Troubles gastrointestinaux

Nourries six semaines avec un régime gras pour abîmer leur foie, puis injectées au paracétamol pour déclencher une défaillance hépatique aiguë, 340 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'atteinte peut réduire l'activité et la mobilité des animaux dans les heures suivant l'injection, avant le prélèvement de leurs organes. Le protocole teste une molécule censée protéger les cellules du foie. Le bénéfice avancé pour les patients, éviter une greffe, reste renvoyé à un éventuel développement clinique.

Objectifs

L’insuffisance hépatique aiguë sur chronique (IHAC) correspond à une dégradation brutale de la fonction du foie chez des patients atteints d’une maladie chronique du foie. Ce syndrome est associé à un pronostic sévère, avec une mortalité pouvant atteindre 58%. À ce jour, la transplantation hépatique constitue le seul traitement curatif. L’IHAC représente donc un enjeu majeur de santé publique et souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, le paracétamol, bien que largement utilisé et généralement considéré comme sûr aux doses thérapeutiques, peut déclencher une décompensation hépatique. Chez les patients atteints d’une maladie hépatique chronique, cette toxicité pourrait survenir à des doses plus faibles en raison d’une capacité de détoxification hépatique altérée. La mort des cellules du foie joue un rôle important dans cette pathologie. Dans une étude précédente utilisant un modèle murin d’intoxication aiguë au paracétamol, nous avons montré l’effet protecteur d’une molécule ciblant deux voies de mort cellulaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette molécule dans un modèle murin d’hépatite aiguë induite par le paracétamol survenant sur un foie atteint d’une maladie chronique induite par un régime alimentaire riche en lipides, chez des souris mâles.

Bénéfices attendus

L’objectif du présent projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une molécule dans un modèle de pathologie hépatique chronique aggravée par une hépatite aiguë induite par le paracétamol. Cette étape constitue une phase préalable au développement clinique de cette molécule. Si son efficacité est confirmée, cette approche pourrait contribuer à améliorer la survie sans recours à la transplantation hépatique et à en réduire l’indication, répondant ainsi à un besoin médical croissant dans un contexte d’augmentation des maladies métaboliques du foie.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures expérimentales incluant un régime alimentaire, des prélèvements sanguins, des injections et une euthanasie sur une durée pouvant aller jusqu’à 7 semaines. Afin d’induire une pathologie hépatique chronique, des groupes de souris seront nourris avec un régime alimentaire spécifique pendant 6 semaines. Durant cette période, les animaux feront l’objet d’un suivi régulier comprenant des pesées et des observations cliniques. Afin de suivre l’évolution de la pathologie, un prélèvement sanguin intermédiaire sera réalisé chez l’ensemble des animaux environ 72 heures avant la fin de cette période. Ce prélèvement sera effectué sous anesthésie générale et la durée de la procédure, incluant l’induction et le réveil, sera inférieure à 5 minutes. Dans certaines procédures, les animaux recevront une injection unique des traitements expérimentaux ou de leur diluant, réalisée sous anesthésie générale en moins de 5 minutes. Une partie des animaux recevra une injection de paracétamol afin d’induire une atteinte hépatique aiguë. Cette injection est réalisée rapidement et ne dure que quelques secondes. Selon les groupes expérimentaux, les animaux seront ensuite suivis pendant des durées variables. Avant l’euthanasie, tous les animaux feront l’objet d’un prélèvement sanguin terminal sur animal vigile, de courte durée, afin de permettre l’analyse des paramètres biologiques. Les animaux seront ensuite euthanasiés pour permettre l’analyse des tissus.

Impact sur les animaux

La MASH est généralement associée à une absence de douleur manifeste aux stades considérés. Au démarrage du protocole expérimental, un léger désagrément transitoire peut être ressenti par l’animal en lien avec le manque d’appétence pour le régime alimentaire hyperlipidique. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture à volonté, à l’exception de la nuit précédant l’injection de paracétamol, durant laquelle la nourriture est retirée, ce qui peut engendrer un léger stress sans conséquences notables. L’induction de l’IHAC par le paracétamol peut provoquer un certain inconfort chez les animaux sans être associé à une douleur intense. Une diminution de l’activité et une réduction de la mobilité des souris peuvent être observées dans les heures suivant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane peut entraîner un stress transitoire à l’induction, une dépression respiratoire légère, une hypothermie, ainsi qu’une récupération parfois ralentie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie et de l’efficacité de nos molécules thérapeutiques.

