés dans cette espèce, rendant la souris le modèle le plus fiable pour établir un lien causal entre microbiote humain, métabolite X et altérations du foie. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux ont terminé leur phase de croissance, présentent une physiologie stable et offrent une meilleure homogénéité des réponses. Par ailleurs, des souris de cet âge tolèrent bien les traitements antibiotiques nécessaires à l’élimination du microbiote, ce qui garantit la fiabilité et la reproductibilité du protocole.

Pour savoir si la chaleur aggrave la toxicité d'une mycotoxine présente dans près de la moitié des céréales, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont exposées quatre semaines à cette toxine par l'alimentation et placées dans une armoire chauffée à 32-35 °C, avec des mesures de glycémie après douze heures de jeûne. Le RNT décrit une baisse de poids, une respiration accélérée et une activité réduite sous l'effet combiné de la chaleur et du contaminant. La mise à mort sert à prélever le foie et l'intestin pour comparer les réponses des mâles et des femelles.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l’Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines sont produites par certaines moisissures et sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50 % des céréales et environ 80 % des individus y sont exposés. Le changement climatique qui implique une hausse des températures, bouscule le rythme naturel des cultures et modifie les périodes où les champignons peuvent les infecter, ce qui peut, selon les régions, augmenter ou réduire la présence de cette mycotoxine. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Le corps garde normalement une température assez stable, même si elle peut un peu varier. Quand il fait très chaud, il subit un stress thermique: cela perturbe son fonctionnement interne et modifie l’activité de nombreuses cellules. Pour se protéger, l’organisme déclenche une réaction de défense, qui se traduit par une hausse de la température corporelle, une plus forte sollicitation du cœur et une utilisation accrue du sucre comme source d’énergie. Même si plusieurs études montrent que le changement climatique peut faire varier la présence de cette toxine, aucune ne s’est encore penchée sur la façon dont elle pourrait devenir plus ou moins dangereuse pour les organismes vivants. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette toxine dans un contexte de forte chaleur et de caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l’intestin. Nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes d’exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à la chaleur potentialise les effets de cette mycotoxine. Les données expérimentales permettront d’évaluer l’impact d’une exposition combinée à la chaleur et à la mycotoxine sur le métabolisme général, ainsi que sur la santé digestive et hépatique. Les résultats attendus de ce projet présentent un enjeu important pour la santé publique, compte tenu de l’exposition chronique des consommateurs à cette toxine et de l’augmentation continue des températures associées au réchauffement climatique. Si les hypothèses sont confirmées, les données produites feront l’objet de publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’Homme.

Procédures

L’objectif de ce projet est d’étudier l’exposition chronique à une mycotoxine lors d’un stress thermique. Les animaux seront exposés à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines et/ou à une chaleur plus élevée que lors d’un hébergement standard (20-24°C) dans une armoire chauffante entre 32-35°C. Les animaux seront pesés une fois par semaine, ce geste dure 15 secondes. Une mesure de la glycémie et de la cétonémie sera réalisée 2 fois au cours de la procédure après 1 et 4 semaines d’exposition. Pour cela, les animaux sont mis à jeun pendant 12h, puis une goutte de sang sera prélevée. Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera effectué puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’exposition à une température ambiante de 32-25°C est susceptible d’induire une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l’activité locomotrice, une modification de la prise alimentaire ainsi qu’une augmentation de la consommation d’eau. Une légère perte de poids transitoire lors des 2 premiers jours ou des modifications du comportement peuvent également être observées. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention (15s) et une douleur ponctuelle liée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée entraîne des perturbations intestinales et hépatiques, tandis que l’exposition à la chaleur induit un stress thermique pouvant altérer le métabolisme du foie. . En effet, des tests in vitro sur cellules ont déjà été réalisé par le laboratoire pour étudier les effets des mycotoxines. Cependant ces modèles présentent des limites car ils ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier avec les interactions entre organes, ne permettent pas d’évaluer correctement la métabolisation des mycotoxines et ne reflètent pas les effets globaux ou à plus long terme. Lorsqu’elle est ingérée par un organisme vivant, son devenir et ses effets dépendent notamment de son absorption intestinale et de sa métabolisation, processus qui peuvent être perturbés par un stress thermique. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux de laboratoire pour étudier les conséquences d’une exposition alimentaire à la mycotoxine dans un environnement plus chaud sur un organisme entier, impliquant l’interaction de différents tissus (foie, tissu adipeux, intestin, cerveau, muscle) et les réponses physiologiques globales du aux adaptations de l’organisme. Il est impossible de reproduire ces interactions complexes en utilisant uniquement des méthodes alternatives, telles que des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