Remplacement

Dans le contexte du développement des pathologies hépatiques telles que la MASH, les alternatives in vitro ou in silico ne permettent pas, à ce jour, de reproduire la complexité physiopathologique de la maladie. En effet, la MASH résulte d’interactions dynamiques entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, pancréas), d’une grande hétérogénéité cellulaire au sein du microenvironnement hépatique, ainsi que de l’influence du microbiote intrahépatique. Les modèles cellulaires ou organoïdes actuellement disponibles ne permettent pas de reconstituer de manière fiable ces communications inter-organes et intercellulaires, ni de reproduire l’évolution spatiotemporelle des lésions observées in vivo. Le présent projet vise à évaluer l’effet protecteur d’un inhibiteur de nécrose programmée dans un contexte d’insuffisance hépatique aiguë induite par le paracétamol sur un foie déjà atteint de MASH. Ce contexte pathologique implique l’activation coordonnée de multiples cascades cellulaires, inflammatoires et métaboliques, dont l’intégration et la dynamique ne peuvent être intégralement modélisées par les systèmes in vitro disponibles à l’heure actuelle. Enfin, la réalisation de cette étude préclinique in vivo constitue une étape indispensable avant tout développement clinique chez l’humain, conformément aux exigences réglementaires et éthiques en vigueur. Ainsi, malgré l’examen attentif des méthodes alternatives disponibles, aucun remplacement complet de l’expérimentation animale n’est actuellement possible pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux sera strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée à partir de données issues d’études précédentes et d’estimations statistiques, en tenant compte de la variabilité attendue des mesures et de la différence minimale considérée comme biologiquement pertinente pour le critère principal étudié (les enzymes hépatiques ALT). Des méthodes expérimentales et analytiques visant à limiter les biais seront utilisées, notamment la répartition aléatoire des animaux dans les différents groupes expérimentaux. Sur cette base, le nombre minimal d’animaux requis est estimé à 10 par groupe. Les données issues d’expérimentations murines antérieures menées dans un modèle d’hépatite aiguë induite par le paracétamol confirment la pertinence de cette taille d’échantillon, compte tenu de l’importante variabilité interindividuelle associée à ce modèle. Par ailleurs, la conception du projet inclut une phase préalable de mise au point du modèle d’insuffisance hépatique aiguë sur fond chronique (IHAC) et d’ajustement de la dose de paracétamol nécessaire à son induction, réalisée sur un nombre limité d’animaux. Cette étape permettra également d’évaluer l’impact potentiel du diluant des molécules sur le développement de la pathologie, afin de garantir la robustesse et la reproductibilité du modèle avant l’étude des traitements.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes (par fratrie) avec un enrichissement adapté (matériaux de nidification et cachettes) permettant l’expression des comportements naturels. En cas d’isolement d’un individu lié à de l’agressivité de dominance, un enrichissement supplémentaire sera ajouté. Une période d’acclimatation d’au moins une semaine et une habituation progressive aux manipulations (contention douce) permettront de réduire le stress. Les manipulations expérimentales seront limitées au strict nécessaire et, dans la mesure du possible, regroupées afin de réduire la fréquence des contentions. Une surveillance clinique sera réalisée à l’aide d’une grille d’évaluation standardisée associée à un suivi du poids de manière hebdomadaire en phase chronique et quotidienne en phase aiguë. Une attention particulière sera portée durant la phase aiguë, notamment dans les heures suivant l’injection de paracétamol, avec une augmentation de la fréquence des observations si nécessaire. L’anesthésie sous l’isoflurane sera utilisée pour les procédures concernées, avec une attention particulière portée au maintien de la température corporelle et à la phase de réveil, afin de limiter les effets indésirables tels que l’hypothermie. Un anesthésique locorégional sera appliqué lors des prélèvements ou de certaines injections réalisées dans des zones sensibles. Des points limites précoces et spécifiques aux modèles utilisés sont définis, incluant notamment une perte de poids excessive, une altération marquée de l’état général, des troubles du comportement ou des signes cliniques sévères. Leur atteinte entraînera l’arrêt de la procédure et la mise en œuvre de mesures appropriées, incluant si nécessaire une euthanasie conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est particulièrement pertinente, car cette lignée constitue un modèle robuste et largement validé pour l’étude de nombreuses pathologies hépatiques et métaboliques. Leur physiologie permet de reproduire, sur des temps expérimentaux raccourcis, des processus pathologiques comparables à ceux observés chez l’Homme. Ce modèle permet d’étudier l’évolution de la maladie et les mécanismes impliqués, comme la mort des cellules, l’inflammation et la réparation du foie. Les souris sont également bien adaptées pour tester de nouvelles molécules et évaluer leur potentiel thérapeutique. Les souris seront incluses dans les protocoles expérimentaux à l’âge adulte, afin de disposer d’une fonction hépatique pleinement mature et fonctionnelle. Ce choix est essentiel pour garantir la validité physiopathologique du modèle, les réponses hépatiques aux agressions toxiques et inflammatoires dépendant étroitement de l’âge. Par ailleurs, l’insuffisance hépatique aiguë sur un foie préalablement altéré par une hépatite chronique de type MASH concerne majoritairement la population adulte, l’âge constituant un facteur de risque majeur dans le développement et la progression de cette pathologie. Seules des souris mâles seront utilisées, conformément aux données scientifiques indiquant une résistance relative des femelles à la MASH et à l’induction d’une hépatite aiguë par le paracétamol. De plus, la prévalence de l’IHAC est plus élevée chez les hommes. Ce choix permet ainsi de maximiser la probabilité de détecter un effet biologique pertinent tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux.

4608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes gras et sucrés pendant six à douze mois pour reproduire une stéatose évoluant vers un cancer du foie, avec échographies sous anesthésie tous les quinze jours et, pour certaines, une chirurgie terminale. Une prise de poids importante, l'anesthésie répétée et le développement tumoral peuvent altérer leur état général. Le porteur justifie ce total de 4608 animaux par un calcul de puissance sans en détailler le résultat, sur un projet qui reste une caractérisation de mécanismes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée).Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

Gavées ou perfusées jusqu'à six heures avec des composés à tester, 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort après un prélèvement sanguin terminal et une nécropsie. Le projet mesure la tolérance de produits d'un commanditaire avant leurs études d'efficacité, en identifiant les doses qui déclenchent apathie, convulsions ou perte de poids d'au moins 20 %, seuil à partir duquel l'animal est tué. Le porteur présente un cathéter implanté dans la jugulaire comme un gain de "bien-être" qui évite six heures de contention, une contrainte que le protocole crée lui-même. Il conclut que la souris reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérabilité de produits administrés par voie orale et intraveineuse chez la souris, en administration aiguë et répétée. L'objectif est de déterminer les effets potentiels sur les paramètres cliniques, le comportement, la mortalité, et les organes cibles, afin de garantir la sécurité des composés avant leur développement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à sécuriser les études d’efficacité en amont, en évaluant la tolérabilité des produits testés chez la souris, en administration aiguë et répétée. Lors de ces études, il est essentiel de s’assurer que les doses administrées ne génèrent pas d’effets indésirables non anticipés. L’objectif est de mieux cibler les plages de doses à utiliser dans les protocoles d’efficacité, en identifiant les seuils de tolérance et les éventuelles toxicités liées à la formulation ou à la voie d’administration. Cette approche permet d’éviter l’exposition inutile des animaux à des doses potentiellement délétères, tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus dans les études suivantes. Les données générées permettront également d’optimiser les plans expérimentaux, de réduire les risques d’échec liés à une mauvaise tolérabilité, et de renforcer la qualité des dossiers réglementaires associés au développement des produits. Justification scientifique et éthique de l’usage du VAB : L’utilisation du VAB permet une administration intraveineuse sans contention physique prolongée. En méthode traditionnelle, les animaux doivent être maintenus dans un tunnel de contention pendant au maximum 6 heures, ce qui génère un stress important. Ce stress est d’autant plus problématique dans les protocoles à administration répétée, où il serait réitéré plusieurs fois. Avec le VAB, les animaux restent libres de leurs mouvements, ce qui réduit significativement le stress et améliore leur bien-être. Cette approche est donc scientifiquement pertinente pour garantir des données fiables, et éthiquement justifiée pour respecter les principes du raffinement dans l’expérimentation animale.