Soumises à des injections, des inhalations sous anesthésie et une trachéotomie en fin de protocole, 6 480 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Selon le modèle d'allergie, elles subissent un choc anaphylactique provoqué, avec chute de température corporelle et diarrhées, un gonflement des oreilles ou une dermatite induite par patch. Ces vaccins à ARN visent à prévenir ou réduire des symptômes allergiques que le RNT présente comme sans traitement efficace à long terme aujourd'hui. Le bénéfice reste une perspective, quand les chocs et inflammations infligés aux souris sont, eux, programmés.

Objectifs

La prévalence mondiale des pathologies allergiques est en perpétuelle augmentation à la fois dans les pays développés et en voie de développement. Par exemple, il est maintenant estimé qu’un tiers des français souffrent d’une ou plusieurs formes de pathologies allergiques, dont certaines peuvent s’avérer fatales (p.ex., certaines formes d’asthmes réfractaires aux corticoïdes ou encore des anaphylaxies induites par l’ingestion de fruits à coques). Il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de prévenir les allergies ou de réduire les symptômes allergiques de manière efficace et sur le long terme. La pandémie de Covid-19 a permis de mettre en lumière l’efficacité, la modularité selon la cible thérapeutique, et la production rapide de vaccins à ARN. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins à ARN dans différents modèles d’allergies majeurs pour permettre de prévenir et de réduire les symptômes allergiques. Nous utiliserons des modèles d’asthme allergique, d’allergie alimentaire, d’anaphylaxie systémique et cutanée et de dermatite atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux traitements à visée anti-allergique permettant de réduire les limitations des traitements actuels qui sont principalement symptomatiques, avec moins d’effets secondaires, de prévenir le risque de complications graves comme l’anaphylaxie. Ces traitements possèdent des modes de production facilités et permettraient une réduction des coûts de santé.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations et injections à l'oreille se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation ou injection : 30 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine avec alternance des sites de prélèvement (joue droite puis joue gauche ; induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).. Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées selon les modèles d’allergies. Le modèle d’allergie alimentaire peut induire un stress lors du gavage des animaux (20 secondes). Il peut aussi provoquer des diarrhées, des douleurs abdominales, la baisse rapide de température corporelle lors de l’induction du choc anaphylactique. Le gonflement des oreilles lié à l’allergie cutanée (anaphylaxie cutanée) peut provoquer une douleur (non quantifiable en l’absence de réactions observables de l’animal). L’application de patch pour induire une dermatite atopique peut géner l’animal et provoquer des démangeaisons.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci ne permettent pas de reproduire toutes les intéractions d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). Ce projet est multidisciplinaire et vise à démontrer l’efficacité de différents vaccins à ARN dans le développement de différentes maladies allergiques, dans des modèles murins mimant les pathologies humaines. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour une procédure, chaque souris sera son propre contrôle permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE. Un enrichissement (frisures de papier (sizzlenest), igloos, ou bâtonnets en bois destinés au rongement...) sera introduit dans l’hébergement des animaux. Les animaux seront suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, pilo-érection et/ou grimace, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, car leur système immunitaire est suffisamment développé pour fonctionner de manière comparable à celui d’un adulte, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et pertinents.