Procédures

Dans le cadre des administrations intraveineuses, deux modalités sont envisagées : Administration aiguë : chaque injection est réalisée sur un animal vigile après passage dans une enceinte thermostatée à 38°C avec une durée maximale de 15 minutes, la durée de l'administration est courte, généralement comprise entre 5 et 10 secondes. Perfusion lente : l’administration est réalisée sur animaux implantés , qui leur permettent d'avoir une totale liberté de mouvement, elle peut durer jusqu’à 6 heures. Pour les procédures par gavage, les administrations sont brèves, inférieures à 10 secondes. Fin de procédure : À l’issue des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément. Un prélèvement sanguin terminal sera alors réalisé, suivi d’une euthanasie sans réveil, conformément aux recommandations éthiques et réglementaires en vigueur.

Impact sur les animaux

Les études de tolérabilité visent à identifier les effets délétères liés à l’administration de composés, immédiats ou après expositions répétées. Bien que supposés bien tolérés, certains effets peuvent survenir selon la dose, la formulation ou la voie d’administration. Les injections IV peuvent provoquer des réactions locales (érythème, œdème, hématome, croûte), notamment en cas d’irritation liée au véhicule. Les administrations orales peuvent entraîner des troubles digestifs, une baisse de consommation alimentaire ou une perte de poids. Ces effets seront surveillés quotidiennement. Le traitement est interrompu en cas de signes cliniques sévères : apathie, prostration, yeux fermés, décubitus latéral, piloérection, tremblements, convulsions, œdème sévère, perte de poids ≥ 20 %, ou absence d’alimentation (liste non exhaustive). Ces critères permettent de limiter la douleur sans compromettre les résultats. Lors d’administrations répétées, l’évolution clinique sera suivie avec attention. Une adaptation des doses ou de la durée pourra être envisagée en cas de toxicité. Les injections seront réalisées dans les règles de l'art. La couleur de la peau (pâleur) et le comportement seront observés le lendemain pour détecter toute atteinte physiologique. Afin de faciliter l’injection IV et éviter le passage en périveineux, les animaux sont placés au maximum 15 minutes dans une enceinte thermostatée à 38°C. Chez les animaux porteurs de VAB implantés à la veine jugulaire, des effets indésirables spécifiques peuvent apparaître : réactions locales (érythème, œdème, croûtes, hématomes), gêne ou douleur à la manipulation, risque d’infection ou de déplacement du dispositif. Une surveillance renforcée est mise en place : inspection du site, suivi du comportement et de l’état général, mesures d’hygiène strictes. Toute anomalie est évaluée par le porteur de projet ou le personnel du bien-être animal, et peut conduire au retrait de l’animal de l’étude.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort de manière éthique et réglementaire, après un prélèvement sanguin terminal réalisé sous anesthésie profonde. Ce prélèvement a pour objectif de détecter d’éventuels effets indésirables ou toxiques du composé testé, notamment par l’analyse de biomarqueurs spécifiques. Par ailleurs, une nécropsie sera systématiquement effectuée afin d’identifier, par observation macroscopique, d’éventuelles altérations des organes cibles, permettant ainsi une évaluation complète de l’impact du traitement.

Remplacement

Avant toute expérimentation in vivo, plusieurs tests de toxicité cellulaire sont réalisés afin d’évaluer la cytotoxicité, les effets mutagènes et les interactions métaboliques des composés. Ces tests permettent d’éliminer les produits les plus toxiques et d’éviter des expositions trop fortes ou inappropriées chez l’animal. Cependant, malgré leur utilité, ces modèles in vitro présentent des limites importantes. Ils ne permettent pas de reproduire les interactions complexes d’un organisme entier, notamment les effets systémiques, les réactions immunitaires, les compensations physiologiques ou les effets secondaires liés à la voie d’administration. De plus, certains effets indésirables ne se manifestent qu’en contexte multi-organes ou après plusieurs jours d’exposition. C’est pourquoi l’expérimentation animale reste indispensable pour confirmer la tolérabilité des produits dans des conditions proches de leur usage clinique. Les études in vivo permettent de valider les doses sûres, d’identifier les seuils de toxicité, et de garantir la sécurité des protocoles d’efficacité à venir.

Réduction

Les études de tolérabilité sont conçues pour être réalisées sur un nombre restreint d’animaux, tout en permettant une évaluation fiable des effets potentiels des produits testés. Chaque protocole est optimisé pour limiter les effectifs tout en assurant la détection des signes de toxicité, qu’ils soient liés à la dose, à la formulation ou à la voie d’administration. Ces études préalables permettent d’éviter l’administration de doses potentiellement toxiques dans les protocoles d’efficacité, qui mobilisent un nombre d’animaux plus important. En ciblant précisément les plages de tolérance, elles contribuent à réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés dans l’ensemble du programme de recherche. Cette approche est pleinement conforme au principe de réduction des 3R, en évitant les expositions inutiles, les traitements non pertinents, et en affinant les plans expérimentaux grâce aux données obtenues. Les effectifs sont définis à partir de données bibliographiques, de tests in vitro, et d’études pilotes, permettant le calcul de puissance statistique et l’ajustement des groupes en fonction de la réponse observée.

Raffinement

Les études de tolérabilité ont été conçues pour limiter au maximum les nuisances potentielles tout en garantissant la qualité des observations. Contrairement aux modèles pathologiques, les produits testés dans ce protocole ne sont pas censés induire de symptômes sévères. Toutefois, des effets liés à la formulation, à la voie d’administration ou à la dose peuvent survenir et seront surveillés avec attention. Ces signes sont considérés comme des atteintes de points limites et entraînent la mise à mort éthique de l’animal concerné, ainsi qu’un réajustement des paramètres expérimentaux (dose, durée, formulation). Les procédures sont réalisées avec un hébergement adapté au bien-être des animaux, incluant un enrichissement du milieu (igloos, éléments de nidification, bois à ronger). Les injections intraveineuses sont réalisées dans les règles de l’art,avec application de lidocaïne au niveau du site d'injection, afin d’éviter les réactions locales ou les erreurs techniques. Les observations sont renforcées dans les heures suivant l’administration, et une attention particulière est portée à la couleur de la peau et au comportement des animaux. Le prélèvement de sang terminal et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. Ce niveau de raffinement permet de garantir une expérimentation respectueuse, conforme aux exigences réglementaires et éthiques, tout en assurant la fiabilité des données générées.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de reproduire de manière fiable les mécanismes physiopathologiques ciblés par nos produits, notamment ceux liés à des atteintes systémiques ou métaboliques. Les modèles murins, tels que le rat et la souris, présentent une homologie génétique d’environ 90 % avec l’humain, ce qui en fait des espèces de choix dans les études pharmacologiques. Le choix d’utiliser à la fois le rat et la souris repose sur le fait que nos modèles d’efficacité ont été développés spécifiquement dans l’une ou l’autre de ces espèces. Il est donc pertinent, avant de procéder aux tests d’efficacité, de vérifier la tolérabilité des produits dans l’espèce concernée par le modèle utilisé.Le test de tolérabilité chez le rat fait l'objet d'une autorisation indépendante de celle-ci. La présente autorisation porte sur le modèle souris. Les animaux utilisés dans ce projet seront des individus jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est choisi car il correspond à une période où les animaux sont suffisamment matures sur le plan immunologique et physiologique, tout en étant encore dans une phase de stabilité métabolique. Cela permet d’obtenir des données fiables et reproductibles sur la tolérabilité des composés testés, tout en limitant les biais liés à l’âge ou au développement.