1 664 souris génétiquement modifiées, privées d'un à trois facteurs dans le foie, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est nourrie quinze semaines avec un régime hypercalorique jusqu'à développer diabète et accumulation de graisse dans le foie, l'autre suivie un an avec des tests de glycémie répétés. Toutes sont tuées pour prélever sang et organes. Le projet étudie la coopération entre facteurs de transcription du métabolisme, présentés comme des cibles thérapeutiques contre les maladies liées à l'obésité.

Objectifs

L’obésité est en constante augmentation et représente un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2 et d’autres maladies telles que la stéatose hépatique métabolique. Le foie est un organe majeur pour la régulation de l’homéostasie énergétique et contrôle de nombreuses fonctions métaboliques et des réponses inflammatoires. De nombreuses fonctions hépatiques sont assurées par des facteurs de transcription qui coopèrent pour réguler l’expression de gènes. La dérégulation de ces processus est l’un des mécanismes observés lors du diabète de type 2 et de la stéatose. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les rôles respectifs et les coopérations potentielles entre plusieurs facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme en condition physiologique et dans l’obésité induite par l’alimentation. Nous disposons au laboratoire de souris spécifiquement délétées pour un ou plusieurs facteurs de transcription dans les hépatocytes. Ces animaux, hébergés pour certains d'entre eux à thermoneutralité, seront soit nourris avec un régime standard et suivis au cours du temps, soit nourris avec un régime hypercalorique pendant 15 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les rôles spécifiques ainsi que les potentielles interactions ou redondances entre différents facteurs de transcription impliqués dans la régulation du métabolisme hépatique, en condition physiologique et physiopathologique.Les facteurs de transcription étudiés sont des cibles thérapeutiques de choix pour le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité et il existe actuellement un intérêt croissant pour le développement de molécules ciblant simultanément plusieurs de ces facteurs. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard et suivis pendant 1 an (512 animaux). D’autres groupes, hébergés à thermoneutralité, seront nourris à volonté avec un régime standard ou hypercalorique pendant 15 semaines (1152 animaux). -pesées hebdomadaires - 6 mesures de la glycémie (tous les 2 mois sur 1 année) pour 512 animaux à partir d’une goutte de sang . La mesure ne nécessite pas de contention et prend moins de 5 secondes. - 2 mesures de la glycémie pour 1152 animaux - 3 tests de tolérance au glucose et 3 tests de tolérance à l’insuline sur une année pour 512 animaux, consistant en 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie (temps 0) puis administration orale de glucose ou injection d'insuline prenant moins de 30 secondes, puis de mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2 h (6 prélèvements de moins de 5 secondes). - 1 test de tolérance au glucose et 1 test de tolérance à l’insuline sur 1152 animaux - un dernier prélèvement sanguin avant la fin de l’étude pour tous les animaux

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec le régime hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète (hyperglycémie, intolérance au glucose, résistance à l’insuline) et d’une stéatose (accumulation de lipides dans le foie). Ces altérations s’installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d’intensité modérée, sans altération brutale de l’état général des animaux. La piqûre pour obtenir la goutte de sang peut entraîner une douleur ponctuelle de faible intensité (quelques secondes), sans effet persistant. Le dernier prélèvement de sang peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une brève douleur d’intensité très modérée. L'administration de glucose ou d'insuline peut également entraîner un stress de quelques minutes lié essentiellement à la contention. Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ce geste n'entraîne pas de douleur significative ni de complication.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des méthodes alternatives utilisant des cellules de foie par exemple pourraientt être envisagées. Néanmoins, le métabolisme énergétique est un processus complexe qui met en jeu des interactions entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, muscle, cerveau) qui sont difficiles à reproduire avec des cellules en culture. L’utilisation d'un organisme vivant, dans lequel tous les organes fonctionnent ensemble, est donc nécessaire. De plus, l’utilisation de souris transgéniques rend possible la délétion d’une protéine d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier son rôle et il est possible d’induire une obésité chez la souris grâce à un régime hypercalorique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). L’hébergement à thermo-neutralité permet de limiter le stress dû au froid. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Les modèles utilisés dans ce projet (délétés pour 1, 2 ou 3 protéines dans le foie) existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.