Pour étudier le rôle des plaquettes dans les maladies du foie liées à l'obésité, 48 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries avec un régime riche en graisses, reçoivent des injections répétées sur animal vigile, puis subissent quatre prélèvements sanguins et un prélèvement terminal sous anesthésie. Le déficit en plaquettes induit peut s'accompagner de petits saignements au point d'injection. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant avoir besoin d'un grand volume de sang et de prélever des organes.

Objectifs

Les maladies du foie sont des conséquences d’un ensemble de troubles souvent associés à l’obésité. Elles évoluent par étapes : accumulation de graisse, inflammation, accumulation de tissu fibreux, et peuvent parfois conduire au cancer du foie, dont le taux de survie à cinq ans est très faible. Ces maladies touchent plus de 30 % de la population mondiale et sont aujourd’hui la principale cause de maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Leurs causes exactes varient d’un patient à l’autre et restent mal comprises, ce qui complique leur prévention et leur traitement. Les plaquettes, connues pour leur rôle dans l’arrêt du saignement, semblent aussi participer au fonctionnement du foie, notamment en cas de troubles métaboliques. Certaines études ont montré que des traitements antiplaquettaires à long terme, peuvent réduire la graisse hépatique, limiter l’inflammation, et diminuer le risque de cancer du foie, tant chez l’homme que dans des modèles animaux. Cependant, on ne comprend pas encore bien comment les plaquettes régulent le métabolisme du foie. Pour y répondre, nous voulons étudier l’effet d’une diminution importante du nombre de plaquettes sur l’apparition des premiers stades de la maladie, en utilisant des souris génétiquement modifiées nourries avec un régime riche en graisses. Ces souris produisent ou ne produisent plus du tout de plaquettes, ce qui aide à comprendre leur rôle précis dans la maladie.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et leurs conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations concernant l’origine de ces maladies hépatiques, et aideront à évaluer l’intérêt de cibler les plaquettes pour le développement de futurs traitements.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime alimentaire riche en lipides pendant 1 semaine. La souris vigile recevra 1 injection de 5 secondes pendant 4 jours consécutifs, puis 1 injection de 5 secondes tous les 2 jours pendant 8 jours. Nous réaliserons 4 prélèvements sanguins de 15 sec sur souris anesthésiée et 1 prélèvement sanguin terminal de 1 minute sur souris anesthésiée

Impact sur les animaux

La mise en régime riche en lipides chez la souris induit une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation de l’organe. L’injection répétée réalisée sur animal vigile peut entrainer un stress à la contention et une douleur au point de piqure de l’aiguille de quelques secondes. Le déficit en plaquette des souris peut être associée à un saignement de quelques secondes lors de l’injection répétée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car nous aurons besoin d’un grand volume de sang (700µl), et de prélever des organes.

Remplacement

Les processus qui contrôlent les plaquettes sanguines et les maladies du foie font intervenir de nombreux types de cellules et plusieurs organes, comme le foie, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux ou encore l’intestin. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire capable de reproduire fidèlement toutes ces interactions complexes. Aucun système expérimental ne permet d’imiter un foie complet avec ses différents types de cellules et ses vaisseaux et de modéliser ses échanges avec d’autres organes. Notre projet étudie une maladie du foie qui résulte de plusieurs problèmes combinés : des troubles du métabolisme des graisses, de l’inflammation et des anomalies des vaisseaux sanguins. Pour comprendre ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des échanges métaboliques, hormonaux et immunitaires d’un organisme.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs ont été déterminés en amont par une approche statistique.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’habituation des animaux à l’expérimentateur et aux différents gestes, une fois par jour pendant 5 jours, la semaine avant le début de la procédure (contention, manipulation, et pesées) - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages sont munies de particules de bois et enrichie avec des carrés de cellulose + des bâtons de coton + de la frisure afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux - Par une anesthésie générale de l’animal pendant les prélèvements sanguins - Par l’injection d’antalgique et d’analgésique avant le prélèvement terminal puis sur le plan musculaire avant incision - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante lors des anesthésies. Des points limites permettent de soustraire les animaux à toute souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous disposons de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les plaquettes sanguines de souris ont des caractéristiques très proches de celles de l'Homme. Nous utiliserons des souris de 12 à 20 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).